CN116590237B - 一种遗传修饰的自然杀伤细胞及其制备和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种遗传修饰的自然杀伤细胞及其制备和用途。本发明中自然杀伤细胞即NK细胞通过碱基编辑系统安全高效地敲除NK细胞的NKG2A基因、CD96基因或PVRIG基因。本发明中碱基编辑的NK细胞具有高效的杀伤肿瘤细胞的作用，可望开发成为一种安全而有效的抗癌药物，具有广阔的临床应用前景和开发价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种遗传修饰的自然杀伤细胞及其制备和用途。
背景技术
NK细胞又称自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)，是机体内重要的免疫细胞，NK细胞形态上属于大颗粒淋巴细胞，来源于骨髓，是除T细胞、B细胞之外的第三大类淋巴细胞，约占血液中所有免疫细胞（白细胞数量）的15%，属于天然免疫系统的核心细胞，主要分布于外周血、肝脏和脾脏，在人体内NK细胞主要特征为CD3-CD56+淋巴细胞群，其中血液中主要为CD16+CD56dim亚型（根据细胞上CD56分子表达密度的差异，将NK细胞分为CD56dim和CD56bright两个亚群；CD56dim占NK细胞90％以上，主要为细胞毒作用，表达中度亲和力的IL-2受体（IL-2R），具有更强的杀伤活性；CD56bright可产生大量细胞因子，主要起免疫调节作用，高表达IL-2R）。
NK细胞是体内负责杀伤老化、受病毒感染、肿瘤等异常细胞的最主要“战士”。其杀伤作用不仅需要通过抑制性受体检测转化细胞上的MHC-I分子，还需要通过激活性受体激活NK细胞。自然细胞毒性受体（NCR）是一组自然杀伤细胞表面激活性受体，包括NKp46、NKp30和NKp44。这些受体以及NKG2D和DNAM-1（DNAX辅助分子-1）识别病毒感染或恶性转化细胞表面表达的配体。一些共受体（2B4、NKp80、NTB-A和CD59）也被表达，它们只有与其他激活性受体结合才能发挥作用。CD16（或FcγRIII）也是一种激活性受体，主要由CD56dim NK细胞亚群表达，对IgG包被靶细胞的抗体依赖性细胞毒性（ADCC）至关重要。
肿瘤通过建立免疫抑制肿瘤微环境来逃避免疫系统。涉及NK细胞的免疫逃避包括几个机制。肿瘤细胞或肿瘤微环境的其他组分如转化生长因子-β（TGF-β）、IL-6、IL-10、色氨酸分解代谢产物、前列腺素E2（PGE2）、dickkopf相关蛋白2（DKK2）、吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）、可溶性HLA-G、可溶性NKG2D配体。据报道，半乳糖-3（NKp30可溶性抑制性受体）可降低NK细胞的活化、细胞毒性、IFNγ的产生及其激活性受体的表达和激活。此外，肿瘤细胞还发现激活性受体的配体脱落和抑制性受体配体的上调。因此，人们开发了多种策略来恢复NK细胞的功能，包括过继细胞转移、细胞因子治疗、靶向激活、抑制性受体和肿瘤微环境的单克隆抗体。肿瘤利用NK细胞抑制性受体进行免疫逃避就是这样一种机制，称为免疫检查点抑制，并已被证明是最有效和最受欢迎的治疗靶点
NKG2A是NKG2家族中的抑制性成员，表达在CD56hi NK细胞、NKT细胞和CD8+ αβ T细胞的一个亚群中。Tumor Cell细胞上的非经典MHC I类分子HLA-E是NKG2A-CD94的主要配体，NKG2A-CD94与载肽HLA-E结合会导致NKG2A中基于细胞质免疫受体酪氨酸的抑制性基序磷酸化，从而导致抑制性信号的传播，抑制来自激活受体（如NKG2D、TCR）的竞争信号，简而言之，NKG2A与HLA-E的结合，抑制了NK和T细胞的激活。
CD96是同一免疫球蛋白超家族的成员，具有类似的抑制作用，但与配体CD155的结合亲和力较低。CD226是一种激活性受体，与TIGIT和CD96竞争结合CD155。CD155（主要）和CD112作为TIGIT和CD96结合的配体，以抑制T细胞和NK细胞介导的免疫。CD155是一种跨膜糖蛋白，又称脊髓灰质炎病毒受体（PVR），最初被鉴定为脊髓灰质炎病毒进入受体。CD155是免疫球蛋白超家族的一员，也是连接蛋白样分子家族的第五个成员，因此也被称为necl-5。它在正常人体组织中几乎不表达，但许多肿瘤细胞系和原发性恶性肿瘤高表达CD155。在CD155的功能中，通过其与抑制性受体TIGIT和CD96以及激活受体CD226的相互作用来进行免疫调节是特别令人感兴趣的。各种癌症都表现出CD155的上调，相应的TIGIT和CD96的NK和T细胞表达上调，以通过诱导T细胞或NK细胞抑制来逃避抗肿瘤免疫。
毫无疑问，自然杀伤细胞是一组独特的抗肿瘤效应细胞，具有不受MHC限制的细胞毒性、产生细胞因子和免疫记忆等功能，使其成为先天性和适应性免疫反应系统中的关键角色。一些癌症的发生与功能失调的NK细胞有关。因此，修复这种NK细胞可能是抗肿瘤免疫治疗的一个潜在选择。这种修复的一种方法是抑制免疫检查点(如CD96、NKG2A等)，即癌细胞通过控制免疫细胞表面的抑制受体进行免疫逃逸。减少肿瘤TME对NK细胞的免疫抑制，从而增强NK细胞的肿瘤杀伤力和持久性，增强肿瘤的免疫应答，减少肿瘤的侵袭和迁移，具有良好的临床应用前景。
尽管经典的CRISPR/Cas9基因编辑技术实现了对NK细胞的高效遗传操作，但经典的CRISPR/Cas9基因编辑技术以DNA双链断裂为基础的遗传操作可能导致百万碱基级别的染色体缺失，影响人类细胞基因组的完整性和稳定性。另外，双链断裂可引起p53诱导的细胞凋亡，阳性编辑的细胞更倾向于富集p53突变的细胞，这种编辑的细胞注射到体内无疑增加了癌变风险。因此，利用更安全的基因编辑工具应用于构建安全风险更小的基因编辑NK细胞是当下亟需解决的问题。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种遗传修饰的自然杀伤细胞及其制备和用途，用于解决现有技术中经以DNA双链断裂遗传操作的NK细胞可能导致百万碱基级别的染色体缺失以及癌变风险增加的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种遗传修饰的自然杀伤细胞及其制备和用途，所述自然杀伤细胞的NKG2A、CD96、PVRIG、CISH或A2AR基因中的1个或多个经过碱基编辑。
优选的，进一步地，所述自然杀伤细胞的NKG2A、CD96、PVRIG、CISH和A2AR基因中的2个或3个同时经过碱基编辑。
优选的，所述自然杀伤细胞包含如下特征中的一项或多项：
1）NKG2A基因和CD96基因同时经过碱基编辑；
2）NKG2A基因和PVRIG基因同时经过碱基编辑；
3）NKG2A基因和CISH基因同时经过碱基编辑；
4）NKG2A基因和A2AR基因同时经过碱基编辑；
5）CD96基因和PVRIG基因同时经过碱基编辑；
6）CD96基因和CISH基因同时经过碱基编辑；
7）CD96基因和A2AR基因同时经过碱基编辑；
8）PVRIG基因和CISH基因同时经过碱基编辑；
9）PVRIG基因和A2AR基因同时经过碱基编辑；
10）CISH基因和A2AR基因同时经过碱基编辑；
11）NKG2A基因、CD96基因和PVRIG基因同时经过碱基编辑；
12）NKG2A基因、CD96基因和CISH基因同时经过碱基编辑；
13）NKG2A基因、CD96基因和A2AR基因同时经过碱基编辑；
14）NKG2A基因、PVRIG基因和CISH基因同时经过碱基编辑；
15）NKG2A基因、PVRIG基因和A2AR基因同时经过碱基编辑；
16）NKG2A基因、CISH基因和A2AR基因同时经过碱基编辑；
17）CD96基因、PVRIG基因和CISH基因同时经过碱基编辑；
18）CD96基因、PVRIG基因和A2AR基因同时经过碱基编辑；
19）CD96基因、CISH基因和A2AR基因同时经过碱基编辑；
20）PVRIG基因、CISH基因和A2AR基因同时经过碱基编辑。
优选的，所述碱基编辑将自然杀伤细胞中NKG2A、CD96、PVRIG、CISH或A2AR基因上的碱基C突变至T，或将碱基A突变至G。
本发明还提供前述自然杀伤细胞的制备方法，所述制备方法为通过将碱基编辑系统转入自然杀伤细胞以制备前述自然杀伤细胞。
本发明还提供一种编辑NKG2A、CD96、PVRIG、CISH或A2AR基因的方法，所述方法为通过前述碱基编辑系统使NKG2A、CD96、PVRIG、CISH或A2AR基因上的至少部分碱基C突变至T，或将碱基A突变至G。
本发明还提供前述碱基编辑系统在使NKG2A、CD96、PVRIG、CISH或A2AR基因上的至少部分碱基C突变至T，或将碱基A突变至G的用途。
本发明还提供一种组合物，所述组合物的主要有效成分为前述自然杀伤细胞或前述碱基编辑系统。
本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包含前述自然杀伤细胞、前述碱基编辑系统或前述组合物。
本发明还提供前述自然杀伤细胞、前述碱基编辑系统、前述组合物或前述试剂盒的用途，前述用途选自以下一项或多项：
制备用于预防和/或治疗自身免疫疾病的药物；
制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物；
制备用于预防和/或治疗病毒感染性疾病的药物；
制备用于预防和/或治疗细菌感染性疾病的药物。
如上所述，本发明的一种自然杀伤细胞、其制备方法及用途，具有以下有益效果：
本发明的研究结果显示：利用修饰的sgRNA和碱基编辑融合蛋白，以电穿孔转染的方式将sgRNA/BE蛋白复合物（RNP）导入经体外扩增的原代NK细胞，可以高效敲除NKG2A、CD96、PVRIG、CISH和A2AR基因。同时利用碱基编辑敲除NKG2A、CD96、PVRIG、CISH和A2AR的NK细胞（NKG2A、CD96、PVRIG、CISH和A2AR- NK细胞），其在DNA与RNA水的脱靶与野生型细胞相比无明显差异，表明了本发明的NK细胞对于细胞治疗产品的安全性。利用本发明的NK细胞，可解除NKG2A、CD96、PVRIG、CISH和A2AR高表达肿瘤细胞对NK细胞的免疫抑制作用。本发明的NK细胞相对于野生型NK细胞在体内、体外实验中均展现出更强的抗肿瘤活性。本发明的NK细胞可以作为药物及时有效地应用于临床免疫治疗，可以为建立碱基编辑技术联合过继免疫在肿瘤及病毒感染性疾病（例如HIV/AIDS）的治疗提供新的选择，还可以为新的有效基因靶点的研究提供支持，同时为相关疾病治疗的研究奠定坚实的技术基础，因此具有明显的应用前景和临床应用价值。
