CN110913870A - 遗传修饰的自然杀伤细胞 - Google Patents

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Abstract

本文提供了遗传修饰的(GM)自然杀伤(NK)细胞和产生GM NK细胞群体的方法。本文进一步提供了使用本文所述的GM NK细胞的方法，例如，用来抑制肿瘤细胞的增殖或抑制病原体感染，例如，病毒感染。在某些可选方案中，本文提供的GM NK细胞缺乏CBLB、NKG2A和/或TGFBR2的表达和/或功能或者显示出降低的CBLB、NKG2A和/或TGFBR2的表达和/或功能。在某些可选方案中，本文提供的GM NK细胞包含修饰的CD16。

Description

遗传修饰的自然杀伤细胞
任何优先申请的按引用并入
本申请要求2016年12月30日提交的美国临时专利申请No.62/440,909的优先权权益。将上述申请的全部公开内容以整体通过引用明确地并入本文。
I.技术领域
本文描述了遗传修饰(GM)的自然杀伤(NK)细胞和产生包括GM NK细胞的细胞群体的方法。还公开了使用这些包括GM NK细胞的细胞群体来例如抑制肿瘤细胞的增殖、调节病原体感染(如细菌感染或病毒感染)或抑制病原体感染(例如，细菌感染或病毒感染)的方法。在某些可选方案中，包括GM NK细胞的细胞群体缺乏CBLB、NKG2A和/或TGFBR2的表达和/或呈现出降低的CBLB、NKG2A和/或TGFBR2的表达和/或功能。在某些可选方案中，所述细胞群体包括GM NK细胞(其包含修饰的CD16)。
II.背景技术
自然杀伤(NK)细胞是构成先天免疫系统的主要成分的细胞毒性淋巴细胞。
NK细胞响应于干扰素或巨噬细胞衍生的细胞因子而激活。NK细胞的细胞毒性活性很大程度上受两种类型的表面受体调节，它们可被认为是“激活性受体”或“抑制性受体”，尽管一些受体如CD94和2B4(CD244)根据配体相互作用以任一方式发挥作用。
在其他活性中，NK细胞在肿瘤的宿主排斥中发挥作用，并显示出能够杀死病毒感染的细胞。自然杀伤细胞可以通过缺乏或显示降低水平的主要组织相容性复合体(MHC)蛋白的细胞而被激活。具有改变的或降低水平的自身I类MHC表达的癌细胞可导致NK细胞敏感性的诱导。来自外周血的激活和扩增的NK细胞以及在某些情况下LAK细胞已用于患有晚期癌症的患者的离体疗法和体内治疗，其中针对骨髓相关疾病，例如白血病；乳腺癌；和某些类型的淋巴瘤获得了一些成功。需要更多途径来研发修饰的NK细胞。
III.发明内容
本文描述了遗传修饰(GM)的自然杀伤(NK)细胞，例如，人NK细胞，产生包含GM NK细胞的细胞群体的方法和使用本文所述的GM NK细胞或包含GM NK细胞的细胞群体来例如抑制肿瘤细胞的增殖、调节病原体感染(例如，细菌感染或病毒感染)或抑制病原体感染(例如，细菌感染或病毒感染)的方法。
在一些可选方案中，提供了一种NK细胞群体，其中NK细胞经遗传修饰以使得它们缺乏NK抑制性分子的表达或呈现出降低的NK抑制性分子的表达。在一些可选方案中，NK细胞经遗传修饰以使得它们调节NK抑制性分子的表达或抑制NK抑制性分子的表达。例如，在一些可选方案中，本文提供的修饰NK细胞包括包含NK细胞的细胞群体，该NK细胞经遗传修饰以与未相对于NK抑制性分子的表达水平进行修饰的NK细胞(此类细胞在本文中称为“未修饰的细胞”，即使这些细胞可以在除NK抑制性分子表达之外的方面相对于天然产生的细胞进行修饰)相比，以较低的水平表达一种或多种NK抑制性分子。与其比较NK抑制性分子水平的未修饰细胞可以是，例如，天然产生的NK细胞或使用如本文所述的方法获得而不是天然产生的NK细胞。在某些可选方案中，以调节的、降低的或零水平表达的NK抑制性分子是CBLB、NKG2A和/或TGFBR2。
在某些可选方案中，在NK细胞中以调节的、降低的或零水平表达的NK抑制性分子是CBLB。在某些可选方案中，NK细胞中的CBLB表达已经被敲除。在某些可选方案中，通过基因编辑技术，如通过使用CRISPR或CRISPR相关技术，敲除NK细胞中的CBLB表达。在某些可选方案中，NK细胞中的CBLB表达的敲除产生了NK细胞群体或包含NK细胞的细胞群体，所述NK细胞与其中CBLB未被敲除的NK细胞(其可以是天然产生的NK细胞或经遗传修饰以降低或消除CBLB表达的非天然产生的NK细胞)相比具有更高的对抗肿瘤的细胞毒性。在具体的可选方案中，肿瘤细胞是多发性骨髓瘤细胞。在具体的可选方案中，肿瘤细胞是RPMI8226细胞。在具体的可选方案中，肿瘤细胞是U266细胞。在具体的可选方案中，肿瘤细胞是ARH77细胞。在具体的可选方案中，肿瘤细胞是急性髓性白血病(AML)细胞。在具体的可选方案中，肿瘤细胞是HL60细胞。在具体的可选方案中，肿瘤细胞是KG1细胞。在某些可选方案中，NK细胞中CBLB表达的敲除产生与其中CBLB未被敲除的未修饰的NK细胞(例如，天然产生的NK细胞)相比具有更高的IFNγ分泌的NK细胞群体。在某些可选方案中，NK细胞中CBLB表达的敲除产生与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比具有更高的脱粒的NK细胞群体。在具体的可选方案中，通过CD107a的增加来测量脱粒。在某些可选方案中，NK细胞中CBLB表达的敲除产生与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比具有GM-CSF、可溶性CD137(sCD137)、IFNγ、MIP1α、MIP1β、TNFα或穿孔素中一种或多种的分泌的变化的NK细胞群体。在某些可选方案中，NK细胞中CBLB表达的敲除产生与其中CBLB未被敲除的NK细胞(如天然产生的NK细胞)相比具有GM-CSF、可溶性CD137(sCD137)、IFNγ、MIP1α、MIP1β、TNFα或穿孔素中一种或多种的分泌的变化的NK细胞群体。
在某些可选方案中，在包含NK细胞的细胞群体中受到调节或表达降低的NK抑制性分子是NKG2A。在某些可选方案中，NKG2A表达被敲除。在某些可选方案中，通过CRISPR或CRISPR相关技术敲除NKG2A表达。在某些可选方案中，NK细胞中NKG2A表达的敲除产生包含NK细胞的细胞群体，所述NK细胞与其中NKG2A未被敲除的NK细胞(如天然产生的NK细胞)相比具有更高的对抗肿瘤细胞的细胞毒性。在具体的可选方案中，肿瘤细胞是多发性骨髓瘤细胞。在具体的可选方案中，肿瘤细胞是RPMI8226细胞。在具体的可选方案中，肿瘤细胞是U266细胞。在具体的可选方案中，肿瘤细胞是ARH77细胞。在某些可选方案中，NK细胞中NKG2A表达的敲除产生与其中NKG2A未被敲除的NK细胞相比具有更高的IFNγ分泌的NK细胞群体。在某些可选方案中，分泌的IFNγ在体外从在激动剂NKG2A抗体的存在下用ICAM-1和MICA刺激的NK细胞测量。在某些可选方案中，NK细胞中NKG2A表达的敲除产生与其中NKG2A未被敲除的NK细胞相比具有更高的脱粒的NK细胞群体。在具体的可选方案中，通过CD107a的增加来测量脱粒。在某些可选方案中，NK细胞中NKG2A表达的敲除产生与其中NKG2A未被敲除的NK细胞相比具有GM-CSF、可溶性CD137(sCD137)、IFNγ、MIP1α、MIP1β、TNFα或穿孔素中一种或多种的分泌的变化的NK细胞群体。在本文的一些可选方案中，NKG2A敲除的NK细胞与没有NKG2A敲除的未处理细胞(如天然产生的NK细胞)相比细胞毒性提高高达三倍或更多。
在某些可选方案中，在包含NK细胞的细胞群体中受到调节或表达降低的NK抑制性分子是TGFBR2。在某些可选方案中，包含NK细胞的细胞群体中的TGFBR2表达已经被敲除。在某些可选方案中，通过CRISPR或CRISPR相关技术敲除TGFBR2表达。在某些可选方案中，NK细胞中TGFBR2表达的敲除产生与其中TGFBR2未被敲除的NK细胞相比对TGFB介导的对抗肿瘤细胞的NK细胞细胞毒性的抑制具有抗性的细胞群体。在具体的可选方案中，肿瘤细胞是多发性骨髓瘤细胞。在具体的可选方案中，肿瘤细胞是RPMI8226细胞。在具体的可选方案中，肿瘤细胞是K562细胞。在具体的可选方案中，肿瘤细胞是HL-60细胞。
在某些可选方案中，提供了自然杀伤细胞群体，其中自然杀伤(NK)细胞经遗传修饰以包含修饰的CD16，例如，修饰的CD16a。在某些可选方案中，修饰的CD16与野生型CD16相比对IgG具有更高的亲和力，例如，修饰的CD16a比野生型CD16a对IgG具有更高的亲和力。在某些可选方案中，修饰的CD16在CD16a的位置158处具有缬氨酸。在某些可选方案中，修饰的CD16对ADAM17切割具有抗性。在某些可选方案中，CD16在CD16a的位置197处具有脯氨酸。在某些可选方案中，修饰的CD16具有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列(MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSV TLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSSETVNITITQGLAVPTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDUKFKWRKDPQDK；SEQ ID NO:1)。在某些可选方案中，修饰的CD16含有IgK信号肽。在某些可选方案中，修饰的CD16包含CD16信号肽。在某些可选方案中，修饰的CD16通过病毒感染引入NK细胞中。在某些可选方案中，修饰的CD16通过病毒感染引入造血细胞中，随后所述造血细胞分化成NK细胞。在某些可选方案中，修饰的CD16通过慢病毒载体引入。在某些可选方案中，慢病毒载体包含CMV或EF1α启动子。在某些可选方案中，慢病毒载体包含一个或多个药物选择标记。在某些可选方案中，修饰的CD16通过逆转录病毒载体引入。在某些可选方案中，逆转录病毒包含一个或多个药物选择标记。
本文描述了抑制肿瘤细胞增殖的方法，包括将肿瘤细胞接触一个或多个按照本文所述制备的遗传修饰的自然杀伤细胞的群体。在某些可选方案中，所述接触在体外进行。在某些可选方案中，所述接触在体内进行。在某些可选方案中，所述接触在人类个体中进行。在某些可选方案中，人类个体选择或鉴定为需要癌症治疗的个体。在某些可选方案中，所述方法包括将所述自然杀伤细胞施用于所述选择或鉴定的个体。在某些可选方案中，所述肿瘤细胞是多发性骨髓瘤细胞。在某些可选方案中，所述肿瘤细胞是急性髓性白血病(AML)细胞。在某些可选方案中，所述个体患有复发性/难治性AML。在某些可选方案中，所述个体患有至少一种针对AML的非先天性淋巴样细胞(ILC)治疗失败的AML。在某些可选方案中，所述个体是65岁或更大年龄，并且处于第一缓解期。在某些可选方案中，在施用所述自然杀伤细胞前，所述个体已经用氟达拉滨、阿糖胞苷或两者进行了调理。在某些可选方案中，所述肿瘤细胞是乳腺癌细胞、头颈癌细胞或肉瘤细胞。在某些可选方案中，所述肿瘤细胞是原发性导管癌细胞、白血病细胞、急性T细胞白血病细胞、慢性髓性淋巴瘤(CML)细胞、慢性髓细胞性白血病(CML)细胞、多发性骨髓瘤(MM)细胞、肺癌细胞、结肠腺癌细胞、组织细胞性淋巴瘤细胞、结肠直肠癌细胞、结直肠腺癌细胞和/或视网膜母细胞瘤细胞。在某些可选方案中，所述肿瘤细胞是实体肿瘤细胞。在某些可选方案中，所述肿瘤细胞是肝肿瘤细胞。在某些可选方案中，所述肿瘤细胞是肺肿瘤细胞。在某些可选方案中，所述肿瘤细胞是胰腺肿瘤细胞。在某些可选方案中，所述肿瘤细胞是肾肿瘤细胞。在某些可选方案中，所述肿瘤细胞是多形性胶质母细胞瘤(GBM)细胞。
在某些可选方案中，所述自然杀伤细胞结合抗CD33抗体施用。在某些可选方案中，所述自然杀伤细胞结合抗CD20抗体施用。在某些可选方案中，所述自然杀伤细胞结合抗CD138抗体施用。在某些可选方案中，所述自然杀伤细胞结合抗CD38抗体施用。在某些可选方案中，所述自然杀伤细胞结合抗CD32抗体施用。
在某些可选方案中，在所述接触或所述施用前，所述自然杀伤细胞经冷冻保存。在某些可选方案中，在所述接触或所述施用前，所述自然杀伤细胞未经冷冻保存。
在某些可选方案中，所述自然杀伤细胞是CD56+CD3-CD117+CD111a+，表达穿孔素和/或EOMES，并且不表达RORγt、芳基烃受体和/或IL1R1中的一种或多种。在某些可选方案中，所述自然杀伤细胞表达穿孔素和/或EOMES，并且不表达RORγt、芳基烃受体和/或IL1R1中的任何一种。在某些可选方案中，所述自然杀伤细胞另外表达T-bet、GZMB、NKp46、NKp30和/或NKG2D。在某些可选方案中，所述自然杀伤细胞表达CD94。在某些可选方案中，所述自然杀伤细胞不表达CD94。
在第一方面中，提供了自然杀伤细胞群体，其中自然杀伤(NK)细胞经遗传修饰以缺乏NK抑制性分子的表达或呈现出降低的NK抑制性分子的表达。在一些可选方案中，NK抑制性分子是选自CBLB、NKG2A和TGFBR2中的一种或多种NK抑制性分子。在一些可选方案中，遗传修饰的NK细胞与其中NK抑制性分子的表达未被敲除或降低的NK细胞相比具有更高的对抗肿瘤细胞的细胞毒性。在一些可选方案中，肿瘤细胞选自多发性骨髓瘤细胞、急性髓性白血病(AML)细胞、乳腺癌细胞、头颈癌细胞、肉瘤细胞、导管癌细胞、白血病细胞、急性T细胞白血病细胞、慢性髓性淋巴瘤细胞、慢性髓细胞性白血病(CML)细胞、多发性骨髓瘤(MM)、肺癌细胞、结肠腺癌细胞、组织细胞性淋巴瘤细胞、结肠直肠癌细胞、结直肠腺癌细胞和视网膜母细胞瘤细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是实体肿瘤细胞。在一些可选方案中，实体肿瘤细胞选自肝肿瘤细胞、肺肿瘤细胞、胰腺肿瘤细胞、肾肿瘤细胞和多形性胶质母细胞瘤(GBM)细胞。在一些可选方案中，NK抑制性分子的表达被敲除。在一些可选方案中，通过CRISPR/CAS9系统、锌指核酸酶或TALEN核酸酶敲除NK抑制性分子的表达。在一些可选方案中，通过CRISPR相关技术敲除NK抑制性分子的表达。在一些可选方案中，NK抑制性分子是CBLB。在一些可选方案中，CBLB表达的敲除产生与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比在用ICAM-1和MICA刺激时具有更高的IFNγ分泌的NK细胞群体。在一些可选方案中，CBLB表达的敲除产生与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比在用ICAM-1和MICA刺激时具有更高的脱粒的NK细胞群体。在一些可选方案中，通过CD107a的增加来测量脱粒。在一些可选方案中，CBLB表达的敲除产生与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比，在与多发性骨髓瘤细胞共培养时具有GM-CSF、可溶性CD137(sCD137)、IFNγ、MIP1α、MIP1β、TNFα和穿孔素中一种或多种的分泌的变化的NK细胞。在一些可选方案中，NK抑制性分子是NKG2A。在一些可选方案中，NKG2A表达的敲除产生与其中NKG2A未被敲除的NK细胞相比在NKG2A激动剂抗体存在下用ICAM-1和MICA刺激时具有更高脱粒的NK细胞群体。在一些可选方案中，通过CD107a的增加来测量脱粒。在一些可选方案中，NKG2A表达的敲除产生与其中NKG2A未被敲除的NK细胞相比具有GM-CSF、可溶性CD137(sCD137)、IFNγ、MIP1α、MIP1β、TNFα或穿孔素中一种或多种的分泌的变化的NK细胞群体。在一些可选方案中，NK抑制性分子是TGFBR2。在一些可选方案中，TGFBR2表达的敲除产生与其中TGFBR2未被敲除的NK细胞相比对TGFβ介导的对抗肿瘤细胞的NK细胞细胞毒性的抑制具有抗性的NK细胞群体。在一些可选方案中，自然杀伤(NK)细胞经遗传修饰以包含修饰的CD16。在一些可选方案中，修饰的CD16比野生型CD16对IgG具有更高的亲和力。在一些可选方案中，修饰的CD16在CD16a的位置158处具有缬氨酸。在一些可选方案中，修饰的CD16对ADAM17切割具有抗性。在一些可选方案中，修饰的CD16在CD16a的位置197处具有脯氨酸。在一些可选方案中，修饰的CD16含有IgK信号肽。在一些可选方案中，修饰的CD16含有CD16信号肽。在一些可选方案中，修饰的CD16通过病毒感染引入NK细胞中。在一些可选方案中，修饰的CD16通过病毒感染引入造血细胞中，随后所述造血细胞分化成NK细胞。在一些可选方案中，修饰的CD16通过慢病毒载体引入。在一些可选方案中，慢病毒载体具有CMV或EF1α启动子。在一些可选方案中，慢病毒载体包含一个或多个药物选择标记。在一些可选方案中，修饰的CD16通过逆转录病毒载体引入。在一些可选方案中，逆转录病毒载体包含一个或多个药物选择标记。在一些可选方案中，NK细胞是胎盘来源的(PNK细胞)。在一些可选方案中，自然杀伤细胞是CD56+CD3-CD117+CD111a+，表达穿孔素和/或EOMES，并且不表达RORγt、芳基烃受体和IL1R1中的一种或多种。在一些可选方案中，所述自然杀伤细胞表达穿孔素和EOMES，并且不表达RORγt、芳基烃受体或IL1R1中的任何一种。在一些可选方案中，所述自然杀伤细胞另外表达T-bet、GZMB、NKp46、NKp30和/或NKG2D。在一些可选方案中，所述自然杀伤细胞表达CD94。在一些可选方案中，所述自然杀伤细胞不表达CD94。
在第二方面中，提供了抑制肿瘤细胞增殖的方法，包括将肿瘤细胞接触来自本文的可选自然杀伤细胞群体中任一个的自然杀伤细胞。在一些可选方案中，提供了自然杀伤细胞群体，其中自然杀伤(NK)细胞经遗传修饰以缺乏NK抑制性分子的表达或呈现出降低的NK抑制性分子的表达。在一些可选方案中，NK抑制性分子是选自CBLB、NKG2A和TGFBR2的一种或多种NK抑制性分子。在一些可选方案中，遗传修饰的NK细胞与其中NK抑制性分子的表达未被敲除或降低的NK细胞相比具有更高的对抗肿瘤细胞的细胞毒性。在一些可选方案中，肿瘤细胞选自多发性骨髓瘤细胞、急性髓性白血病(AML)细胞、乳腺癌细胞、头颈癌细胞、肉瘤细胞、导管癌细胞、白血病细胞、急性T细胞白血病细胞、慢性髓性淋巴瘤细胞、慢性髓细胞性白血病(CML)细胞、多发性骨髓瘤(MM)、肺癌细胞、结肠腺癌细胞、组织细胞性淋巴瘤细胞、结肠直肠癌细胞、结直肠腺癌细胞和视网膜母细胞瘤细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是实体肿瘤细胞。在一些可选方案中，实体肿瘤细胞选自肝肿瘤细胞、肺肿瘤细胞、胰腺肿瘤细胞、肾肿瘤细胞和多形性胶质母细胞瘤(GBM)细胞。在一些可选方案中，NK抑制性分子的表达被敲除。在一些可选方案中，通过CRISPR/CAS9系统、锌指核酸酶或TALEN核酸酶敲除NK抑制性分子的表达。在一些可选方案中，通过CRISPR相关技术敲除NK抑制性分子的表达。在一些可选方案中，NK抑制性分子是CBLB。在一些可选方案中，CBLB表达的敲除产生与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比在用ICAM-1和MICA刺激时具有更高的IFNγ分泌的NK细胞群体。在一些可选方案中，CBLB表达的敲除产生与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比在用ICAM-1和MICA刺激时具有更高的脱粒的NK细胞群体。在一些可选方案中，通过CD107a的增加来测量脱粒。在一些可选方案中，CBLB表达的敲除产生与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比，在与多发性骨髓瘤细胞共培养时具有GM-CSF、可溶性CD137(sCD137)、IFNγ、MIP1α、MIP1β、TNFα和穿孔素中一种或多种的分泌的变化的NK细胞。在一些可选方案中，NK抑制性分子是NKG2A。在一些可选方案中，NKG2A表达的敲除产生与其中NKG2A未被敲除的NK细胞相比在NKG2A激动剂抗体存在下用ICAM-1和MICA刺激时具有更高脱粒的NK细胞群体。在一些可选方案中，通过CD107a的增加来测量脱粒。在一些可选方案中，NKG2A表达的敲除产生与其中NKG2A未被敲除的NK细胞相比具有GM-CSF、可溶性CD137(sCD137)、IFNγ、MIP1α、MIP1β、TNFα和/或穿孔素中一种或多种的分泌的变化的NK细胞群体。在一些可选方案中，NK抑制性分子是TGFBR2。在一些可选方案中，TGFBR2表达的敲除产生与其中TGFBR2未被敲除的NK细胞相比对TGFβ介导的对抗肿瘤细胞的NK细胞细胞毒性的抑制具有抗性的NK细胞群体。在一些可选方案中，自然杀伤(NK)细胞经遗传修饰以包含修饰的CD16。在一些可选方案中，修饰的CD16比野生型CD16对IgG具有更高的亲和力。在一些可选方案中，修饰的CD16在CD16a的位置158处具有缬氨酸。在一些可选方案中，修饰的CD16对ADAM17切割具有抗性。在一些可选方案中，修饰的CD16在CD16a的位置197处具有脯氨酸。在一些可选方案中，修饰的CD16含有IgK信号肽。在一些可选方案中，修饰的CD16含有CD16信号肽。在一些可选方案中，修饰的CD16通过病毒感染引入NK细胞中。在一些可选方案中，修饰的CD16通过病毒感染引入造血细胞中，随后所述造血细胞分化成NK细胞。在一些可选方案中，修饰的CD16通过慢病毒载体引入。在一些可选方案中，慢病毒载体具有CMV或EF1α启动子。在一些可选方案中，慢病毒载体包含一个或多个药物选择标记。在一些可选方案中，修饰的CD16通过逆转录病毒载体引入。在一些可选方案中，逆转录病毒载体包含一个或多个药物选择标记。在一些可选方案中，NK细胞是胎盘来源的(PNK细胞)。在一些可选方案中，自然杀伤细胞是CD56+CD3-CD117+CD111a+，表达穿孔素和/或EOMES，并且不表达RORγt、芳基烃受体和IL1R1中的一种或多种。在某些可选方案中，所述自然杀伤细胞表达穿孔素和EOMES，并且不表达RORγt、芳基烃受体或IL1R1中的任何一种。在某些可选方案中，所述自然杀伤细胞另外表达T-bet、GZMB、NKp46、NKp30和/或NKG2D。在一些可选方案中，所述自然杀伤细胞表达CD94。在一些可选方案中，所述自然杀伤细胞不表达CD94。在所述方法的一些可选方案中，所述接触在体外进行。在所述方法的一些可选方案中，所述接触在体内进行。在所述方法的一些可选方案中，所述接触在人类个体中进行，优选选择为接受抗癌治疗的个体。在所述方法的一些可选方案中，所述方法包括将所述自然杀伤细胞施用于所述个体。在所述方法的一些可选方案中，所述肿瘤细胞是多发性骨髓瘤细胞。在所述方法的一些可选方案中，所述肿瘤细胞是急性髓性白血病(AML)细胞。在所述方法的一些可选方案中，所述个体患有复发性/难治性AML。在所述方法的一些可选方案中，所述个体患有对于抗AML的至少一种非先天性淋巴样细胞(ILC)治疗失败的AML。在所述方法的一些可选方案中，所述个体是65岁或更大年龄，并且处于第一缓解期中。在所述方法的一些可选方案中，在施用所述自然杀伤细胞前，所述个体已经用氟达拉滨、阿糖胞苷或两者进行调理。在所述方法的一些可选方案中，肿瘤细胞选自多发性骨髓瘤细胞、急性髓性白血病(AML)细胞、乳腺癌细胞、头颈癌细胞、肉瘤细胞、导管癌细胞、白血病细胞、急性T细胞白血病细胞、慢性髓性淋巴瘤细胞、慢性髓细胞性白血病(CML)细胞、多发性骨髓瘤(MM)、肺癌细胞、结肠腺癌细胞、组织细胞性淋巴瘤细胞、结肠直肠癌细胞、结直肠腺癌细胞和视网膜母细胞瘤细胞。在所述方法的一些可选方案中，所述肿瘤细胞是实体肿瘤细胞。在所述方法的一些可选方案中，实体肿瘤细胞选自肝肿瘤细胞、肺肿瘤细胞、胰腺肿瘤细胞、肾肿瘤细胞和多形性胶质母细胞瘤(GBM)细胞。在所述方法的一些可选方案中，自然杀伤细胞与抗CD33抗体一起施用。在所述方法的一些可选方案中，自然杀伤细胞与抗CD20抗体一起施用。在所述方法的一些可选方案中，自然杀伤细胞与抗CD138抗体一起施用。在所述方法的一些可选方案中，自然杀伤细胞与抗CD38抗体一起施用。在所述方法的一些可选方案中，在所述接触或所述施用之前，所述自然杀伤细胞经冷冻保存。在所述方法的一些可选方案中，在所述接触或所述施用之前，所述自然杀伤细胞未经冷冻保存。
在第三方面中，提供了源自胎盘或其部分的自然杀伤细胞群体，由此包含胎盘来源的NK细胞(pNK细胞)，其中pNK细胞以遗传修饰，使得它们缺乏NK抑制性分子的表达或呈现出降低的NK抑制性分子的表达。在一些可选方案中，NK抑制性分子是选自CBLB、NKG2A和TGFBR2的一种或多种NK抑制性分子。在一些可选方案中，遗传修饰的NK细胞与其中NK抑制性分子的表达未被敲除或降低的NK细胞相比具有更高的对抗肿瘤细胞的细胞毒性。在一些可选方案中，肿瘤细胞选自多发性骨髓瘤细胞、急性髓性白血病(AML)细胞、乳腺癌细胞、头颈癌细胞、肉瘤细胞、导管癌细胞、白血病细胞、急性T细胞白血病细胞、慢性髓性淋巴瘤细胞、慢性髓细胞性白血病(CML)细胞、多发性骨髓瘤(MM)、肺癌细胞、结肠腺癌细胞、组织细胞性淋巴瘤细胞、结肠直肠癌细胞、结直肠腺癌细胞和视网膜母细胞瘤细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是实体肿瘤细胞。在一些可选方案中，实体肿瘤细胞选自肝肿瘤细胞、肺肿瘤细胞、胰腺肿瘤细胞、肾肿瘤细胞和多形性胶质母细胞瘤(GBM)细胞。在一些可选方案中，NK抑制性分子的表达被敲除。在一些可选方案中，通过CRISPR/CAS9系统、锌指核酸酶或TALEN核酸酶敲除NK抑制性分子的表达。在一些可选方案中，通过CRISPR相关技术敲除NK抑制性分子的表达。在一些可选方案中，NK抑制性分子是CBLB。在一些可选方案中，CBLB表达的敲除产生与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比在用ICAM-1和MICA刺激时具有更高的IFNγ分泌的NK细胞群体。在一些可选方案中，CBLB表达的敲除产生与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比在用ICAM-1和MICA刺激时具有更高的脱粒的NK细胞群体。在一些可选方案中，通过CD107a的增加来测量脱粒。在一些可选方案中，CBLB表达的敲除产生与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比，在与多发性骨髓瘤细胞共培养时具有GM-CSF、可溶性CD137(sCD137)、IFNγ、MIP1α、MIP1β、TNFα和/或穿孔素中一种或多种的分泌的变化的NK细胞群体。在一些可选方案中，NK抑制性分子是NKG2A。在一些可选方案中，NKG2A表达的敲除产生与其中NKG2A未被敲除的NK细胞相比在NKG2A激动剂抗体存在下用ICAM-1和MICA刺激时具有更高脱粒的NK细胞群体。在一些可选方案中，通过CD107a的增加来测量脱粒。在一些可选方案中，通过FACs来测量CD107a的增加。在一些可选方案中，NKG2A表达的敲除产生与其中NKG2A未被敲除的NK细胞(如天然产生的NK细胞)相比具有GM-CSF、可溶性CD137(sCD137)、IFNγ、MIP1α、MIP1β、TNFα和/或穿孔素中一种或多种的分泌的变化的NK细胞群体。
在第四方面中，一个胎盘来源的自然杀伤细胞(pNK)的群体，其中pNK细胞经遗传修饰以包含修饰的CD16。在一些可选方案中，修饰的CD16比野生型CD16对IgG具有更高的亲和力。在一些可选方案中，修饰的CD16在CD16a的位置158处具有缬氨酸。在一些可选方案中，修饰的CD16对ADAM17切割具有抗性。在一些可选方案中，修饰的CD16在CD16a的位置197处具有脯氨酸。在一些可选方案中，修饰的CD16含有IgK信号肽或CD16信号肽。在一些可选方案中，修饰的CD16通过病毒感染引入NK细胞中。在一些可选方案中，修饰的CD16通过病毒感染引入造血细胞中，随后所述造血细胞分化成NK细胞。在一些可选方案中，修饰的CD16通过慢病毒载体引入。在一些可选方案中，慢病毒载体具有CMV或EF1α启动子。在一些可选方案中，慢病毒载体包含一个或多个药物选择标记。在一些可选方案中，选择标记包括编码赋予对选择剂的抗性的蛋白的基因，如PuroR基因、ZeoR基因、HygroR基因、neoR基因和/或杀稻瘟菌素抗性基因。在一些可选方案中，修饰的CD16通过逆转录病毒载体引入。在一些可选方案中，逆转录病毒载体包含一个或多个药物选择标记。
IV.附图说明
图1A-B：GM NK细胞中的CBLB敲除效率(1A)和敲除后的倍数扩增(1B)。
图2A-C：在20:1、10:1和5:1的效应:靶(E:T)比率下，未处理(菱形)和CBLB敲除(方块)的三阶段NK细胞在三阶段过程的第34/35天对RPMI8226(2A)、U266(2B)和ARH77(2C)细胞的细胞毒性(通过杀灭百分比测量的)。
图3A-C：在20:1、10:1和5:1的效应:靶(E:T)比率下，未处理(菱形)和CBLB敲除(方块)的三阶段NK细胞在三阶段过程的第34/35天对RPMI8226(3A)、U266(3B)和ARH77(3C)细胞的相对细胞毒性。
图4A-B：未处理(NT)和CBLB-敲除(CBLB KO)的三阶段NK细胞对HL-60(4A)和KG1(4B)细胞的相对细胞毒性。
图5A-B：在1.25μg/ml的ICAM-1的存在下用不同量的I类主要组织相容性复合物(MHC)相关A链(MICA)刺激时，未处理(右)和CBLB-敲除(左)的三阶段NK细胞的IFN-γ分泌分析(5A)和CD107a/脱粒分析(5B)。
图6A-C：CBLB敲除的三阶段NK细胞与RPMI8226(6A)、U266(6B)和ARH77(6C)共孵育过程中分泌的细胞因子的水平，其表示为未处理的三阶段NK细胞的细胞因子分泌的百分比。
图7：CBLB敲除的三阶段NK过程的示意图。
图8：在第-1天或第-5天施用白消安的情况下，施用三阶段CBLB敲除NK细胞或未处理NK细胞后第7天，NOD SCIDγ(NSG)小鼠的脾、骨髓(BM)、血液、肝、肺中的人CD45+细胞数和总数。
图9：在第-1天或第-5天施用白消安的情况下，施用CBLB敲除三阶段NK细胞或未处理NK细胞后第14天，NSG小鼠的脾、BM、血液、肝、肺中的人CD45+细胞数和总数。
图10：在第-1天或第-5天施用白消安的情况下，施用CBLB敲除三阶段NK细胞或未处理NK细胞后第21天，NSG小鼠的脾、BM、血液、肝、肺中的人CD45+细胞数和总数。
图11A-D：在具有第-1天或第-5天的白消安的情况下，施用CBLB敲除或未处理的后第7、14和21天，NSG小鼠的脾(11A)、肝(11B)、骨髓(11C)和肺(11D)中的CD56+CD11a+三阶段NK细胞的百分比。
图12A-D：在具有第-1天或第-5天的白消安的情况下，施用CBLB敲除或未处理的后第7、14和21天，NSG小鼠的脾(12A)、肝(12B)、骨髓(12C)和肺(12D)中的CD56+CD16+三阶段NK细胞的百分比。
图13A-D：在具有第-1天或第-5天的白消安的情况下，施用CBLB敲除或未处理的后第7、14和21天，NSG小鼠的脾(13A)、肝(13B)、骨髓(13C)和肺(13D)中的CD56+CD158b1,b2,j+三阶段NK细胞的百分比。
图14A-B：施用后14天来自NSG小鼠的分离纯化的三阶段NK细胞，CBLB敲除或对照细胞对K562(14A)和HL60(14B)细胞的细胞毒性。对照在(14A)和(14B)中显示出较低的杀伤百分比。
图15A-D：施用后14天来自NSG小鼠的分离纯化的三阶段NK细胞，CBLB敲除(右)或对照(左)与K562细胞、HL60细胞或无细胞共孵育时的GM-CSF(15A)、IFN-γ(15B)、sCD137(15C)和TNF-α(15D)分泌。
图16A-D：施用后14天来自NSG小鼠的三阶段NK细胞，CBLB敲除(右)或对照(左)与两种AML患者异种移植(PDX)肿瘤细胞共培养时的GM-CSF(16A)、IFN-γ(16B)、sCD137(16C)和TNF-α(16D)分泌。
图17A-B：NKG2A敲除GM NK效率(17A)和敲除后的倍数扩增(17B)。
图18A-D：在不同的E:T比率下，在三阶段过程的第34/35天未处理(菱形)和NKG2A敲除(方块)的三阶段NK细胞对K562(18A)、RPMI8226(18B)、U266(18C)和ARH77(18D)细胞的细胞毒性(如通过杀灭百分比来测量的)。
图19A-C：在20:1、10:1和5:1的效应:靶(E:T)比率下，在三阶段过程的第34/35天，未处理(菱形)和NKG2A敲除(方块)的三阶段NK细胞对RPMI8226(19A)、U266(19B)和ARH77(19C)细胞的相对细胞毒性。
图20：野生型三阶段NK细胞与NKG2A抗体(方块)、NKG2A敲除的三阶段NK细胞与NKG2A抗体(三角)、野生型三阶段NK细胞与IgG(圆圈)和NKG2A敲除的三阶段NK细胞与IgG(菱形)的CD107a(板结合的)分析，全部在1.25μg/ml ICAM-1和5μg/ml MICA的存在下进行。