附图说明
图1显示为本发明中sgRNA编辑效率比率。
图2显示为本法发明中20组组合靶点对NK细胞的编辑效率。
图3显示为本发明中6组编辑效率较高的组合靶点的NK细胞的杀伤水平。
图4显示为本发明的不同RNP摩尔质量比对组合靶点代表CBE-NKM编辑效率的影响。
图5显示为本发明的组合靶点代表CBE-NKM细胞抗肿瘤活性的比较。
图6显示为本发明的组合靶点代表CBE-NKM细胞治疗后肿瘤体积变化。
图7显示为本发明的组合靶点代表CBE-NKM细胞治疗后肿瘤质量变化。
图8显示为本发明的全基因组测序分析组合靶点代表CBE-NKM的DNA脱靶。
图9显示为本发明的全转录组测序分析组合靶点代表CBE-NKM的RNA脱靶。
图10显示为本发明的组合靶点电转设计汇总表。
图11显示为本发明的所用Lonza仪器电转汇总表。
图12显示为本发明的计算NK细胞杀伤活力公式。
实施方式
本发明提供一种自然杀伤细胞，所述自然杀伤细胞的NKG2A、CD96、PVRIG、CISH或A2AR基因中的1个或多个经过碱基编辑。
本申请中，NKG2A、CD96、PVRIG、CISH或A2AR都对NK细胞具有免疫抑制作用，同时编辑其中多个基因具有协同效应，可提高NK细胞的杀伤能力和抗肿瘤效果。
进一步地，所述自然杀伤细胞的NKG2A、CD96、PVRIG、CISH和A2AR基因中的2个或3个同时经过碱基编辑。
在一些具体实施方式中，所述自然杀伤细胞包含如下特征中的一项或多项：
NKG2A基因和CD96基因同时经过碱基编辑；
NKG2A基因和PVRIG基因同时经过碱基编辑；
NKG2A基因和CISH基因同时经过碱基编辑；
NKG2A基因和A2AR基因同时经过碱基编辑；
CD96基因和PVRIG基因同时经过碱基编辑；
CD96基因和CISH基因同时经过碱基编辑；
CD96基因和A2AR基因同时经过碱基编辑；
PVRIG基因和CISH基因同时经过碱基编辑；
PVRIG基因和A2AR基因同时经过碱基编辑；
CISH基因和A2AR基因同时经过碱基编辑；
NKG2A基因、CD96基因和PVRIG基因同时经过碱基编辑；
NKG2A基因、CD96基因和CISH基因同时经过碱基编辑；
NKG2A基因、CD96基因和A2AR基因同时经过碱基编辑；
NKG2A基因、PVRIG基因和CISH基因同时经过碱基编辑；
NKG2A基因、PVRIG基因和A2AR基因同时经过碱基编辑；
NKG2A基因、CISH基因和A2AR基因同时经过碱基编辑；
CD96基因、PVRIG基因和CISH基因同时经过碱基编辑；
CD96基因、PVRIG基因和A2AR基因同时经过碱基编辑；
CD96基因、CISH基因和A2AR基因同时经过碱基编辑；
PVRIG基因、CISH基因和A2AR基因同时经过碱基编辑。
所述自然杀伤细胞的来源为源于外周血细胞的NK细胞、源于脐带血的NK细胞、胚胎干细胞诱导的NK细胞或诱导多能干细胞（ips）诱导的NK细胞中的一种或多种。
进一步的，前述自然杀伤细胞中NKG2A、CD96、PVRIG、CISH或A2AR基因的至少部分碱基C突变至T，或至少部分碱基A突变至G；所述碱基C突变至T生成提前终止密码子或使得起始密码子突变或使内含子剪接位点突变，碱基A突变至G使得起始密码子突变或使内含子剪接位点突变；所述碱基C突变至T发生CDS区中的CAA、CAG、CGA、TGG；具体的，前述自然杀伤细胞中提前终止密码子为TAA，TAG，TGA或者TGA；所述碱基C突变至T中发生起始密码子ATG突变为ATA；所述碱基C突变至T发生内含子剪接位点GT、AG突变为AT、AA；所述碱基A突变至G发生起始密码子ATG突变为ACG或GTG；所述碱基A突变至G发生内含子剪接位点GT、A突变为GC、GG。
在一些具体实施方式中，至少部分碱基C突变至T，或将至少部分碱基A突变至G选自下列的一种或多种：
1）将NKG2A基因中核苷酸序列如SEQ ID NO .1- SEQ ID NO .6, SEQ ID NO .68-SEQ ID NO .69，SEQ ID NO .85任一所示的靶点所对应碱基编辑窗口的至少部分碱基C突变至T，和/或将碱基A突变至G；
2）将CD96基因中核苷酸序列如SEQ ID NO .7- SEQ ID NO .21, SEQ ID NO .70-SEQ ID NO .76，SEQ ID NO .86任一所示的靶点所对应碱基编辑窗口的至少部分碱基C突变至T，和/或将碱基A突变至G；
3）将PVRIG基因中核苷酸序列如SEQ ID NO .43- SEQ ID NO .67, SEQ ID NO.80- SEQ ID NO .84，SEQ ID NO .91任一所示的靶点所对应碱基编辑窗口的至少部分碱基C突变至T，和/或将碱基A突变至G；
4）将CISH基因中核苷酸序列如SEQ ID NO .22- SEQ ID NO .29, SEQ ID NO.77- SEQ ID NO .78，SEQ ID NO .87- SEQ ID NO .88任一所示的靶点所对应碱基编辑窗口的至少部分碱基C突变至T，和/或将碱基A突变至G；
5）将A2AR基因中核苷酸序列如SEQ ID NO .30- SEQ ID NO .42, SEQ ID NO.79，SEQ ID NO .89-- SEQ ID NO .90任一所示的靶点所对应碱基编辑窗口的至少部分碱基C突变至T，和/或将碱基A突变至G；
更优选地，突变选自下列的一种或多种：
6）NKG2A基因上如SEQ ID NO .1- SEQ ID NO .6, SEQ ID NO .68- SEQ ID NO.69，SEQ ID NO .85任一所示的核苷酸序列突变为如SEQ ID NO .183- SEQ ID NO .188,SEQ ID NO .250- SEQ ID NO .251，SEQ ID NO .267任一所示的核苷酸序列；
7）CD96基因上如SEQ ID NO .7- SEQ ID NO .21, SEQ ID NO .70- SEQ ID NO.76，SEQ ID NO .86任一所示的核苷酸序列突变为如SEQ ID NO .189- SEQ ID NO .203,SEQ ID NO .252- SEQ ID NO .258，SEQ ID NO .268任一所示的核苷酸序列；
8）PVRIG基因上如SEQ ID NO .43- SEQ ID NO .67, SEQ ID NO .80- SEQ ID NO.84，SEQ ID NO .91任一所示的核苷酸序列突变为如SEQ ID NO .225- SEQ ID NO .249,SEQ ID NO .262- SEQ ID NO .266，SEQ ID NO .273任一所示的核苷酸序列；
9）CISH基因上如SEQ ID NO .22- SEQ ID NO .29, SEQ ID NO .77- SEQ ID NO.78，SEQ ID NO .87- SEQ ID NO .88任一所示的核苷酸序列突变为如SEQ ID NO .204-SEQ ID NO .211, SEQ ID NO .259- SEQ ID NO .260，SEQ ID NO .269- SEQ ID NO .270任一所示的核苷酸序列；
10）A2AR基因上如SEQ ID NO .30- SEQ ID NO .42, SEQ ID NO .79，SEQ ID NO.89-- SEQ ID NO .90任一所示的核苷酸序列突变为如SEQ ID NO .212- SEQ ID NO.224, SEQ ID NO .261， SEQ ID NO .271-SEQ ID NO .272任一所示的核苷酸序列。
本发明还提供前述自然杀伤细胞的制备方法，所述制备方法为将碱基编辑系统转入天然自然杀伤细胞以制备NKG2A、CD96、PVRIG、CISH或A2AR基因经过碱基编辑的自然杀伤细胞。
在一些具体实施方式中，前述碱基编辑系统包括I）融合蛋白或其变体或编码融合蛋白或其变体的核苷酸；II）引导RNA或编码引导RNA的核苷酸。
在一些具体实施方式中，所述融合蛋白或其变体的N端至C端依次连接第一nCas9片段、脱氨酶片段和第二nCas9片段。更具体的，第一nCas9片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.278所示；第二nCas9片段的氨基酸序列如SEQ ID NO. 279所示。
在一些具体实施方式中，前述第一nCas9片段与前述脱氨酶片段通过连接肽A连接；前述第二nCas9片段与前述脱氨酶片段通过连接肽A连接；更具体的，前述连接肽A的氨基酸序列如SEQ ID NO. 285所示。
在一些具体实施方式中，前述融合蛋白还包含核定位信号、尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)片段或GS肽段中的一种或多种。更具体的，所述核定位信号的氨基酸序列如SEQ IDNO.282所示；所述尿嘧啶糖基化酶抑制剂的氨基酸序列如SEQ ID NO.283；所述GS肽段SEQID NO.284如所示。
优选的，前述融合蛋白的结构为NH2-[核定位信号]-[第一nCas9片段]-[连接肽A]-[胞嘧啶脱氨酶片段]-[连接肽A]-[第二nCas9片段]-[GS肽段]-[UGI肽段]-[UGI肽段]-[核定位信号]-COOH或NH2-[核定位信号]-[第一nCas9片段]-[连接肽A]-[腺嘌呤脱氨酶片段]-[连接肽A]-[第二nCas9片段]-[GS肽段]- [核定位信号]-COOH。
进一步的，前述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 274- SEQ ID No. 275任一所示；编码前述融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No. 276- SEQ ID No. 277任一所示。
所述编码融合蛋白及其变体的核苷酸为DNA或RNA形式中的一种或多种。DNA形式为cDNA、基因组DNA、人工合成的DNA，cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA中任一单链形式的一种或多种；RNA形式为编码链或非编码链中的一种或种。
在一些具体实施方式中，前述融合蛋白及其变体直接递送至自然杀伤细胞中以编辑核苷酸的碱基；或以前述编码融合蛋白及其变体的核苷酸的RNA形式递送，其在递送进入宿主细胞之后被翻译成所述融合蛋白或其变体以编辑核苷酸的碱基；或以包含前述编码融合蛋白及其变体的核苷酸的DNA形式的表达载体递送，所述表达载体包含编码一个或多个基因以表达融合蛋白及其变体的DNA形式的核苷酸序列，其在递送进入宿主细胞之后被转录、翻译成所述融合蛋白或其变体以编辑核苷酸的碱基。
在一些具体实施方式中，前述编码融合蛋白及其变体的核苷酸序列为只编码融合蛋白及其变体的核苷酸序列、编码融合蛋白及其变体和各种附加的核苷酸序列或编码融合蛋白及其变体的核苷酸序列和非编码序列的核苷酸序列的一种或多种；前述RNA或编码引导RNA的核苷酸的核苷酸序列为只编码引导RNA或编码引导RNA的核苷酸的核苷酸序列、编码引导RNA或编码引导RNA的核苷酸和各种附加的核苷酸序列、编码引导RNA或编码引导RNA的核苷酸和非编码序列的核苷酸序列的一种或多种。
在一些具体实施方式中，前述碱基编辑系统为表达载体。所述表达载体为一个或多个。前述表达载体包含第一调控元件和第二调控元件，所述第一调控元件含有前述编码融合蛋白或其变体的核苷酸序列；所述第二调控元件含有前述编码引导RNA或编码引导RNA的核苷酸的核苷酸序列。前述第一调控元件和第二调控元件位于相同或不同的表达载体上。表达载体中第一调控元件和第二调控元件为一个或多个。
前述第一调控元件调控前述编码融合蛋白及其变体的核苷酸序列的转录。所述第一调控元件中编码融合蛋白及其变体的核苷酸序列为一个或多个。所述第二调控元件调控前述编码引导RNA或编码引导RNA的核苷酸的核苷酸序列的转录。所述第二调控元件中编码引导核苷酸序列的核苷酸序列为一个或多个。
在一些具体实施方式中，前述融合蛋白的变体为前述融合蛋白的片段、衍生物和类似物，其为一个或多个保守或非保守性氨基酸残基（优选保守性氨基酸残基）被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基为遗传密码编码或非遗传密码编码的，或在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白（如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列）。根据本发明的定义，前述片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。在一些实施方式中，所述融合蛋白的变体是指与前述融合蛋白的氨基酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性，且具有前述融合蛋白相同或相似功能的蛋白。上述75％或75％以上同一性，可为75％、80％、85％、90％或95％以上的同一性；具体地可为75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。上述90％或90％以上同一性，可为91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。所述相似功能是指保留原蛋白的75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高的功能。
在一些具体实施方式中，前述脱氨酶片段为胞嘧啶脱氨酶片段或腺嘌呤脱氨酶片段。更具体的，所述胞嘧啶脱氨酶选自APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H、APOBEC4、激活诱导的脱氨酶(AID)或pmCDA1中的一种或多种；所述腺嘌呤脱氨酶选自野生型ectadA或突变型ectadA*的一种或多种。
优选的，所述胞嘧啶脱氨酶为APOBEC3A；所述腺嘌呤脱氨酶为ectadA- ectadA*复合体。
在一些具体实施方式中，前述引导核苷酸的靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO .1-SEQ ID NO .91任一所示；前述引导核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO .92 -SEQ ID NO.182任一所示。更具体的，融合蛋白及其变体中脱氨酶为APOBEC3A时，所述引导核苷酸的靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO .1- SEQ ID NO .84任一所示；所述引导核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.92- SEQ ID NO.175任一所示。融合蛋白及其变体中脱氨酶为ectadA-ectadA*时，所述引导核苷酸的靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO.85- SEQ ID NO.91任一所示；所述引导核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.176- SEQ ID NO.182任一所示。
在一些具体实施方式中，针对NKG2A基因的引导核苷酸的靶点的核苷酸序列如SEQID NO .1- SEQ ID NO .6, SEQ ID NO .68- SEQ ID NO .69，SEQ ID NO .85所示；针对NKG2A基因的引导核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO .92- SEQ ID NO .97, SEQ ID NO.159- SEQ ID NO .160，SEQ ID NO .176所示。
在一些具体实施方式中，针对CD96基因基因的引导核苷酸的靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO .7- SEQ ID NO .21, SEQ ID NO .70- SEQ ID NO .76，SEQ ID NO .86所示；针对CD96基因基因的引导核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO .98- SEQ ID NO .112, SEQID NO .161- SEQ ID NO .167，SEQ ID NO .177所示。
在一些具体实施方式中，针对PVRIG基因的引导核苷酸的靶点的核苷酸序列如SEQID NO .43- SEQ ID NO .67, SEQ ID NO .80- SEQ ID NO .84，SEQ ID NO .91所示；针对PVRIG基因基因的引导核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO .134- SEQ ID NO .158, SEQ IDNO .171- SEQ ID NO .175，SEQ ID NO .182所示。
在一些具体实施方式中，针对CISH基因的引导核苷酸的靶点的核苷酸序列如SEQID NO .22- SEQ ID NO .29, SEQ ID NO .77- SEQ ID NO .78，SEQ ID NO .87- SEQ IDNO .88所示；针对CISH基因的引导核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO .113- SEQ ID NO.120, SEQ ID NO .77- SEQ ID NO .78，SEQ ID NO .87- SEQ ID NO .88所示。
在一些具体实施方式中，针对A2AR基因的引导核苷酸的靶点的核苷酸序列如SEQID NO .30- SEQ ID NO .42, SEQ ID NO .79，SEQ ID NO .89-- SEQ ID NO .90所示；针对A2AR基因的引导核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO .121- SEQ ID NO .133, SEQ ID NO.170，SEQ ID NO .180-SEQ ID NO .181所示。
优选的，融合蛋白为氨基酸序列如SEQ ID No. 274所示的融合蛋白时，所述引导核苷酸的靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO .1- SEQ ID NO .91任一所示；所述引导核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.92- SEQ ID NO.182任一所示。融合蛋白为氨基酸序列如SEQID No.275所示的融合蛋白时，所述引导核苷酸的靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO.85- SEQID NO.91任一所示；所述引导核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.176- SEQ ID NO.182任一所示
优选的，前述引导核苷酸的3 '端和5 '端的前2-4个核苷酸为硫代基和/或甲氧基修饰的核苷酸。
在一些具体实施方式中，前述编辑系统中引导核苷酸与融合蛋白或其变体的质量比为1: (2~20)；更具体的，所述质量比为1:（1~2）、1: (2~4)、1: (2~6)、1: (2~8)、1: (2~10)、1: (2~12)、1: (2~14)、1: (2~16)、1: (2~18) 、1: (2~20)、1：(4~6)、1: (4~8)、1: (4~10)、1: (4~12)、1: (4~14)、1: (4~16)、1: (4~18)、1: (4~20)、1: (8~10)、1: (8~12)、1:(8~14)、1: (8~16)、1: (8~18)、1: (8~20)、1: (10~12)、1: (10~14)、1: (10~16)、1: (10~18) 、1: (10~20)、1: (12~14)、1: (14~16)、1: (16~18) 或1: (18~20)中任一的一组。优选的，所述质量比为为1:(2～8)。更优选的，所述质量比为1：(2~4)。
在一些具体实施方式中，前述转入的方法选自电穿孔法、病毒转导、显微注射法、粒子轰击法或基因枪转化法中的一种或多种。更具体的，所述转入的方法为电穿孔法。
优选的，前述电穿孔法中使用的电转仪系统选自LONZA系统、Thermo的Neon转染系统或CTS 的Xenon电穿孔系统中的一种或多种。
进一步的，所述电穿孔法中使用的电转仪系统为LONZA系统、型号为4D-Nucleofector的电转仪时，电转程序选自CM137、CM158或CM189；