图21A-C：NKG2A敲除的三阶段NK细胞在与RPMI8226(21A)、U266(21B)和ARH77(21C)细胞共孵育过程中分泌的细胞因子的水平，表示为未处理三阶段NK细胞的细胞因子分泌的百分比。
图22：在第5天转染(方块)相对第10天转染(×)时，35天的三阶段NK过程中TGFBR2敲除的敲除效率。
图23A-D：测定前用20ng/mL(方块)或40ng/mL(三角形)的TGF-β1处理48小时或未处理(菱形)时，在不同的E:T比率下三阶段NK细胞相对肿瘤细胞系的细胞毒性(如通过杀灭百分比测量的)：对照NK相对K562(23A)、TGFBR2敲除相对K562(23B)、对照NK相对RPMI8226(23C)和TGFBR2敲除相对RPMI8226(23D)。
图24A-D：在不存在(上线)或存在(下线)TGF-β1的情况下对照细胞相对HL60细胞(24A)、TGFBR2敲除细胞相对HL60细胞(24B)、对照细胞相对K562细胞(24C)和TGFBR2敲除细胞相对K562细胞(24D)的四小时细胞毒性分析。
图25：对于未处理或CD16VP转导的细胞，在培养过程中三阶段NK细胞中的CD16表达的持久性。
图26A-B：未处理(上线)或用CD16VP转导(下线)的三阶段NK细胞的倍数扩增(26A)。未处理(左)或CD16VP转导(右)细胞的35天三阶段NK培养的第33天的标志物表达(26B)。
图27A-B：在针对Daudi细胞的四小时ADCC分析中，在抗CD20抗体(27A)和抗CD38抗体(27B)存在下CD16VP转导细胞的ADCC平均特异性杀灭。
图28A-C显示出在各种不同条件下四小时ADCC分析中，CD16VP转导的细胞的IFN-γ(图28A)、GM-CSF(图28B)和TNF-α(图28C)分泌。
图29：双重敲除三阶段GM NK的倍数扩增，显示了模拟转染(菱形；955.89)、TGFBR2单敲除(方块；380)、CBLB单敲除(三角形；500.175)和TGFBR2/CBLB双重敲除(×；322.69)。
图30A-B：在存在(30A)或不存在(30B)TGFβ处理的情况下，双重敲除三阶段GM NK对HL60的效应子功能。
图31A-B：在存在(31A)或不存在(31B)TGFβ处理的情况下，双重敲除三阶段GM NK对K562的效应子功能。
图32A-E：在存在或不存在TGFβ处理的情况下及在K562、HL60、RPMI或KG1细胞存在下，NK细胞的GM-CSF(32A)、sCD137(32B)、IFN-γ(32C)、TNF-α(32D)和穿孔素(32E)分泌。条从左到右表示模拟转染、TGFBR2敲除、CBLB敲除和TGFBR2/CBLB双重敲除的分泌。
图33显示了CD16转导效率。优化CD34细胞的转导，测试了各种条件。慢病毒转导在600g下在第5天以100MOI的1×转导优化以获得超过70％的中值转导效率(针对获自八个供体(#92-#99)的细胞为43-81％)。
图34显示了获自八个不同供体(#92-#99)的细胞的PNK-CD16VP扩增结果。
图35显示了获自八个不同供体(#92-#99)的细胞的扩增后PNK-CD16CP表型数据。
图36显示了获自八个不同供体(#92-#99)的细胞的PNK-CD16VP构建体验证数据。如左图中所示的，上线是对于CD16VP的数据，下线是对于PNK-NT的数据。在右图的条形图中，用于通过PMA激活的6个条的顺序为：未处理的、PMA处理的、PMA+a-TACE D1(A12)未处理的、PMA处理的和PMA+a-TACE D1(A12)。在显示了通过ADCC激活的数据的条形图中，6个条的顺序为Daudi未包被的、Daudi+IgG、Daudi+a-CD38、Daudi未包被的、Daudi+IgG和Daudi+a-CD38。
图37显示了表明获自八个不同供体(#92-#99)的细胞的PNK-CD16VP ADCC功能的数据。如所示的，PNK-CD16VP在具有CD20、CD38和CD319的情况下对Daudi的ADCC中表现出提高。
V.术语
在以下的描述中，当根据说明书阅读时，术语应当以其清楚和普通的含义给出。本领域技术人员将理解根据整个说明书使用的术语。
如本文所用，术语“免疫调节化合物”和“IMiDTM”不包括沙利度胺。
当根据说明书阅读时，“遗传修饰”具有其清楚和普通的含义，并且可以包括但不限于，例如，用已经使用基因工程技术改变的遗传物质(如核酸)修饰生物体或细胞(如细菌)、淋巴细胞(如T细胞或NK细胞)、细菌细胞、真核细胞、昆虫、植物或哺乳动物的过程。例如，可以通过首先使用分子克隆方法分离和拷贝目标遗传物质以产生DNA序列，或通过合成DNA并随后将该构建体插入宿主生物体中而将核酸(如DNA)插入宿主基因组中。使用基因编辑也可以去除或“敲除”基因和基因表达。本领域技术人员可以理解用于敲除基因的许多技术。非限制地，可以使用例如RNA干扰，CRISPR或TALEN的技术敲除基因和/或基因表达。基因靶向是一种使用同源重组来改变内源基因的不同技术，并且可用于删除基因、去除外显子、添加基因或引入点突变。
本文描述了通过转导进行的遗传修饰。当根据说明书阅读时，“转导”具有其清楚和普通的含义，并且可以包括但不限于，例如，通过载体将遗传物质(例如DNA或RNA)转移至细胞的方法。常用技术使用病毒载体、电穿孔和化学试剂来增加细胞渗透性。DNA可以通过病毒或通过病毒载体转移。如本文所述，提供了用于修饰免疫细胞(例如自然杀伤细胞)的方法。病毒载体可源自腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒和慢病毒。
已经研发了各种转导技术，其利用重组感染性病毒颗粒进行递送。这代表了目前优选的细胞转导方法。可用于转导的病毒载体可包括源自猿猴病毒40、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、慢病毒载体和逆转录病毒的病毒载体。因此，基因转移和表达方法很多，但基本上起到在哺乳动物细胞中引入和表达遗传物质的作用。几种上述技术可用于转导细胞，包括磷酸钙转染、原生质体融合、电穿孔以及用重组腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或逆转录病毒载体的感染。已经通过电穿孔和逆转录病毒或慢病毒感染成功转导了淋巴细胞。因此，逆转录病毒和慢病毒载体可以提供真核细胞中基因转移的高效方法。逆转录病毒和慢病毒载体提供了用于将基因转移到淋巴细胞(如T细胞和NK细胞)中的高效方法。此外，逆转录病毒或慢病毒整合以受控方式发生，并导致每个细胞一个或几个拷贝的新遗传信息的稳定整合。
“基因编辑”在根据说明书阅读时具有其清楚和普通的含义，并且可以包括但不限于，例如，使用核酸酶或一种或多种工程化核酸酶，在活生物体的基因组中插入、删除或替换DNA的遗传工程类型。非限制地，核酸酶可以是CRISPR/CAS9系统、锌指核酸酶或TALEN核酸酶。核酸酶可用于靶向核酸序列上的基因座或靶向的基因座。
根据说明书阅读时，“TALEN”或“转录激活因子样效应核酸酶”具有其清楚和普通的含义，并且可以包括但不限于例如可以工程化成用于切割特定DNA序列的限制酶。它们通过将TAL效应DNA结合结构域与DNA切割结构域(切割DNA链的核酸酶)融合而制成。可以将转录激活因子样效应子(TALE)工程化以实际上结合任何所需的DNA序列，因此在与核酸酶结合时，可以在特定位置切割DNA。可以将限制酶引入细胞中，用于原位基因编辑或基因组编辑中，这种技术称为使用工程化核酸酶的基因组编辑。除了锌指核酸酶和CRISPR/Cas9外，TALEN还是基因组编辑领域的重要工具。这些核酸酶可用于“敲除”基因。
根据说明书阅读时，“CRISPR”(成簇的规律间隔短回文重复序列)具有其清楚和普通的含义，并且可以包括但不限于，例如，含有碱基序列的短重复序列的原核DNA片段。每个重复序列之后是来自先前暴露于细菌病毒或质粒的短“间隔物DNA”片段。CRISPR/Cas系统是原核免疫系统，其赋予对外来遗传元件(如质粒和噬菌体)的抗性，并提供获得性免疫的一种形式。CRISPR间隔物以类似于真核生物体中的RNAi的方式识别和切割这些外源遗传元件。CRISPR/Cas系统已被用于在整个生命树的物种中的基因编辑(添加、破坏或改变特定基因的序列)和基因调节。通过将Cas9蛋白和适当的指导RNA递送到细胞中，可以在任何期望的位置切割生物体的基因组。本领域技术人员可以理解使用CRISPR来构建能够改变整个群体的基因组的RNA指导的基因编辑工具。
根据说明书阅读时，“来那度胺”具有其清楚和普通的含义，并且可以包括但不限于，例如，3-(4'-氨基异吲哚啉-1'-酮)-1-哌啶-2,6-二酮(化学文摘服务名称)或2,6-哌啶二酮,3-(4-氨基-1,3-二氢-1-氧代-2H-异吲哚-2-基)-(国际理论与应用化学联合会(IUPAC)名称)。如本文所用，“泊马度胺”是指4-氨基-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚-1,3-二酮。
根据说明书阅读时，“多能”具有其清楚和普通的含义，并且可以包括但不限于，例如，涉及细胞时，表示细胞具有分化成另一细胞类型的细胞的能力。在某些可选方案中，“多能细胞”是具有生长成哺乳动物身体的大约260种细胞类型的子集细胞的能力的细胞。与全能细胞不同，多能细胞不具有形成所有细胞类型的能力。
根据说明书阅读时，“饲养细胞”具有其清楚和普通的含义，并且可以包括但不限于，例如，与第二类型的细胞共培养以提供第二类型的细胞可在其中保持并可能增殖的环境的一种类型的细胞。不受任何理论的限制，饲养细胞可以向靶细胞提供，例如，肽、多肽、电信号、有机分子(例如，类固醇)、核酸分子、生长因子(例如，bFGF)、其它因子(例如，细胞因子)和代谢营养物质。在某些可选方案中，饲养细胞以单层生长。
根据说明书阅读时，“自然杀伤细胞”或“NK细胞”具有其清楚和普通的含义，并且可以包括但不限于，例如，来自任何组织来源的自然杀伤细胞并且还包括使用如本文所述那些的方法产生的自然杀伤细胞。
根据说明书阅读时，“胎盘灌流液”具有其清楚和普通的含义，并且可以包括但不限于，例如，已通过胎盘(例如人胎盘)的至少部分，例如通过胎盘脉管系统，且包括在流经胎盘过程中被灌注溶液收集的多个细胞的灌注溶液。
根据说明书阅读时，“胎盘灌流液细胞”具有其清楚和普通的含义，并且可以包括但不限于，例如，分离自或可分离自胎盘灌流液的有核细胞，例如总有核细胞。
根据说明书阅读时，“肿瘤细胞抑制”、“肿瘤细胞增殖抑制”等具有其清楚和普通的含义，并且可以包括但不限于，例如，减缓肿瘤细胞群体的生长，例如通过杀死所述肿瘤细胞群体中的一个或多个肿瘤细胞，例如通过使例如使用本文所述的三阶段方法产生的NK细胞或NK细胞群体接触或使其邻近肿瘤细胞群体，例如使肿瘤细胞群体与使用本文所述的三阶段方法产生的NK细胞或NK细胞群体接触。在某些可选方案中，所述接触在体外发生。在其他可选方案中，所述接触在体内发生。
根据说明书阅读时，“造血细胞”具有其清楚和普通的含义，并且可以包括但不限于，例如，造血干细胞和造血祖细胞。
“CBLB”，E3泛素连接酶(casitas B谱系淋巴瘤-b)，是T细胞激活的负向调节剂。在本文所述的一些可选方案中，提供了包含自然杀伤细胞的细胞群体，其中自然杀伤(NK)细胞经遗传修饰，使得它们缺乏NK抑制性分子的表达或呈现出降低的NK抑制性分子的表达。在一些可选方案中，NK抑制性分子是T细胞激活的负向调节剂。在一些可选方案中，NK抑制性分子是CBLB。
“NKG2A”是C型凝集素受体的一种形式，其主要在NK细胞和CD8+ T淋巴细胞的子集的表面上表达。这些受体刺激或抑制NK细胞的细胞毒性活性，因此根据它们的功能将它们分为激活性受体和抑制性受体。在本文所述的一些可选方案中，提供了包含自然杀伤细胞的细胞群体，其中自然杀伤(NK)细胞经遗传修饰，使得它们缺乏NK抑制性分子的表达或呈现出降低的NK抑制性分子的表达。在一些可选方案中，NK抑制性分子是C型凝集素受体的一种形式。在一些可选方案中，NK抑制性分子是NKG2A。在本文的一些可选方案中，NKG2A敲除的NK细胞与NKG2A未被敲除的未处理细胞(如天然产生的NK细胞)相比，细胞毒性增加高达三倍或更多。
“TGFBR2”是TGFβ受体。在本文所述的一些可选方案中，提供了包含自然杀伤细胞的细胞群体，其中自然杀伤(NK)细胞经遗传修饰，使得它们缺乏NK抑制性分子的表达或呈现出降低的NK抑制性分子的表达。在一些可选方案中，这种NK抑制性分子是TGFBR2。
“CD16”是在免疫细胞的表面上发现的低亲和力Fc受体，所述免疫细胞例如为自然杀伤细胞、嗜中性多形核白细胞、单核细胞和巨噬细胞。
“ADAM金属肽酶结构域17”(ADAM 17)，也称为TACE，是属于解整联蛋白和金属蛋白酶的ADAM蛋白家族的酶。ADAM可以涉及TNF-α的加工。在本文的一些可选方案中，提供了包含自然杀伤细胞的细胞群体，其中自然杀伤(NK)细胞经遗传修饰以包含修饰的或突变的CD16。在一些可选方案中，修饰的或突变的CD16对ADAM17切割具有抗性。
根据说明书阅读时，“药物选择标记”具有其清楚和普通的含义，并且可以包括但不限于，例如，促进接受载体并具有选择标记的宿主细胞的鉴定或选择的选择标记。非限制地，选择标记可以包括编码赋予对选择剂的抗性的蛋白质的基因，例如，PuroR基因、ZeoR基因、HygroR基因、neoR基因和/或杀稻瘟菌素抗性基因。
根据说明书阅读时，“未限定组分”具有其清楚和普通的含义，并且可以包括但不限于，例如，其成分通常未给出或定量的组分。“未限定组分”的实例包括，不限于，血清，例如，人血清(例如，人血清AB)和胎儿血清(例如，胎牛血清或小牛血清)。
如本文所用，当用于指示特定细胞标志物的存在时，“+”意指细胞标志物相对于同型对照可检测地存在于荧光激活细胞分选中；或者在定量或半定量RT-PCR中可检测地高于背景。
如本文所用，当用于指示特定细胞标志物的存在时，“-”意指细胞标志物相对于同型对照不是可检测地存在于荧光激活细胞分选中；或者在定量或半定量RT-PCR中不是可检测地高于背景。
根据说明书阅读时，“胎盘来源的NK细胞”或pNK细胞具有其清楚和普通的含义，并且可以包括源自产后胎盘和脐带的NK细胞。在pNK细胞加工前，供体适格性通过一系列测试，如血清学、细菌学和HLA分型，进行。由本领域技术人员在无菌条件下进行分离。
根据说明书阅读时，“表达的”具有其清楚和普通的含义，并且可以包括但不限于，例如，对于指示特定的细胞标志物的存在，表示使用本领域技术人员已知的检测蛋白质或核酸的存在的技术，细胞标志物可检测地存在或可检测地高于背景存在。当用于指示特定的细胞标志物的存在时，如本文使用的，“未表达的”、“缺乏表达”等表示使用本领域技术人员已知的检测蛋白质或核酸的存在的技术，细胞标志物不是可检测地存在或不是可检测地高于背景存在。
如本文使用的，“缺乏功能”、“没有功能”等在用于指示特定功能的存在时，表示使用本领域技术人员已知的检测所述功能的标准测定法，所述功能不是可检测地存在或不是高于背景可检测的。
VI.发明详述
尽管NK细胞在杀灭肿瘤细胞和病毒感染的细胞中表现出有利特性，但本领域仍然需要研发有效的方法来产生和扩增保留了杀肿瘤功能的自然杀伤细胞。
NK细胞是先天性淋巴样细胞(ILC)。先天性淋巴样细胞通过其发育依赖于转录因子ID2而相关。
本文提供了遗传修饰(GM)的自然杀伤(NK)细胞的群体、产生GM NK细胞群体的方法和使用GM NK细胞的方法。
1.具有改变的NK抑制性分子表达的GM NK细胞
在某些可选方案中，本文提供的GM NK细胞缺乏CBLB、NKG2A和/或TGFBR2表达和/或功能或者与天然产生的NK细胞或未修饰的NK细胞对照相比显示出降低的CBLB、NKG2A和/或TGFBR2表达和/或功能。CBLB、NKG2A和TGFBR2的基因序列是本领域技术人员已知的并且本文中描述了示例性序列。本领域技术人员已知的标准技术可以用于修饰本文所述的序列。
CBLB(Casitas B谱系淋巴瘤原癌基因B)是作用于RTK、CD28、CTLA4和TGFb信号途径的下游的胞内蛋白，并且维持免疫力和耐受性之间的平衡。GenBankTM登录号Q13191.2提供了示例性的人CBLB氨基酸序列。GenBankTM登录号NM_001321788.1提供了示例性的人CBLB核苷酸序列。不希望受到任何特定的机理或理论的束缚，假设敲除NK细胞中的CBLB将降低NK细胞激活阈值，从而赋予NK细胞超活性。在某些可选方案中，本文提供了缺乏CBLB表达的GM NK细胞群体。在某些可选方案中，本文提供了具有降低的CBLB表达的GM NK细胞群体。在某些可选方案中，GM NK细胞是人GM NK细胞。在某些可选方案中，本文提供了GM NK细胞群体，其中CBLB表达已经被敲除。可以使用RNA干扰、CRISPR或TALEN技术来敲除基因。在具体的可选方案中，通过CRISPR相关技术进行CBLB表达的敲除。在某些可选方案中，CBLB表达的敲除产生与没有CBLB敲除的NK细胞(例如，未修饰的NK细胞或天然产生的NK细胞)相比具有更高的对肿瘤细胞的细胞毒性的NK细胞群体。在具体的可选方案中，肿瘤细胞是多发性骨髓瘤细胞。在具体的可选方案中，肿瘤细胞是RPMI8226细胞。在具体的可选方案中，肿瘤细胞是U266细胞。在具体的可选方案中，肿瘤细胞是ARH77细胞。在某些可选方案中，CBLB表达的敲除产生与没有CBLB敲除的NK细胞(例如，天然产生的或未修饰的NK细胞)相比具有更高的IFNγ分泌的NK细胞群体。在某些可选方案中，CBLB表达的敲除产生与没有CBLB敲除的NK细胞(例如，天然产生的或未修饰的NK细胞)相比具有更高的脱粒的NK细胞群体。在具体的可选方案中，通过CD107a的增加来测量更高的脱粒。免疫反应的标志物的测量技术是本领域技术人员已知的。CD107a可以通过基于流式细胞术的方法来测量，例如，使用抗CD107a抗体。在某些可选方案中，CBLB表达的敲除导致GM-CSF、可溶性CD137(sCD137)、IFNγ、MIP1α、MIP1β、TNFα或穿孔素中一种或多种的分泌的变化，如与没有CBLB敲除的NK细胞(如天然产生的或未修饰的NK细胞)相比。在某些可选方案中，CBLB表达的敲除导致GM-CSF、可溶性CD137(sCD137)、IFNγ、MIP1α、MIP1β、TNFα或穿孔素中一种或多种的分泌浓度的变化，如与没有CBLB敲除的NK细胞(如天然产生的或未修饰的NK细胞)相比。
NKG2A是结合NK细胞中的CD94并抑制NK活性的蛋白质。GenBankTM登录号AAL65234.1提供了示例性的人NKG2A氨基酸序列。GenBankTM登录号AF461812.1提供了示例性的人NKG2A核苷酸序列。不希望受到任何特定的机理或理论的束缚，假设NKG2A缺陷的、功能上成熟的NK细胞产物的产生将提供增强的治疗活性。在某些可选方案中，本文提供了缺乏NKG2A表达的GM NK细胞群体。在某些可选方案中，GM NK细胞是人GM NK细胞。在某些可选方案中，GM NK细胞群体具有降低的NKG2A表达。在某些可选方案中，本文提供的涉及GM NK细胞群体，其中NKG2A表达已经被敲除。可以使用RNA干扰、CRISPR或TALEN的技术来敲除基因。在具体的可选方案中，通过CRISPR相关技术进行NKG2A表达的敲除。在某些可选方案中，NKG2A表达的敲除产生与没有NKG2A敲除的NK细胞(例如，未修饰的NK细胞或天然产生的NK细胞)相比具有更高的对肿瘤细胞的细胞毒性的NK细胞群体。在具体的可选方案中，肿瘤细胞是多发性骨髓瘤细胞。在具体的可选方案中，肿瘤细胞是RPMI8226细胞。在具体的可选方案中，肿瘤细胞是U266细胞。在具体的可选方案中，肿瘤细胞是ARH77细胞。在某些可选方案中，NKG2A表达的敲除产生与没有NKG2A敲除的NK细胞(例如，未修饰的NK细胞或天然产生的NK细胞)相比具有更高的IFNγ分泌的NK细胞群体。在某些可选方案中，NKG2A表达的敲除产生与没有NKG2A敲除的NK细胞(例如，未修饰的NK细胞或天然产生的NK细胞)相比具有更高的脱粒的NK细胞群体。在具体的可选方案中，通过CD107a检测的增加来测量更高的脱粒。在某些可选方案中，与没有NKG2A敲除的NK细胞(例如，未修饰的NK细胞或天然产生的NK细胞)相比，NKG2A表达的敲除导致NK细胞中的GM-CSF、sCD137、IFNγ、MIP1α、MIP1β、TNFα和/或穿孔素中一种或多种的分泌的变化。在某些可选方案中，与没有CBLB敲除的NK细胞(例如，未修饰的NK细胞或天然产生的NK细胞)相比，CBLB表达的敲除导致GM-CSF、可溶性CD137(sCD137)、IFNγ、MIP1α、MIP1β、TNFα和/或穿孔素中一种或多种的分泌浓度的变化。在本文的一些可选方案中，NKG2A敲除的NK细胞与没有NKG2A敲除的未处理细胞相比具有高达三倍或更高的细胞毒性增加。
TGF-β1是促进从NK细胞抗肿瘤免疫逃逸的有效的免疫抑制剂。TGFβ信号传导通过TGFβ2型受体2(TGFBR2或TβRII)起作用，并且控制数百个下游基因的表达。下游事件包括Smad2/3磷酸化和NK激活性受体的下调。GenBankTM登录号ABG65632.1提供了示例性的人TGFBR2氨基酸序列。GenBankTM登录号KU178360.1提供了示例性的人TGFBR2核苷酸序列。因此，不希望受到任何特定的机理或理论的束缚，假设NK细胞中的TGFBR2敲除的产生提供具有更高的效应子功能和更高的激活性受体表达的NK细胞群体。本文提供的某些可选方案包括缺乏TGFBR2表达的GM NK细胞群体。在某些可选方案中，本文提供了具有降低的TGFBR2表达的GM NK细胞群体。在某些可选方案中，本文提供了GM NK细胞群体，其中TGFBR2表达已经被敲除。可以使用RNA干扰、CRISPR或TALEN的技术来敲除基因。在某些可选方案中，GM NK细胞是人GM NK细胞。在具体的可选方案中，通过CRISPR相关技术进行TGFBR2表达的敲除。在某些可选方案中，TGFBR2表达的敲除产生与没有TGFBR2敲除的NK细胞(如未修饰的NK细胞或天然产生的NK细胞)相比具有更高的对肿瘤细胞的细胞毒性的NK细胞群体。在具体的可选方案中，肿瘤细胞是多发性骨髓瘤细胞。在具体的可选方案中，肿瘤细胞是慢性髓性白血病细胞。在具体的可选方案中，肿瘤细胞是急性髓性白血病细胞。在具体的可选方案中，肿瘤细胞是RPMI8226细胞。在具体的可选方案中，肿瘤细胞是U266细胞。在具体的可选方案中，肿瘤细胞是K562细胞。在具体的可选方案中，肿瘤细胞是HL-60细胞。在具体的可选方案中，肿瘤细胞是ARH77细胞。在某些可选方案中，TGFBR2表达的敲除产生与没有TGFBR2敲除的NK细胞相比具有更高的IFNγ分泌的NK细胞。在某些可选方案中，TGFBR2表达的敲除产生与没有TGFBR2敲除的NK细胞(例如，未修饰的NK细胞或天然产生的NK细胞)相比具有更高的脱粒的NK细胞群体。在具体的可选方案中，通过CD107a检测的增加来测量更高的脱粒。免疫反应标志物的测量技术是本领域技术人员已知的。可以通过基于流式细胞术的方法来测量CD107a，例如，使用抗CD107a抗体。在某些可选方案中，与没有TGFBR2敲除的NK细胞(例如，未修饰的NK细胞或天然产生的NK细胞)相比，TGFBR2表达的敲除导致NK细胞中GM-CSF、sCD137、IFNγ、MIP1α、MIP1β、TNFα和/或穿孔素的一种或多种的分泌的变化。在某些可选方案中，与没有CBLB敲除的NK细胞(例如，未修饰的NK细胞或天然产生的NK细胞)相比，CBLB表达的敲除导致GM-CSF、可溶性CD137(sCD137)、IFNγ、MIP1α、MIP1β、TNFα和/或穿孔素中一种或多种的分泌浓度的变化。在某些可选方案中，与没有TGFBR2敲除的NK细胞(例如，未修饰的NK细胞或天然产生的NK细胞)相比，TGFBR2表达的敲除导致降低的Smad2/3磷酸化水平。在某些可选方案中，与没有TGFBR2敲除的NK细胞(例如，未修饰的NK细胞或天然产生的NK细胞)相比，TGFBR2表达的敲除导致增加的Smad2/3磷酸化水平。在某些可选方案中，TGFBR2表达的敲除导致DNAM-1、NKG2D和/或NKp30中一种或多种的增加的表达。
2.包含修饰的CD16的GM NK细胞
CD16的基因序列是本领域技术人员已知的并且本文中描述了示例性序列。可以使用本领域技术人员已知的标准技术来修饰本文中所述的序列。
CD16(分化16簇)由两个亚型组成，Fc受体FcγRIIIa和FcγRIIIb，也分别称为CD16a和CD16b。CD16a在自然杀伤细胞上发现。CD16结合IgG抗体的Fc部分，其激活自然杀伤细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。CD16a和CD16b均含有由ADAM17靶向的切割位点。在NK细胞激活时发生通过ADAM17的CD16a的蛋白水解切割，并导致可溶性CD16释放至血浆中。GenBankTM登录号NP_000560.6提供了示例性人野生型CD16a氨基酸序列。GenBankTM登录号BC036723.1提供了示例性人野生型CD16a核苷酸序列。
在某些可选方案中，本文提供了包含修饰的CD16的GM NK细胞。在某些可选方案中，GM NK细胞是人GM NK细胞。在某些可选方案中，修饰的CD16是修饰的人CD16。在具体的可选方案中，修饰的CD16比野生型CD16具有更高的对IgG的亲和力。在更具体的可选方案中，修饰的CD16在CD16a的位置158处具有缬氨酸(Val或V)。在具体的可选方案中，修饰的CD16对ADAM17切割是抗性的。在更具体的可选方案中，CD16在CD16a的位置197处具有脯氨酸(Pro或P)(S197P突变)。在某些可选方案中，修饰的CD16比野生型CD16具有更高的对IgG的亲和力并且对ADAM17切割是抗性的。在某些可选方案中，修饰的CD16具有SEQ ID NO:1列出的氨基酸序列(MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSSETVNITITQGLAVPTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK；SEQ ID NO:1)。在某些可选方案中，CD16具有CD16a的位置158处的缬氨酸和CD16a的位置197处的脯氨酸。在某些可选方案中，修饰的CD16含有IgK信号肽。在某些可选方案中，修饰的CD16含有CD16信号肽。在某些可选方案中，将修饰的CD16通过病毒感染引入NK细胞中。在某些可选方案中，将修饰的CD16通过病毒感染引入造血细胞中，随后造血细胞分化成NK细胞。在某些可选方案中，修饰的CD16通过慢病毒载体引入。在某些可选方案中，慢病毒载体具有CMV或EF1α启动子。在某些可选方案中，慢病毒载体包含一个或多个药物选择标记。在某些可选方案中，修饰的CD16通过逆转录病毒载体引入。在某些可选方案中，逆转录病毒载体包含一个或多个药物选择标记。
在某些可选方案中，本文公开的具有修饰的CD16的GM-NK细胞与具有野生型CD16的NK细胞(如天然产生的NK细胞)相比，显示出提高的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
3.包含遗传修饰的GM NK细胞
在某些可选方案中，本文提供的GM NK细胞(1)缺乏CBLB、NKG2A和/或TGFBR2的表达和/或功能或者显示出降低的CBLB、NKG2A和/或TGFBR2的表达和/或功能，和/或(2)包含本文所述的修饰的CD16。在具体的可选方案中，本文提供的GM NK细胞缺乏CBLB和TGFBR2的表达和/或功能。
4.GM NK细胞和GM NK细胞群体的产生
在某些可选方案中，通过本发明方法产生GM NK细胞和/或GM NK细胞群体包括扩增造血细胞群体。在某些可选方案中，如本文和国际专利申请公开No.WO 2016/109661(将其全部按引用并入本文中)中所述的，在用于产生NK细胞的35天三阶段过程的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天对NK细胞进行遗传修饰。在某些可选方案中，在用于产生NK细胞的35天三阶段过程的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天，或者在上述任两个天数限定范围中的任何一天对NK细胞进行遗传修饰。在某些可选方案中，在用于产生NK细胞的35天三阶段过程的第3、5、7或9天对NK细胞进行遗传修饰。在某些可选方案中，在用于产生NK细胞的35天三阶段过程的第3、5、7或9天，或者在上述任两个天数限定范围中的任何一天对NK细胞进行遗传修饰。在某些可选方案中，在用于产生NK细胞的35天三阶段过程的第5天对NK细胞进行遗传修饰。在某些可选方案中，在用于产生NK细胞的35天三阶段过程的第3天对NK细胞进行遗传修饰。在某些可选方案中，在用于产生NK细胞的35天三阶段过程的第7天对NK细胞进行遗传修饰。在某些可选方案中，在用于产生NK细胞的35天三阶段过程的第9天对NK细胞进行遗传修饰。在某些可选方案中，遗传修饰包括如本文中所述的CBLB、NKG2A和/或TGFBR2的敲除。在某些可选方案中，遗传修饰包括如本文中所述的CBLB、NKG2A和/或TGFBR2的敲除。在某些可选方案中，遗传修饰包括如本文中所述的修饰的CD16的引入。
可以通过本领域技术人员已知的任何方法来进行通过如本文中所述的敲除的基因修饰。例如，可以通过基因编辑技术进行敲除。可以使用RNA干扰、CRISPR或TALEN的技术来敲除基因。在某些可选方案中，基因编辑技术是CRISPR相关技术。在某些可选方案中，基因编辑技术是大范围核酸酶相关技术。在某些可选方案中，基因编辑技术是锌指核酸酶(ZFN)相关技术。在某些可选方案中，基因编辑技术是基于转录激活因子样效应子的核酸酶(TALEN)相关技术。
在具体的可选方案中，CRISPR相关技术涉及CRISPR/Cas9系统。例如，为了使用CRISPR/Cas9系统来产生敲除，可以将Crispr指导RNA(gRNA)进行化学修饰并且以单指导(sgRNA)形式合成。Cas9随后可以作为具有假尿苷(Ψ)修饰的mRNA来递送。随后利用核转染(nucleofector)将sgRNA和Cas9 mRNA递送至细胞。
如本文中所述的修饰基因的引入可以通过本领域技术人员已知的任何方法来进行。例如，可以通过逆转录病毒载体引入遗传修饰的基因。在一些可选方案中，通过慢病毒载体引入遗传修饰的基因。
在细胞扩增过程中，例如，在用于产生NK细胞的三阶段方法中，造血细胞群体内的多个造血细胞分化成NK细胞。在这个过程中，所述NK细胞进行遗传修饰以使得所得到的NK细胞是GM NK细胞。在某些可选方案中，在细胞分化成NK细胞前进行遗传修饰。在某些可选方案中，在细胞分化成NK细胞之后进行遗传修饰。在某些可选方案中，对NK祖细胞进行遗传修饰。在一个方面中，本文提供了产生GM NK细胞的方法，包括通过以下方法产生NK细胞，所述方法包括在包含干细胞动员剂和血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞，例如，CD34+干细胞或祖细胞以产生第一细胞群体，随后在包含干细胞动员剂和白介素-15(IL-15)并缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群体以产生第二细胞群体，并且随后在包含IL-2和IL-15并缺乏干细胞动员剂和LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群体以产生第三细胞群体，其中所述第三细胞群体包含作为CD56+,CD3-的自然杀伤细胞，和其中至少70％，例如，至少80％，85％，90％，95％或落入上述任两个百分比限定的范围内的百分比的自然杀伤细胞是存活的。在某些可选方案中，这样的自然杀伤细胞包含是CD16-的自然杀伤细胞。在某些可选方案中，这样的自然杀伤细胞包含是CD94+的自然杀伤细胞。在某些可选方案中，这样的自然杀伤细胞包含是CD94+或CD16+的自然杀伤细胞。在某些可选方案中，这样的自然杀伤细胞包含是CD94-或CD16-的自然杀伤细胞。在某些可选方案中，这样的自然杀伤细胞包含是CD94+或CD16+的自然杀伤细胞。在某些可选方案中，这样的自然杀伤细胞包含是CD94-或CD16-的自然杀伤细胞。在某些可选方案中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些可选方案中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和/或FMS-样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体的可选方案中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和/或MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和/或Flt3L。在某些可选方案中，第一培养基、第二培养基或第三培养基中没有一个包含肝素，例如，低分子量肝素。
在一个方面中，本文提供了一种产生GM NK细胞的方法，包括通过包括以下的方法产生NK细胞：(a)在包含干细胞动员剂和血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群体；(b)在包含干细胞动员剂和白介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养第一细胞群体以产生第二细胞群体；和(c)在包含IL-2和IL-15并且缺乏LMWH的第三培养基中培养第二细胞群体以产生第三细胞群体；其中第三细胞群体包含是CD56+、CD3-和CD11a+的自然杀伤细胞。在某些可选方案中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些可选方案中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和/或FMS样酪氨酸激酶3配体(Tlt-3L)。在具体的可选方案中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和/或MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和/或Flt3L。在某些可选方案中，第一培养基、第二培养基或第三培养基中没有一个包含肝素，例如，低分子量肝素。
在一个方面中，本文提供了产生GM NK细胞的方法，包括通过包括以下的方法产生NK细胞：(a)在包含干细胞动员剂和血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群体；(b)在包含干细胞动员剂和白介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养第一细胞群体以产生第二细胞群体；和(c)在包含IL-2和IL-15并且缺乏干细胞因子(SCF)和LMWH中每一种的第三培养基中培养第二细胞群体以产生第三细胞群体；其中第三细胞群体包含是CD56+、CD3-和CD11a+的自然杀伤细胞。在某些可选方案中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些可选方案中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和/或FMS-样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体的可选方案中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和/或MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和/或Flt3L。在某些可选方案中，第一培养基、第二培养基或第三培养基中没有一个包含肝素，例如，低分子量肝素。
在一个方面中，本文提供了产生GM NK细胞的方法，包括通过包括以下的方法产生NK细胞：(a)在包含干细胞动员剂和血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群体；(b)在包含干细胞动员剂和白介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养第一细胞群体以产生第二细胞群体；和(c)在包含IL-2和IL-15并且缺乏SCF、干细胞动员剂和LMWH中每一种的第三培养基中培养第二细胞群体以产生第三细胞群体；其中第三细胞群体包含是CD56+、CD3-和CD11a+的自然杀伤细胞。在某些可选方案中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些可选方案中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和/或FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt-3L)。在具体的可选方案中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和/或MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和/或Flt3L。在某些可选方案中，第一培养基、第二培养基或第三培养基中没有一个包含肝素，例如，低分子量肝素。
在一个方面中，本文提供了产生GM NK细胞的方法，包括通过包括以下的方法产生NK细胞：(a)在包含干细胞动员剂和血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群体；(b)在包含干细胞动员剂和白介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养第一细胞群体以产生第二细胞群体；(c)在包含IL-2和IL-15并且缺乏干细胞动员剂和LMWH中每一种的第三培养基中培养第二细胞群体以产生第三细胞群体；和(d)从第三细胞群体分离CD11a+细胞以产生第四细胞群体；其中第四细胞群体包含是CD56+、CD3-和CD11a+的自然杀伤细胞。在某些可选方案中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些可选方案中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和/或FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt-3L)。在具体的可选方案中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和/或MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和/或Flt3L。在某些可选方案中，第一培养基、第二培养基或第三培养基中没有一个包含肝素，例如，低分子量肝素。
在以上可选方案的任一个的某些可选方案中，所述自然杀伤细胞表达穿孔素和/或EOMES。在某些可选方案中，所述自然杀伤细胞不表达RORγt和/或IL1R1。
本文所述的GM NK细胞可以从任何类型的NK细胞产生，或通过用于产生NK细胞的任何生产方法产生。可以使用本文所述的方法来分离或产生本文所述的GM NK细胞。在某些可选方案中，使用本文的方法产生的NK细胞在产生后进行修饰以产生GM NK细胞。在某些可选方案中，使用本文的方法产生的NK细胞在产生期间修饰以产生GM NK细胞。在某些可选方案中，为产生GM NK细胞，使用本文的方法产生的NK细胞在产生前进行修饰。本文的GM NK细胞是指对其直接进行遗传修饰的细胞，或指这样的包含遗传修饰的细胞的任何后代。在某些可选方案中，通过三阶段方法，例如，国际专利公开No.WO2016/109661(将其整体按引用并入本文中)中所述的三阶段方法，产生本文提供的GM NK细胞。在某些可选方案中，从胎盘NK细胞，例如，如美国专利No.8,263,065、美国专利申请公开No.2011/0280849和/或美国专利申请公开No.2015/0366910(将每篇整体按引用并入本文中)中所述的胎盘NK细胞，产生本文提供的GM NK细胞。在某些可选方案中，通过美国专利No.8,926,964和/或美国公开No.2015/0225697中所述的两步或三步法来产生本文提供的GM NK细胞，将上述每篇整体按引用并入本文中。在某些可选方案中，通过国际专利公开No.WO 2016/109668(将其整体按引用并入本文中)中所述的任何方法来产生本文提供的GM NK细胞。
a.6.4.1使用三阶段方法产生GM NK细胞群体
在一个可选方案中，通过三阶段方法，例如，国际专利公开No.WO 2016/109661中(将其整体按引用并入本文中)所述的三阶段方法，产生本文提供的GM NK细胞。在某些可选方案中，遗传修饰在第一、第二和/或第三阶段期间引入NK细胞中。在某些可选方案中，遗传修饰在第一和第二阶段期间引入NK细胞中。在某些可选方案中，遗传修饰在第一和第三阶段期间引入NK细胞中。在某些可选方案中，遗传修饰在第二和第三阶段期间引入NK细胞中。在某些可选方案中，遗传修饰在第一阶段期间引入NK细胞中。在某些可选方案中，遗传修饰在第二阶段期间引入NK细胞中。在某些可选方案中，遗传修饰在第三阶段期间引入NK细胞中。
在某些可选方案中，三阶段方法包括第一阶段(“阶段1”)，其包括在第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞(例如，CD34+干细胞或祖细胞)指定时间段(例如如本文所述的)以产生第一细胞群体。在某些可选方案中，第一培养基包含干细胞动员剂和血小板生成素(Tpo)。在某些可选方案中，除了干细胞动员剂和Tpo之外，第一培养基还包含LMWH、Flt-3L、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的一种或多种。在一个具体的可选方案中，除了干细胞动员剂和Tpo之外，第一培养基包含LMWH、Flt-3L、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一种。在具体可选方案中，第一培养基缺乏添加的LMWH。在具体的可选方案中，第一培养基缺乏添加的脱硫酸糖胺聚糖。在具体的可选方案中，第一培养基缺乏LMWH。在具体的可选方案中，第一培养基缺乏脱硫酸糖胺聚糖。在具体的可选方案中，除了干细胞动员剂和Tpo之外，第一培养基还包含Flt-3L、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一种。在具体的可选方案中，第一培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)、巨噬细胞抑制蛋白-1α(MIP-1α)或两者。
在某些可选方案中，随后在“阶段2”中，将所述细胞在第二培养基中培养指定时间段(例如，如本文所述)以产生第二细胞群体。在某些可选方案中，第二培养基包含干细胞动员剂和白介素-15(IL-15)，且缺乏Tpo。在某些可选方案中，除了干细胞动员剂和IL-15之外，第二培养基还包含LMWH、Flt-3、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和/或GM-CSF中的一种或多种。在某些可选方案中，除了干细胞动员剂和IL-15之外，第二培养基还包含LMWH、Flt-3、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和/或GM-CSF中的每一种。在具体可选方案中，第二培养基缺乏添加的LMWH。在具体的可选方案中，第二培养基缺乏添加的脱硫酸糖胺聚糖。在具体的可选方案中，第二培养基缺乏肝素，例如LMWH。在具体的可选方案中，第二培养基缺乏脱硫酸糖胺聚糖。在某些可选方案中，除了干细胞动员剂和IL-15之外，第二培养基还包含Flt-3、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和/或GM-CSF中的每一种。在具体的可选方案中，第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)、巨噬细胞抑制蛋白-1α(MIP-1α)或两者。
在某些可选方案中，随后在“阶段3”中，所述细胞在第三培养基中培养指定的时间段(例如如本文所述的)以产生第三细胞群体，例如，自然杀伤细胞。在某些可选方案中，第三培养基包含IL-2和/或IL-15，且缺乏干细胞动员剂和/或LMWH。在某些可选方案中，除了IL-2和IL-15之外，第三培养基还包含SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和/或GM-CSF中的一种或多种。在某些可选方案中，除了IL-2和IL-15之外，第三培养基还包含SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和/或GM-CSF中的每一种。在具体的可选方案中，第一培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L中的一种、两种或全部三种。在具体的可选方案中，第三培养基缺乏添加的脱硫酸糖胺聚糖。在具体的可选方案中，第三培养基缺乏脱硫酸糖胺聚糖。在具体的可选方案中，第三培养基缺乏肝素，例如LMWH。
在具体的可选方案中，使用三阶段方法来产生NK细胞群体。在某些可选方案中，三阶段方法在不存在基质饲养细胞支持的情况下进行。在某些可选方案中，三阶段方法在不存在外源添加的类固醇(例如，可的松、氢化可的松或其衍生物)的情况下进行。
在某些方面，该三阶段方法产生包含至少20％的CD56+CD3-自然杀伤细胞的自然杀伤细胞。在某些方面，该三阶段方法产生包含至少40％的CD56+CD3-自然杀伤细胞的自然杀伤细胞。在某些方面，该三阶段方法产生包含至少60％的CD56+CD3-自然杀伤细胞的自然杀伤细胞。在某些方面，该三阶段方法产生包含至少70％的CD56+CD3-自然杀伤细胞的自然杀伤细胞。在某些方面，该三阶段方法产生包含至少80％的CD56+CD3-自然杀伤细胞的自然杀伤细胞。在某些方面，该三阶段方法产生包含至少20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的CD56+CD3-自然杀伤细胞或上述任两个百分比限定的范围中的百分比的自然杀伤细胞。
在某些方面，本文公开的三阶段方法产生包含至少20％的CD56+CD3-CD11a+自然杀伤细胞的自然杀伤细胞。在某些方面，本文公开的三阶段方法产生包含至少40％的CD56+CD3-CD11a+自然杀伤细胞的自然杀伤细胞。在某些方面，本文公开的三阶段方法产生包含至少60％的CD56+CD3-CD11a+自然杀伤细胞的自然杀伤细胞。在某些方面，本文公开的三阶段方法产生包含至少80％的CD56+CD3-CD11a+自然杀伤细胞的自然杀伤细胞。在某些方面，该三阶段方法产生包含至少20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的CD56+CD3-CD11a+自然杀伤细胞或上述任两个百分比限定的范围中的百分比的自然杀伤细胞。
在某些方面，该三阶段方法产生的自然杀伤细胞在所述自然杀伤细胞和K562细胞在体外以10：1的比率共培养时，表现出对所述K562细胞的至少20％的细胞毒性。在某些方面，该三阶段方法产生的自然杀伤细胞在所述自然杀伤细胞和K562细胞在体外以10：1的比率共培养时，表现出对所述K562细胞的至少35％的细胞毒性。在某些方面，该三阶段方法产生的自然杀伤细胞在所述自然杀伤细胞和K562细胞在体外以10：1的比率共培养时，表现出对所述K562细胞的至少45％的细胞毒性。在某些方面，该三阶段方法产生的自然杀伤细胞在所述自然杀伤细胞和K562细胞在体外以10：1的比率共培养时，表现出对所述K562细胞的至少60％的细胞毒性。在某些方面，该三阶段方法产生的自然杀伤细胞在所述自然杀伤细胞和K562细胞在体外以10：1的比率共培养时，表现出对所述K562细胞的至少75％的细胞毒性。在某些方面，该三阶段方法产生的自然杀伤细胞在所述自然杀伤细胞和K562细胞在体外以10：1的比率共培养时，表现出对所述K562细胞的至少35％、45％、55％、65％或75％或者上述任两个百分比限定的范围中的百分比的细胞毒性。
在某些方面，在所述第三培养步骤之后，所述第三细胞群体(例如，所述GM NK细胞群体)冷冻保存。在某些方面，在所述第四步骤之后，所述第四细胞群体(例如，所述GM NK细胞群体)冷冻保存。
在某些方面，本文提供了包含自然杀伤细胞(即通过本文所述的三阶段方法产生的自然杀伤细胞)的细胞群体。因此，本文提供了通过本文描述的三阶段方法产生的分离的自然杀伤细胞群体。在具体的可选方案中，所述自然杀伤细胞群体包含至少20％的CD56+CD3-自然杀伤细胞。在具体的可选方案中，所述自然杀伤细胞群体包含至少40％的CD56+CD3-自然杀伤细胞。在具体的可选方案中，所述自然杀伤细胞群体包含至少60％的CD56+CD3-自然杀伤细胞。在具体的可选方案中，所述自然杀伤细胞群体包含至少80％的CD56+CD3-自然杀伤细胞。在具体的可选方案中，所述自然杀伤细胞群体包含至少60％的CD16-细胞。在具体的可选方案中，所述自然杀伤细胞群体包含至少80％的CD16-细胞。在具体的可选方案中，所述自然杀伤细胞群体包含至少20％、40％、60％或80％或者上述任两个百分比限定的范围中的百分比的CD56+CD3-细胞。在具体的可选方案中，所述自然杀伤细胞群体包含至少20％的CD94+细胞。在具体的可选方案中，所述自然杀伤细胞群体包含至少40％的CD94+细胞。
在某些方面，本文提供了为CD56+CD3-CD117+CD11a+的自然杀伤细胞群体，其中所述自然杀伤细胞表达穿孔素和/或EOMES，且不表达RORγt、芳基烃受体(AHR)和IL1R1中的一种或多种。在某些方面，所述自然杀伤细胞表达穿孔素和EOMES，且不表达RORγt、芳基烃受体或IL1R1中的任一种。在某些方面，所述自然杀伤细胞另外表达T-bet、GZMB、NKp46、NKp30和/或NKG2D。在某些方面，所述自然杀伤细胞表达CD94。在某些方面，所述自然杀伤细胞不表达CD94。
在某些方面，本文提供了产生包含GM NK细胞的细胞群体的方法，其包括(a)在包含干细胞动员剂和血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群体；(b)在包含干细胞动员剂和白介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养第一细胞群体以产生第二细胞群体；(c)在包含IL-2和/或IL-15并且缺乏干细胞动员剂和/或LMWH中的每一种的第三培养基中培养第二细胞群体以产生第三细胞群体；和(d)从第三细胞群体分离CD11a+细胞和CD11a-细胞；和(e)以50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:20、1:30、1:40或1:50的比率或者上述任两个比率限定的范围中的比率将CD11a+细胞与CD11a-细胞组合以产生第四细胞群体。在某些可选方案中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些可选方案中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt-3L)。在具体的可选方案中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和/或MIP-1α，和所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和/或Flt3L。在某些可选方案中，第一培养基、第二培养基或第三培养基均不包含肝素，例如低分子量肝素。在某些方面，在第四细胞群体中，CD11a+细胞和CD11a-细胞以50:1、20:1、10:1、5:1或1:1的比率或者上述任两个比率限定的范围中的任何比率组合。在某些方面，在第四细胞群体中，CD11a+细胞和CD11a-细胞以50:1的比率组合。在某些方面，在第四细胞群体中，CD11a+细胞和CD11a-细胞以20:1的比率组合。在某些方面，在第四细胞群体中，CD11a+细胞和CD11a-细胞以10:1的比率组合。在某些方面，在第四细胞群体中，CD11a+细胞和CD11a-细胞以5:1的比率组合。在某些方面，在第四细胞群体中，CD11a+细胞和CD11a-细胞以1:1的比率组合。在某些方面，在第四细胞群体中，CD11a+细胞和CD11a-细胞以1:5的比率组合。在某些方面，在第四细胞群体中，CD11a+细胞和CD11a-细胞以1:10的比率组合。在某些方面，在第四细胞群体中，CD11a+细胞和CD11a-细胞以1:20的比率组合。在某些方面，在第四细胞群体中，CD11a+细胞和CD11a-细胞以1:50的比率组合。
5.NK细胞的分离
分离自然杀伤细胞的方法是本领域已知的，且可以用于分离NK细胞，例如，GM NK细胞。例如，在一个可选方案中，NK细胞可以例如通过用抗CD56和CD3的抗体染色细胞，并选择CD56+CD3-细胞来分离或富集。在某些可选方案中，与使用本文描述的三阶段方法产生的总细胞相比，NK细胞是CD56+CD3-细胞富集的。可以使用市售试剂盒，例如NK细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)，分离NK细胞，例如使用本文描述的三阶段方法产生的细胞。也可通过移除包含NK细胞(例如使用本文所述的三阶段方法产生的细胞)的细胞群体中NK细胞以外的细胞来分离或富集NK细胞(例如使用本文所述的三阶段方法产生的细胞)。例如，NK细胞(例如使用本文描述的三阶段方法产生的细胞)可以通过使用例如针对CD3、CD4、CD14、CD19、CD20、CD36、CD66b、CD123、HLA DR和/或CD235a(血型糖蛋白A)中的一种或多种的抗体来耗尽显示非NK细胞标志物的细胞而分离或富集。可以使用市售的试剂盒，例如，NK细胞负向分离试剂盒(Dynal Biotech)进行负向分离。可以另外分选通过这些方法分离的细胞，例如，以分离CD11a+和CD11a-细胞，和/或CD117+和CD117-细胞，和/或CD16+和CD16-细胞，和/或CD94+和CD94-。在某些可选方案中，细胞(例如通过本文描述的三步法产生的细胞)被分选以分离CD11a+和CD11a-细胞。在具体的可选方案中，分离CD11a+细胞。在某些可选方案中，与使用本文描述的三阶段方法产生的总细胞相比，细胞是CD11a+细胞富集的。在具体的可选方案中，分离CD11a-细胞。在某些可选方案中，与使用本文所述的三阶段方法产生的总细胞相比，细胞是CD11a-细胞富集的。在某些可选方案中，分选细胞以分离CD117+和CD117-细胞。在具体的可选方案中，分离CD117+细胞。在某些可选方案中，与使用本文所述的三阶段方法产生的总细胞相比，细胞是CD117+细胞富集的。在具体的可选方案中，分离CD117-细胞。在某些可选方案中，与使用本文描述的三阶段方法产生的总细胞相比，细胞是CD117-细胞富集的。用于选择和富集细胞的方法是本领域技术人员已知的，且例如细胞可以通过靶向细胞表面蛋白来选择。在某些可选方案中，细胞被分选以分离CD16+和CD16-细胞。在具体的可选方案中，分离CD16+细胞。在某些可选方案中，与使用本文描述的三阶段方法产生的总细胞相比，细胞是CD16+细胞富集的。在具体的可选方案中，分离CD16-细胞。在某些可选方案中，与使用本文描述的三阶段方法产生的总细胞相比，细胞是CD16-细胞富集的。在某些可选方案中，细胞被分选以分离CD94+和CD94-细胞。在具体的可选方案中，分离CD94+细胞。在某些可选方案中，与使用本文描述的三阶段方法产生的总细胞相比，细胞是CD94+细胞富集的。在具体的可选方案中，分离CD94-细胞。在某些可选方案中，与使用本文描述的三阶段方法产生的总细胞相比，细胞是CD94-细胞富集的。在某些可选方案中，使用磁性分离进行分离。在某些可选方案中，使用流式细胞术进行分离。
在一个可选方案中，通过选择CD56+CD3-CD94+CD11a+细胞来分离或富集NK细胞，例如GM NK细胞。在某些可选方案中，与使用本文描述的三阶段方法产生的总细胞相比，NK细胞是CD56+CD3-CD94+CD11a+细胞富集的。在一个可选方案中，通过选择CD56+CD3-CD94+CD11a+CD117-细胞来分离或富集NK细胞。在某些可选方案中，与使用本文描述的三阶段方法产生的总细胞相比，NK细胞是CD56+CD3-CD94+CD11a+CD117-细胞富集的。
细胞分离可以通过例如流式细胞术、荧光激活细胞分选(FACS)来完成，或者在一个可选方案中，通过使用与特异性抗体偶联的微珠的磁性细胞分选来完成。例如，可以使用磁性激活细胞分选(MACS)技术来分离细胞，MACS技术是基于其结合包含一种或多种特异性抗体(例如，抗CD56抗体)的磁珠(例如，约0.5-100μm直径)的能力来分离颗粒的方法。磁性细胞分离可以使用例如AUTOMACSTM分离器(Miltenyi)执行和自动化。可以在磁性微球上进行各种有用的修饰，包括共价添加特异性识别特定细胞表面分子或半抗原的抗体。然后将珠与细胞混合以使其结合。然后使细胞通过磁场以分离出具有特定细胞表面标志物的细胞。在一个可选方案中，然后可以将这些细胞分离并与偶联于针对另外的细胞表面标志物的抗体的磁珠重新混合。细胞再次通过磁场，从而分离结合两种抗体的细胞。然后可以将这些细胞稀释到单独的培养皿中，例如用于克隆分离的微量滴定盘。
6.GM NK细胞
本文提供的GM NK细胞包括通过本文所述的任何方法产生的NK细胞群体，以及从任何组织来源(例如，人组织来源)分离的NK细胞。
a.6.6.1通过三阶段方法产生的GM NK细胞
在另一个可选方案中，本文提供的是分离的GM NK细胞群体，其中NK细胞根据上述的三阶段方法来产生，并且其中遗传修饰在三阶段的一个或多个阶段期间引入以产生GMNK细胞群体。
在一个可选方案中，本文提供的是分离的GM NK细胞群体，其中通过本文所述的三阶段方法来产生NK细胞群体，其中所述NK细胞群体进行遗传修饰以产生GM NK细胞群体，和其中所述NK细胞群体包含50％或更多的CD3-CD56+细胞。在某些可选方案中，所述NK细胞群体中的CD3-CD56+细胞包含另外是NKp46+的CD3-CD56+细胞。在某些可选方案中，所述NK细胞群体中的所述CD3-CD56+细胞包含另外是CD16-的CD3-CD56+细胞。在某些可选方案中，所述NK细胞群体中的所述CD3-CD56+细胞包含另外是CD16+的CD3-CD56+细胞。在某些可选方案中，所述NK细胞群体中的所述CD3-CD56+细胞包含另外是CD94-的CD3-CD56+细胞。在某些可选方案中，所述NK细胞群体中的所述CD3-CD56+细胞包含另外是CD94+的CD3-CD56+细胞。在某些可选方案中，所述NK细胞群体中的所述CD3-CD56+细胞包含另外是CD11a+的CD3-CD56+细胞。在某些可选方案中，所述NK细胞群体中的所述CD3-CD56+细胞包含另外是NKp30+的CD3-CD56+细胞。在某些可选方案中，所述NK细胞群体中的所述CD3-CD56+细胞包含另外是CD161+的CD3-CD56+细胞。在某些可选方案中，所述NK细胞群体中的所述CD3-CD56+细胞包含另外是DNAM-1+的CD3-CD56+细胞。在某些可选方案中，所述NK细胞群体中的所述CD3-CD56+细胞包含另外是T-bet+的CD3-CD56+细胞。
在一个可选方案中，通过本文所述的三阶段方法产生的NK细胞群体包含为CD117+的细胞。在一个可选方案中，通过本文所述的三阶段方法产生的NK细胞群体包含其中细胞是NKG2D+的细胞。在一个可选方案中，通过本文所述的三阶段方法产生的NK细胞群体包含其中细胞是NKp44+的细胞。在一个可选方案中，通过本文所述的三阶段方法产生的NK细胞群体包含其中细胞是CD244+的细胞。在一个可选方案中，通过本文所述的三阶段方法产生的NK细胞群体包含其中细胞表达穿孔素的细胞。在一个可选方案中，通过本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体包含其中细胞表达EOMES的细胞。在一个可选方案中，通过本文所述的三阶段方法产生的NK细胞群体包含其中细胞表达粒酶B的细胞。在一个可选方案中，通过本文所述的三阶段方法产生的NK细胞群体包含其中细胞分泌IFNγ、GM-CSF和/或TNFα的细胞。
7.细胞的保存
细胞，例如，本文提供的或使用本文所述的方法产生的GM NK细胞，例如，使用三阶段方法产生的GM NK细胞群体，可以被保存，即置于允许长期储存的条件下，或者在抑制通过例如凋亡或坏死的细胞死亡的条件下。
合适的冷冻保存介质包括但不限于生理盐水、培养基，包括例如，生长培养基，或细胞冷冻培养基，例如市售细胞冷冻培养基，例如C2695、C2639或C6039(Sigma)；
Figure BDA0002182352220000441
CS2、
Figure BDA0002182352220000442
CS5或
Figure BDA0002182352220000443
CS10(BioLife Solutions)。在一个可选方案中，冷冻保存介质包含浓度为例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％(v/v)或由上述任意两个百分比限定的范围中的任何v/v百分比的DMSO(二甲基亚砜)。冷冻保存介质可以包含其他试剂，例如甲基纤维素、葡聚糖、白蛋白(例如人血清白蛋白)、海藻糖和/或甘油。在某些可选方案中，冷冻保存介质包含约1％-10％DMSO，约25％-75％葡聚糖和/或约20-60％人血清白蛋白(HSA)。在某些可选方案中，冷冻保存介质包含1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％DMSO或由上述任意两个百分比限定的范围中的任何百分比的DMSO。在某些可选方案中，冷冻保存介质包含25％、35％、45％、55％、65％、70％、75％葡聚糖，或由上述任意两个百分比限定的范围中的任意百分比的葡聚糖。在某些可选方案中，冷冻保存介质包含20％、30％、40％、50％或60％HSA，或由上述任意两个百分比限定的范围中的任意百分比的HSA。在某些可选方案中，冷冻保存介质包含1％-10％的DMSO，25％-75％海藻糖和/或20-60％人HSA。在某些可选方案中，冷冻保存介质包含1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％DMSO或由上述任意两个百分比限定的范围中的任何百分比的DMSO。在某些可选方案中，冷冻保存介质包含25％、35％、45％、55％、65％、70％、75％海藻糖，或由上述任意两个百分比限定的范围中的任意百分比的海藻糖。在某些可选方案中，冷冻保存介质包含20％、30％、40％、50％或60％HSA，或由上述任意两个百分比限定的范围中的任意百分比的HSA。在具体的可选方案中，冷冻保存介质包含5％的DMSO、55％的葡聚糖和40％的HSA。在更具体的可选方案中，冷冻保存介质包含5％的DMSO、55％葡聚糖(10％w/v，生理盐水中)和40％的HSA。在另一个具体的可选方案中，冷冻保存介质包含5％的DMSO、55％海藻糖和40％的HSA。在更具体的可选方案中，冷冻保存介质包含5％的DMSO、55％海藻糖(10％w/v，生理盐水中)和40％的HSA。在另一个具体的可选方案中，冷冻保存介质包含
Figure BDA0002182352220000451
CS5。在另一个具体的可选方案中，冷冻保存培养基包含
Figure BDA0002182352220000452
CS10。
本文提供的细胞可以通过多种方法中的任何一种以及在细胞培养、扩增或分化的任何阶段进行冷冻保存。例如，本文提供的细胞可以在从原始组织或器官(例如胎盘灌流液或脐带血)分离后立即冷冻保存，或者在以上概述方法的第一、第二或第三步骤期间或之后进行冷冻保存。在某些可选方案中，造血细胞(例如，造血干细胞或祖细胞)在从原始组织或器官分离后1、5、10、15、20、30、45分钟内或在1、2、4、6、10、12、18、20或24小时内或者由上述任意两个时间点限定的范围内的时间冷冻保存。在某些可选方案中，造血细胞(例如，造血干细胞或祖细胞)在从原始组织或器官分离后的1、5、10、15、20、30、45分钟内或由上述任意两个分钟数限定的范围内的任何分钟数内或者在从原始组织或器官分离后的1、2、4、6、10、12、18、20或24小时内或由上述任意两个时间点限定的范围内冷冻保存。在某些可选方案中，所述细胞在从原始组织或器官分离后1天、2天或3天内冷冻保存。在某些可选方案中，所述细胞在如上所述的第一培养基中培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天或由上述任意两个天数限定的范围内的任何天数之后冷冻保存。在一些可选方案中，所述细胞在如上所述的第一培养基中培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天或由上述任意两个天数限定的范围内的任何天数后，并在如上所述的第二培养基中培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天或由上述任意两个天数限定的范围内的任何天数后冷冻保存。在一些可选方案中，当使用本文所述的三阶段方法制备NK细胞时，所述细胞在第一培养基中培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天或由上述任意两个天数限定的范围内的任何天数后；和/或在第二培养基中培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天或由上述任意两个天数限定的范围内的任何天数后；和/或在第三培养基中培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天或由上述任意两个天数限定的范围内的任何天数后冷冻保存。在具体的可选方案中，使用本文所述的三阶段方法制备NK细胞(例如，GM NK细胞)，且所述细胞在第一培养基中培养10天后；在第二培养基中培养4天后；和在第三培养基中培养21天后冷冻保存。