或电穿孔法中使用的电转仪系统为Thermo电转染系统、型号为Neon电转染仪或CTS Xenon电转染仪时，电转程序选自以下任一程序：
1）电压1650-1750v，脉冲宽度9-11ms，脉冲次数1-3；
2）电压1750-1850v，脉冲宽度9-11ms，脉冲次数1-3；
3）电压2150-2250v，脉冲宽度2-4ms，脉冲次数3-5；
4）电压1550-1650v，脉冲宽度7-9ms，脉冲次数2-4。
本发明还提供一种编辑NKG2A、CD96、PVRIG、CISH或A2AR基因的方法，所述方法为通过碱基编辑系统使NKG2A、CD96、PVRIG、CISH或A2AR基因上的碱基C突变至T，或将碱基A突变至G以编辑NKG2A、CD96、PVRIG、CISH或A2AR基因。
在一些具体实施方式中，碱基C突变至T，或碱基A突变至G选自下列的一种或多种：
1）将NKG2A基因中核苷酸序列如SEQ ID NO .1- SEQ ID NO .6, SEQ ID NO .68-SEQ ID NO .69，SEQ ID NO .85任一所示的靶点所对应碱基编辑窗口的碱基C突变至T，和/或将碱基A突变至G；
2）将CD96基因中核苷酸序列如SEQ ID NO .7- SEQ ID NO .21, SEQ ID NO .70-SEQ ID NO .76，SEQ ID NO .86任一所示的靶点所对应碱基编辑窗口的碱基C突变至T，和/或将碱基A突变至G；
3）将PVRIG基因中核苷酸序列如SEQ ID NO .43- SEQ ID NO .67, SEQ ID NO.80- SEQ ID NO .84，SEQ ID NO .91任一所示的靶点所对应碱基编辑窗口的碱基C突变至T，和/或将碱基A突变至G；
4）将CISH基因中核苷酸序列如SEQ ID NO .22- SEQ ID NO .29, SEQ ID NO.77- SEQ ID NO .78，SEQ ID NO .87- SEQ ID NO .88任一所示的靶点所对应碱基编辑窗口的碱基C突变至T，和/或将碱基A突变至G；
5）将A2AR基因中核苷酸序列如SEQ ID NO .30- SEQ ID NO .42, SEQ ID NO.79，SEQ ID NO .89-- SEQ ID NO .90任一所示的靶点所对应碱基编辑窗口的碱基C突变至T，和/或将碱基A突变至G；
更优选地，突变选自下列的一种或多种：
6）NKG2A基因上如SEQ ID NO .1- SEQ ID NO .6, SEQ ID NO .68- SEQ ID NO.69，SEQ ID NO .85任一所示的核苷酸序列突变为如SEQ ID NO .183- SEQ ID NO .188,SEQ ID NO .250- SEQ ID NO .251，SEQ ID NO .267任一所示的核苷酸序列；
7）CD96基因上如SEQ ID NO .7- SEQ ID NO .21, SEQ ID NO .70- SEQ ID NO.76，SEQ ID NO .86任一所示的核苷酸序列突变为如SEQ ID NO .189- SEQ ID NO .203,SEQ ID NO .252- SEQ ID NO .258，SEQ ID NO .268任一所示的核苷酸序列；
8）PVRIG基因上如SEQ ID NO .43- SEQ ID NO .67, SEQ ID NO .80- SEQ ID NO.84，SEQ ID NO .91任一所示的核苷酸序列突变为如SEQ ID NO .225- SEQ ID NO .249,SEQ ID NO .262- SEQ ID NO .266，SEQ ID NO .273任一所示的核苷酸序列；
9）CISH基因上如SEQ ID NO .22- SEQ ID NO .29, SEQ ID NO .77- SEQ ID NO.78，SEQ ID NO .87- SEQ ID NO .88任一所示的核苷酸序列突变为如SEQ ID NO .204-SEQ ID NO .211, SEQ ID NO .259- SEQ ID NO .260，SEQ ID NO .269- SEQ ID NO .270任一所示的核苷酸序列；
10）A2AR基因上如SEQ ID NO .30- SEQ ID NO .42, SEQ ID NO .79，SEQ ID NO.89-- SEQ ID NO .90任一所示的核苷酸序列突变为如SEQ ID NO .212- SEQ ID NO.224, SEQ ID NO .261， SEQ ID NO .271-SEQ ID NO .272任一所示的核苷酸序列。本发明还提供前述碱基编辑系统在使NKG2A、CD96、PVRIG、CISH或A2AR基因上的碱基C突变至T，或将碱基A突变至G的用途。
在一些具体实施方式，所述碱基C突变至T，或将碱基A突变至G发生在前述NKG2A、CD96、PVRIG、CISH或A2AR基因的编码核苷酸序列中；所述C突变至T，或将碱基A突变至G导致NKG2A、CD96、PVRIG、CISH或A2AR基因中的突变。
进一步的，NKG2A、CD96、PVRIG、CISH或A2AR基因的突变为功能丧失突变或非编码突变。具体的，所述功能丧失突变为在NKG2A、CD96、PVRIG、CISH或A2AR基因中引入提前终止密码子或使内含子的剪接位点突变，其导致截短或非功能性的NKG2A、CD96、PVRIG、CISH或A2AR蛋白产生；或所述非编码突变是通过使NKG2A、CD96、PVRIG、CISH或A2AR基因的起始密码子ATG突变，其导致消除NKG2A、CD96、PVRIG、CISH或A2AR基因表达。
进一步的，前述提前终止密码子为TAA，TAG，TGA或者TGA。例如，所述提前终止密码子经由编码链上的第一个C的脱氨基从CAA至TAA转化生成；所述提前终止密码子经由编码链上的第一个C的脱氨基从CAG至TAG转化生成；所述提前终止密码子经由编码链上的第一个C的脱氨基从CGA至TGA转化生成；所述提前终止密码子经由互补链上的第三个C的脱氨基从TGG至TGA转化生成；所述起始密码子突变经由互补链上的第三个C的脱氨基从ATG至ATA转化生成；所述起始密码子突变经由互补链上的第二个A的脱氨基从ATG至ACG转化生成；所述起始密码子突变经由编码链上的第一个A的脱氨基从ATG至GTG转化生成；所述内含子剪接位点突变由互补链上的C的脱氨基从CA转变成TA或TC转变为TT；所述内含子剪接位点突变由互补链上的A的脱氨基从CA转变成CG；所述内含子剪接位点突变由编码链上的A的脱氨基从AG转变成GG。
在一些具体实施方式中，NKG2A、CD96、PVRIG、CISH或A2AR基因的突变的核苷酸个数为1-91个。更具体的， 所述突变的核苷酸个数为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91个。
本发明还提供一种有效成分为前述碱基编辑系统或前述自然杀伤细胞的组合物。进一步的，所述组合物还包含药学上可接受的载体。所述可接受的载体例如无菌水或生理盐水、稳定剂、赋形剂、抗氧化剂（抗坏血酸）、缓冲剂（磷酸、枸橼酸、其它的有机酸）、防腐剂、表面活性剂（PEG、Tween）、螯合剂（EDTA）、粘合剂等。而且，也可含有低分子量的多肽；血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；甘氨酸、谷酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；多糖或单糖；甘露糖醇或山梨糖醇。当制备用于注射的水溶液时，例如生理盐水、含有葡萄糖或其它的辅助药物的等渗溶液，如D-山梨糖醇、D-甘露糖、 D-甘露糖醇、氯化钠，可并用适当的增溶剂例如醇（乙醇）、多元醇（丙二醇，PEG）、非离子表面活性剂（吐温80，HCO-50）。
本发明还提供一种包含前述碱基编辑系统、前述自然杀伤细胞或前述组合物的试剂盒。
本发明还提供前述碱基编辑系统、前述自然杀伤细胞、前述组合物或前述试剂盒的用途，所述用途选自以下一项或多项：
制备用于预防和/或治疗自身免疫疾病的药物；
制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物；
制备用于预防和/或治疗病毒感染性疾病的药物；
制备用于预防和/或治疗细菌感染性疾病的药物。
其中，所述自身免疫性疾病选自系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、银屑病关节炎、狼疮性肾炎、视神经脊髓炎、系统性硬化症、口眼干燥综合征、多发性肌炎中的一种或多种；。
其中，所述肿瘤选自肿瘤选自淋巴瘤、血液瘤或实体瘤；优选的，选自肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺癌、宫颈鳞状细胞癌、宫颈内腺癌、胆管癌、结肠腺癌、淋巴样肿瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、食管癌、多形性成胶质细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、急性髓性白血病、脑低度胶质瘤、肝细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、间皮细胞癌、卵巢癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、前列腺癌、直肠癌、恶性肉瘤、黑色素瘤、胃癌、睾丸生殖细胞肿瘤、甲状腺癌、胸腺癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、葡萄膜黑色素瘤、多发性骨髓瘤、急性淋系白血病、慢性淋系白血病、慢性髓性白血病、T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、肺癌、肛门癌、眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤中的一种或多种。优选地，所述肺癌为非小细胞肺癌。
其中，所述病毒选自流感病毒、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、疱疹病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、或埃可病毒中的一种或多种。