在一个方面，本文提供了冷冻保存NK细胞群体，例如，GM NK细胞的方法。在一个可选方案中，所述方法包括：在包含干细胞动员剂和血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞(例如CD34+干细胞或祖细胞)以产生第一细胞群体，随后在包含干细胞动员剂和白介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群体以产生第二细胞群体，和随后在包含IL-2和/或IL-15并且缺乏干细胞动员剂和/或LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群体以产生第三细胞群体，其中所述第三细胞群体包含是CD56+、CD3-、CD16-或CD16+及CD94+或CD94-的自然杀伤细胞，和其中至少70％或至少80％、85％、90％或95％或上述任意两个百分比限定的范围内的百分比的自然杀伤细胞是存活的，和接下来在冷冻保存介质中冷冻保存该NK细胞。在某些可选方案中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些可选方案中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和/或FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt-3L)。在具体的可选方案中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和/或MIP-1α，和所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和/或Flt3L。在某些可选方案中，第一培养基、第二培养基或第三培养基均不包含肝素，例如低分子量肝素。在具体的可选方案中，所述冷冻保存步骤还包括(1)制备细胞悬液；(2)向来自步骤(1)的细胞悬液加入冷冻保存介质以获得冷冻保存的细胞悬液；(3)冷却来自步骤(3)的冷冻保存的细胞悬液以获得冷冻保存的样品；和(4)将冷冻保存的样品存储在-80℃以下。在某些可选方案中，该方法不包括中间步骤。
在一个可选方案中，所述方法包括：(a)在包含干细胞动员剂和血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群体；(b)在包含干细胞动员剂和白介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养第一细胞群体以产生第二细胞群体；和(c)在包含IL-2和IL-15并且缺乏LMWH的第三培养基中培养第二细胞群体以产生第三细胞群体；其中所述第三细胞群体包含为CD56+、CD3-和CD11a+的自然杀伤细胞，和接下来将所述NK细胞在冷冻保存基质中冷冻保存。细胞动员剂是本领域技术人员已知的并且例如，可以包括CXCR4拮抗剂，如普乐沙福(Plerixafor)。在某些可选方案中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些可选方案中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和/或FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt-3L)。在具体的可选方案中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和/或MIP-1α，和所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和/或Flt3L。在某些可选方案中，第一培养基、第二培养基或第三培养基均不包含肝素，例如低分子量肝素。在具体的可选方案中，所述冷冻保存步骤还包括(1)制备细胞悬液；(2)向来自步骤(1)的细胞悬液加入冷冻保存介质以获得冷冻保存的细胞悬液；(3)冷却来自步骤(3)的冷冻保存的细胞悬液以获得冷冻保存的样品；和(4)将冷冻保存的样品存储在-80℃以下。在某些可选方案中，该方法不包括中间步骤。
在一个可选方案中，所述方法包括：(a)在包含干细胞动员剂和血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群体；(b)在包含干细胞动员剂和白介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养第一细胞群体以产生第二细胞群体；和(c)在包含IL-2和/或IL-15并且缺乏干细胞因子(SCF)和/或LMWH中的每一种的第三培养基中培养第二细胞群体以产生第三细胞群体；其中所述第三细胞群体包含为CD56+、CD3-和CD11a+的自然杀伤细胞，和接下来将所述NK细胞在冷冻保存介质中冷冻保存。在某些可选方案中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些可选方案中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和/或FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体的可选方案中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，和所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和/或Flt3L。在某些可选方案中，第一培养基、第二培养基或第三培养基均不包含肝素，例如低分子量肝素。在具体的可选方案中，所述冷冻保存步骤还包括(1)制备细胞悬液；(2)向来自步骤(1)的细胞悬液加入冷冻保存培养基以获得冷冻保存的细胞悬液；(3)冷却来自步骤(3)的冷冻保存的细胞悬液以获得冷冻保存的样品；和(4)将冷冻保存的样品存储在-80℃以下。在某些可选方案中，该方法不包括中间步骤。
在一个可选方案中，所述方法包括：(a)在包含干细胞动员剂和血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群体；(b)在包含干细胞动员剂和白介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养第一细胞群体以产生第二细胞群体；和(c)在包含IL-2和/或IL-15并且缺乏SCF、干细胞动员剂和/或LMWH中每一种的第三培养基中培养第二细胞群体以产生第三细胞群体；其中所述第三细胞群体包含为CD56+、CD3-和CD11a+的自然杀伤细胞，和接下来将所述NK细胞在冷冻保存介质中冷冻保存。在某些可选方案中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些可选方案中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和/或FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体的可选方案中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和/或MIP-1α，和所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和/或Flt3L。在某些可选方案中，第一培养基、第二培养基或第三培养基均不包含肝素，例如低分子量肝素。在具体r可选方案中，所述冷冻保存步骤还包括(1)制备细胞悬液；(2)向来自步骤(1)的细胞悬液加入冷冻保存介质以获得冷冻保存的细胞悬液；(3)冷却来自步骤(3)的冷冻保存的细胞悬液以获得冷冻保存的样品；和(4)将冷冻保存的样品存储在-80℃以下。在某些可选方案中，该方法不包括中间步骤。
在一个可选方案中，所述方法包括：(a)在包含干细胞动员剂和血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群体；(b)在包含干细胞动员剂和白介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养第一细胞群体以产生第二细胞群体；(c)在包含IL-2和/或IL-15并且缺乏干细胞动员剂和/或LMWH的每一种的第三培养基中培养第二细胞群体以产生第三细胞群体；和(d)从第三细胞群体分离CD11a+细胞以产生第四细胞群体；其中所述第四细胞群体包含是CD56+、CD3-和CD11a+的自然杀伤细胞，和接下来将所述NK细胞在冷冻保存介质中冷冻保存。在某些可选方案中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些可选方案中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体的可选方案中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和/或MIP-1α，和所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和/或Flt3L。在某些可选方案中，第一培养基、第二培养基或第三培养基均不包含肝素，例如低分子量肝素。在具体r可选方案中，所述冷冻保存步骤还包括(1)制备细胞悬液；(2)向来自步骤(1)的细胞悬液加入冷冻保存介质以获得冷冻保存的细胞悬液；(3)冷却来自步骤(3)的冷冻保存的细胞悬液以获得冷冻保存的样品；和(4)将冷冻保存的样品存储在-80℃以下。在某些可选方案中，该方法不包括中间步骤。
本文提供的细胞可在速率受控的冷冻机中冷冻，例如在冷冻保存期间以0.1、0.3、0.5、1或2℃/分钟或由上述任意两个温度限定的范围中的任何温度冷却。在一个可选方案中，冷冻保存为约-80℃至约-180℃，或约-125℃至约-140℃。冷冻保存的细胞可以在解冻使用前转移到液氮中。在一些可选方案中，例如，一旦安瓿达到约-90℃，它们被转移到液氮储存区域。冷冻保存的细胞可以在约25℃至约40℃的温度下解冻，更具体地可以解冻至约37℃的温度。冷冻保存的细胞可以在25℃、35℃、40℃或40℃，或由上述任意两个温度限定的范围中的任何温度下解冻。在某些可选方案中，冷冻保存的细胞在冷冻保存1、2、4、6、10、12、18、20或24小时或由上述任意两个值限定的范围中的任何小时数，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天或由上述任意两个值限定的范围中的任何天数后解冻。在某些可选方案中，冷冻保存的细胞在冷冻保存1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个月或由上述任意两个值限定的范围中的任何月数后解冻。在某些可选方案中，冷冻保存的细胞在冷冻保存1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年或者由上述任意两个值限定的范围中的任何年数后解冻。
合适的解冻介质包括但不限于生理盐水、勃脉力(plasmalyte)培养基，包括例如生长培养基，例如RPMI培养基。在某些可选方案中，解冻介质包含一种或多种培养基补充剂(例如营养物质、细胞因子和/或因子)。适用于解冻本文提供的细胞的培养基补充剂包括例如，但不限于，血清如人血清AB、胎牛血清(FBS)或小牛血清(FCS)、维生素、人血清白蛋白(has)、牛血清白蛋白(BSA)、氨基酸(例如，L-谷氨酰胺)、脂肪酸(例如，油酸、亚油酸或棕榈酸)、胰岛素(例如，重组人胰岛素)、转铁蛋白(铁饱和人转铁蛋白)、β-巯基乙醇、干细胞因子(SCF)、Fms样酪氨酸激酶3配体(Flt3-L)、细胞因子如白介素-2(IL-2)、白介素-7(IL-7)、白介素-15(IL-15)、血小板生成素(Tpo)或肝素。在具体的可选方案中，可用于本文提供的方法的解冻介质包含RPMI。在另一具体可选方案中，所述解冻介质包含勃脉力。在另一具体可选方案中，所述解冻介质包含0.5-20％的FBS。在另一个具体可选方案中，所述解冻介质包含0.5、1、5、15、15或20％FBS或由上述任意两个百分比限定的范围中的任何百分比的FBS。在另一具体可选方案中，所述解冻介质包含约1、2、5、10、15或20％的FBS。在另一具体可选方案中，所述解冻介质包含约0.5％-20％的HSA。在另一具体可选方案中，所述解冻介质包含0.5、1、5、15、15或20％HSA或由上述任意两个百分比限定的范围中的任何百分比的HSA。在另一具体可选方案中，所述解冻介质包含1、2.5、5、10、15或20％的HSA。在更具体的可选方案中，所述解冻介质包含RPMI和10％的FBS。在另一更具体的可选方案中，所述解冻介质包含勃脉力和5％的HSA。
本文提供的冷冻保存方法可以优化以允许长期储存，或在抑制通过例如凋亡或坏死的细胞死亡的条件下。在一个可选方案中，解冻后细胞包含大于60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％的活细胞，如由例如自动细胞计数器或台盼蓝方法确定的。在一个可选方案中，解冻后细胞包含大于60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％或由上述任意两个百分比限定的范围内的任何百分比的活细胞。在另一可选方案中，解冻后细胞包含0.5％、1％、5％、10％、15％、20％或25％的死细胞。在另一可选方案中，解冻后细胞包含0.5％、1％、5％、10％、15％、20％或25％的死细胞或者由上述任意两个百分比限定的范围内的任意百分比的死细胞。在另一可选方案中，解冻后细胞包含0.5％、1％、5％、10％、15％、20％或25％的早期凋亡细胞。在另一可选方案中，解冻后细胞包含0.5％、1％、5％、10％、15％、20％或25％的早期凋亡细胞或由上述任意两个百分比限定的范围内的任意百分比的早期凋亡细胞。在另一可选方案中，0.5％、1％、5％、10％、15％或20％的解冻后细胞在解冻后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天后发生凋亡，例如通过细胞凋亡分析法(例如，TO-PRO3或AnnV/PI凋亡测定试剂盒)测定的。在某些可选方案中，解冻后细胞在使用本文提供的方法培养、扩增或分化后重新冷冻保存。
8.包含GM NK细胞的组合物
本文提供的包含GM NK细胞的组合物，如药物组合物，包括包含通过本文所述的任何方法产生的NK细胞群体的组合物，以及包含从任何组织来源(例如，人组织来源)分离的NK细胞的组合物。
a.6.8.1使用三阶段方法产生的GM NK细胞
在一些可选方案中，本文提供了包含分离的NK细胞群体(例如，GM NK细胞群体)的组合物，例如，药物组合物。在具体的可选方案中，所述分离的NK细胞群体从造血细胞(例如，从胎盘灌流液、脐带血和/或外周血分离的造血干细胞或祖细胞)产生。在另一具体的可选方案中，所述分离的NK细胞占组合物中细胞的至少50％。在另一具体的可选方案中，所述分离的NK细胞群体，例如CD3-CD56+细胞，占组合物中细胞的至少80％、85％、90％、95％、98％或99％。在某些可选方案中，所述分离的NK细胞群体中不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％的细胞是CD3-CD56+细胞。在某些可选方案中，所述CD3-CD56+细胞是CD16-。
NK细胞群体(例如，GM NK细胞群体)可以配制成用于体内使用的药物组合物。此类药物组合物包含药学上可接受的载体(例如，盐水溶液或其他公认的生理上可接受的用于体内施用的溶液)中的NK细胞群体。本发明的药物组合物可以包含本文其它地方描述的任何NK细胞群体。
本文所述的药物组合物包含含有50％或更多活细胞(即，例如，群体中至少50％的细胞是功能性的或存活的)的NK细胞群体。优选地，群体中至少60％的细胞是存活的。更优选地，药物组合物中的群体的至少70％、80％、90％、95％或99％或由上述任意两个百分比限定的范围中的任何百分比的细胞是存活的。
本文所述的药物组合物可以包含一种或多种例如促进植入的化合物；稳定剂，如白蛋白、葡聚糖40、明胶和/或羟乙基淀粉等。
当配制成可注射溶液时，在一个可选方案中，药物组合物可包含1.25％的HSA和2.5％的葡聚糖。可以使用适用于施用细胞产物的其他可注射制剂。
在一个可选方案中，本文提供的组合物(例如药物组合物)适用于全身或局部施用。在具体的可选方案中，本文提供的组合物(例如药物组合物)适用于肠胃外施用。在具体的可选方案中，本文提供的组合物(例如药物组合物)适用于注射、输注、静脉内(IV)施用、股骨内施用或肿瘤内施用。在具体的可选方案中，本文提供的组合物(例如药物组合物)适合于通过装置、基质或支架施用。在具体的可选方案中，本文提供的组合物(例如药物组合物)适用于注射。在具体的可选方案中，本文提供的组合物(例如药物组合物)适合于通过导管施用。在具体的可选方案中，本文提供的组合物(例如药物组合物)适用于局部注射。在更具体的可选方案中，本文提供的组合物(例如药物组合物)适合于直接局部注射到实体肿瘤(例如肉瘤)中。在具体的可选方案中，本文提供的组合物(例如药物组合物)适用于通过注射器注射。在具体的可选方案中，本文提供的组合物(例如药物组合物)适合于通过导引递送施用。在具体的可选方案中，本文提供的组合物(例如药物组合物)适合于通过腹腔镜检查、内窥镜检查、超声、计算机断层摄影术、磁共振或放射学辅助的注射。
在某些可选方案中，本文提供的包含NK细胞(例如，GM NK细胞)的组合物(例如药物组合物)作为药物级可施用单元提供。这样的单元可以以离散体积提供，例如15mL、20mL、25mL、30mL、35mL、40mL、45mL、50mL、55mL、60mL、65mL、70mL、75mL、80mL、85mL、90mL、95mL、100mL、150mL、200mL、250mL、300mL、350mL、400mL、450mL、500mL等，或由上述任意两个体积量限定的范围中的任何体积。可以提供这样的单元以包含特定数量的细胞，例如GM NK细胞，例如1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108或更多细胞/毫升，或1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011个或更多细胞/单元，或由上述任意两个值限定的范围中的任何细胞数/单元。在具体的可选方案中，该单元可以包含约、至少约或至多约1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106或更多的NK细胞/毫升，或1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011或更多细胞/单元，或由上述任意两个值限定的范围内的任何细胞数/毫升或/单元。可提供这样的单元以含有特定数量的NK细胞或NK细胞群体和/或任何其他细胞。在具体的可选方案中，NK细胞以本文提供的比率存在。
在另一个具体的可选方案中，所述组合物中的所述分离的NK细胞(例如，GM NK细胞)来自单一个体。在更具体的可选方案中，所述分离的NK细胞包含来自至少两个不同个体的NK细胞。在另一具体的可选方案中，所述组合物中的所述分离的NK细胞来自与打算用NK细胞进行治疗的个体不同的个体。在另一具体的可选方案中，所述NK细胞已经接触或接近免疫调节化合物或沙利度胺，其量和时间足以使所述NK细胞与同等数量的自然杀伤细胞(即不与所述免疫调节化合物或沙利度胺接触或接近的NK细胞)相比表达可检测地更多的颗粒酶B和/或或穿孔素。在另一具体的可选方案中，所述组合物另外包含免疫调节化合物或沙利度胺，或在与免疫调节化合物或沙利度胺的产品组合中或与其结合(例如，在免疫调节化合物或沙利度胺之前、期间或之后，但是单独地)提供。在某些可选方案中，免疫调节化合物是下述化合物。参见例如，美国专利No.7,498,171，其公开内容在此通过引用整体并入。在某些可选方案中，免疫调节化合物是氨基取代的异吲哚啉。在一个可选方案中，免疫调节化合物是3-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氢异吲哚-2-基)-哌啶-2,6-二酮；3-(4'-氨基异吲哚啉-1'-酮)-1-哌啶-2,6-二酮；4-(氨基)-2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1,3-二酮；或4-氨基-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚-1,3-二酮。在另一可选方案中，免疫调节化合物是泊马度胺或来那度胺。在另一可选方案中，所述免疫调节化合物是具有以下结构的化合物：
Figure BDA0002182352220000561
其中X和Y中的一个是C＝O，X和Y中的另一个是C＝O或CH2，和R2是氢或低级烷基；或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、对映异构体、非对映异构体、外消旋物或立体异构体的混合物。在另一可选方案中，所述免疫调节化合物是具有以下结构的化合物：
Figure BDA0002182352220000562
其中X和Y中的一个是C＝O和另一个是CH2或C＝O；
R1是H、(C1-C8)烷基、(C3-C7)环烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄基、芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)杂环烷基、(C0-C4)烷基-(C2-C5)杂芳基、C(O)R3、C(S)3、C(O)OR4、(C1-C8)烷基-N(R6)2、(C1-C8)烷基-OR5、(C1-C8)烷基-C(O)OR5、C(O)NHR3、C(S)NHR3、C(O)NR3R3'、C(S)NR3R3'或(C1-C8)烷基-O(CO)R5；
R2是H、F、苄基、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基或(C2-C8)炔基；
R3和R3'独立地是(C1-C8)烷基、(C3-C7)环烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄基、芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)杂环烷基、(C0-C4)烷基-(C2-C5)杂芳基、(C0-C8)烷基-N(R6)2、(C1-C8)烷基-OR5、(C1-C8)烷基-C(O)OR5、(C1-C8)烷基-O(CO)R5或C(O)OR5；
R4是(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、(C1-C4)烷基-OR5、苄基、芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)杂环烷基或(C0-C4)烷基-(C2-C5)杂芳基；
R5是(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄基、芳基或(C2-C5)杂芳基；
每次出现的R6独立地是H、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄基、芳基、(C2-C5)杂芳基或(C0-C8)烷基-C(O)O-R5，或R6基团可以连接以形成杂环烷基基团；
n是0或1；和
*表示手性碳中心；
或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、对映异构体、非对映异构体、外消旋物或立体异构体的混合物。在另一可选方案中，所述免疫调节化合物是具有以下结构的化合物：
Figure BDA0002182352220000571
其中
X和Y中的一个是C＝O，和另一个是CH2或C＝O；
R是H或CH2OCOR'；
(i)R1、R2、R3或R4中的每一个彼此独立地为卤素、1至4个碳原子的烷基或1至4个碳原子的烷氧基，或(ii)R1、R2、R3或R4中的一个是硝基或-NHR5和R1、R2、R3或R4中其余的是氢；
R5是氢或1至8个碳的烷基；
R6是氢、1至8个碳原子的烷基、苯并、氯代或氟代；
R'是R7-CHR10-N(R8R9)；
R7是间亚苯基或对亚苯基或-(CnH2n)-，其中n的值为0至4；
R8和R9各自独立地为氢或1-8个碳原子的烷基，或R8和R9一起为四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基或-CH2CH2X1CH2CH2-，其中X1为-O-、-S-或-NH-；
R10是氢、1至8个碳原子的烷基或苯基；
*表示手性碳中心；
或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、对映异构体、非对映异构体、外消旋物或立体异构体的混合物。
在另一具体的可选方案中，本文所述的组合物另外包含一种或多种抗癌化合物，或在与一种或多种抗癌化合物的产品组合中或与其结合施用，例如下述一种或多种抗癌化合物。
在更具体的可选方案中，组合物包含来自另一来源或通过另一种方法制备的GMNK细胞(无论是否遗传修饰)。在具体的可选方案中，所述其他来源是胎盘血和/或脐带血。在另一具体的可选方案中，所述其他来源是外周血。在更具体的可选方案中，所述组合物中的NK细胞群体与来自另一来源或通过另一方法制备的NK细胞以约100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等的比率，或由上述任意两个比率限定的范围中的任何比率组合。
在另一具体的可选方案中，组合物包含使用本文所述三阶段方法产生的NK细胞群体以及分离的胎盘灌流液或分离的胎盘灌流液细胞。在更具体的可选方案中，所述胎盘灌流液来自与所述NK细胞群体相同的个体。在另一更具体的可选方案中，所述胎盘灌流液包含来自与所述NK细胞群体不同的个体的胎盘灌流液。在另一具体的可选方案中，所述胎盘灌流液中全部或基本上全部(例如，大于90％、95％、98％或99％)的细胞是胎儿细胞。在另一具体的可选方案中，胎盘灌流液或胎盘灌流液细胞包含胎儿和母体细胞。在更具体的可选方案中，所述胎盘灌流液中的胎儿细胞占所述灌流液中小于90％、80％、70％、60％或50％(但不是零)的细胞，或由上述任意两个百分比限定的范围中的任何百分比的细胞。在另一具体的可选方案中，所述灌流液通过使0.9％的NaCl溶液通过胎盘脉管系统获得。在另一具体的可选方案中，所述灌流液包含培养基。在另一具体的可选方案中，所述灌流液经处理以除去红细胞。在另一具体的可选方案中，所述组合物包含免疫调节化合物，例如下述免疫调节化合物，例如氨基取代的异吲哚啉化合物。在另一具体的可选方案中，组合物另外包含一种或多种抗癌化合物，例如下述的一种或多种抗癌化合物。
在另一具体的可选方案中，组合物包含NK细胞群体和胎盘灌流液细胞。在更具体的可选方案中，所述胎盘灌流液细胞来自与所述NK细胞群体相同的个体。在另一更具体的可选方案中，所述胎盘灌流液细胞来自与所述NK细胞群体不同的个体。在另一具体的可选方案中，组合物包含分离的胎盘灌流液和分离的胎盘灌流液细胞，其中所述分离的灌流液和所述分离的胎盘灌流液细胞来自不同的个体。在包含胎盘灌流液的任何上述可选方案的任何一个更具体的可选方案中，所述胎盘灌流液包含来自至少两个个体的胎盘灌流液。在包含胎盘灌流液细胞的任何上述可选方案的另一更具体的可选方案中，所述分离的胎盘灌流液细胞来自至少两个个体。在另一具体的可选方案中，所述组合物包含免疫调节化合物。在另一具体的可选方案中，组合物另外包含一种或多种抗癌化合物，例如下述的一种或多种抗癌化合物。
9.GM NK细胞的用途
本文所述的GM NK细胞，例如通过本文所述的三阶段方法产生的GM NK细胞，可以用于治疗患有癌症的个体(例如具有实体肿瘤细胞和/或血液癌细胞的个体)或具有病毒感染的个人的方法。在一些这样的可选方案中，NK细胞的有效剂量范围为1×104至5×104、5×104至1×105、1×105至5×105、5×105至1×106、1×106至5×106、5×106至1×107，或更多细胞/千克体重。在一些这样的可选方案中，NK细胞的有效剂量范围为1×104至5×104、5×104至1×105、1×105至5×105、5×105至1×106、1×106至5×106、5×106至1×107或更多细胞/千克体重，或者由上述任意两个值限定的范围中的任意细胞数/千克体重。NK细胞，例如，本文所述的GM NK细胞，也可以用于抑制肿瘤细胞增殖的方法中。
a.6.9.1患有癌症的个体的治疗
在一个可选方案中，本文提供治疗患有癌症(例如血液癌症或实体肿瘤)的个体的方法，包括向所述个体(优选已经选择或鉴定来接受抗癌治疗的个体)施用治疗有效量的本文所述的GM NK细胞，例如，本文所述的GM NK细胞群体。在某些可选方案中，个体具有自然杀伤细胞的缺陷，例如缺乏对个体的癌症具有活性的NK细胞，并且所述个体在接受治疗前已经如此鉴定或选择。在具体的可选方案中，该方法另外包括向所述个体施用分离的胎盘灌流液或分离的胎盘灌流液细胞，例如治疗有效量的胎盘灌流液或分离的胎盘灌流液细胞。在一些可选方案中，个体已经选择来接受分离的胎盘灌流液或分离的胎盘灌流液细胞。在另一具体的可选方案中，该方法包括向所述个体另外施用有效量的免疫调节化合物，例如上述免疫调节化合物或沙利度胺。在一些可选方案中，个体已经选择来接受免疫调节化合物。如本文所用，“有效量”是例如导致个体所患的癌症的一种或多种症状的可检测的改善、进展减缓或消除的量。
分离的GM NK细胞群体或其药物组合物的施用可以是系统性的或局部的。在具体的可选方案中，施用是肠胃外的。在具体的可选方案中，向受试者施用分离的GM NK细胞群体或其药物组合物是通过注射、输注、静脉内(IV)施用、股骨内施用或肿瘤内施用。在具体的可选方案中，向受试者施用分离的GM NK细胞群体或其药物组合物是利用装置、基质或支架进行的。在具体的可选方案中，向受试者施用分离的GM NK细胞群体或其药物组合物是通过注射。在具体的可选方案中，向受试者施用分离的GM NK细胞群体或其药物组合物是通过导管。在具体的可选方案中，GM NK细胞的注射是局部注射。在更具体的可选方案中，局部注射直接注入实体肿瘤(例如肉瘤)中。在具体的可选方案中，向受试者施用分离的GM NK细胞群体或其药物组合物是通过注射器的注射。在具体的可选方案中，向受试者施用分离的GMNK细胞群体或其药物组合物是通过导引递送。在具体的可选方案中，通过注射向受试者施用分离的GM NK细胞或其药物组合物通过腹腔镜检查、内窥镜检查、超声、计算机断层扫描、磁共振或放射学辅助。
在具体的可选方案中，癌症是血液癌症，例如白血病或淋巴瘤。在更具体的可选方案中，癌症是急性白血病，例如急性T细胞白血病，急性髓细胞性白血病(AML)、急性早幼粒细胞白血病、急性髓母细胞性白血病、急性成巨核细胞性白血病、前体B急性淋巴母细胞性白血病、前体T急性淋巴母细胞性白血病、伯基特白血病(伯基特淋巴瘤)或急性双表型白血病；慢性白血病，例如慢性髓样淋巴瘤、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性单核细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤或B细胞幼淋巴细胞性白血病；毛细胞淋巴瘤；T细胞幼淋巴细胞性白血病；或淋巴瘤，例如组织细胞性淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤(例如瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞瘤(例如浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、单克隆免疫球蛋白沉积病或重链病)、结外边缘区B细胞淋巴瘤(MALT淋巴瘤)、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、T细胞大颗粒淋巴细胞性白血病、侵袭性NK细胞白血病、成人T细胞白血病/淋巴瘤、结外NK/T细胞淋巴瘤、鼻型、肠病型T细胞淋巴瘤、肝脾T细胞淋巴瘤、母细胞性NK细胞淋巴瘤、蕈样霉菌病(Sezary综合征)、原发性皮肤CD30阳性T细胞淋巴增殖性疾病(例如，原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤或淋巴瘤样丘疹病)、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、未分类的间变性大细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤或结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤。在另一具体的可选方案中，癌症是多发性骨髓瘤或骨髓增生异常综合征。