其中，所述细菌选自大肠杆菌、干酪乳杆菌、脆弱拟杆菌、鲁氏不动杆菌、具核梭杆菌、乔氏拟杆菌、拟南芥拟杆菌、鼠李糖乳杆菌、马赛拟杆菌、卵形拟杆菌、空肠弯曲菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、多形拟杆菌、普通拟杆菌、单形拟杆菌、粪副拟杆菌、死亡梭杆菌以及短双歧杆菌中的一种或多种。
本发明还提供一种预防和/或治疗病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的前述碱基编辑系统、前述自然杀伤细胞或前述组合物；所述病症选自以下一项或多种：自身免疫性疾病、肿瘤、病毒感染性疾病、细菌感染性疾病。
本发明中，前述碱基编辑系统、前述自然杀伤细胞或前述组合物还可以与其他药物联用。在一些实施方式中，未编辑的自然杀伤细胞细胞来自于有需要的受试者。在一些实施方式中，所述方法进一步包括，向有需要的受试者施用一种或多种细胞因子，例如包括但不限于是IL-2和/或IL-15等。与天然自然杀伤细胞细胞相比，经碱基编辑的前述自然杀伤细胞对细胞因子刺激更加敏感并表现出改善的扩增、抗肿瘤功能和抗病毒功能等。
本发明所提供的组合物或用途中，前述碱基编辑系统或前述自然杀伤细胞为单一有效成分或与其他活性组分进行组合，构成联合制剂。所述其他活性组分可以是其他各种可以用于治疗自身免疫性疾病、肿瘤、病毒感染性疾病、细菌感染性疾病的药物。组合物中活性组分的含量通常为安全有效量，所述安全有效量对于本领域技术人员来说应该是可以调整的，例如，所述活性成分的施用量通常依赖于患者的体重、应用的类型、疾病的病情和严重程度，例如，作为活性成分的所述碱基编辑系统或NK细胞的施用量通常可以为1~1000mg/kg/day、20~200mg/kg/day、1~3 mg/kg/day、3~5 mg/kg/day、5~10 mg/kg/day、10~20mg/kg/day、20~30 mg/kg/day、30~40 mg/kg/day、40~60 mg/kg/day、60~80 mg/kg/day、80~100 mg/kg/day、100~150 mg/kg/day、150~200 mg/kg/day、200~300 mg/kg/day、300~500mg/kg/day、或500~1000 mg/kg/day。
本文所用“基因递送”、“基因转移”、“转导”、“转入”等，其指代将外源性多核苷酸导入宿主细胞，如载体介导的基因转移（通过，例如，病毒感染/转染，或各种其他基于蛋白质或基于脂质的基因递送复合物）以及协助“裸”多核苷酸递送的技术（如电穿孔，“基因枪”递送以及用于导入多核苷酸的各种其他技术）。导入的多核苷酸可以稳定地或瞬时地维持在宿主细胞中。稳定维持通常需要导入的多核苷酸包含与宿主细胞相容的复制起点或者纳入到宿主细胞的复制子，诸如染色体外复制子（例如，质粒）或核或线粒体染色体。许多“载体”已知能够介导基因向哺乳动物细胞的转移，如本领域已知和本文所述。
如本文所用，所述药物组合物的剂型选自：注射剂、注射用无菌粉末、片剂、丸剂、胶囊、锭剂、醑剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂、或栓剂。本领域技术人员可根据给药方式，选择合适的制剂形式，例如，适合于口服给药的制剂形式可以是包括但不限于丸剂、片剂、咀嚼剂、胶囊剂、颗粒剂、溶液剂、滴剂、糖浆、气雾剂或粉雾剂等。
本发明所述方法和用途中，当所述活性成分与其他治疗剂联用时，所述活性成分与其他治疗剂共同给予。“共同给予”表示在同一制剂中或在两种不同制剂中经由相同或不同途径同时给予，或通过相同或不同途径顺次给予。“顺次”给予表示在两种或多种不同化合物的给药之间具有以秒、分钟、小时或天计的时间差异。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
如本文所用，同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
如本文所用，“包含”、“含有”等应理解为是包括性的意思，而没有排他性或穷尽的意思；即“包括但不限于”的意思。
如本文所用，“治疗有效量”通常指一用量在经过适当的给药期间后，能够达到治疗如上所列出的疾病的效果。
如本文所用，“治疗性”和“预防性”应理解为其最宽的意义。术语“治疗性” 不一定暗示哺乳动物接受治疗直至完全恢复。类似地，“预防性”不一定表示对象最终不会感染疾病病症。因此，治疗和预防包括缓解具体病症的症状或防止或降低具体病症产生的风险。术语“预防”可理解为降低具体病症发作的严重程度。治疗也可降低已有病症的严重程度或急性发作的频率。
如本文所用，进行治疗性或预防性治疗的对象或个体优选哺乳动物，例如但不限于人、灵长类、牲畜（如绵羊、牛、马、驴、猪）、宠物（如狗、猫）、实验室试验动物（如小鼠、家兔、大鼠、豚鼠、仓鼠）或被捕获的野生动物（如狐狸、鹿）。所述对象优选灵长类。所述对象最优选人。
如本文所用，术语“核酸”和“核酸组分”可互换使用，其指具有核碱基和酸性部分的化合物，例如核苷、核苷酸或核苷酸的聚合物。在一些实施方式中，“核酸”是指单个核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)。在一些实施方式 中，“核酸”是指包含三个或更多个核苷酸残基的寡核苷酸链。本文中所用术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用以指核苷酸的聚合物(例如，一串至少三个核苷酸)。在一些实施方式中，“核酸”包括RNA以及单链和/或双链DNA。核酸可以是天然产生的或是非天然产生的分子。
如本文所用，术语“表达”指多核苷酸转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸源自基因组DNA，则表达可包括真核细胞中mRNA的剪接。基因的表达水平可以通过测量细胞或组织样品内mRNA或蛋白质的量予以确定。
术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可以互换使用并以其最广泛的含义使用，是指两个或更多个亚基的氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物的化合物。亚基可以通过肽键连接。在另一方面中，亚基可以通过其他键连接，例如，酯、醚等。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对构成蛋白质或肽序列的最大氨基酸数没有限制。已知蛋白质和肽具有C-末端和N-末端，所述C-末端指代在该末端氨基酸上存在未结合羧基的末端，所述N-末端指代在该末端氨基酸上存在未结合氨基的末端。本文所用术语“氨基酸”指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸，以及D和L光学异构体，氨基酸类似物和肽模拟物。术语“融合”在蛋白质或多肽上下文中是指两个或更多个蛋白质或多肽（或其结构域）末端之间形成融合蛋白的连接。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
1.原代NK细胞的扩增和培养
从液氮中取出冻存的人外周血单个核细胞（PBMC），于37℃水浴迅速融化。
在一个新的15mL离心管中加入9mL含有10% FBS的RPMI-1640完全培养基，将1mLPBMC悬液转移至15mL离心管中，取出20μL计数,剩余细胞进行离心。
室温250×g离心5min。
弃去上清液，使用1mL RPMI-1640培养基重悬细胞。
在一个新的75mL 细胞培养瓶中加入19mL RPMI-1640培养液基将上述细胞悬液转移至培养瓶中。
向培养瓶中加入人重组IL-2蛋白，终浓度200U/mL。
将培养瓶置于37℃ 5% CO2细胞培养箱中，平放培养。
从液氮取出冻存的辐照EK562工程细胞，并于37℃水浴迅速融化。
在一个新的15mL离心管中加入9mL RPMI-1640完全培养基，将EK562细胞悬液转移至15mL离心管中。
室温250×g离心5min。
弃去上清液，使用1mL RPMI-1640培养基重悬细胞并进行细胞计数。
按PBMC：EK562=1：1的效靶比向培养瓶中加入EK562细胞。
将细胞置于37℃ 5% CO2培养箱中培养，每两天换一次液并进行细胞计数，将细胞密度控制在0.5至1×106个/mL范围内，根据培养液体积加入IL-2，终浓度100U/mL。
培养至第7天时，将培养瓶中细胞进行计数，此时培养瓶中NK细胞的纯度可达到95%以上。
2.sgRNA的制备
通过对NKG2A、CD96、PVRIG、CISH和A2AR基因的编码区和非编码区分析，本发明选取了可能突变成终止密码子或突变起始密码子或突变内含子剪接位点的靶序列（SEQ IDNO .1- SEQ ID NO .91）。相应的sgRNA可以通过第三方公司合成方式获得。对合成的sgRNA末端进行修饰，有助于提高编辑效率，序列如SEQ ID NO .92- SEQ ID NO .182所示，其中，每条序列在3 '端和5 '端各含有3个硫代基和3个甲氧基修饰。
其中，针对NKG2A基因的引导核苷酸的靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO .1- SEQID NO .6, SEQ ID NO .68- SEQ ID NO .69，SEQ ID NO .85所示；针对NKG2A基因的引导核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO .92- SEQ ID NO .97, SEQ ID NO .159- SEQ ID NO.160，SEQ ID NO .176所示。
针对CD96基因基因的引导核苷酸的靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO .7- SEQ IDNO .21, SEQ ID NO .70- SEQ ID NO .76，SEQ ID NO .86所示；针对CD96基因基因的引导核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO .98- SEQ ID NO .112, SEQ ID NO .161- SEQ ID NO.167，SEQ ID NO .177所示。
针对PVRIG基因的引导核苷酸的靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO .43- SEQ ID NO.67, SEQ ID NO .80- SEQ ID NO .84，SEQ ID NO .91所示；针对PVRIG基因基因的引导核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO .134- SEQ ID NO .158, SEQ ID NO .171- SEQ ID NO.175，SEQ ID NO .182所示。
针对CISH基因的引导核苷酸的靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO .22- SEQ ID NO.29, SEQ ID NO .77- SEQ ID NO .78，SEQ ID NO .87- SEQ ID NO .88所示；针对CISH基因的引导核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO .113- SEQ ID NO .120, SEQ ID NO .77-SEQ ID NO .78，SEQ ID NO .87- SEQ ID NO .88所示。
针对A2AR基因的引导核苷酸的靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO .30- SEQ ID NO.42, SEQ ID NO .79，SEQ ID NO .89-- SEQ ID NO .90所示；针对A2AR基因的引导核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO .121- SEQ ID NO .133, SEQ ID NO .170，SEQ ID NO .180-SEQ ID NO .181所示。
3.碱基编辑融合蛋白（BE蛋白）的制备和纯化
密码子优化。将所使用的胞嘧啶碱基编辑融合蛋白与腺嘌呤碱基编辑融合编辑融合蛋白蛋白进行大肠杆菌密码子优化，由金斯瑞公司合成序列，并构建入pET28a表达质粒骨架中。优化后序列如下：胞嘧啶碱基编辑融合蛋白DNA序列：SEQ ID NO .276；腺嘌呤碱基编辑融合蛋白DNA序列：SEQ ID NO .277。
质粒转化。将质粒分别转化BL21感受态，涂板，挑单克隆进行摇菌表达，准备2L培基在37℃，220rpm的摇床摇菌，待菌液OD值在0.6-0.8之间加IPTG 2mL（2M 浓度），诱导培养24小时后收菌。
收菌。将菌液高速离心：4000rpm 30min，弃上清。
破菌。用Buffer A 将离心后的菌体吹散后，加入蛋白酶抑制剂，用高压破碎机将大肠杆菌破碎。高速离心后取上清。Buffer A 配方：25mM Tris pH=8.0，500mM NaCl，10%(v/v)Glycerol，0.22 μM滤器过滤。
过柱。将破碎后的上清用0.45 μM滤膜过滤，然后加入Buffer A润洗后的钴离子亲和层析柱（Clontech，635504）对带His标签的Cas9蛋白吸附。
去杂质。用40ml 添加有5mM咪唑的Buffer A 过柱子，以去除亲和力较低的杂质。
洗脱。用30ml 添加有500mM咪唑的BufferA 过柱子，置换出目的蛋白。
浓缩。Western blot鉴定后将洗脱下来的目的蛋白加入到蛋白浓缩柱中，3900rpm，20min。
浓缩后的蛋白进行离子交换层析（Ion exchange chromatography (IEC)），以除去与蛋白结合的核酸。然后再次浓缩，分别得到氨基酸序列如SEQ ID NO .215所示的胞嘧啶碱基编辑蛋白（CBE蛋白），以及氨基酸序列如SEQ ID NO .216所示的腺嘌呤碱基编辑融合蛋白（ABE蛋白），测定浓度，分装，冻存备用。
4.电穿孔转染NK细胞
RNP混合，根据比例将sgRNA分别与BE蛋白以1：4的质量比混合，用枪头轻轻吹打混匀。
准备NK细胞。用PBS将步骤1制备的NK细胞洗一遍并离心。
电穿孔转染。
一个可选的实施方案是，采用Lonza电转仪4D-Nucleofector进行电穿孔转染，用电转液将NK细胞和RNP重悬混匀后，加入电转杯中，从候选的135个电转程序中选择合适的电转程序进行电转。电转后用枪头吸出液体放入提前预热的培养基中培养，培养7天后进行流式检测或者测序分析，从而获得编辑效率相关的数据。
一个可选实施方案是，采用Thermo电转仪进行电穿孔转染，用电转液将细胞和RNP重悬混匀后，加入电转杯中，从候选的4个电转程序中选择合适的电转程序进行电转。电转后用枪头吸出液体放入提前预热的培养基中培养，培养7天后进行流式检测或者测序分析，从而获得编辑效率相关的数据。
1.NK细胞中碱基编辑效率的检测
利用胞嘧啶碱基编辑工具敲除NKG2A、CD96、PVRIG、CISH和A2AR基因，所选用的sgRNA需要针对CAA、CAG、CGA或者TGG三联体密码子，突变成终止密码子，又或者作用于起始密码子ATG，突变成ATA。通过分析发现有67个sgRNA（SEQ ID NO .1- SEQ ID NO .67）可以突变成终止密码子，7个sgRNA（SEQ ID NO .85- SEQ ID NO .91）可以突变起始密码子，17个sgRNA（SEQ ID NO .68- SEQ ID NO .84）可以突变内含子剪接位点。
本实施例对这91组sgRNA分析其相对应的编辑效率，即分析公司合成的sgRNA（3 '端和5 '端各含有3个硫代基和3个甲氧基修饰的SEQ ID NO.92~182）的编辑效率。
利用Lonza的CM137电转程序对相应的RNP电转，其中，sgRNA与编辑融合蛋白的质量比为1: 4。电转完培养7天进行编辑效率分析。结果发现不同sgRNA的编辑效率存在较大差异，其中，编辑效率在60%-70%的sgRNA所占的比例为18.25%，编辑效率在60%-70%的sgRNA所占的比例为18.75%，编辑效率在30%-60%的sgRNA所占的比例为12.50%，编辑效率在10%-30%的sgRNA所占的比例为56.25%，而编辑效率小于10%的sgRNA所占的比例为12.50%（图1）；
再次，在所筛选的91条sgRNA中选取每个靶点中编辑效率最高的位点，而后按照进行组合，共分为20组，如图10所示组合进行电转，其中，sgRNA与编辑融合蛋白的质量比为1:4。电转完培养7天进行编辑效率分析。结果发现双靶点或三靶点同时编辑的效率和单靶点相近或略高于单靶点编辑，且20个Group之间的编辑效率没有显著差异。
再次，如图2所示由于上述20组之间的编辑没有明显差异，故选取部分组别，如Group1，Group2，Group6，Group11，Group15，Group17，并采用实时动态法检测NK细胞体外杀伤活性进行进一步筛选，主要过程为：首先使用吸取50ul poly-L-ornithine Solution（Thermo）包被96孔细胞板，于生物安全柜包被1小时；而后吸出poly-L-ornithineSolution（Thermo），于生物安全柜吹干30min；而后取出肿瘤细胞Oci-AML3和KG-1a进行计数后取出1E6个细胞，1000rpm，离心5min，弃上清。加入1.0mLPBS和1.0uLCellTrace™ 远红外细胞增殖试剂盒(Thermo),避光孵育20min，接入五倍体积培养基，避光终止反应5min，1000rpm，离心5min，弃上清。加入将细胞密度稀释为4E5/mL。最后吸出50ul至各96孔中，于生物安全柜静置。同时，取出NK计数，然后将密度稀释为4E5/mL，最后加入50ul至96孔板中。此时NK细胞：肿瘤细胞的个数比为1：1，每组做3个重复孔，另设立3个肿瘤细胞单独培养对照孔。将细胞板放在实时动态检测仪（IncuCyte S3，Sartorius）上进行拍照48小时。48小时后，实时动态检测仪检测得出细胞的细胞荧光强度图。
图3分别展示了当靶细胞为KG-1A（图3A）和Oci-AML3（图3B），且效靶比为1：1，杀伤48小时后细胞的荧光强度图，结果表明六个组合和WT-NK组相比，表现出更加优异的抗肿瘤水平，其中Group11，Group15和Group17的抗肿瘤水平要优于Group1，Group2和Group6，即三靶点组合的杀伤效果要优于双靶点组合。
最后，考虑到实验成本以及综合上述编辑效率和细胞杀伤结果，选取编号为Group11的组合，为后续实施例实验的实验组。
目前对于使用碱基编辑蛋白对某一个靶点sgRNA电转已经有比较成熟的电转方案，但是对多靶点的组合编辑仍需要进行探索。本实施例中选取实施例2中编号为Group 11（用于敲除NKG2A、CD96和PVRIG）进行电转条件优化，以进一步提高碱基编辑效率。
从液氮中取出冻存的人外周血单个核细胞（PBMC），于37℃水浴迅速融化。
在一个新的15mL离心管中加入9mL含有10% FBS的RPMI-1640完全培养基，将1mLPBMC悬液转移至15mL离心管中，取出20μL计数,剩余细胞进行离心。
室温250×g离心5min。
弃去上清液，使用1mL RPMI-1640培养基重悬细胞。
在一个新的75mL 细胞培养瓶中加入19mL RPMI-1640培养液基将上述细胞悬液转移至培养瓶中。
向培养瓶中加入人重组IL-2蛋白，终浓度200U/mL。
将培养瓶置于37℃ 5% CO2细胞培养箱中，平放培养。
从液氮取出冻存的辐照EK562工程细胞，并于37℃水浴迅速融化。
在一个新的15mL离心管中加入9mL RPMI-1640完全培养基，将EK562细胞悬液转移至15mL离心管中。
室温250×g离心5min。
弃去上清液，使用1mL RPMI-1640培养基重悬细胞并进行细胞计数。
按PBMC：EK562=1：1的效靶比向培养瓶中加入EK562细胞。
将细胞置于37℃ 5% CO2培养箱中培养，每两天换一次液并进行细胞计数，将细胞密度控制在0.5至1×106个/mL范围内，根据培养液体积加入IL-2，终浓度100U/mL。
培养至第7天时，将培养瓶中细胞进行计数。此时培养瓶中NK细胞的纯度可达到95%以上。
收集上述体外扩增的原代NK细胞，室温250×g离心5min。
弃上清，采用1×PBS缓冲液重悬细胞，室温250×g离心5min。
弃上清，采用电转仪配套电转缓冲液重悬NK细胞。
RNP混合，根据比例将实施例1制备的CBE蛋白和实施例2 制备的sgRNA以4:1的质量比混匀。
将RNP混合液加入上述准备好的NK细胞悬液中，于电转仪进行电转。
本实施例的目的是找到细胞活率与电转效率的一个最优组合，采用Lonza电转仪4D-Nucleofector进行电穿孔转染，使用CM137，CM189，CM158三个程序分别对相同的RNP电转。