在某些其他具体的可选方案中，癌症是实体肿瘤，例如癌瘤，如腺癌、肾上腺皮质癌、结肠腺癌、结直肠腺癌、结肠直肠癌、导管细胞癌、肺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、黑素瘤(例如恶性黑素瘤)、非黑素瘤皮肤癌或未分类的癌瘤；硬纤维瘤；促结缔组织小圆细胞肿瘤；内分泌肿瘤；尤因肉瘤；生殖细胞肿瘤(例如睾丸癌、卵巢癌、绒毛膜癌、内胚窦瘤、生殖细胞瘤等)；肝母细胞瘤；肝细胞癌；神经母细胞瘤；非横纹肌肉瘤软组织肉瘤；骨肉瘤；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；或肾母细胞瘤。在另一可选方案中，实体肿瘤是胰腺癌或乳腺癌。在其他可选方案中，实体肿瘤是听神经瘤；星形细胞瘤(例如I级毛细胞性星形细胞瘤，II级低级星形细胞瘤；III级间变性星形细胞瘤；或IV级多形性成胶质细胞瘤)；脊索瘤；颅咽管瘤；神经胶质瘤(例如，脑干胶质瘤；室管膜瘤；混合型神经胶质瘤；视神经胶质瘤；或室管膜下层瘤)；胶质母细胞瘤；髓母细胞瘤；脑膜瘤；转移性脑肿瘤；少突胶质细胞瘤；松果体母细胞瘤；垂体瘤；原始神经外胚层肿瘤；或神经鞘瘤。在另一可选方案中，癌症是前列腺癌。在另一可选方案中，癌症是肝癌。在另一可选方案中，癌症是肺癌。在另一可选方案中，癌症是肾癌。
在某些可选方案中，患有癌症(例如血液癌症或实体肿瘤)的个体，例如具有自然杀伤细胞缺陷的个体，是在所述施用之前已经接受了骨髓移植的个体。在某些可选方案中，骨髓移植是在所述癌症的治疗中。在某些其他可选方案中，骨髓移植是在除所述癌症之外的病症的治疗中。在某些可选方案中，除了所述骨髓移植之外，个体还接受免疫抑制剂。在某些可选方案中，已经进行骨髓移植的个体在所述施用时表现出移植物抗宿主病(GVHD)的一种或多种症状。在某些其他可选方案中，已经进行骨髓移植的个体在GVHD的症状显现之前施用所述细胞。
在某些具体的可选方案中，在所述施用之前，患有癌症(例如血液癌症)的个体已经接受至少一剂TNFα抑制剂，例如
Figure BDA0002182352220000621
(Enbrel)。在具体的可选方案中，所述个体在所述癌症的诊断的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月内或由上述任意两个时间段限定的范围内接受所述TNFα抑制剂剂量。在具体的可选方案中，接受TNFα抑制剂剂量的个体表现出急性髓性白血病。在更具体的可选方案中，接受TNFα抑制剂剂量并表现出急性髓性白血病的个体进一步表现出血液细胞中染色体5的长臂的缺失。在另一可选方案中，患有癌症(例如血液癌症)的个体显示出费城染色体。
在某些其他可选方案中，所述个体中的癌症(例如血液癌症或实体肿瘤)是一种或多种抗癌药物难治的。在具体的可选方案中，癌症是
Figure BDA0002182352220000631
(甲磺酸伊马替尼)难治的。
在某些可选方案中，所述个体中的癌症(例如血液癌症)对至少一种抗癌药物有反应；在这个可选方案中，胎盘灌流液、分离的胎盘灌流液细胞、分离的自然杀伤细胞(例如胎盘自然杀伤细胞，例如胎盘来源的中间自然杀伤细胞)、分离的组合自然杀伤细胞或本文所述的NK细胞，和/或其组合，及任选的免疫调节化合物作为辅助治疗或作为与所述抗癌药物的联合疗法加入。在某些其他可选方案中，患有癌症(例如血液癌症)的个体已经接受至少一种抗癌药物，且在所述施用之前复发。在某些可选方案中，待接受治疗的个体患有难治性癌症。在一个可选方案中，用本文所述细胞的癌症治疗方法防止(例如预防或延迟)癌症的复发。在一个可选方案中，本文所述的癌症治疗方法导致癌症缓解1个月或更久，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或更久，1年或更久，2年或更久，3年或更久，或者4年或更久。
在一个可选方案中，本文提供治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法，其包括向个体施用(1)来那度胺；(2)美法仑；和(3)GM NK细胞，其中所述GM NK细胞有效地治疗所述个体中的多发性骨髓瘤。在具体的可选方案中，所述GM NK细胞源自脐带血NK细胞或从脐带血造血细胞(例如造血干细胞)产生的NK细胞。在另一可选方案中，所述GM NK细胞通过本文所述的用于产生NK细胞的三阶段方法产生。在另一可选方案中，所述来那度胺、美法仑和/或GM NK细胞彼此独立施用。在治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法的某些具体可选方案中，所述GM NK细胞通过包括产生NK细胞的方法产生，产生NK细胞是通过包括以下步骤的方法：在包含干细胞动员剂和血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞(例如CD34+干细胞或祖细胞)以产生第一细胞群体，随后在包含干细胞动员剂和白介素-15(IL-15)且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群体以产生第二细胞群体，和随后在包含IL-2和/或IL-15且缺乏干细胞动员剂和/或LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群体以产生第三细胞群体，其中所述第三细胞群体包含是CD56+、CD3-、CD16-或CD16+及CD94+或CD94-的自然杀伤细胞，和其中至少70％或至少80％、85％、90％或95％的自然杀伤细胞是存活的。在某些可选方案中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些可选方案中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和/或FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体的可选方案中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和/或MIP-1α，和所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和/或Flt3L。在某些可选方案中，第一培养基、第二培养基或第三培养基均不包含肝素，例如低分子量肝素。
在另一可选方案中，本文提供治疗患有急性髓细胞性白血病(AML)的个体的方法，其包括向个体施用NK细胞(任选地通过用单独的IL2或单独的IL-15、IL2及IL12和IL18、IL12和IL15、IL12和IL18、IL2及IL12和IL15和IL18，或IL2和IL15和IL18预处理而激活)，其中所述NK细胞有效地治疗所述个体中的AML。在具体的可选方案中，使用本文所述的三阶段方法产生的分离的NK细胞群体在所述施用之前用IL2、IL12、IL18或IL15中的一种或多种进行预处理。在具体的可选方案中，所述GM NK细胞源自脐带血NK细胞或从脐带血造血细胞(例如造血干细胞)产生的NK细胞。在另一可选方案中，所述GM NK细胞通过本文所述的用于产生NK细胞的三阶段方法产生。在治疗患有AML的个体的方法的某些具体可选方案中，所述NK细胞通过本文所述的三阶段方法产生。在特定的可选方案中，待通过前述方法治疗的AML包括难治性AML、预后不良AML或儿童期AML。本领域已知的用于施用NK细胞以治疗难治性AML、预后不良AML或儿童期AML的方法可适用于此目的；参见例如Miller等，2005，Blood105：3051-3057；Rubnitz等，2010，J Clin Oncol.28:955-959，其各自的全部内容通过引用并入本文。在某些可选方案中，所述个体患有至少一种针对AML的非自然杀伤细胞治疗失败的AML。在具体的可选方案中，所述个体是65岁或更大，并处于第一缓解期。在具体的可选方案中，在施用所述自然杀伤细胞之前，所述个体已经用氟达拉滨、阿糖胞苷或两者进行了调理。
在治疗患有AML个体的方法的其他具体可选方案中，所述GM NK细胞通过产生NK细胞的方法产生，产生NK细胞是通过包括以下步骤的方法：在包含干细胞动员剂和血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞(例如CD34+干细胞或祖细胞)以产生第一细胞群体，随后在包含干细胞动员剂和白介素-15(IL-15)且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群体以产生第二细胞群体，和随后在包含IL-2和/或IL-15且缺乏干细胞动员剂和/或LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群体以产生第三细胞群体，其中第三细胞群体包含为CD56+、CD3-、CD16-或CD16+和CD94+或CD94-的自然杀伤细胞，和其中至少70％或至少80％、85％、90％或95％的自然杀伤细胞是存活的。在某些可选方案中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些可选方案中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和/或FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体的可选方案中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和/或MIP-1α，和所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和/或Flt3L。在某些可选方案中，第一培养基、第二培养基或第三培养基均不包含肝素，例如低分子量肝素。
在另一可选方案中，本文提供了治疗患有慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的个体的方法，其中包括向个体施用治疗有效剂量的(1)来那度胺；(2)美法仑；(3)氟达拉滨；和(4)NK细胞，例如本文所述的GM NK细胞，其中所述GM NK细胞有效地治疗或缓解或抑制所述个体中的所述CLL。在具体的可选方案中，所述GM NK细胞源自脐带血NK细胞或由脐带血造血干细胞产生的NK细胞。在另一可选方案中，所述GM NK细胞通过本文所述的用于产生NK细胞的三阶段方法产生。在任何上述方法的具体可选方案中，所述来那度胺、美法仑、氟达拉滨和GM NK细胞分开施用于所述个体。在对患有CLL的个体提供治疗的方法的某些具体可选方案中，所述GM NK细胞通过包括产生NK细胞的方法产生，产生NK细胞是通过包括以下步骤的方法：在包含干细胞动员剂和血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞(例如CD34+干细胞或祖细胞)以产生第一细胞群体，随后在包含干细胞动员剂和白介素-15(IL-15)且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群体以产生第二细胞群体，和然后在包含IL-2和/或IL-15且缺乏干细胞动员剂和LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群体以产生第三细胞群体，其中所述第三细胞群体包含是CD56+、CD3-，CD16-或CD16+和CD94+或CD94-的自然杀伤细胞，和其中至少70％或至少80％、85％、90％或95％的自然杀伤细胞是存活的。在某些可选方案中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些可选方案中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和/或FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体的可选方案中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和/或MIP-1α，和所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和/或Flt3L。在某些可选方案中，第一培养基、第二培养基或第三培养基均不包含肝素，例如低分子量肝素。
b.6.9.2肿瘤细胞增殖的抑制
本文进一步提供了抑制肿瘤细胞增殖的方法，其包括将本文所述的GM NK细胞接近肿瘤细胞，例如将肿瘤细胞与本文所述的GM NK细胞接触。任选地，使分离的胎盘灌流液或分离的胎盘灌流液细胞接近肿瘤细胞和/或本文所述的GM NK细胞。在另一具体的可选方案中，另外将免疫调节化合物(例如上述免疫调节化合物)或沙利度胺与肿瘤细胞和/或本文所述的GM NK细胞接近，使得与相同类型的但没有与本文所述的GM NK细胞接近的肿瘤细胞相比，该肿瘤细胞的增殖可检测地减少。任选地，将分离的胎盘灌流液或分离的胎盘灌流液细胞接近肿瘤细胞和/或本文所述的GM NK细胞其已经接触或接近免疫调节化合物。
如本文所用，在某些可选方案中，关于细胞的“接触”或“使其接近”在一个可选方案中涵盖天然杀伤细胞(例如，本文所述的GM NK细胞群体)与肿瘤细胞之间的直接物理(例如细胞-细胞)接触。在另一可选方案中，“接触”包括存在于相同的物理空间中，例如自然杀伤细胞(例如，本文所述的GM NK细胞)和/或分离的组合自然杀伤细胞被置于与肿瘤细胞相同的容器(例如，培养皿、多孔板)中。在另一可选方案中，使自然杀伤细胞(例如，本文所述的GM NK细胞)与肿瘤细胞“接触”例如通过注射或输注自然杀伤细胞(例如，GM NK细胞)到包含肿瘤细胞的个体(例如包含肿瘤细胞的人，例如癌症患者)中来完成。在免疫调节化合物和/或沙利度胺的情况下，“接触”是指例如细胞和免疫调节化合物和/或沙利度胺彼此直接物理接触，或者置于相同的物理体积(例如，细胞培养容器或个体)内。
在具体的可选方案中，肿瘤细胞是血液癌症细胞，例如白血病细胞或淋巴瘤细胞。在更具体的可选方案中，癌症是急性白血病，例如急性T细胞白血病细胞、急性髓细胞性白血病(AML)细胞、急性早幼粒细胞性白血病细胞、急性成髓细胞性白血病细胞、急性成巨核细胞性白血病细胞、前体B急性淋巴母细胞性白血病细胞、前体T急性淋巴母细胞性白血病细胞、伯基特白血病(伯基特淋巴瘤)细胞或急性双表型白血病细胞；慢性白血病细胞，例如，慢性髓性淋巴瘤细胞、慢性髓细胞性白血病(CML)细胞、慢性单核细胞性白血病细胞、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤细胞或B细胞幼淋巴细胞性白血病细胞；毛细胞淋巴瘤细胞；T细胞幼淋巴细胞性白血病细胞；或淋巴瘤细胞，例如组织细胞性淋巴瘤细胞、淋巴浆细胞性淋巴瘤细胞(例如，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症细胞)、脾边缘区淋巴瘤细胞、浆细胞瘤细胞(例如，浆细胞骨髓瘤细胞、浆细胞瘤细胞、单克隆免疫球蛋白沉积病或重链病)、结外边缘区B细胞淋巴瘤(MALT淋巴瘤)细胞、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)细胞、滤泡性淋巴瘤细胞、套细胞淋巴瘤细胞、弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤细胞、血管内大B细胞淋巴瘤细胞、原发性渗出淋巴瘤细胞、T细胞大颗粒淋巴细胞性白血病细胞、侵袭性NK细胞白血病细胞、成人T细胞白血病/淋巴瘤细胞、结外NK/T细胞淋巴瘤-鼻型细胞、肠病型-T细胞淋巴瘤细胞、肝脾T细胞淋巴瘤细胞、母细胞性NK细胞淋巴瘤细胞、蕈样霉菌病(Sezary综合症)、原发性皮肤CD30阳性T细胞淋巴组织增殖性疾病(例如，原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤或淋巴瘤样丘疹病)细胞、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤细胞、外周T细胞淋巴瘤-未分类细胞、间变性大细胞淋巴瘤细胞、霍奇金淋巴瘤细胞或结节性淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤细胞。在另一具体的可选方案中，肿瘤细胞是多发性骨髓瘤细胞或骨髓增生异常综合征细胞。
在具体的可选方案中，肿瘤细胞是实体肿瘤细胞，例如癌瘤细胞，例如腺癌细胞、肾上腺皮质癌细胞、结肠腺癌细胞、结直肠腺癌细胞、结肠直肠癌细胞、导管细胞癌细胞、肺癌细胞、甲状腺癌细胞、鼻咽癌细胞、黑素瘤细胞(例如恶性黑素瘤细胞)、非黑素瘤皮肤癌细胞或未分类癌细胞；硬纤维瘤细胞；促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤细胞；内分泌肿瘤细胞；尤因肉瘤细胞；生殖细胞肿瘤细胞(例如睾丸癌细胞、卵巢癌细胞、绒毛膜癌细胞、内胚窦瘤细胞、生殖细胞瘤细胞等)；肝母细胞瘤细胞；肝细胞癌细胞；成神经细胞瘤细胞；非横纹肌肉瘤软组织肉瘤细胞；骨肉瘤细胞；成视网膜细胞瘤细胞；横纹肌肉瘤细胞；或肾母细胞瘤细胞。在另一可选方案中，肿瘤细胞是胰腺癌细胞或乳腺癌细胞。在其他可选方案中，实体肿瘤细胞是听神经瘤细胞；星形细胞瘤细胞(例如，I级毛细胞星形细胞瘤细胞，II级低级星形细胞瘤细胞；III级间变性星形细胞瘤细胞；或IV级多形性成胶质细胞瘤细胞)；脊索瘤细胞；颅咽管瘤细胞；神经胶质瘤细胞(例如，脑干神经胶质瘤细胞；室管膜瘤细胞；混合性神经胶质瘤细胞；视神经胶质瘤细胞；或室管膜下瘤细胞)；成胶质细胞瘤细胞；髓母细胞瘤细胞；脑膜瘤细胞；转移性脑肿瘤细胞；少突胶质细胞瘤；松果体细胞瘤细胞；垂体瘤细胞；原始神经外胚层肿瘤细胞；或神经鞘瘤细胞。在另一可选方案中，肿瘤细胞是前列腺癌细胞。
如本文所用，“治疗有益的”和“治疗有益效果”包括但不限于，例如肿瘤大小的减小；肿瘤扩增的减少或停止；减少或预防转移性疾病；每单位体积的组织样品(例如血液样品)中癌细胞数量的减少；所述个体具有的特定癌症或肿瘤的任何症状的临床改善，个体具有的特定癌症的任何症状的恶化减轻或停止，等等。
c.6.9.3.使用GM NK细胞和其他抗癌剂治疗癌症
利用本文所述的GM NK细胞给患有癌症的个体提供治疗可以是包括一种或多种其他抗癌剂的抗癌治疗方案的部分。另外地或可选地，利用本文所述的GM NK细胞给患有癌症的个体提供治疗可用于补充包括一种或多种其他抗癌剂的抗癌疗法。此类抗癌剂在本领域中是公知的，且包括抗炎剂、免疫调节剂、细胞毒性剂、癌症疫苗、化疗剂、HDAC抑制剂(例如，HDAC6i(ACY-241))和siRNA。除了本文所述的GM NK细胞外，还可以施用于患有癌症的个体(例如具有肿瘤细胞的个体)的特定抗癌剂包括但不限于：阿西维辛；阿柔比星；盐酸阿索达唑；阿克罗宁；阿多来新；阿霉素；氟尿嘧啶(adrucil)；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；醋酸阿美坦醌；安吖啶；阿那曲唑；安曲霉素；天冬酰胺酶(例如，来自Erwinia chrysan；Erwinaze)；曲林菌素；阿瓦斯丁(贝伐单抗)；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴马司他；苯佐替派；比卡鲁胺；盐酸比生群；二甲磺酸双奈法德(bisnafide dimesylate)；比折来新；硫酸博来霉素；布喹那钠；溴匹立明；白消安；放线菌素；卡普睾酮；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡莫司汀；盐酸卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；塞来考昔(COX-2抑制剂)；柔红霉素(Cerubidine)；苯丁酸氮芥；西罗里霉素；顺铂；克拉屈滨；甲磺酸克雷斯托(crisnatolmesylate)；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪；放线菌素D；盐酸柔红霉素；地西他滨；右奥马铂；地扎胍宁；甲磺酸地扎胍宁；地吖醌；多西他赛；多柔比星；盐酸多柔比星；屈洛昔芬；柠檬酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；达佐霉素；依达曲沙；盐酸依氟鸟氨酸；依沙芦星；爱施巴(Elspar)；恩洛铂；恩普氨酯；依匹哌啶；盐酸表柔比星；厄布洛唑；盐酸阿柔比星；雌莫司汀；雌莫司汀磷酸钠；依他硝唑；依托泊苷；依托泊苷磷酸盐；凡毕复(Etopophos)；埃托宁；法倔唑盐酸盐；法扎拉滨；芬维A胺；氟尿苷；氟达拉滨磷酸盐；氟尿嘧啶；氟西他滨；磷喹酮；福斯曲星钠；吉西他滨；盐酸吉西他滨；羟基脲；去甲柔毛霉素(Idamycin)；盐酸伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；异丙铂；伊立替康；盐酸伊立替康；醋酸兰瑞肽；来曲唑；醋酸亮丙瑞林；利罗唑盐酸盐；洛美曲索钠；洛莫司汀；洛索蒽酮盐酸盐；马索罗酚；美登素；盐酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美仑孕酮；美法仑；美诺立尔；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤钠；氯苯氨啶；美乌替派；米丁度胺；米托卡星；丝裂红素(mitocromin)；米托洁林；丝裂马菌素；丝裂霉素；米托司培；米托坦；米托蒽醌盐酸盐；霉酚酸；诺考达唑；诺加霉素；奥马铂；奥昔舒仑；紫杉醇；培门冬酶；培利霉素；戊氮芥；硫酸培洛霉素；培磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；盐酸吡罗蒽醌；普卡霉素；普洛美坦；卟菲尔钠；紫菜霉素；泼尼莫司汀；丙卡巴嗪盐酸盐；阿地白介素(Proleukin)；巯基嘌呤(Purinethol)；嘌呤霉素；嘌呤霉素盐酸盐；吡唑呋喃菌素；甲氨蝶呤(Rheumatrex)；利波腺苷；沙芬戈；盐酸沙芬戈；司莫司汀；辛曲秦；磷乙酰天冬氨酸钠(sparfosate sodium)；稀疏霉素；盐酸螺旋锗；螺莫司汀；螺铂；链黑菌素；链脲佐菌素；磺氯苯脲；Tabloid；他利霉索；替可加兰钠；泰索帝；替加氟；盐酸替罗蒽醌；替莫泊芬；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酯；硫咪嘌呤；硫鸟嘌吟；塞替派；噻唑呋林；替拉扎明；Toposar；托瑞米芬柠檬酸盐；醋酸曲托龙；甲氨蝶呤(Trexall)；磷酸曲西立滨；三甲曲沙；葡糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；盐酸妥布氯唑；乌拉莫司汀(uracil mustard)；乌瑞替派；伐普肽；维替泊芬；硫酸长春碱；硫酸长春新碱；长春地辛；硫酸长春地辛；硫酸长春新碱；硫酸长春甘酯；硫酸长春瑞林；酒石酸长春瑞滨；硫酸长春罗定；硫酸长春利定；伏氯唑；折尼铂；净司他丁；和/或盐酸佐柔比星。
可以在涉及GM NK细胞的一些考虑的方法中提供的其他抗癌药物包括但不限于：20-表-1,25二羟基维生素D3；5-氮杂胞苷；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙；阿克拉霉素；酰基富烯(acylfulvene)；腺环戊醇(adecypenol)；阿多来新；阿地白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺；氨莫司汀；艾美多(amidox)；氨磷汀；氨基乙酰丙酸；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心莲内酯；血管生成抑制剂；拮抗剂D；拮抗剂G；安雷利克斯；抗背侧化形态形成蛋白(anti-dorsalizing morphogenetic protein)-1；抗雄激素，前列腺癌；抗雌激素；抗瘤酮；反义寡核苷酸；阿非迪霉素甘氨酸盐(aphidicolin glycinate)；凋亡基因调节剂；凋亡调节剂；无嘌呤酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；奥沙那宁(asulacrine)；阿他美坦；阿莫司汀(atrimustine)；乌司他丁(axinastatin)1；乌司他丁2；乌司他丁3；阿扎司琼；阿扎毒素(azatoxin)；重氮酪氨酸；浆果赤霉素III衍生物；班兰诺(balanol)；巴马司他；BCR/ABL拮抗剂；苯并二氢卟吩(benzochlorins)；苯甲酰基星形孢菌素(benzoylstaurosporine)；β-内酰胺衍生物；β-阿立辛(β-alethine)；β-可来霉素B(betaclamycin B)；桦木酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；比生群；双氮丙啶基精胺(bisaziridinylspermine)；双奈法德；Bistratene A；比折来新；比锐来特(breflate)；溴匹立明；布朵替坦；丁硫氨酸亚砜胺；卡泊三醇；卡弗他丁(calphostin)C；依立替康(camptosar)(也称Campto；伊立替康)喜树碱衍生物；卡培他滨；甲酰胺-氨基-三唑；羧基酰胺三唑；CaRest M3；CARN 700；软骨源抑制剂；卡折来新；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；栗树精胺；CC-122；CC-220；CC-486；杀菌肽B；西曲瑞克；二氢卟酚(chlorlns)；氯喹喔啉磺酰胺；西卡前列素；顺式卟啉；克拉屈滨；克罗米芬类似物；克霉唑；克立霉素(collismycin)A；克立霉素B；考布他汀A4；考布他汀类似物；康纳京尼(conagenin)；卡那贝西汀(crambescidin)816；克雷斯托(crisnatol)；念珠藻素(cryptophycin)8；念珠藻素A衍生物；卡拉新(curacin)A；环戊蒽醌类(cyclopentanthraquinones)；环普兰姆(cycloplatam)；西匹霉素(cypemycin)；阿糖胞苷烷磷酯(cytarabine ocfosfate)；细胞溶解因子；血清胱抑素(cytostatin)；达昔单抗(dacliximab)；地西他滨；脱氢膜海鞘素(dehydrodidemnin)B；地洛瑞林；地塞米松；右异环磷酰胺(dexifosfamide)；右丙亚胺；右维拉帕米(dexverapamil)；亚丝醌(diaziquone)；膜海鞘素(didemnin)B；地多西(didox)；二乙基降精胺(diethylnorspermine)；二氢-5-氮杂胞苷；9-二氢紫杉醇；二恶霉素(dioxamycin)；二苯基螺莫司汀；多西他赛；二十二烷醇；多拉司琼；脱氧氟尿苷；多柔比星；屈洛昔芬；屈大麻酚；杜洛霉素SA；依布硒啉；依考莫司汀；依地福新；依决洛单抗；依氟鸟氨酸；榄香烯；乙嘧替氟；表柔比星；依立雄胺；雌莫司汀类似物；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依他硝唑；依托泊苷磷酸盐；依西美坦；法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；非格司亭；非那雄胺；夫拉平度；氟卓斯汀(flezelastine)；夫斯特隆(fluasterone)；氟达拉滨(例如，Fludara)；盐酸氟道诺霉素；福酚美克(forfenimex)；福美坦；福司曲星(fostriecin)；福莫司汀；钆特沙弗林；硝酸镓；加洛他滨(galocitabine)；加尼瑞克；明胶酶抑制剂；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂；普苏姆(hepsulfam)；heregulin；六亚甲基二乙酰胺；金丝桃素；伊班膦酸；伊达比星；碘昔芬；伊决孟酮(idramantone)；伊莫福新；伊洛马司他(ilomastat)；伊马替尼(例如
Figure BDA0002182352220000731
)，咪喹莫特；免疫刺激肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白细胞介素；碘苄胍(iobenguane)；碘阿霉素(iododoxorubicin)；4-甘薯苦醇(ipomeanol，4-)；伊罗普拉(iroplact)；伊索拉定；异苯胍唑(isobengazole)；异高芽孢杆菌素(isohomohalicondrin)B；伊他司琼(itasetron)；jasplakinolide；kahalalide F；三乙酸片螺素-N；兰乐肽；leinamycin；来格司亭；香菇多糖硫酸酯；leptolstatin；来曲唑；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；亮丙瑞林+雌激素+黄体酮；亮丙瑞林；左旋咪唑；利阿唑；线性多胺类似物；亲脂性二糖肽；亲脂性铂化合物；立索克林酰胺(lissoclinamide)7；洛铂；蚯蚓磷脂(lombricine)；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽醌；洛索立宾；勒托替康；镥德卟啉(lutetium texaphyrin)；立索茶碱(lysofylline)；裂解肽；美坦辛(maitansine)；麦洛坦汀(mannostatin)A；马马司他；马索罗酚；丝抑蛋白(maspin)；基质溶解素抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔(menogaril)；麦尔巴隆(merbarone)；美替瑞林(meterelin)；甲硫氨酸酶；甲氧氯普胺；MIF抑制剂；米非司酮；米替福新；米立司亭(mirimostim)；米托胍腙(mitoguazone)；二溴卫矛醇；丝裂霉素类似物；米托萘胺(mitonafide)；迈托毒素成纤维细胞生长因子-皂草素(mitotoxin fibroblast growth factor-saporin)；米托蒽醌；莫法罗汀(mofarotene)；莫拉司亭；抗EGFR抗体(例如，爱必妥(西妥昔单抗))；抗CD19抗体；抗CD20抗体(例如，利妥昔单抗)；抗CS-1抗体(例如，埃罗妥珠单抗(elotuzumab)(BMS/AbbVie))；抗CD38抗体(例如，达托木单抗(Genmab/Janssen Biotech)；抗CD138抗体(例如，吲达昔单抗(Biotest AG Dreieich))；抗PD-1抗体；抗PD-L1抗体(例如，度伐单抗(AstraZeneca))；抗NKG2A抗体(例如，monalizumab(IPH2201；Innate Pharma))；抗DLL4抗体(例如，demcizumab(Oncomed/Celgene))；抗DLL4和抗VEGF双特异性抗体；抗RSPO3抗体；抗-TIGIT抗体；ICOS激动剂抗体；抗-双唾液酸神经节苷脂(GD2)抗体(例如，单克隆抗体3F8或ch14.18)；抗ErbB2抗体(例如，赫赛汀)；人绒毛膜促性腺激素；单磷酰脂质A+分枝杆菌细胞壁sk；单哌潘生丁；氮芥类抗癌剂；美卡普罗(mycaperoxide)B；分枝杆菌细胞壁提取物；myriaporone；N-乙酰地那林；N-取代苯甲酰胺类；那法瑞林；纳格瑞替(nagrestip)；纳洛酮+喷他佐辛；纳普维(napavin)、萘特非(naphterpin)；那托司亭；奈达铂；奈莫柔比星；奈立膦酸；尼鲁米特；丽沙霉素(nisamycin)；一氧化氮调节剂；氮氧化物抗氧化剂；硝普林(nitrullyn)；奥利默森
Figure BDA0002182352220000741
O6-苄基鸟嘌呤；奥曲肽；奥克恩(okicenone)；寡核苷酸；奥那司酮；昂丹司琼；奥坦西隆；奥拉新(oracin)；口服细胞因子诱导剂；奥马铂；奥沙特隆；奥沙利铂(例如，Floxatin)；厄诺霉素(oxaunomycin)；紫杉醇；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；帕诺明(palauamine)；十六酰基根霉素(palmitoylrhizoxin)；帕米膦酸；人参炔三醇；帕诺米芬(panomifene)；帕拉贝新(parabactin)；帕折普汀(pazelliptine)；培门冬酶；皮地新(peldesine)；戊聚糖多硫酸钠；喷司他丁；pentrozole；全氟溴烷；培磷酰胺(perfosfamide)；紫苏醇；苯连氮霉素(phenazinomycin)；苯基乙酸酯；磷酸酶抑制剂；毕西巴尼；盐酸毛果芸香碱；吡柔比星；吡曲克辛；普来司汀(placetin)A；普来司汀B；纤溶酶原激活物抑制剂；铂络合物；铂化合物；铂-三胺复合物；卟菲尔钠；泊非罗霉素；强的松；丙基双吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶体抑制剂；基于蛋白A的免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；蛋白激酶C抑制剂，微藻；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；羟基茜草素；吡唑啉吖啶(pyrazoloacridine)；吡哆酰基化血红蛋白聚氧乙烯偶联物；raf拮抗剂；雷替曲塞；雷莫司琼；ras法尼基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；去甲基化瑞替普汀；铼Re 186依替膦酸盐；根霉素；核酶；RII视黄酰胺；罗希吐碱(rohitukine)；罗莫肽(romurtide)；罗喹美克；鲁滨吉隆(rubiginone)B1；鲁泊塞(ruboxyl)；沙芬戈(safingol)；圣特平(saintopin)；SarCNU；肌肉叶绿醇(sarcophytol)A；沙格司亭；Sdi 1模拟物；司莫司汀；衰老源性抑制剂1；正义寡核苷酸；信号转导抑制剂；西佐喃；索布佐生；硼卡钠；苯乙酸钠；索佛罗(solverol)；生长调节素结合蛋白；索纳明(sonermin)；斯帕磷酸；斯皮卡霉素(Spicamycin)D；螺莫司汀(spiromustine)；斯耐潘定(splenopentin)；海绵抑制素1；角鲨胺；斯替皮米德(stipiamide)；溶基质素抑制剂；索非罗新(sulfinosine)；超活性血管活性肠肽拮抗剂；suradista；苏拉明；苦马豆素；他莫司汀(tallimustine)；他莫昔芬甲碘化物；牛磺莫司汀(tauromustine)；他扎罗汀；替可加兰钠；替加氟；碲哌喃鎓(tellurapyrylium)；端粒酶抑制剂；替莫泊芬；替尼泊苷；四氯十氧化物(tetrachlorodecaoxide)；替唑明(tetrazomine)；噻立拉斯汀(thaliblastine)；噻可拉林(thiocoraline)；血小板生成素；血小板生成素模拟物；胸腺法新；促胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南(thymotrinan)；促甲状腺激素；锡乙基初卟啉(tin ethyl etiopurpurin)；替拉扎明；二氯化二茂钛；托普升替(topsentin)；托瑞米芬；翻译抑制剂；维A酸；三乙酰尿苷；曲西立滨；曲美沙特；曲普瑞林；托烷司琼；妥罗雄脲(turosteride)；酪氨酸激酶抑制剂；酪氨酸磷酸化抑制剂；UBC抑制剂；乌苯美司；泌尿生殖窦源性生长抑制因子；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽；凡瑞林(variolin)B；维克替比(Vectibix)(帕尼单抗)维拉雷琐(velaresol)；凡拉明(veramine)；凡啶(verdins)；维替泊芬；长春瑞滨；维萨汀(vinxaltine)；维他欣(vitaxin)；伏氯唑；Welcovorin(亚叶酸)；希罗达(卡培他滨)；扎诺特隆；折尼铂；亚苄维C(zilascorb)；和/或净司他丁斯酯。
使用本文所述的GM NK细胞给患有癌症的个体提供的治疗可以是抗癌治疗方案的部分，所述抗癌治疗方案包括一种或多种免疫检查点调节剂。在某些可选方案中，免疫检查点调节剂调节免疫检查点分子如CD28、OX40、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白(GITR)、CD137(4-1BB)、CD27、疱疹病毒进入介体(HVEM)、含T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域-3(TIM-3)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)、T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制剂(VISTA)、B和T淋巴细胞衰减剂(BTLA)、PD-1和/或PD-L1。在某些可选方案中，免疫检查点分子是抗体或其抗原结合片段。在某些可选方案中，免疫检查点调节剂是免疫检查点分子的激动剂。在某些可选方案中，免疫检查点分子是CD28、OX40、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白(GITR)、CD137(4-1BB)、CD27、ICOS(CD278)；诱导性T细胞共刺激剂和/或疱疹病毒进入介体(HVEM)。在某些可选方案中，免疫检查点调节剂是抗体或其抗原结合片段。在某些可选方案中，免疫检查点调节剂是免疫检查点分子的拮抗剂。在某些可选方案中，免疫检查点分子是含T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域-3(TIM-3)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)、T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制剂(VISTA)、B和T淋巴细胞衰减剂(BTLA)、PD-1和/或PD-L1。在某些可选方案中，免疫检查点调节剂是抗体或其抗原结合片段。在某些可选方案中，免疫检查点调节剂是抗体或其抗原结合片段。在某些可选方案中，抗体或其抗体结合片段结合PD-1。在某些可选方案中，结合PD-1的抗体或其抗体结合片段是纳武单抗(nivolumab)(
Figure BDA0002182352220000761
BMS-936558，MDX-1106，ONO-4538；Bristol-Myers Squibb，Ono Pharmaceuticals，Inc.)、派姆单抗(pembrolizumab)(
Figure BDA0002182352220000762
lambrolizumab，MK-3475；Merck)、pidilizumab(CT-011；Curetech,Medivation)；MEDI0680(AMP-514；MedImmune，AstraZeneca)；PDR-001(Novartis)、SHR1210或INCSHR1210；Incyte,Jiangsu Hengrui)。在某些可选方案中，抗体或其抗原结合片段结合PD-L1。在某些可选方案中，结合PD-L1的抗体或其抗体结合片段是度伐单抗(MEDI4736；MedImmune，AstraZeneca)、BMS-936559(MDX-1105；Bristol-Myers Squibb)、avelumab(MSB0010718C；Merck Serono，Pfizer)，或阿特朱单抗(MPDL-3280A；Genentech，Roche)。在某些可选方案中，抗体或其抗体结合片段结合LAG-3。在某些可选方案中，结合LAG-3的抗体或其抗体结合片段是BMS-986016(Bristol-Myers Squibb)、GSK2831781(GlaxoSmithKline)或LAG525(Novartis)。在某些可选方案中，抗体或其抗体结合片段结合CTLA-4。在某些可选方案中，结合CTLA-4的抗体或其抗体结合片段是伊匹单抗(YERVOYTM，BMS-734016，MDX010，MDX-101；Bristol-Myers Squibb)或tremelimumab(CP-675,206；MedImmune，AstraZeneca)。在某些可选方案中，抗体或其抗体结合片段结合OX40。在某些可选方案中，结合OX40的抗体或其抗体结合片段是MEDI6469(MedImmune，AstraZeneca)、MEDI0562(MedImmune，AstraZeneca)或KHK4083(Kyowa Hakko Kirin)。在某些可选方案中，抗体或其抗体结合片段结合GITR。在某些可选方案中，结合GITR的抗体或其抗体结合片段是TRX518(LeapTherapeutics)或MEDI1873(MedImmune，AstraZeneca)。在某些可选方案中，抗体或其抗体结合片段结合CD137(4-1BB)。在某些可选方案中，结合CD137(4-1BB)的抗体或其抗体结合片段是PF-2566(PF-05082566；Pfizer)或urelumab(BMS-663513；Bristol-Myers Squibb)。在某些可选方案中，抗体或其抗体结合片段结合CD27。在某些可选方案中，结合CD27的抗体或其抗体结合片段是varilumab(CDX-1127；Celldex Therapies)。
在某些可选方案中，利用本文所述的GM NK细胞治疗患有癌症的个体的疗法是包括来那度胺或泊马度胺的抗癌治疗方案的部分。在某些可选方案中，利用本文所述的GM NK细胞治疗患有癌症的个体的疗法是包括HDAC抑制剂的抗癌治疗方案的部分。在某些可选方案中，利用本文所述的GM NK细胞治疗患有癌症的个体的疗法是包括抗CS-1抗体的抗癌治疗方案的部分。在某些可选方案中，利用本文所述的GM NK细胞治疗患有癌症的个体的疗法是包括抗CD38抗体的抗癌治疗方案的部分。在某些可选方案中，利用本文所述的GM NK细胞治疗患有癌症的个体的疗法是包括抗CD138抗体的抗癌治疗方案的部分。在某些可选方案中，利用本文所述的GM NK细胞治疗患有癌症的个体的疗法是包括抗PD-1抗体的抗癌治疗方案的部分。在某些可选方案中，利用本文所述的GM NK细胞治疗患有癌症的个体的疗法是包括抗PD-L1抗体的抗癌治疗方案的部分。在某些可选方案中，利用本文所述的GM NK细胞治疗患有癌症的个体的疗法是包括抗NKG2A抗体的抗癌治疗方案的部分。在某些可选方案中，利用本文所述的GM NK细胞治疗患有癌症的个体的疗法是包括抗CD20抗体(例如，利妥昔单抗；
Figure BDA0002182352220000781
)的抗癌治疗方案的部分。在某些可选方案中，利用本文所述的GMNK细胞治疗患有癌症的个体的疗法是包括CC-122的抗癌治疗方案的部分。在某些可选方案中，利用本文所述的GM NK细胞治疗患有癌症的个体的疗法是包括CC-220的抗癌治疗方案的部分。在某些可选方案中，利用本文所述的GM NK细胞治疗患有癌症的个体的疗法是包括抗DLL4抗体(例如，demcizumab)的抗癌治疗方案的部分。在某些可选方案中，利用本文所述的GM NK细胞治疗患有癌症的个体的疗法是包括抗DLL4和抗VEGF双特异性抗体的抗癌治疗方案的部分。在某些可选方案中，利用本文所述的GM NK细胞治疗患有癌症的个体的疗法是包括抗RSPO3抗体的抗癌治疗方案的部分。在某些可选方案中，利用本文所述的GM NK细胞治疗患有癌症的个体的疗法是包括抗TIGIT抗体的抗癌治疗方案的部分。在某些可选方案中，利用本文所述的GM NK细胞治疗患有癌症的个体的疗法是包括ICOS激动剂抗体的抗癌治疗方案的部分。
在一些可选方案中，利用本文所述的GM NK细胞治疗患有癌症的个体的疗法是用于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的抗癌治疗方案的部分。在一个可选方案中，ADCC方案包括与本文所述的GM NK细胞组合施用一种或多种抗体(例如前述段落中描述的抗体)。可以使用这样的ADCC方法抑制或治疗几种类型的癌症，包括但不限于急性淋巴母细胞性白血病(ALL)或其他B细胞恶性肿瘤(淋巴瘤和白血病)、成神经细胞瘤、黑素瘤、乳腺癌和头颈癌。在具体的可选方案中，ADCC疗法包括与本文所述的GM NK细胞组合施用一种或多种以下抗体：抗EGFR抗体(例如，爱必妥(西妥昔单抗))、抗CD19抗体、抗CD20抗体(例如，利妥昔单抗)、抗-双唾液酸神经节苷脂(GD2)抗体(例如，单克隆抗体3F8或ch14.18)或抗ErbB2抗体(例如，赫赛汀)。在一个可选方案中，ADCC方案包括与本文所述的GM NK细胞组合施用抗CD33抗体。在一个可选方案中，ADCC方案包括与本文所述的GM NK细胞组合施用抗CD20抗体。在一个可选方案中，ADCC方案包括与本文所述的GM NK细胞组合施用抗CD138抗体。在一个可选方案中，ADCC方案包括与本文所述的GM NK细胞组合施用抗CD32抗体。
d.6.9.4.病毒感染的治疗
在另一可选方案中，本文提供了治疗患有病毒感染的个体的方法，其包括向所述个体施用治疗有效量的本文所述的GM NK细胞。在某些可选方案中，个体具有自然杀伤细胞的缺陷，例如缺乏具有针对个体的病毒感染的活性的NK细胞或其他先天淋巴样细胞。在某些具体的可选方案中，本文所述的GM NK细胞在所述施用之前接触或接近免疫调节化合物(例如上述免疫调节化合物)或沙利度胺。在某些其他具体可选方案中，除了本文所述的GMNK细胞外，所述施用包括向所述个体施用免疫调节化合物(例如上述免疫调节化合物)或沙利度胺，其中所述量为例如导致所述病毒感染的一种或多种症状的可检测的改善、减缓其进展或消除所述病毒感染的一种或多种症状的量。在具体的可选方案中，病毒感染是由腺病毒科、微小核糖核酸病毒科、疱疹病毒科、肝脱氧核糖核酸病毒科、黄病毒科、逆转录病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、乳头瘤病毒科、弹状病毒科或披膜病毒科的病毒导致的感染。在更具体的可选方案中，所述病毒是人类免疫缺陷病毒(HIV)、柯萨奇病毒、甲型肝炎病毒(HAV)、脊髓灰质炎病毒、埃-巴二氏病毒(EBV)、1型单纯疱疹病毒(HSV1)、2型单纯疱疹病毒(HSV2)、人巨细胞病毒(CMV)、8型人疱疹病毒(HHV8)、带状疱疹病毒(水痘带状疱疹病毒(VZV)或带状疱疹(shingles)病毒)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)、流感病毒(例如，甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒或托高土病毒(thogotovirus))、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、乳头瘤病毒、狂犬病毒或风疹病毒。
在其他更具体的可选方案中，所述病毒是腺病毒种A，血清型12、18或31；腺病毒种B，血清型3、7、11、14、16、34、35或50；腺病毒种C，血清型1、2、5或6；种D，血清型8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、33、36、37、38、39、42、43、44、45、46、47、48、49或51；种E，血清型4；或种F，血清型40或41。
在某些其他更具体的可选方案中，所述病毒是阿波依(Apoi)病毒(APOIV)、Aroa病毒(AROAV)、巴格扎病毒(BAGV)、斑齐(benzi)病毒(BANV)、博博衣病毒(BOUV)、Cacipacore病毒(CPCV)、卡勒岛病毒(CIV)、牛骨山脊(Cowbone Ridge)病毒(CRV)、登革热病毒(DENV)、埃杰山病毒(EHV)、加德格兹谷(Gadgets Gully)病毒(GGYV)、伊列乌斯病毒(ILHV)、以色列火鸡脑膜脑脊髓炎病毒(ITV)、日本脑炎病毒(JEV)、朱格拉病毒(JUGV)、朱蒂亚帕病毒(JUTV)、凯丹姆病毒(KADV)、凯多各病毒(KEDV)、科科贝拉病毒(KOKV)、科坦戈病毒(KOUV)、科萨努尔森林病病毒(KFDV)、兰加特病毒(LGTV)、米班(Meaban)病毒(MEAV)、摩多克病毒(MODV)、蒙大纳鼠耳蝠白质脑炎病毒(MMLV)、墨莱溪谷脑炎病毒(MVEV)、恩塔亚(Ntaya)病毒(NTAV)、鄂木斯克出血热病毒(OHFV)、波瓦桑病毒(POWV)、里约布拉沃病毒(RBV)、皇家农场病毒(RFV)、Saboya病毒(SABV)、圣路易斯脑炎病毒(SLEV)、萨尔别霍(Sal Vieja)病毒(SVV)、圣帕利塔(San Perlita)病毒(SPV)、索马里滋礁病毒(SREV)、塞皮克(Sepik)病毒(SEPV)、坦布苏(Tembusu)病毒(TMUV)、蜱传脑炎病毒(TBEV)、秋列尼(Tyuleniy)病毒(TYUV)、乌干达S病毒(UGSV)、乌苏图(Usutu)病毒(USUV)、韦塞尔斯布朗(Wesselsbron)病毒(WESSV)、西尼罗病毒(WNV)、雅温得病毒(YAOV)、黄热病病毒(YFV)、横须贺(Yokose)病毒(YOKV)或寨卡病毒(ZIKV)。
在其他可选方案中，本文所述的GM NK细胞作为包括一种或多种其他抗病毒剂的抗病毒治疗方案的部分施用于患有病毒感染的个体。在一些可选方案中，个体已经被选择来接受遗传修饰的NK细胞抗病毒剂。可以施用于患有病毒感染的个体的特定抗病毒剂包括但不限于：咪喹莫特、普达非洛、盾叶鬼臼树脂、干扰素α(IFNα)、reticolos、壬苯醇醚-9、阿昔洛韦、泛昔洛韦、伐昔洛韦、更昔洛韦、西多福韦；金刚烷胺、金刚乙胺；利巴韦林；扎那马韦和奥塞洛韦；蛋白酶抑制剂，如茚地那韦、奈非那韦、利托那韦或沙奎那韦；核苷逆转录酶抑制剂，如双脱氧腺苷、拉米夫定、司他夫定、扎西他滨或齐多夫定；和非核苷逆转录酶抑制剂，如奈韦拉平或依法韦仑。
e.6.9.5.施用
分离的GM NK细胞群体或其药物组合物的施用可以是全身性的或局部的。在具体的可选方案中，施用是肠胃外的。在具体的可选方案中，向受试者施用分离的GM NK细胞群体或其药物组合物是通过注射、输注、静脉内(IV)施用、股骨内施用或肿瘤内施用。在具体的可选方案中，向受试者施用分离的GM NK细胞群体或其药物组合物是利用装置、基质或支架进行的。在具体的可选方案中，向受试者施用分离的GM NK细胞群体或其药物组合物是通过注射。在具体的可选方案中，向受试者施用分离的GM NK细胞群体或其药物组合物是通过导管。在具体的可选方案中，GM NK细胞的注射是局部注射。在更具体的可选方案中，局部注射是直接进入实体肿瘤(例如，肉瘤)中。在具体的可选方案中，向受试者施用分离的GM NK细胞群体或其药物组合物是通过采用注射器的注射。在具体的可选方案中，向受试者施用分离的GM NK细胞群体或其药物组合物是通过导引递送。在具体的可选方案中，分离的GMNK细胞群体或其药物组合物通过注射施用于受试者通过腹腔镜检查、内窥镜检查、超声、计算机断层扫描、磁共振或放射学辅助。
i.6.9.5.1.细胞的施用
在某些可选方案中，本文所述的GM NK细胞以对个体导致可检测的治疗益处的任何量或数量(例如有效量)使用，例如施用于个体，其中个体具有病毒感染、癌症或肿瘤细胞，例如具有肿瘤细胞、实体肿瘤或血液癌症的个体，例如癌症患者。这样的细胞可以按照细胞的绝对数量施用于这样的个体，例如，所述个体可以施用以下数量、至少以下数量或至多以下数量本文所述的GM NK细胞：1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010或1×1011个，或由上述任意两个值限定的范围中的任何细胞数量。在其他可选方案中，本文所述的GM NK细胞可以按照相对细胞数量施用于这样的个体，例如，所述个体可以施用以下数量、至少以下数量或至多以下数量本文所述的GMNK细胞：1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010或1×1011个细胞/千克个体体重，或由上述任意两个值限定的范围中的任何细胞数量/千克个体体重。在其他可选方案中，本文所述的GM NK细胞可以按照相对细胞数量施用于这样的个体，例如，所述个体可以施用以下数量、至少以下数量或至多以下数量本文所述的GM NK细胞：1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108或5×108个本文所述的GM NK细胞/千克个体体重，或由上述任意两个值限定的范围中的任何细胞数量/千克个体体重。本文所述的GM NK细胞可以根据GM NK细胞的数量与所述个体中的肿瘤细胞数量(例如，估计数量)之间的大致比率施用于这样的个体。例如，本文所述的GM NK细胞可以相对于个体中肿瘤细胞数量以，至少或至多1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1的比率，或上述任意两个比率限定的范围中的GM NK细胞与个体中肿瘤细胞数量的比率，施用于所述个体。可以通过例如计数来自个体的组织样品(例如血液样品，活组织检查等)中的肿瘤细胞数目来估计这样的个体中肿瘤细胞的数量。在具体的可选方案中，例如，对于实体肿瘤，所述计数与一个或多个肿瘤的成像结合进行以获得大致的肿瘤体积。在具体的可选方案中，除了本文所述的GM NK细胞之外，向个体施用免疫调节化合物或沙利度胺，例如有效量的免疫调节化合物或沙利度胺。
在某些可选方案中，抑制(例如，个体中的)肿瘤细胞增殖的方法，治疗具有个体的自然杀伤细胞的缺陷的个体的方法，或治疗患有病毒感染的个体的方法，或治疗患有癌症的个体(例如具有肿瘤细胞、血液癌症或实体肿瘤的个体)的方法包括使肿瘤细胞接近或向所述个体施用GM NK细胞和一种或多种胎盘灌流液和/或胎盘灌流液细胞的组合。在具体的可选方案中，该方法另外包括使肿瘤细胞接近或向个体施用免疫调节化合物或沙利度胺。
在具体的可选方案中，例如，治疗具有个体自然杀伤细胞的缺陷(例如，NK细胞数量或NK细胞对癌症、肿瘤或病毒性感染细胞的反应性的缺陷)的个体的疗法，或治疗患有癌症或病毒感染的个体的疗法或抑制肿瘤细胞增殖包括使所述肿瘤细胞接近或向所述个体施用本文所述的GM NK细胞，其补充有分离的胎盘灌流液细胞或胎盘灌流液。在具体的可选方案中，使用本文所述的方法产生每毫升1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108或更多的NK细胞，或产生由上述任意两个值限定的范围中的任何每毫升细胞数，或使用本文所述的方法产生1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011，或更多的GMNK细胞，或由上述任意两个值限定的范围中的每毫升的任何细胞数，其补充有或至少约1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108或更多的分离的胎盘灌流液细胞/毫升，或者1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011或更多的分离的胎盘灌流液细胞。在其他更具体的可选方案中，使用本文所述的方法产生约1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108或更多的GM NK细胞，或产生由上述任意两个值限定的范围中任何GM NK细胞数，或使用本文所述的方法产生1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011或更多的GM NK细胞，或由上述任意两个值限定的范围中任何GM NK细胞数，其补充有，或至少，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000mL灌流液，或约1单位的灌流液。
在另一个具体的可选方案中，治疗具有个体的自然杀伤细胞缺陷的个体的疗法，治疗患有癌症的个体的疗法，治疗患有病毒感染的个体的疗法或肿瘤细胞增殖的抑制包括使肿瘤细胞接近或向个体施用本文所述的GM NK细胞，其中所述细胞补充有粘附胎盘细胞，例如粘附胎盘干细胞或多能细胞，例如CD34-、CD10+、CD105+、CD200+组织培养塑料贴壁胎盘细胞。在具体的可选方案中，本文所述的GM NK细胞补充有1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108或更多的粘附胎盘干细胞/毫升，或由上述任意两个值限定的范围中的任何数量的贴壁胎盘干细胞/毫升，或1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011或更多粘附胎盘细胞，或由上述任意两个值限定的范围中的每毫升任何数量的粘附胎盘干细胞，例如粘附胎盘干细胞或多能细胞。
在另一个具体的可选方案中，治疗具有个体的自然杀伤细胞缺陷的个体的疗法，治疗患有癌症的个体的疗法，治疗患有病毒感染的个体的疗法或肿瘤细胞增殖的抑制使用免疫调节化合物或沙利度胺与本文所述的GM NK细胞结合进行，其中所述细胞补充有条件培养基，例如由CD34-、CD10+、CD105+、CD200+组织培养塑料贴壁胎盘细胞条件化的培养基，例如每单位灌流液或由上述任意两个值限定的范围中的任何体积，或者每104、105、106、107、108、109、1010或1011个本文所述的GM NK细胞或由上述任意两个值限定的范围中的任何数量的GM NK细胞，0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.1、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mL的干细胞条件培养基。在某些可选方案中，组织培养塑料贴壁胎盘细胞是在美国专利号7,468,276和8,057,788中描述的多能粘附胎盘细胞，其公开内容以引用的方式整体并入本文。在另一具体的可选方案中，所述方法另外包括使肿瘤细胞接近或向个体施用免疫调节化合物或沙利度胺。
在另一具体的可选方案中，治疗具有个体的自然杀伤细胞缺陷的个体的疗法，治疗患有癌症的个体的疗法，治疗患有病毒感染的个体的疗法或肿瘤细胞增殖的抑制(其中所述的本文所述GM NK细胞补充有胎盘灌流液细胞)，在所述接近之前，使灌流液细胞与白介素-2(IL-2)接近一段时间。在某些可选方案中，所述时间段为所述接近之前，至少或至多，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46或48小时，或由上述任意两个值限定的范围中的任何小时数。
本文所述的GM NK细胞及任选地灌注液或灌注液细胞可以在抗癌治疗期间一次性施用于患有病毒感染的个体、患有癌症的个体或具有肿瘤细胞的个体；或可以多次施用，例如治疗期间每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小时一次，或每1、2、3、4、5、6或7天一次，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、24、36或更多周一次。在一些可选方案中，在抗癌治疗期间每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小时或由上述任意两个值限定的范围中的任何时间量，将GM NK细胞一次施用于患有病毒感染的个体、患有癌症的个体或具有肿瘤细胞的个体。在一些可选方案中，在抗癌治疗期间每1、2、3、4、5、6或7天或由上述任意两个值限定的范围中的任何时间量，将GMNK细胞一次施用于患有病毒感染的个体、患有癌症的个体或具有肿瘤细胞的个体。在一些可选方案中，在抗癌治疗期间每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、24、36或更多周或由上述任意两个值限定的范围中的任何时间量，将GM NK细胞一次施用于患有病毒感染的个体、患有癌症的个体或具有肿瘤细胞的个体。在其中使用细胞及免疫调节化合物或沙利度胺的可选方案中，免疫调节化合物或沙利度胺以及细胞或灌流液可一起施用于个体，例如在相同的制剂中；分开地施用，例如以单独的制剂，大致同时地施用；或可以单独施用，例如，以不同的给药时间表或在一天中的不同时间施用。类似地，在其中使用细胞及抗病毒化合物或抗癌化合物的可选方案中，抗病毒化合物或抗癌化合物以及细胞或灌流液可一起施用于个体，例如在相同的制剂中；分开地施用，例如以单独的制剂，大致同时地施用；或可以单独地施用，例如，以不同的给药时间表或在一天中的不同时间施用。可以施用本文所述的GM NK细胞和灌注液或灌注液细胞，而不管在过去是否已经向个体施用过本文所述的GM NK细胞、灌流液或灌流液细胞。
10.试剂盒
本文提供了包含一个或多个容器的药物包装或试剂盒，所述容器填充有一种或多种本文所述组合物，例如包含一个或多个GM NK细胞群体的组合物。任选地与这样的容器相关联的可以是由管理药品或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的通告，该通告反映了政府机构关于用于人类施用的制造、使用或销售的批准。
本文涵盖的试剂盒可根据本文所述的方法使用，例如抑制肿瘤细胞生长的方法和/或治疗癌症(例如血液癌症)的方法和/或治疗病毒感染的方法。在一个可选方案中，试剂盒在一个或多个容器中包含本文所述的GM NK细胞或其组合物。在具体的可选方案中，本文提供了包含一个或多个本文所述的NK细胞群体或其组合物的试剂盒。
11.更多可选方案
在一些可选方案中，提供了自然杀伤细胞群体，其中自然杀伤(NK)细胞经遗传修饰以使得它们缺乏NK抑制性分子的表达或呈现出降低的NK抑制性分子的表达。在一些可选方案中，NK抑制性分子是CBLB、NKG2A和/或TGFBR2。在一些可选方案中，NK抑制性分子是CBLB。在一些可选方案中，CBLB表达已经被敲除。在一些可选方案中，通过CRISPR/CAS9系统、锌指核酸酶或TALEN核酸酶敲除CBLB表达。在一些可选方案中，通过CRISPR相关技术敲除CBLB表达。在一些可选方案中，CBLB表达的敲除导致与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比具有更高的对肿瘤细胞的细胞毒性的NK细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是多发性骨髓瘤细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是RPMI8226细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是U266细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是ARH77细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是急性髓性白血病细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是HL60细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是KG1细胞。在一些可选方案中，CBLB表达的敲除导致与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比，在用ICAM-1和MICA刺激时具有更高的IFNγ分泌的NK细胞。在一些可选方案中，CBLB表达的敲除导致与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比，在用ICAM-1和MICA刺激时具有更高的脱粒的NK细胞。在一些可选方案中，通过CD107a的增加来测量脱粒。在一些可选方案中，CBLB表达的敲除导致与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比，在与多发性骨髓瘤细胞共培养时具有GM-CSF、可溶性CD137(sCD137)、IFNγ、MIP1α、MIP1β、TNFα或穿孔素中一种或多种的分泌的改变的NK细胞。在一些可选方案中，NK抑制性分子是NKG2A。在一些可选方案中，NKG2A表达已经被敲除。在一些可选方案中，通过CRISPR/CAS9系统、锌指核酸酶或TALEN核酸酶敲除NKG2A表达。在一些可选方案中，通过CRISPR相关技术敲除NKG2A表达。在一些可选方案中，NKG2A表达的敲除导致与其中NKG2A未被敲除的NK细胞相比具有更高的对肿瘤细胞的细胞毒性的NK细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是多发性骨髓瘤细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是RPMI8226细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是U266细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是ARH77细胞。在一些可选方案中，NKG2A表达的敲除导致了与其中NKG2A未被敲除的NK细胞相比，在NKG2A激动剂抗体的存在下用ICAM-1和MICA刺激时具有更高的脱粒的NK细胞。在一些可选方案中，通过CD107a的增加来测量脱粒。在一些可选方案中，NKG2A表达的敲除导致了与其中NKG2A未被敲除的NK细胞相比，具有GM-CSF、可溶性CD137(sCD137)、IFNγ、MIP1α、MIP1β、TNFα或穿孔素中一种或多种的分泌的改变的NK细胞。在一些可选方案中，NK抑制性分子是TGFBR2。在一些可选方案中，TGFBR2表达已经被敲除。在一些可选方案中，通过CRISPR/CAS9系统、锌指核酸酶或TALEN核酸酶敲除TGFBR2表达。在一些可选方案中，通过CRISPR相关技术敲除TGFBR2表达。在一些可选方案中，TGFBR2表达的敲除导致与其中TGFBR2未被敲除的NK细胞相比对TGFβ介导的对肿瘤细胞的NK细胞细胞毒性抑制的抗性。在一些可选方案中，肿瘤细胞是多发性骨髓瘤细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是RPMI8226细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是急性髓性白血病细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是K562细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是慢性髓性白血病细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是HL-60细胞。在一些可选方案中，NK细胞是胎盘来源的(PNK细胞)。在一些可选方案中，自然杀伤细胞是CD56+CD3-CD117+CD11a+，表达穿孔素和/或EOMES，并且不表达RORγt、芳基烃受体和IL1R1中的一种或多种。在一些可选方案中，所述自然杀伤细胞表达穿孔素和EOMES，并且不表达RORγt、芳基烃受体或IL1R1中的任何一种。在所述方法的一些可选方案中，所述自然杀伤细胞另外表达T-bet、GZMB、NKp46、NKp30和NKG2D。在一些可选方案中，所述自然杀伤细胞表达CD94。在一些可选方案中，所述自然杀伤细胞不表达CD94。