电转后培养7天检测编辑效率和细胞增殖情况。图11显示3种Lonza电转程序所对应的编辑效率和细胞增殖倍数。结果发现三种电转程序的编辑效率和细胞增殖倍数均能维持较高水平，且CM137电转程序的综合效果相对更好。
同样方法，本发明采用CTS Xneon 1mL电转体系（Thermo）中的四种电转程序：1）电压1650-1750v，脉冲宽度9-11ms，脉冲次数1-3；2）电压1750-1850v，脉冲宽度9-11ms，脉冲次数1-3；3） 电压2150-2250v，脉冲宽度2-4ms，脉冲次数3-5；4）电压1550-1650v，脉冲宽度7-9ms，脉冲次数2-4。的编辑效率进行了测定，其中1）、2）、3）、4）四种电转程序分别对应的编辑效率分别是52%、67%、70%、和59%对应的细胞增殖倍数分别是154、221、237、和176。综合比较 3）电转程序在编辑效率和细胞增殖两个维度获得较为理想结果。
根据实施例2和3对电转程序及sgRNA优化的结果，选定Lonza电转仪CM137程序为优选电转程序，所用的高效sgRNA为实施例2中编号为Group 11（用于敲除NKG2A、CD96和PVRIG）。在此基础上进一步对sgRNA与碱基编辑融合蛋白的比例进行优化，以进一步提高碱基编辑效率。
1）收集实施例1步骤1经体外扩增的原代NK细胞，室温250×g离心5min。
2）弃上清，采用1×PBS缓冲液重悬细胞，室温250×g离心5min。
3）弃上清，采用电转仪配套电转缓冲液重悬NK细胞。
4）RNP混合，根据比例将实施例1步骤2制备的sgRNA和实施例1步骤3制备的CBE蛋白以1:1.2、1:2、1:2.25、1:3的摩尔质量比混匀。
5）将RNP混合液加入准备好的NK细胞悬液中，于电转仪进行电转。
6）采用Lonza电转仪进行电穿孔转染，电转程序设置为CM137。
7）电转后用枪头吸出液体放入提前预热的培养基中培养，培养7天后进行流式检测。由图4A所示，在一定范围内，编辑效率会随着sgRNA与蛋白摩尔质量比的增高而增高，且当sgRNA与蛋白摩尔质量比为1:3时，三个基因最终的编辑效率超过70%（图4B）。
1.实时动态法检测NK细胞体外杀伤活性
1)收集肿瘤细胞和NK细胞进行计数，向96孔板中加入肿瘤细胞，10000个/孔，终体积50μL。
2)收集野生型NK细胞（NK-WT）、CBE碱基编辑的NK细胞（具体序列为SEQ ID NO .2的sgRNA，用来编码基因NKG2A，作为另外一个阴性对照，标记为NK-CBES）和实施例4中sgRNA与蛋白摩尔质量比为1:3时获得的经CBE碱基编辑的NK细胞（选取实施例2中编号为Group11（用于敲除NKG2A、CD96和PVRIG）），标记为NK-CBEM，计数后分别按NK细胞：肿瘤细胞（如H1975肺癌细胞）=1:1的个数比例，向96孔板中加入50μL NK细胞。
3)每组做3个重复孔，另设立3个肿瘤细胞单独培养对照孔。
4)将细胞板放在实时动态检测仪（IncuCyte S3，Sartorius）上进行拍照48小时。
5)48小时后，实时动态检测仪检测得出细胞的荧光强度。
6)按图12的公式计算NK细胞杀伤活力：
其中，NKNK+Tumor：NK细胞与肿瘤细胞共培养组的平均发光强度；
NKTumor：肿瘤细胞单独培养组的平均发光强度。
如图5所示，野生型、CBE碱基编辑的NK细胞（NK-CBES和NK-CBEM）与肿瘤细胞共培养48小时之间，通过实时动态检测NK细胞对靶细胞的杀伤率，结果显示CBE碱基编辑的NK-CBES和NK-CBEM细胞相对于野生型NK细胞均具有更强的抗肿瘤活性（图5C），且NK-CBEM的抗肿瘤活性最强（图5A），且这种差异在肿瘤细胞与NK细胞共孵育15小时最为显著（图5B）。
2.基因编辑NK细胞抗肿瘤性的体内检测
1)选取T、B和NK细胞均缺失的重症联合免疫缺陷（SCID-bg）小鼠作为荷瘤小鼠，订购小鼠均为雄性，5周龄，小鼠饲养于SPF级动物饲养室，适应性饲养一周后向其背部接种肿瘤细胞。
2)消化并收集H1975肺癌细胞，使用无血清RPMI-1640培养液重悬细胞。
3)将H1975细胞悬液浓度调整至3×107个/mL。
4)取6周龄雄性SCID-Bg小鼠称重，置于呼吸麻醉机进行异氟烷麻醉。
5)使用剃毛器将小鼠背部右侧靠近肩胛骨处毛发剃去，皮下注射上述细胞悬液100μL。
6)接种3天后，小鼠按体重随机分为3组，每组4只，分别接种收集野生型NK细胞（NK-WT）、CBE碱基编辑的NK细胞（具体序列为SEQ ID NO .2的sgRNA，用来编码基因NKG2A，作为另外一个阴性对照，标记为NK-CBES）和实施例4中sgRNA与蛋白摩尔质量比为1:3时获得的经CBE碱基编辑的NK细胞（选取实施例2中编号为Group 11（用于敲除NKG2A、CD96和PVRIG））的3种sgRNA，标记为NK-CBEM）进行过继免疫治疗，空白对照组（Control）仅注射RPMI-1640培养液。NK细胞经尾静脉注射给予，每只小鼠注射1×107个NK细胞，每周注射1次，共治疗3次，从接种肿瘤细胞后的第3天开始第一次NK细胞注射治疗。从接种肿瘤细胞后的第3天开始测量小鼠瘤块大小，每2天测量一次，同时记录小鼠体重。
如图6和图7所示，经CBE碱基编辑（NK-CBES和NK-CBEM）治疗后，肺癌荷瘤小鼠肿瘤生长受到明显抑制，经过3次NK细胞过继免疫治疗， CBE碱基编辑（NK-CBES和NK-CBEM）组肿瘤体积较野生型（NK-WT）治疗组明显缩小，肿瘤重量明显降低，且NK-CBEM组的治疗效果更为显著，表明多靶点组合碱基编辑的NK细胞在体内均具有更强的抗肿瘤效应。
1.利用全基因组测序分析DNA脱靶
利用上述优化的LONZA的CM137电转程序，采用实施例4中sgRNA与蛋白摩尔质量比为1:3时获得的经CBE碱基编辑的NK细胞（选取实施例2中编号为Group 11（用于敲除NKG2A、CD96和PVRIG））的3种sgRNA，标记为NK-CBEM）进行培养，7天后收集编辑后的NK细胞，同时收集未编辑的野生型NK细胞。利用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（DP304）提取NK细胞基因组DNA，送北京安诺优达进行全基因组测序，测序深度在25-30x。测序的原始数据通过BWA v0.7.16比对到人的参考基因组上（GRCh38/hg38）。SNP位点通过GATKHaplotypeCaller软件进行分析，根据潜在的脱靶位点计算脱靶效率。
图8显示，通过与参考基因组与野生型NK细胞去除相关的SNP，利用碱基编辑处理后的NK细胞没有发现DNA脱靶。
2.利用转录组分析RNA脱靶
利用上述优化的Lonza的CM137电转程序，采用实施例4中sgRNA与蛋白摩尔质量比为1:3时获得的经CBE碱基编辑的NK细胞（选取实施例2中编号为Group 11（用于敲除NKG2A、CD96和PVRIG））的3种sgRNA，标记为NK-CBEM）进行培养，7天后收集编辑后的NK细胞，同时收集未编辑的野生型NK细胞。利用天根RNA Easy Fast 动物组织/细胞总RNA提取试剂盒（DP451）提取编辑NK与未编辑NK细胞总RNA，送北京安诺优化进行RNA测序（Illumina HiSeqX 10）。每个样品的读取深度约为2000万。通过STAR软件（版本2.5.1）将读段映射到人参考基因组（hg38），使用来自GENCODE v30版的注释。删除重复后，通过GATK HaplotypeCaller（版本4.1.2）识别变体，并用QD（质量按深度）过滤，所有变体均通过bam-readcount进行验证并量化，参数为-q 20 -b 30。具体结果如图9所示，利用碱基编辑系统敲除NKG2A、CD96、和PVRIGR基因的NK细胞，在全转录组水平没有检测明显的脱靶。
综上所述可见：本发明所述的碱基编辑NK细胞在体内、体外相比普通NK细胞均具有更强的抗肿瘤活性，且碱基编辑的NK细胞相对于基因编辑的NK细胞具有更好的安全性，因此本发明所述的碱基编辑NK细胞有望开发成为安全有效的抗肿瘤生物制剂，具有明显的应用前景和临床应用价值。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
Claims (24)
1.一种自然杀伤细胞，其特征在于，所述自然杀伤细胞的NKG2A基因、CD96基因或PVRIG基因中的多个经过碱基编辑以在不引入DNA双链断裂的情况下进行基因编辑；
所述自然杀伤细胞的NKG2A、CD96和PVRIG基因中3个同时经过碱基编辑；
所述碱基编辑将自然杀伤细胞中NKG2A基因、CD96基因或PVRIG基因上的至少部分碱基C突变至T，或至少部分碱基A突变至G；
所述至少部分碱基C突变至T，或将至少部分碱基A突变至G选自下列的一种或多种：
1）将NKG2A基因中核苷酸序列如SEQ ID NO .1- SEQ ID NO .6, SEQ ID NO .68- SEQID NO .69，SEQ ID NO .85任一所示的靶点所对应碱基编辑窗口的至少部分碱基C突变至T，和/或将碱基A突变至G；
2）将CD96基因中核苷酸序列如SEQ ID NO .7- SEQ ID NO .21, SEQ ID NO .70- SEQID NO .76，SEQ ID NO .86任一所示的靶点所对应碱基编辑窗口的至少部分碱基C突变至T，和/或将碱基A突变至G；
3）将PVRIG基因中核苷酸序列如SEQ ID NO .43- SEQ ID NO .67, SEQ ID NO .80-SEQ ID NO .84，SEQ ID NO .91任一所示的靶点所对应碱基编辑窗口的至少部分碱基C突变至T，和/或将碱基A突变至G；
所述突变为：
1）NKG2A基因上如SEQ ID NO .1- SEQ ID NO .6, SEQ ID NO .68- SEQ ID NO .69，SEQ ID NO .85任一所示的核苷酸序列分别突变为如SEQ ID NO .183- SEQ ID NO .188,SEQ ID NO .250- SEQ ID NO .251，SEQ ID NO .267任一所示的核苷酸序列；
2）CD96基因上如SEQ ID NO .7- SEQ ID NO .21, SEQ ID NO .70- SEQ ID NO .76，SEQ ID NO .86任一所示的核苷酸序列分别突变为如SEQ ID NO .189- SEQ ID NO .203,SEQ ID NO .252- SEQ ID NO .258，SEQ ID NO .268任一所示的核苷酸序列；