在一些可选方案中，提供了自然杀伤细胞群体，其中自然杀伤(NK)细胞经遗传修饰以包含修饰的CD16。在一些可选方案中，修饰的CD16比野生型CD16具有更高的IgG亲和力。在一些可选方案中，修饰的CD16在CD16a的位置158处具有缬氨酸。在一些可选方案中，修饰的CD16对ADAM17切割具有抗性。在一些可选方案中，CD16在CD16a的位置197处具有脯氨酸。在某些可选方案中，修饰的CD16具有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列(MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSSETVNITITQGLAVPTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK；SEQ ID NO:1)。在一些可选方案中，修饰的CD16含有IgK信号肽。在一些可选方案中，修饰的CD16含有CD16信号肽。在一些可选方案中，修饰的CD16通过病毒感染引入NK细胞中。在一些可选方案中，修饰的CD16通过病毒感染引入造血细胞中，随后所述造血细胞分化成NK细胞。在一些可选方案中，修饰的CD16通过慢病毒载体引入。在一些可选方案中，慢病毒载体具有CMV或EF1α启动子。在一些可选方案中，慢病毒载体包含一个或多个药物选择标记。在一些可选方案中，修饰的CD16通过逆转录病毒载体引入。在一些可选方案中，逆转录病毒载体包含一个或多个药物选择标记。在一些可选方案中，NK细胞是胎盘来源的(PNK细胞)。在一些可选方案中，自然杀伤细胞是CD56+CD3-CD117+CD11a+，表达穿孔素和/或EOMES，并且不表达RORγt、芳基烃受体和IL1R1中的一种或多种。在一些可选方案中，所述自然杀伤细胞表达穿孔素和EOMES，并且不表达RORγt、芳基烃受体或IL1R1中的任何一种。在所述方法的一些可选方案中，所述自然杀伤细胞另外表达T-bet、GZMB、NKp46、NKp30和NKG2D。在一些可选方案中，所述自然杀伤细胞表达CD94。在一些可选方案中，所述自然杀伤细胞不表达CD94。
在一些可选方案中，抑制肿瘤细胞增殖的方法包括将肿瘤细胞接触来自本文任一个可选方案的群体的自然杀伤细胞。在一些可选方案中，自然杀伤(NK)细胞经遗传稀释，使得它们缺乏NK抑制性分子的表达或呈现出降低的NK抑制性分子的表达。在一些可选方案中，NK抑制性分子是CBLB、NKG2A和/或TGFBR2。在一些可选方案中，NK抑制性分子是CBLB。在一些可选方案中，CBLB表达已经被敲除。在一些可选方案中，通过CRISPR/CAS9系统、锌指核酸酶或TALEN核酸酶敲除CBLB表达。在一些可选方案中，通过CRISPR相关技术敲除CBLB表达。在一些可选方案中，CBLB表达的敲除导致与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比具有更高的对肿瘤细胞的细胞毒性的NK细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是多发性骨髓瘤细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是RPMI8226细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是U266细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是ARH77细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是急性髓性白血病细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是HL60细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是KG1细胞。在一些可选方案中，CBLB表达的敲除导致与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比，在用ICAM-1和MICA刺激时具有更高的IFNγ分泌的NK细胞。在一些可选方案中，CBLB表达的敲除导致了与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比，在用ICAM-1和MICA刺激时具有更高的脱粒的NK细胞。在一些可选方案中，通过CD107a的增加来测量脱粒。在一些可选方案中，CBLB表达的敲除导致与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比，在与多发性骨髓瘤细胞共培养时具有GM-CSF、可溶性CD137(sCD137)、IFNγ、MIP1α、MIP1β、TNFα或穿孔素中一种或多种的分泌的改变的NK细胞。在一些可选方案中，NK抑制性分子是NKG2A。在一些可选方案中，NKG2A表达已经被敲除。在一些可选方案中，通过CRISPR/CAS9系统、锌指核酸酶或TALEN核酸酶敲除NKG2A表达。在一些可选方案中，通过CRISPR相关技术敲除NKG2A表达。在一些可选方案中，NKG2A表达的敲除导致与其中NKG2A未被敲除的NK细胞相比具有更高的对肿瘤细胞的细胞毒性的NK细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是多发性骨髓瘤细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是RPMI8226细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是U266细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是ARH77细胞。在一些可选方案中，NKG2A表达的敲除导致了与其中NKG2A未被敲除的NK细胞相比在NKG2A激动剂抗体的存在下用ICAM-1和MICA刺激时具有更高的脱粒的NK细胞。在一些可选方案中，通过CD107a的增加来测量脱粒。在一些可选方案中，NKG2A表达的敲除导致了与其中NKG2A未被敲除的NK细胞相比，具有GM-CSF、可溶性CD137(sCD137)、IFNγ、MIP1α、MIP1β、TNFα或穿孔素中一种或多种的分泌的改变的NK细胞。在一些可选方案中，NK抑制性分子是TGFBR2。在一些可选方案中，TGFBR2表达已经被敲除。在一些可选方案中，通过CRISPR/CAS9系统、锌指核酸酶或TALEN核酸酶敲除TGFBR2表达。在一些可选方案中，通过CRISPR相关技术敲除TGFBR2表达。在一些可选方案中，TGFBR2表达的敲除导致了与其中TGFBR2未被敲除的NK细胞相比对TGFβ介导的对肿瘤细胞的NK细胞细胞毒性抑制的抗性。在一些可选方案中，肿瘤细胞是多发性骨髓瘤细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是RPMI8226细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是急性髓性白血病细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是K562细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是慢性髓性白血病细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是HL-60细胞。在一些可选方案中，NK细胞是胎盘来源的(PNK细胞)。在一些可选方案中，自然杀伤(NK)细胞进行遗传修饰以包含修饰的CD16。在一些可选方案中，修饰的CD16比野生型CD16具有更高的IgG亲和力。在一些可选方案中，修饰的CD16在CD16a的位置158处具有缬氨酸。在某些可选方案中，修饰的CD16具有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列(MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSSETVNITITQGLAVPTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK；SEQ ID NO:1)。在一些可选方案中，修饰的CD16对ADAM17切割具有抗性。在一些可选方案中，CD16在CD16a的位置197处具有脯氨酸。在一些可选方案中，修饰的CD16含有IgK信号肽。在一些可选方案中，修饰的CD16含有CD16信号肽。在一些可选方案中，修饰的CD16通过病毒感染引入NK细胞中。在一些可选方案中，修饰的CD16通过病毒感染引入造血细胞中，随后所述造血细胞分化成NK细胞。在一些可选方案中，修饰的CD16通过慢病毒载体引入。在一些可选方案中，慢病毒载体具有CMV或EF1α启动子。在一些可选方案中，慢病毒载体包含一个或多个药物选择标记。在一些可选方案中，修饰的CD16通过逆转录病毒载体引入。在一些可选方案中，逆转录病毒载体包含一个或多个药物选择标记。在一些可选方案中，自然杀伤细胞是CD56+CD3-CD117+CD11a+，表达穿孔素和/或EOMES，并且不表达RORγt、芳基烃受体和IL1R1中的一种或多种。在一些可选方案中，所述自然杀伤细胞表达穿孔素和EOMES，并且不表达RORγt、芳基烃受体或IL1R1中的任何一种。在所述方法的一些可选方案中，所述自然杀伤细胞另外表达T-bet、GZMB、NKp46、NKp30和NKG2D。在一些可选方案中，所述自然杀伤细胞表达CD94。在一些可选方案中，所述自然杀伤细胞不表达CD94。在一些可选方案中，NK细胞是胎盘来源的(PNK细胞)。在所述方法的一些可选方案中，接触在体外进行。在所述方法的一些可选方案中，所述接触在体内进行。在所述方法的一些可选方案中，所述接触在人类个体中进行。在所述方法的一些可选方案中，所述方法包括将所述自然杀伤细胞施用于所述个体。在所述方法的一些可选方案中，所述肿瘤细胞是多发性骨髓瘤细胞。在某些可选方案中，所述肿瘤细胞是急性髓性白血病(AML)细胞。在所述方法的一些可选方案中，所述个体患有复发/难治性AML。在所述方法的一些可选方案中，所述个体患有至少一种抗AML的非先天性淋巴样细胞(ILC)治疗失败的AML。在所述方法的一些可选方案中，所述个体是65岁或更大年龄，并且处于第一缓解期。在所述方法的一些可选方案中，在施用所述自然杀伤细胞前，所述个体已经用氟达拉滨、阿糖胞苷或两者进行了调理。在所述方法的一些可选方案中，所述肿瘤细胞是乳腺癌细胞、头颈癌细胞或肉瘤细胞。在所述方法的一些可选方案中，所述肿瘤细胞是原发性导管癌细胞、白血病细胞、急性T细胞白血病细胞、慢性髓性淋巴瘤(CML)细胞、慢性髓性白血病(CML)细胞、多发性骨髓瘤(MM)细胞、肺癌细胞、结肠腺癌细胞、组织细胞性淋巴瘤细胞、结肠直肠癌细胞、结直肠腺癌细胞和/或视网膜母细胞瘤细胞。在所述方法的一些可选方案中，所述肿瘤细胞是实体肿瘤细胞。在所述方法的一些可选方案中，所述肿瘤细胞是肝肿瘤细胞。在所述方法的一些可选方案中，所述肿瘤细胞是肺肿瘤细胞。在所述方法的一些可选方案中，所述肿瘤细胞是胰腺肿瘤细胞。在所述方法的一些可选方案中，所述肿瘤细胞是肾肿瘤细胞。在所述方法的一些可选方案中，所述肿瘤细胞是多形性胶质母细胞瘤(GBM)细胞。在所述方法的一些可选方案中，所述自然杀伤细胞与抗CD33抗体一起施用。在所述方法的一些可选方案中，所述自然杀伤细胞与抗CD20抗体一起施用。在所述方法的一些可选方案中，所述自然杀伤细胞与抗CD138抗体一起施用。在所述方法的一些可选方案中，所述自然杀伤细胞与抗CDF38抗体一起施用。在所述方法的一些可选方案中，在所述接触或所述施用前，所述自然杀伤细胞经冷冻保存。在一些可选方案中，在所述接触或所述施用前，所述自然杀伤细胞未经冷冻保存。在一些可选方案中，所述自然杀伤细胞是CD56+CD3-CD117+CD111a+，表达穿孔素和/或EOMES，并且不表达RORγt、芳基烃受体和IL1R1中的一种或多种。在一些可选方案中，所述自然杀伤细胞表达穿孔素和/或EOMES，并且不表达RORγt、芳基烃受体或IL1R1中的任何一种。在一些可选方案中，所述自然杀伤细胞另外表达T-bet、GZMB、NKp46、NKp30和NKG2D。在一些可选方案中，所述自然杀伤细胞表达CD94。在一些可选方案中，所述自然杀伤细胞不表达CD94。
在一些可选方案中，提供了自然杀伤细胞群体，其中自然杀伤(NK)细胞经遗传修饰以缺乏NK抑制性分子的表达或呈现出降低的NK抑制性分子的表达。在一些可选方案中，NK抑制性分子是选自CBLB、NKG2A和TGFBR2的一种或多种NK抑制性分子。在一些可选方案中，遗传修饰的NK细胞与其中NK抑制性分子的表达未被敲除或降低的NK细胞相比，具有更高的对肿瘤细胞的细胞毒性。在一些可选方案中，肿瘤细胞选自多发性骨髓瘤细胞、急性髓性白血病(AML)细胞、乳腺癌细胞、头颈癌细胞、肉瘤细胞、导管癌细胞、白血病细胞、急性T细胞白血病细胞、慢性髓性淋巴瘤细胞、慢性髓细胞性白血病(CML)细胞、多发性骨髓瘤(MM)、肺癌细胞、结肠腺癌细胞、组织细胞性淋巴瘤细胞、结肠直肠癌细胞、结直肠腺癌细胞和视网膜母细胞瘤细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是实体肿瘤细胞。在一些可选方案中，实体肿瘤细胞选自肝肿瘤细胞、肺肿瘤细胞、胰腺肿瘤细胞、肾肿瘤细胞和多形性胶质母细胞瘤(GBM)细胞。在一些可选方案中，NK抑制性分子的表达被敲除。在一些可选方案中，通过CRISPR/CAS9系统、锌指核酸酶或TALEN核酸酶敲除NK抑制性分子的表达。在一些可选方案中，通过CRISPR相关技术敲除NK抑制性分子的表达。在一些可选方案中，NK抑制性分子是CBLB。在一些可选方案中，CBLB表达的敲除产生与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比在用ICAM-1和MICA刺激时具有更高的IFNγ分泌的NK细胞群体。在一些可选方案中，CBLB表达的敲除产生与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比在用ICAM-1和MICA刺激时具有更高的脱粒的NK细胞群体。在一些可选方案中，通过CD107a的增加来测量脱粒。在一些可选方案中，CBLB表达的敲除产生与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比，在与多发性骨髓瘤细胞共培养时具有GM-CSF、可溶性CD137(sCD137)、IFNγ、MIP1α、MIP1β、TNFα和穿孔素中一种或多种的分泌的变化的NK细胞群体。在一些可选方案中，NK抑制性分子是NKG2A。在一些可选方案中，NKG2A表达的敲除产生与其中NKG2A未被敲除的NK细胞相比在NKG2A激动剂抗体存在下用ICAM-1和MICA刺激时具有更高脱粒的NK细胞群体。在一些可选方案中，通过CD107a的增加来测量脱粒。在一些可选方案中，NKG2A表达的敲除产生与其中NKG2A未被敲除的NK细胞相比具有GM-CSF、可溶性CD137(sCD137)、IFNγ、MIP1α、MIP1β、TNFα或穿孔素中一种或多种的分泌的变化的NK细胞群体。在一些可选方案中，NK抑制性分子是TGFBR2。在一些可选方案中，TGFBR2表达的敲除产生与其中TGFBR2未被敲除的NK细胞相比对TGFβ介导的对肿瘤细胞的NK细胞细胞毒性的抑制具有抗性的NK细胞群体。在一些可选方案中，自然杀伤(NK)细胞进行遗传修饰以包含修饰的CD16。在一些可选方案中，修饰的CD16比野生型CD16对IgG具有更高的亲和力。在一些可选方案中，修饰的CD16在CD16a的位置158处具有缬氨酸。在一些可选方案中，修饰的CD16对ADAM17切割具有抗性。在一些可选方案中，修饰的CD16在CD16a的位置197处具有脯氨酸。在某些可选方案中，修饰的CD16具有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列(MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSSETVNITITQGLAVPTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK；SEQ ID NO:1)。在一些可选方案中，修饰的CD16含有IgK信号肽。在一些可选方案中，修饰的CD16含有CD16信号肽。在一些可选方案中，修饰的CD16通过病毒感染引入NK细胞中。在一些可选方案中，修饰的CD16通过病毒感染引入造血细胞中，随后所述造血细胞分化成NK细胞。在一些可选方案中，修饰的CD16通过慢病毒载体引入。在一些可选方案中，慢病毒载体具有CMV或EF1α启动子。在一些可选方案中，慢病毒载体包含一个或多个药物选择标记。在一些可选方案中，修饰的CD16通过逆转录病毒载体引入。在一些可选方案中，逆转录病毒载体包含一个或多个药物选择标记。在一些可选方案中，NK细胞是胎盘来源的(PNK细胞)。在一些可选方案中，自然杀伤细胞是CD56+CD3-CD117+CD11a+，表达穿孔素和/或EOMES，并且不表达RORγt、芳基烃受体和IL1R1中的一种或多种。在一些可选方案中，所述自然杀伤细胞表达穿孔素和EOMES，并且不表达RORγt、芳基烃受体或IL1R1中的任何一种。在一些可选方案中，所述自然杀伤细胞另外表达T-bet、GZMB、NKp46、NKp30和/或NKG2D。在一些可选方案中，所述自然杀伤细胞表达CD94。在一些可选方案中，所述自然杀伤细胞不表达CD94。
在一些可选方案中，提供了抑制肿瘤细胞增殖的方法，包括将肿瘤细胞接触来自本文的任一个可选自然杀伤细胞群体的自然杀伤细胞。在一些可选方案中，提供了自然杀伤细胞群体，其中自然杀伤(NK)细胞进行遗传修饰以缺乏NK抑制性分子的表达或呈现出降低的NK抑制性分子的表达。在一些可选方案中，NK抑制性分子是选自CBLB、NKG2A和TGFBR2的一种或多种NK抑制性分子。在一些可选方案中，遗传修饰的NK细胞与其中NK抑制性分子的表达未被敲除或降低的NK细胞相比具有更高的对肿瘤细胞的细胞毒性。在一些可选方案中，肿瘤细胞选自多发性骨髓瘤细胞、急性髓性白血病(AML)细胞、乳腺癌细胞、头颈癌细胞、肉瘤细胞、导管癌细胞、白血病细胞、急性T细胞白血病细胞、慢性髓性淋巴瘤细胞、慢性髓细胞性白血病(CML)细胞、多发性骨髓瘤(MM)、肺癌细胞、结肠腺癌细胞、组织细胞性淋巴瘤细胞、结肠直肠癌细胞、结直肠腺癌细胞和视网膜母细胞瘤细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是实体肿瘤细胞。在一些可选方案中，实体肿瘤细胞选自肝肿瘤细胞、肺肿瘤细胞、胰腺肿瘤细胞、肾肿瘤细胞和多形性胶质母细胞瘤(GBM)细胞。在一些可选方案中，NK抑制性分子的表达被敲除。在一些可选方案中，通过CRISPR/CAS9系统、锌指核酸酶或TALEN核酸酶敲除NK抑制性分子的表达。在一些可选方案中，通过CRISPR相关技术敲除NK抑制性分子的表达。在一些可选方案中，NK抑制性分子是CBLB。在一些可选方案中，CBLB表达的敲除产生与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比在用ICAM-1和MICA刺激时具有更高的IFNγ分泌的NK细胞群体。在一些可选方案中，CBLB表达的敲除产生与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比在用ICAM-1和MICA刺激时具有更高的脱粒的NK细胞群体。在一些可选方案中，通过CD107a的增加来测量脱粒。在一些可选方案中，CBLB表达的敲除产生与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比，在与多发性骨髓瘤细胞共培养时具有GM-CSF、可溶性CD137(sCD137)、IFNγ、MIP1α、MIP1β、TNFα和穿孔素中一种或多种的分泌的变化的NK细胞群体。在一些可选方案中，NK抑制性分子是NKG2A。在一些可选方案中，NKG2A表达的敲除产生与其中NKG2A未被敲除的NK细胞相比在NKG2A激动剂抗体存在下用ICAM-1和MICA刺激时具有更高脱粒的NK细胞群体。在一些可选方案中，通过CD107a的增加来测量脱粒。在一些可选方案中，NKG2A表达的敲除产生与其中NKG2A未被敲除的NK细胞相比具有GM-CSF、可溶性CD137(sCD137)、IFNγ、MIP1α、MIP1β、TNFα或穿孔素中一种或多种的分泌的变化的NK细胞群体。在一些可选方案中，NK抑制性分子是TGFBR2。在一些可选方案中，TGFBR2表达的敲除产生与其中TGFBR2未被敲除的NK细胞相比具有对TGFβ介导的对肿瘤细胞的NK细胞细胞毒性抑制的抗性的NK细胞群体。在一些可选方案中，自然杀伤(NK)细胞进行遗传修饰以包含修饰的CD16。在一些可选方案中，修饰的CD16比野生型CD16对IgG具有更高的亲和力。在一些可选方案中，修饰的CD16在CD16a的位置158处具有缬氨酸。在一些可选方案中，修饰的CD16对ADAM17切割具有抗性。在一些可选方案中，修饰的CD16在CD16a的位置197处具有脯氨酸。在一些可选方案中，修饰的CD16具有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列(MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSSETVNITITQGLAVPTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK；SEQ ID NO:1)。在一些可选方案中，修饰的CD16含有IgK信号肽。在一些可选方案中，修饰的CD16含有CD16信号肽。在一些可选方案中，修饰的CD16通过病毒感染引入NK细胞中。在一些可选方案中，修饰的CD16通过病毒感染引入造血细胞中，随后所述造血细胞分化成NK细胞。在一些可选方案中，修饰的CD16通过慢病毒载体引入。在一些可选方案中，慢病毒载体具有CMV或EF1α启动子。在一些可选方案中，慢病毒载体包含一个或多个药物选择标记。在一些可选方案中，将修饰的CD16通过逆转录病毒载体引入。在一些可选方案中，逆转录病毒载体包含一个或多个药物选择标记。在一些可选方案中，NK细胞是胎盘来源的(PNK细胞)。在一些可选方案中，自然杀伤细胞是CD56+CD3-CD117+CD111a+，表达穿孔素和/或EOMES，并且不表达RORγt、芳基烃受体和IL1R1中的一种或多种。在一些可选方案中，所述自然杀伤细胞表达穿孔素和EOMES，并且不表达RORγt、芳基烃受体或IL1R1中的任何一种。在一些可选方案中，所述自然杀伤细胞另外表达T-bet、GZMB、NKp46、NKp30和/或NKG2D。在一些可选方案中，所述自然杀伤细胞表达CD94。在一些可选方案中，所述自然杀伤细胞不表达CD94。在一些可选方案中，提供了源自胎盘或其部分的自然杀伤细胞群体，由此包含胎盘来源的NK细胞(pNK细胞)，其中pNK细胞以遗传修饰以使得它们缺乏NK抑制性分子的表达或呈现出降低的NK抑制性分子的表达。在一些可选方案中，NK抑制性分子是选自CBLB、NKG2A和TGFBR2的一种或多种NK抑制性分子。在一些可选方案中，遗传修饰的NK细胞与其中NK抑制性分子的表达未被敲除或降低的NK细胞相比具有更高的对肿瘤细胞的细胞毒性。在一些可选方案中，肿瘤细胞选自多发性骨髓瘤细胞、急性髓性白血病(AML)细胞、乳腺癌细胞、头颈癌细胞、肉瘤细胞、导管癌细胞、白血病细胞、急性T细胞白血病细胞、慢性髓性淋巴瘤细胞、慢性髓细胞性白血病(CML)细胞、多发性骨髓瘤(MM)、肺癌细胞、结肠腺癌细胞、组织细胞性淋巴瘤细胞、结肠直肠癌细胞、结直肠腺癌细胞和视网膜母细胞瘤细胞。在一些可选方案中，肿瘤细胞是实体肿瘤细胞。在一些可选方案中，实体肿瘤细胞选自肝肿瘤细胞、肺肿瘤细胞、胰腺肿瘤细胞、肾肿瘤细胞和多形性胶质母细胞瘤(GBM)细胞。在一些可选方案中，NK抑制性分子的表达被敲除。在一些可选方案中，通过CRISPR/CAS9系统、锌指核酸酶或TALEN核酸酶敲除NK抑制性分子的表达。在一些可选方案中，通过CRISPR相关技术敲除NK抑制性分子的表达。在一些可选方案中，NK抑制性分子是CBLB。在一些可选方案中，CBLB表达的敲除产生与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比在用ICAM-1和MICA刺激时具有更高的IFNγ分泌的NK细胞群体。在一些可选方案中，CBLB表达的敲除产生与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比在用ICAM-1和MICA刺激时具有更高的脱粒的NK细胞群体。在一些可选方案中，通过CD107a的增加来测量脱粒。在一些可选方案中，CBLB表达的敲除产生与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比，在与多发性骨髓瘤细胞共培养时具有GM-CSF、可溶性CD137(sCD137)、IFNγ、MIP1α、MIP1β、TNFα和/或穿孔素中一种或多种的分泌的变化的NK细胞群体。在一些可选方案中，NK抑制性分子是NKG2A。在一些可选方案中，NKG2A表达的敲除产生与其中NKG2A未被敲除的NK细胞相比在NKG2A激动剂抗体存在下用ICAM-1和MICA刺激时具有更高脱粒的NK细胞群体。在一些可选方案中，通过CD107a的增加来测量脱粒。在一些可选方案中，CD107a的增加通过FACs测量。在一些可选方案中，NKG2A表达的敲除产生与其中NKG2A未被敲除的NK细胞(如天然产生的NK细胞)相比具有GM-CSF、可溶性CD137(sCD137)、IFNγ、MIP1α、MIP1β、TNFα和/或穿孔素中一种或多种的分泌的变化的NK细胞群体。在一些可选方案中，细胞群体是胎盘来源的自然杀伤细胞(pNK)，其中pNK细胞进行遗传修饰以包含修饰的CD16。在一些可选方案中，修饰的CD16比野生型CD16对IgG具有更高的亲和力。在一些可选方案中，修饰的CD16在CD16a的位置158处具有缬氨酸。在一些可选方案中，修饰的CD16对ADAM17切割具有抗性。在一些可选方案中，修饰的CD16在CD16a的位置197处具有脯氨酸。在一些可选方案中，修饰的CD16具有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列(MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSSETVNITITQGLAVPTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK；SEQ ID NO:1)。在一些可选方案中，修饰的CD16含有IgK信号肽或CD16信号肽。在一些可选方案中，修饰的CD16通过病毒感染引入NK细胞中。在一些可选方案中，修饰的CD16通过病毒感染引入造血细胞中，随后所述造血细胞分化成NK细胞。在一些可选方案中，修饰的CD16通过慢病毒载体引入。在一些可选方案中，慢病毒载体具有CMV或EF1α启动子。在一些可选方案中，慢病毒载体包含一个或多个药物选择标记。在一些可选方案中，选择标记包括编码赋予对选择剂的抗性的蛋白质的基因，如PuroR基因、ZeoR基因、HygroR基因、neoR基因和/或杀稻瘟菌素抗性基因。在一些可选方案中，修饰的CD16通过逆转录病毒载体引入。在一些可选方案中，逆转录病毒载体包含一个或多个药物选择标记。在所述方法的一些可选方案中，所述接触在体外进行。在所述方法的一些可选方案中，所述接触在体内进行。在所述方法的一些可选方案中，所述接触在人类个体中进行，优选选择来接受抗癌治疗的个体。在所述方法的一些可选方案中，所述方法包括将所述自然杀伤细胞施用于所述个体。在所述方法的一些可选方案中，所述肿瘤细胞是多发性骨髓瘤细胞。在所述方法的一些可选方案中，所述肿瘤细胞是急性髓性白血病(AML)细胞。在所述方法的一些可选方案中，所述个体患有复发/难治性AML。在所述方法的一些可选方案中，所述个体患有对至少一种抗AML的非先天性淋巴样细胞(ILC)治疗失败的AML。在所述方法的一些可选方案中，所述个体是65岁或更大年龄，并且处于第一缓解期。在所述方法的一些可选方案中，在施用所述自然杀伤细胞前，所述个体已经用氟达拉滨、阿糖胞苷或两者进行了调理。在所述方法的一些可选方案中，肿瘤细胞选自多发性骨髓瘤细胞、急性髓性白血病(AML)细胞、乳腺癌细胞、头颈癌细胞、肉瘤细胞、导管癌细胞、白血病细胞、急性T细胞白血病细胞、慢性髓性淋巴瘤细胞、慢性髓细胞性白血病(CML)细胞、多发性骨髓瘤(MM)、肺癌细胞、结肠腺癌细胞、组织细胞性淋巴瘤细胞、结肠直肠癌细胞、结直肠腺癌细胞和视网膜母细胞瘤细胞。在所述方法的一些可选方案中，所述肿瘤细胞是实体肿瘤细胞。在所述方法的一些可选方案中，实体肿瘤细胞选自肝肿瘤细胞、肺肿瘤细胞、胰腺肿瘤细胞、肾肿瘤细胞和多形性胶质母细胞瘤(GBM)细胞。在所述方法的一些可选方案中，所述自然杀伤细胞与抗CD33抗体一起施用。在所述方法的一些可选方案中，所述自然杀伤细胞与抗CD20抗体一起施用。在所述方法的一些可选方案中，所述自然杀伤细胞与抗CD138抗体一起施用。在所述方法的一些可选方案中，所述自然杀伤细胞与抗CD38抗体一起施用。在所述方法的一些可选方案中，在所述接触或所述施用之前，所述自然杀伤细胞经冷冻保存。在所述方法的一些可选方案中，在所述接触或所述施用之前，所述自然杀伤细胞未经冷冻保存。
在第三方面中，提供了源自胎盘或其部分的自然杀伤细胞群体，由此包含胎盘来源的NK细胞(pNK细胞)，其中pNK细胞经遗传修饰以使得它们缺乏NK抑制性分子的表达或呈现出降低的NK抑制性分子的表达。在一些可选方案中，NK抑制性分子是选自CBLB、NKG2A和TGFBR2的一种或多种NK抑制性分子。在一些可选方案中，遗传修饰的NK细胞与其中NK抑制性分子的表达未被敲除或降低的NK细胞相比具有更高的对肿瘤细胞的细胞毒性。在一些可选方案中，肿瘤细胞选自多发性骨髓瘤细胞、急性髓性白血病(AML)细胞、乳腺癌细胞、头颈癌细胞、肉瘤细胞、导管癌细胞、白血病细胞、急性T细胞白血病细胞、慢性髓性淋巴瘤细胞、慢性髓细胞性白血病(CML)细胞、多发性骨髓瘤(MM)、肺癌细胞、结肠腺癌细胞、组织细胞性淋巴瘤细胞、结肠直肠癌细胞、结直肠腺癌细胞和视网膜母细胞瘤细胞。在一些可选方案中，所述肿瘤细胞是实体肿瘤细胞。在一些可选方案中，实体肿瘤细胞选自肝肿瘤细胞、肺肿瘤细胞、胰腺肿瘤细胞、肾肿瘤细胞和多形性胶质母细胞瘤(GBM)细胞。在一些可选方案中，NK抑制性分子的表达被敲除。在一些可选方案中，通过CRISPR/CAS9系统、锌指核酸酶或TALEN核酸酶敲除NK抑制性分子的表达。在一些可选方案中，通过CRISPR相关技术敲除NK抑制性分子的表达。在一些可选方案中，NK抑制性分子是CBLB。在一些可选方案中，CBLB表达的敲除产生与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比在用ICAM-1和MICA刺激时具有更高的IFNγ分泌的NK细胞群体。在一些可选方案中，CBLB表达的敲除产生与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比在用ICAM-1和MICA刺激时具有更高的脱粒的NK细胞群体。在一些可选方案中，通过CD107a的增加来测量脱粒。在一些可选方案中，CBLB表达的敲除产生与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比，在与多发性骨髓瘤细胞共培养时具有GM-CSF、可溶性CD137(sCD137)、IFNγ、MIP1α、MIP1β、TNFα和/或穿孔素中一种或多种的分泌的变化的NK细胞群体。在一些可选方案中，NK抑制性分子是NKG2A。在一些可选方案中，NKG2A表达的敲除产生与其中NKG2A未被敲除的NK细胞相比在NKG2A激动剂抗体存在下用ICAM-1和MICA刺激时具有更高脱粒的NK细胞群体。在一些可选方案中，通过CD107a的增加来测量脱粒。在一些可选方案中，通过FACs测量CD107a的增加。在一些可选方案中，NKG2A表达的敲除产生与其中NKG2A未被敲除的NK细胞(如天然产生的NK细胞)相比具有GM-CSF、可溶性CD137(sCD137)、IFNγ、MIP1α、MIP1β、TNFα和/或穿孔素中一种或多种的分泌的变化的NK细胞群体。