3）PVRIG基因上如SEQ ID NO .43- SEQ ID NO .67, SEQ ID NO .80- SEQ ID NO.84，SEQ ID NO .91任一所示的核苷酸序列分别突变为如SEQ ID NO .225- SEQ ID NO.249, SEQ ID NO .262- SEQ ID NO .266，SEQ ID NO .273任一所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞，其特征在于，所述自然杀伤细胞为源于外周血细胞的NK细胞、源于脐带血的NK细胞、胚胎干细胞诱导的NK细胞或诱导多能干细胞诱导的NK细胞中的一种或多种。
3.权利要求1-2任一所述的自然杀伤细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法为将碱基编辑系统通过电穿孔法导入自然杀伤细胞进行编辑，获得所述自然杀伤细胞；
所述电穿孔法中使用的电转仪系统选自LONZA系统、Thermo的Neon转染系统或GibcoCTS Xenon电转染系统中的一种或多种；
所述电穿孔法中使用的电转仪系统为LONZA系统、型号为4D-Nucleofector的电转仪时，电转程序选自CM137、CM158或CM189；
或电穿孔法中使用的电转仪系统为Thermo电转染系统、型号为Neon电转染仪或CTSXenon电转染仪时，电转程序选自以下任一程序：
电压1650-1750v，脉冲宽度9-11ms，脉冲次数1-3；
电压2150-2250v，脉冲宽度2-4ms，脉冲次数3-5；
电压1550-1650v，脉冲宽度7-9ms，脉冲次数2-4。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述碱基编辑系统包括I）融合蛋白或编码融合蛋白的核苷酸；II）引导RNA或编码引导RNA的核苷酸。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述碱基编辑系统中引导RNA或编码引导RNA的核苷酸与融合蛋白的质量比为1：1-1：20。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述质量比为1：2-1：4。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述融合蛋白的N端至C端依次连接第一nCas9片段、脱氨酶片段和第二nCas9片段。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述第一nCas9片段的氨基酸序列如SEQ ID NO. 278所示；和/或，第二nCas9片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.279所示。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述脱氨酶片段为胞嘧啶脱氨酶片段或腺嘌呤脱氨酶片段。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述胞嘧啶脱氨酶选自APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H、APOBEC4、AID或pmCDA1中的一种或多种。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述胞嘧啶脱氨酶为氨基酸序列如SEQ ID NO.280所示的APOBEC3A。
12.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述腺嘌呤脱氨酶选自野生型ectadA、突变型ectadA*或ectadA- ectadA*复合体的一种或多种。
13.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述腺嘌呤脱氨酶为氨基酸序列如SEQ ID NO.281所示的ectadA- ectadA*复合体。
14.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述融合蛋白还包含核定位信号、尿嘧啶糖基化酶抑制剂片段或GS肽段中的一种或多种。
15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述核定位信号的氨基酸序列如SEQ ID NO.282所示；和/或，尿嘧啶糖基化酶抑制剂片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.283所示；和/或，GS肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.284所示。
16.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述融合蛋白的结构为NH2-[核定位信号]-[第一nCas9片段]-[连接肽A]-[胞嘧啶脱氨酶片段]-[连接肽A]-[第二nCas9片段]-[GS肽段]-[UGI肽段]-[UGI肽段]- [核定位信号]-COOH或NH2-[核定位信号]-[第一nCas9片段]-[连接肽A]-[腺嘌呤脱氨酶片段]-[连接肽A]-[第二nCas9片段]-[GS肽段]- [核定位信号]-COOH。
17.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQID No. 274- SEQ ID No. 275任一所示；和/或，编码融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.276- SEQ ID No. 277任一所示。
18.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述引导核苷酸的核苷酸序列如SEQID NO .92-102、SEQ ID NO .134-167、SEQ ID NO .171-177或SEQ ID NO .182任一所示；和/或，所述引导核苷酸的靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO .1-21、SEQ ID NO .43-76、SEQID NO .80-86或 SEQ ID NO .91任一所示。
19.根据权利要求18所述的制备方法，其特征在于，融合蛋白中脱氨酶为APOBEC3A时，所述引导核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO .92-102、SEQ ID NO .134-167或SEQ ID NO.171-175任一所示；和/或，所述引导核苷酸的靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO .1-21、SEQID NO .43-76或SEQ ID NO .80-84任一所示。
20.根据权利要求18所述的制备方法，其特征在于，融合蛋白中脱氨酶为ectadA-ectadA*时，所述引导核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.176-177或 SEQ ID NO.182任一所示；和/或，所述引导核苷酸的靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO.85-86或 SEQ ID NO.91任一所示。
21.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述引导核苷酸的3 '端和5 '端的前2-4个核苷酸为硫代基和/或甲氧基修饰的核苷酸。
22.如权利要求1-2任一所述的自然杀伤细胞的用途，所述用途选自以下一项或多项：
制备用于预防和/或治疗自身免疫疾病的药物；
制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物；
制备用于预防和/或治疗病毒感染性疾病的药物；
制备用于预防和/或治疗细菌感染性疾病的药物。
23.根据权利要求22所述的用途，其特征在于，所述自身免疫性疾病选自系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、银屑病关节炎、狼疮性肾炎、视神经脊髓炎、系统性硬化症、口眼干燥综合征、多发性肌炎中的一种或多种；
和/或，所述肿瘤选自肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺癌、宫颈鳞状细胞癌、宫颈内腺癌、胆管癌、结肠腺癌、淋巴样肿瘤、食管癌、多形性成胶质细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、急性髓性白血病、脑低度胶质瘤、肝细胞癌、间皮细胞癌、卵巢癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、前列腺癌、直肠癌、恶性肉瘤、黑色素瘤、胃癌、睾丸生殖细胞肿瘤、甲状腺癌、胸腺癌、子宫内膜癌、慢性髓性白血病、肺癌、肛门癌、视网膜母细胞瘤中的一种或多种；
和/或，所述病毒选自流感病毒、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、疱疹病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒或埃可病毒中的一种或多种；
和/或，所述细菌选自大肠杆菌、干酪乳杆菌、脆弱拟杆菌、鲁氏不动杆菌、具核梭杆菌、乔氏拟杆菌、拟南芥拟杆菌、鼠李糖乳杆菌、马赛拟杆菌、卵形拟杆菌、空肠弯曲菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、多形拟杆菌、普通拟杆菌、单形拟杆菌、粪副拟杆菌、死亡梭杆菌以及短双歧杆菌中的一种或多种。
24.根据权利要求23所述的用途，其特征在于，所述淋巴样肿瘤选自急性淋系白血病、慢性淋系白血病、T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤；和/或，所述黑色素瘤选自葡萄膜黑色素瘤、眼内黑色素瘤；和/或，所述肺癌选自肺腺癌、肺鳞状细胞癌；和/或，所述恶性肉瘤选自子宫肉瘤。
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