在第四方面中，胎盘来源的自然杀伤细胞(pNK)群体，其中pNK细胞经遗传修饰以包含修饰的CD16。在一些可选方案中，修饰的CD16比野生型CD16对IgG具有更高的亲和力。在一些可选方案中，修饰的CD16在CD16a的位置158处具有缬氨酸。在一些可选方案中，修饰的CD16对ADAM17切割具有抗性。在一些可选方案中，CD16在CD16a的位置197处具有脯氨酸。在某些可选方案中，修饰的CD16具有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列(MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSSETVNITITQGLAVPTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWR KDPQDK；SEQ ID NO:1)。在一些可选方案中，修饰的CD16含有IgK信号肽或CD16信号肽。在一些可选方案中，修饰的CD16通过病毒感染引入NK细胞中。在一些可选方案中，修饰的CD16通过病毒感染引入造血细胞中，随后所述造血细胞分化成NK细胞。在一些可选方案中，修饰的CD16通过慢病毒载体引入。在一些可选方案中，慢病毒载体具有CMV或EF1α启动子。在一些可选方案中，慢病毒载体包含一个或多个药物选择标记。在一些可选方案中，选择标记包括编码赋予对选择剂的抗性的蛋白质的基因，如PuroR基因、ZeoR基因、HygroR基因、neoR基因和/或杀稻瘟菌素抗性基因。在一些可选方案中，修饰的CD16通过逆转录病毒载体引入。在一些可选方案中，逆转录病毒载体包含一个或多个药物选择标记。
a.7.1可选方案1：CBLB敲除三阶段NK细胞
i.7.1.1 CBLB敲除表征
如本文和国际专利申请公开No.WO 2016/109661(将其整体按引用并入本文中)中所述的，在用于产生NK细胞的35天三阶段过程的第3、5或7天中，通过在NK细胞中进行CBLB基因的CRISPR敲除产生CBLB敲除NK细胞。
CBLB敲除的平均效率在35天过程的第35天高于80％，如通过TIDE(Tracking ofIndels by DEcomposition)测定测量的(图1A)。
测量敲除后NK细胞的倍数扩增，并测定了活细胞和CD3-CD56+细胞的百分比。在CBLB敲除NK细胞中，与未处理的细胞相比，倍数扩增降低(图1B)，但活细胞和CD3-CD56+细胞的比例与未处理的细胞相当。
在三阶段过程的第34或35天，在20:1、10:1和5:1的效应:靶(E:T)比率下测定对各种多发性骨髓瘤细胞系(RPMI8226、U266、ARH277)的细胞毒性(图2A-C)。对于测试的每个细胞系以及在所有比率下，CBLB敲除NK细胞与未处理的细胞相比显示出具有提高的细胞毒性(图3A-C)。随后将细胞毒性数据标准化，且CBLB敲除NK细胞与未处理细胞相比显示出具有高达四倍的细胞毒性增加。还测定了CBLB敲除NK细胞对HL60和KG1细胞的细胞毒性，如图4A-B中所示的。
除了细胞毒性数据，测量了用I类MHC多肽相关序列A(MICA)和ICAM-1刺激时的IFNγ分泌和CD107a(脱粒的量度)的水平。在恒定水平的ICAM-1存在下用不同水平的MICA刺激的CBLB敲除和未处理NK细胞的IFNγ分泌水平显示于图5A中。在恒定水平的ICAM-1存在下用不同水平的MICA刺激的CBLB敲除和未处理NK细胞中CD107a测定的结果显示于图5B中。如5A和5B中所示的，未处理的是在图8的成对条图中的右侧条图，而处理的是左侧条图。
GM-CSF、sCD137、IFNγ、MIP1α、MIP1β、TNFα和穿孔素的细胞因子分泌也存在多发性骨髓瘤细胞系RPMI、U266或ARH77而无MICA刺激的情况下测量。细胞因子分泌测定的结果显示于图6A-C中。
ii.7.1.2.CBLB敲除临床前数据
为了测定如实施例7.1.1中产生的CBLB敲除NK细胞在体内的生物分布和持久性，设计了如图7中所示的研究。研究了两个组，一组具有在第-1天的白消安(抗肿瘤剂)预调理，一组具有第-5天的白消安预调理。在细胞输注至NOD SCIDγ(NSG)小鼠组织中后七、十四和二十一天，获取脾、骨髓(BM)、血液、肝和肺中的人CD45+计数，并且还计算总计数(图8-10)。发现在七天后，未处理和CBLB敲除NK细胞中的生物分布和持久性相似(图8)。十四天后，组之间的生物分布和持久性的相似性得到维持，尽管人CD45+计数的绝对数较高(图8-9)。二十一天后，持久性和生物分布持续相似，但人CD45+计数的绝对数下跌，表明持久性与IL-15补充相关(图10)。IL-15是诱导NK细胞的细胞增殖的细胞因子。
在第七天、十四天和二十一天时，还测量了脾、肝、骨髓和肺中的CD56+CD11a+细胞的存在(图11)。对于未处理和CBLB敲除条件，发现了相似的CD56+CD11a+细胞频率，并且与其他组织相比，在骨髓中发现了较低的CD56+CD11a+细胞频率(图11)。还测量了脾、肝、骨髓和肺中的CD16和KIR表达，并且对于未处理和CBLB敲除条件发现了相似的频率(图12和13)。还注意到与输注前资料相比，CD16和KIR表达均在体内提高。
测量了NSG小鼠中NK细胞的增殖，并且到施用NK细胞第14天时，CBLB敲除NK细胞显示出比对照处理细胞更快地增殖。
将施用后14天从NSG小鼠组织分离的NK细胞进行纯化，并且测定了对K562和HL60细胞系的细胞毒性(图14A-B)。与对照处理细胞相比，CBLB敲除NK细胞显示出对离体的两个细胞系具有增强的细胞毒性(图14A-B)。在图14A至14B中，对照在两个曲线中显示为较低百分比的杀灭者。离体分离的CBLB敲除细胞还显示出与对照处理细胞相比，在肿瘤细胞共培养物中释放提高水平的GM-CSF、IFNγ、sCD137和TNFα细胞因子(图15A-D)。因此，CBLB敲除NK细胞在NSG小鼠中十四天后保持其增强的功能活性。
最后，测试了CBLB敲除NK细胞对新分离的患者来源的AML异种移植物(PDX)的功能活性(图16A-D)。与对照相比，CBLB敲除NK细胞呈现出分泌的GM-CSF、IFNγ、sCD137和TNFα的增加。
b.7.2可选方案2：NKG2A敲除三阶段NK细胞。
如本文和国际专利申请公开No.WO 2016/109661(将其整体按引用并入本文中)中所述的，在用于产生NK细胞的35天三阶段方法过程的第3、5或7天中，通过在NK细胞中进行NKG2A基因的CRISPR敲除产生NKG2A敲除NK细胞。
NKG2A敲除的平均效率在35天过程的第35天时为约60％，如通过TIDE(Trackingof Indels by DEcomposition)测定测量的(图17A)。
测量了敲除后NK细胞的倍数扩增，并测定了活细胞和CD3-CD56+细胞的百分比。在NKG2A敲除NK细胞中，与未处理的细胞相比，倍数扩增降低(图17B)，但活细胞和CD3-CD56+细胞的比例与未处理的细胞相当。
在三阶段过程的第34或35天，在20:1、10:1和5:1的E:T比率下测定对各种多发性骨髓瘤细胞系(RPMI8226、U266、ARH277)的细胞毒性(图18A-D)。在10:1、5:1和2.5:1的E:T比率下测定对K562的细胞毒性。对于RPMI8226、U266和ARH277细胞系中的每一个以及在所有比率下，NKG2A敲除NK细胞与未处理的细胞相比显示出具有提高的细胞毒性(图19A-C)，但对K562细胞具有与未处理细胞相当的细胞毒性。假设对K562细胞的细胞毒性已经达到了最大水平。对多种骨髓瘤细胞系的细胞毒性数据随后标准化，并且与未处理细胞相比，NKG2A敲除NK细胞显示出细胞毒性具有高达三倍的增加。在本文的一些可选方案中，与未处理细胞相比，NKG2A敲除NK细胞显示出细胞毒性具有高达三倍的增加。
进行了平板结合脱粒分析来测试NKG2A敲除NK细胞在MICA和ICAM-1刺激存在下对NKG2A激动剂抗体的反应(图20)。在对照IgG抗体存在下，NKG2A敲除细胞显示出高活性(CD107a百分比)，就和具有野生型NKG2A的对照NK细胞一样。对照(非敲除)NK细胞在NKG2A激动剂抗体的存在下显示出预期的低活性。NKG2A敲除NK细胞在NKG2A激动剂抗体的存在显示出中等活性。因此，发现NKG2A激动剂抗体降低对照NK细胞活性，但在NKG2A敲除细胞中效力较低，表明了这些细胞对NKG2A介导的抑制信号更有抗性。
GM-CSF、sCD137、IFNγ、MIP1α、MIP1β、TNFα和穿孔素的细胞因子分泌也在存在多种骨髓瘤细胞系RPMI、U266和ARH77而没有MICA刺激的情况下测量。细胞因子分泌测定的结果显示于图21A-C中。
c.7.3可选方案3：TGF-β敲除三阶段NK细胞
使用CRISPR相关技术，敲除了NK-92细胞中的TGF-β受体II(TGFBR2)，导致了TGFBR2表达的显著降低。NK-92细胞中的结果通过显示出磷酸化Smad2/3(pSmad2/3)降低(表明TGF-β信号传导途径的阻断)进一步验证。这些细胞中的TGF-β引发的激活标志物(NKp30)下调也消除。
随后如本文和国际专利申请公开No.WO 2016/109661(将其整体按引用并入本文中)中所述的，在用于产生NK细胞的35天三阶段过程的第0、5、10或14天中，通过在NK细胞中进行TGFBR2基因的CRISPR敲除产生了TGFBR2敲除NK细胞。第5敲除的表征在下面描述。
TGFBR2敲除的效率从第5天的70％快速提高至高于80％，并且在整个35天过程中保持稳定(图22)。同样，突变谱在过程中保持未改变。与NK-92细胞一样，第5天的TGF-β敲除GM NK细胞显示出TGF-β信号传导的阻断，导致降低的pSmad2-3。对于如DNAM-1、NKG2D和NKp20的受体，TGFBR2敲除细胞中的激活性受体下调也被消除。发现TGFBR2敲除NK细胞的分化与对照未处理组相似，如表1中所示的。
表1.通过流式细胞术的TGFBR2KO vs.对照NK细胞的免疫分型
Figure BDA0002182352220001081
在第34或35天，在一定范围的E:T比率下，测定了对K562和RPMI8226细胞系的细胞毒性。TGFBR2敲除NK细胞中的细胞毒性与没有TGF-β1处理的对照中的细胞毒性相似(图23A-D)，并且在细胞毒性分析中TGFBR2敲除NK细胞显示出给予对TGF-β1抑制的抗性。
在不同的转染天数和不同的细胞批次中TGFBR2敲除结果的遗传和表型分析显示于表2中。在不同时间点，对于多个供体的GM NK获得了高水平的TGFBR2删除(平均88.1％)。通过相应的表型变化，如信号传导阻断和NK标志物下调的变化，证实了这些结果。
表2.在不同的转染天数和不同的细胞批次中TGFBR2敲除结果的遗传和表型分析
Figure BDA0002182352220001091
平均KO效率＝88.1％(SD 8.6％)
还在四小时细胞毒性分析中测试了TGFBR2敲除细胞对HL60细胞和K562细胞的效应子功能(图24A-D)。TGFBR2敲除细胞显示了在HL60和K562细胞中对TGFβ1引发的抗肿瘤细胞毒性抑制的抗性。
d.7.4可选方案4：具有修饰的CD16的NK细胞
开发了包含遗传修饰的CD16的慢病毒载体，如表3中所示。
表3.用于GM NK细胞的CD16慢病毒构建体。
Figure BDA0002182352220001092
Figure BDA0002182352220001101
使用两种不同的信号肽，IgK和CD16，和使用两种不同的启动子，EF1α和CMV，以及所需的突变-高IgG结合亲和力突变体F158V和ADAM17抗性突变体S197P。还设计了用于转导后富集的嘌呤霉素选择的慢病毒载体。
针对第5天转导的NK细胞测试了如本文和国际专利申请公开No.WO 2016/109661(将其整体按引用并入本文中)中所述的用于产生NK细胞的35天三阶段方法中的CD16表达的持久性。使用抗CD16-FITC抗体(BD目录#555406，克隆3G8)通过FACS测定CD16表达。与野生型相比，CD16VP转导的细胞中稳定且较高水平的CD16是明显的(图25)。(图25中成对条图中的右条图)。因此，证实了使用慢病毒载体将遗传修饰的CD16递送至35天三阶段过程NK细胞的可行性。
为了测定由CD16切割导致的CD16脱落的量，开发了一种分析法，其中用50μM蛋白酶抑制剂TAPI处理NK细胞30分钟，随后使用或未用PMA(1μg/mL)处理4小时。PMA激活显示出将外周血NK细胞中的CD16降低97％，并且在35天三阶段过程NK细胞中降低89％。TAPI处理能够抑制外周血和三阶段NK细胞中的CD16脱落。用CD16VP转导的NK细胞显示出对PMA诱导的CD16脱落的抗性。在未处理细胞中，94％的CD16脱落，而在CD16VP转导的细胞中仅有17％的CD16脱落。
将用CD16VP转导的35天三阶段过程NK细胞的增殖和表型与未处理细胞相比较。在转导的和未处理的细胞之间发现增殖或NK成熟标志物方面没有显著差异(图26A-B)。(在图26B中，成对条图的右条图表示未处理的。图26B中的成对条图的右条图表示CD16VP转导的细胞)。
研究抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)来评价用CD16VP转导的作用。靶癌细胞(Daudi或U266)与mAb(抗CD20或抗CD38)一起孵育30分钟，无mAb和IgG的用作对照。以1.25:1的E:T比率将效应细胞和癌细胞一起加入，并且还进行了没有效应细胞的对照。加入Topo5使活细胞染色。FACS分析测定了效应细胞的特异性杀灭的百分比。发现在具有抗CD20和抗CD38抗体两者的情况下，CD16VP转导的细胞与未处理的NK细胞相比具有提高的对Daudi细胞的ADCC(图27A-B)。还在1:1的E:T下，在24小时ADCC过程中测试IFN-γ、GM-CSF和TNF-α的分泌，并且CD16VP转导的NK细胞与未处理的NK细胞相比显示出提高的细胞因子分泌(图28A-C)。
e.7.5可选方案5：TGFBR2/CBLB双重敲除三阶段NK细胞
使用CRISPR相关技术，对第5天GM NK细胞进行TGFBR和CBLB基因的敲除以形成以下的群体：模拟转染、TGFBR2敲除GM NK、CBLB敲除GM NK和TGFBR2/CBLB双重敲除GM NK。通过结合TIDE(Tracking of Indels by DEcomposition)分析的靶向扩增子测序来评价基因编辑效率。按照常规免疫分型方案进行GM NK细胞和对照的免疫分型。在效应子功能和分泌分析物评价之前，细胞用TGFβ1处理48小时或未用TGFβ1处理。为了在造血癌细胞系(即，K562、HL60、KG-1和RPMI8266)中测定效应子功能，利用基于4小时流的细胞毒性测定。对于分泌分析物评价，将GM NK细胞和对照与造血癌细胞系以1:1E:T比率共培养24小时。收集上清液，并储存在-20℃直至通过Luminex Multiplex免疫测定进行分析。
双重敲除GM NK的基因敲除效率。在双重敲除与单敲除对照中，对于TGFBR2和CBLB基因座各自的敲除效率相当，参见表4。
表4.双重敲除GM NK的敲除效率。N.D.表明无数据/未测定。
Figure BDA0002182352220001121
双重敲除GM NK的免疫表型。免疫表型分析显示出双重敲除GM NK具有与对照相似的表型(表5)。
表5.双重敲除GM NK的表型分析
Figure BDA0002182352220001122
双重敲除GM NK的倍数扩增。总体倍数扩增显示出单敲除扩增低于模拟转染对照的趋势，并且双重敲除的扩增与单敲除相比进一步降低(图29)。
细胞毒性分析。双重敲除GM NK显示来自两个单敲除的组合益处。双重敲除显示出CBLB-GM NK的增加的特异性杀灭以及TGFBR2-GM NK的对TGFβ引发的抑制的不敏感性。因此，在TGFβ的存在下，双重敲除GM NK细胞呈现出最高的对靶肿瘤细胞系的杀灭，如图30和31中看到的。
共培养物上清液中的分泌分析物。来自CBLB-GM NK的分泌分析物反映出增强的效应子功能。与对照组相比时，在CBLB-GM NK中观察到sCD137的大幅增加和GM-CSF、IFNγ、TNFα和穿孔素的中等增加。在CBLB-GM NK和GM NK对照中，这些分析物的分泌通过TGFβ处理都显著降低(图32A-E)。
与GM NK对照相比，TGFBR2-GM NK不仅分泌相似水平的GM-CSF、sCD137、TNFα和穿孔素，而且针对某些靶细胞极大地增加了IFNγ。这些分析物的分泌没有受到TGFβ处理的抑制(图32A-E)。
双重敲除GM NK证明了来自两个单敲除的组合益处。不仅分泌的分析物，如GM-CSF、sCD137、IFNγ、TNFα和穿孔素，提高，而且对TGFβ引发的降低具有抗性。对于GM-CSF、IFNγ和TNFα，还观察到了协同作用。在那些情况中，双重敲除GM NK与组合的两个单敲除相比分泌相等或更多的分析物(图32A-E)。
f.7.6.可选方案6：PNK-CD16VP
i.CD16VP构建体的背景和实验设置
建立CD16构建体用于在PNK(胎盘来源的NK细胞)中过表达，以产生具有增加的ADCC功能的遗传修饰PNK细胞。形成具有两个点突变的CD16，一个产生高亲和力缬氨酸变体(158V/V)，而第二个使得CD16不被Adam 17切割(S197P)。将CD16变体称为CD16VP。产生了慢病毒载体，并且CD34细胞在扩增过程的第5天转导。在培养过程中监测CD16的表达，并且在培养阶段结束时评价功能。具有或没有CD16VP的PNK细胞针对对于IgG1k抗体的亲和力的提高以及对激活诱导的脱落的抗性进行测试。
ii.转导效率、PNK扩增和表型
目标1：使用慢病毒载体实现CD16VP在PNK细胞上的高表达效率。
方法：为了获得PNK细胞上CD16VP的高表达，CD34细胞通过以下所列的各种条件来转导：
·培养的第5天和第10天
·1-2轮的感染
·5MOI至200MIO范围的感染复数(MOI)
·600g和1200g的旋转接种(spinoculation)离心速度
结果：第5天和第10天的转导产生了相似的转导效率，因此选择第5天作为慢病毒转导的标准时间表。转导的轮数(1vs 2)显示出在较低MOI(500MIO)下少量的提高，然而，效率在较高MOI(100MOI)下没有不同。转导效率从50至100MOI是提高的，但在200MOI下显示出没有进一步提高。600g的离心速度产生了与1200g相似的转导效率。因此，确定优化的方案为在第5天100MOI的单轮感染的600g/1hr的旋转接种方案。使用涂覆10-20μg/cm2retronectin的非组织培养物处理的48孔平板进行转导。(图33)。
用CD34供体(n＝7)评价优化的转导方案，并且获得了超过70％的中值转导效率。
目标2：评价基因修饰和转导方法对PNK细胞的扩增潜能的影响。
方法：按照优化的转导方案，细胞按照之前记载的进行培养。
结果：优化的转导方法不影响细胞(n＝6)的中值扩增潜能，即使一些供体与未转导的对照相比显示出PNK-CD16VP的倍数扩增降低(图34)。PNK-NT的扩增范围是81-5863倍，而PNK-CD16VP是134-7818倍。
目标3：评价慢病毒基因修饰对PNK细胞表型的影响。
方法：如之前记载的，通过流式细胞术评价PNK细胞的CD3、CD56、CD11a和CD16的表达。
结果：按照产品定义标准(以第35天85％的CD3-CD56+)，慢病毒基因修饰引起CD56+ve细胞出现的略微延迟。培养期增加3天，从35到38天，导致了超过85％阈值的CD3-CD56+表型百分比的增加。CD16表达持续高于非转导的细胞，约55％的PNK细胞具有中值CD16表达。与PNK-NT相比，还观察到PNK-CD16VP中CD11a+ve群体的少量增加(图35)。基因修饰引起CD56分化的延迟，这通过将培养时间延长3天(38天)来克服。扩增后基因修饰组的中值CD16表达显示出超过55。CD16VP修饰的细胞中的中值CD11a表达看起来高于非转导的对照。
通过将培养时间延长3天克服了由基因修饰引起的CD56+PNK细胞的分化延迟。
iii.PNK CD16VP构建体验证：CD16诱导的脱粒以及对激活诱导的切割的抗性
目标1：评价CD16VP构建体对IgG1κ治疗抗体的功能性反应。
方法：在4小时脱粒测定中测试了用CD16VP表达衍生的PNK细胞对平板结合的Unituxin抗体的反应性。在4℃下将不同浓度的Unituxin(0μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml和1μg/ml)涂覆于高结合平底96孔平板上过夜。用PBS洗涤平板后，在CD107a-PE抗体和莫能菌素(BD Biosciences)存在下，接种PNK-NT或PNK-CD16VP细胞。在CO2培养箱中37℃下的4小时刺激后，用CD56-APC、CD16-BV421、CD11a-FITC和CD107a-PE(所有抗体来自BDBiosciences)对细胞染色以评价PNK细胞的脱粒。将细胞洗涤，固定并转移至U形底96孔平板，并且使用FACSCanto I流式细胞分析仪阅读。
结果：用平板结合的GD2抗体(Unituxin)激活后，PNK-NT和PNK-CD16VP显示出脱粒反应，通过与未涂覆的孔相比1ug/ml Unituxin涂覆的PNK细胞上CD107a的表达所证明。通过基因修饰(CD16VP)提高CD16表达导致与PNK-NT相比PNK-CD16VP提高的脱粒反应，证实了令人惊讶的工程化CD16VP蛋白的功能完整性的结果(图36)。
目标2：评价CD16VP构建体对激活诱导的脱落的抗性。
方法：测试了用CD16VP表达衍生的PNK细胞对激活诱导的切割的抗性。在ADAM-17抑制抗体(抗-TACE，克隆D1(A12))的存在或不存在下，用免疫细胞激活剂佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-醋酸酯(PMA)处理PNK细胞4小时。使用抗CD16抗体评估CD16的表达。
结果：PMA介导的激活后，非转导的PNK(PNK-NT)细胞显示出CD16表达急剧损失约90％，这在ADAM-17抑制剂抗-tace抗体的存在下被防止。用PMA刺激时，来自PNK-CD16VP的CD16的表达没有显著损失(～6％的表达损失)。ADAM-17抑制剂的存在也防止了观察到的6％的CD16表达损失。数据表明CD16VP构建体对于PNK细胞激活时的脱落具有抗性。PNK-NT中PMA介导的野生型CD16的脱落的作用机理可以归因于ADAM-17的作用(如文献中证明的)，这通过ADAM-17抑制剂在防止野生型CD16表达的损失中的能力得到证明。
工程化蛋白CD16VP在功能上是完整的--能够引发通过PNK-CD16VP的脱粒反应并且如预期的，对激活介导的受体切割具有抗性。
iv.抗体依赖性细胞毒性(ADCC)
目标：评价PNK-CD16VP的提高的ADCC潜能
方法：按照之前所述的设置ADCC分析，用PKH-26染料将肿瘤靶标预染色，并随后用20ug/ml治疗抗体(CD20、CD38和CD319)在分析缓冲液中在37℃下染色30分钟，并洗涤以除去过量的未结合抗体。该分析在U形底96孔平板中以10:1和2.5:1的E:T比率设置。
结果：三种测试的抗体显示出通过PNK-CD16VP的肿瘤靶Daudi的裂解与PNK-NT相比的提高(图37)。
如所示的，从使用pNK细胞的测试，可以将这些细胞扩增、表征并产生可以用于治疗疾病(如癌症)的产物。
发展了优化的慢病毒转导方法，并且获得了70％(43-81％)的转导效率中值，和在扩增结束时维持了超过50％的中值表达。这些实验还显示出转导过程没有不利地影响PNK-CD16VP细胞与PNK-NT相比的中值扩增潜能(范围从81-7818)。
CD56+ve PNK细胞的分化略有延迟，这通过将培养时间延长3天来克服。
然而，PNK-CD16VP上另外的CD16表达导致PNK-CD16VP响应于平板结合的治疗性IgG1κ抗体Unituxin的更高脱粒-表明工程化蛋白的功能完整性。
证实了CD16VP对激活诱导的脱落/切割是抗性的。
令人惊讶地，PNK-CD16VP细胞针相CD20、CD38和CD319抗体显示出较高的抗Daudi肿瘤系的细胞毒性。
本发明的范围不受在此描述的特定可选方案的限制。实际上，根据前面的描述和附图，除了所描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将变得明显。这些修改旨在落入所附权利要求的范围内。
本文引用的所有参考文献的全部内容出于所有目的通过引用并入本文，其程度如同为了所有目的将每个单独的出版物、专利或专利申请具体地和单独地指出通过引用而整体并入。任何出版物的引用是为了在申请日期之前的公开内容，而不应该被解释为承认本发明没有资格由于在先发明而先于这些出版物。

Claims (92)

1.一种自然杀伤细胞群体，其中所述自然杀伤(NK)细胞经遗传修饰以使其缺乏NK抑制性分子的表达或呈现出降低的NK抑制性分子的表达。
2.权利要求1的群体，其中所述NK抑制性分子是选自CBLB、NKG2A和TGFBR2的一种或多种NK抑制性分子。
3.权利要求1或2的群体，其中所述遗传修饰的NK细胞与其中所述NK抑制性分子的表达未被敲除或降低的NK细胞相比具有更高的对抗肿瘤细胞的细胞毒性。
4.权利要求3的群体，其中所述肿瘤细胞选自多发性骨髓瘤细胞、急性髓性白血病(AML)细胞、乳腺癌细胞、头颈癌细胞、肉瘤细胞、导管癌细胞、白血病细胞、急性T细胞白血病细胞、慢性髓性淋巴瘤细胞、慢性髓细胞性白血病(CML)细胞、多发性骨髓瘤(MM)、肺癌细胞、结肠腺癌细胞、组织细胞性淋巴瘤细胞、结肠直肠癌细胞、结直肠腺癌细胞和视网膜母细胞瘤细胞。
5.权利要求4的群体，其中所述肿瘤细胞是实体肿瘤细胞。
6.权利要求5的群体，其中所述实体肿瘤细胞选自肝肿瘤细胞、肺肿瘤细胞、胰腺肿瘤细胞、肾肿瘤细胞和多形性胶质母细胞瘤(GBM)细胞。
7.权利要求1的群体，其中所述NK抑制性分子的表达被敲除。
8.权利要求7的群体，其中所述NK抑制性分子的表达通过CRISPR/CAS9系统、锌指核酸酶或TALEN核酸酶敲除。
9.权利要求7的群体，其中所述NK抑制性分子的表达通过CRISPR相关技术敲除。
10.权利要求1或2的群体，其中所述NK抑制性分子是CBLB。
11.权利要求7-10任一项的群体，其中CBLB表达的敲除产生在用ICAM-1和MICA刺激时比其中CBLB未被敲除的NK细胞具有更高的IFNγ分泌的NK细胞群体。
12.权利要求7-10任一项的群体，其中CBLB表达的敲除产生在用ICAM-1和MICA刺激时与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比具有更高的脱粒的NK细胞群体。
13.权利要求12的群体，其中所述脱粒通过CD107a的增加来测量。
14.权利要求7-10任一项的群体，其中CBLB表达的敲除产生与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比具有GM-CSF、可溶性CD137(sCD137)、IFNγ、MIP1α、MIP1β、TNFα和穿孔素中一种或多种的分泌的变化的NK细胞。
15.权利要求1或2的群体，其中所述NK抑制性分子是NKG2A。
16.权利要求15-19任一项的群体，其中NKG2A表达的敲除产生在NKG2A激动剂抗体存在下用ICAM-1和MICA刺激时与其中NKG2A未被敲除的NK细胞相比具有更高的脱粒的NK细胞群体。
17.权利要求16的群体，其中所述脱粒通过CD107a的增加来测量。
18.权利要求16或17的群体，其中NKG2A表达的敲除产生与其中NKG2A未被敲除的NK细胞相比具有GM-CSF、可溶性CD137(sCD137)、IFNγ、MIP1α、MIP1β、TNFα和/或穿孔素中一种或多种的分泌的变化的NK细胞群体。
19.权利要求1或2的群体，其中所述NK抑制性分子是TGBFR2。
20.权利要求19的群体，其中TGBFR2表达的敲除产生与其中TGFBR2未被敲除的NK细胞相比具有对于TGFβ介导的抗肿瘤细胞NK细胞细胞毒性的抑制的抗性的NK细胞群体。
21.一种自然杀伤细胞群体，其中所述自然杀伤(NK)细胞经遗传修饰以包含修饰的CD16。
22.权利要求21的群体，其中所述修饰的CD16比野生型CD16具有更高的对于IgG的亲和力。
23.权利要求22的群体，其中所述修饰的CD16在CD16a的位置158处具有缬氨酸。
24.权利要求21的群体，其中所述修饰的CD16对ADAM17切割是抗性的。
25.权利要求24的群体，其中所述修饰的CD16在CD16a的位置197处具有脯氨酸。
26.权利要求21-25任一项的群体，其中所述修饰的CD16含有IgK信号肽。
27.权利要求21-26任一项的群体，其中所述修饰的CD16含有CD16信号肽。
28.权利要求21-27任一项的群体，其中所述修饰的CD16通过病毒感染引入所述NK细胞中。
29.权利要求28的群体，其中所述修饰的CD16通过病毒感染引入造血细胞中，随后该造血细胞分化成NK细胞。
30.权利要求28-29的群体，其中所述修饰的CD16通过慢病毒载体引入。
31.权利要求30的群体，其中所述慢病毒载体具有CMV或EF1α启动子。
32.权利要求30或31的群体，其中所述慢病毒载体包含一个或多个药物选择标记。
33.权利要求28或29的群体，其中所述修饰的CD16通过逆转录病毒载体引入。
34.权利要求33的群体，其中所述逆转录病毒载体包含一个或多个药物选择标记。
35.权利要求1-34任一项的群体，其中所述NK细胞是胎盘来源的(PNK细胞)。
36.一种抑制肿瘤细胞增殖的方法，包括将所述肿瘤细胞接触来自权利要求1-35或55-59任一项的群体的自然杀伤细胞。
37.权利要求36的方法，其中所述接触在体外进行。
38.权利要求36的方法，其中所述接触在体内进行。
39.权利要求38的方法，其中所述接触在人类个体中进行，优选选择来接受抗癌治疗的个体。
40.权利要求39的方法，其中所述方法包括将所述自然杀伤细胞施用于所述个体。
41.权利要求36-40任一项的方法，其中所述肿瘤细胞是多发性骨髓瘤细胞。
42.权利要求36-40任一项的方法，其中所述肿瘤细胞是急性髓性白血病(AML)细胞。
43.权利要求42的方法，其中所述个体患有复发性/难治性AML。
44.权利要求42的方法，其中所述个体患有对于抗AML的至少一种非先天性淋巴样细胞(ILC)治疗失败的AML。
45.权利要求40的方法，其中所述个体为65岁或更大年龄，并且处于第一缓解期。
46.权利要求40-45任一项的方法，其中在施用所述自然杀伤细胞前，所述个体已经用氟达拉滨、阿糖胞苷或两者进行了调理。
47.权利要求40-46任一项的方法，其中所述肿瘤细胞选自多发性骨髓瘤细胞、急性髓性白血病(AML)细胞、乳腺癌细胞、头颈癌细胞、肉瘤细胞、导管癌细胞、白血病细胞、急性T细胞白血病细胞、慢性髓性淋巴瘤细胞、慢性髓细胞性白血病(CML)细胞、多发性骨髓瘤(MM)、肺癌细胞、结肠腺癌细胞、组织细胞性淋巴瘤细胞、结肠直肠癌细胞、结直肠腺癌细胞和视网膜母细胞瘤细胞。
48.权利要求40-47任一项的群体，其中所述肿瘤细胞是实体肿瘤细胞。
49.权利要求48的群体，其中所述实体肿瘤细胞选自肝肿瘤细胞、肺肿瘤细胞、胰腺肿瘤细胞、肾肿瘤细胞和多形性胶质母细胞瘤(GBM)细胞。权利要求40-49任一项的方法，其中所述自然杀伤细胞与抗CD33抗体一起施用。
50.权利要求40-49任一项的方法，其中所述自然杀伤细胞与抗CD20抗体一起施用。
51.权利要求40-49任一项的方法，其中所述自然杀伤细胞与抗CD138抗体一起施用。
52.权利要求40-49任一项的方法，其中所述自然杀伤细胞与抗CD38抗体一起施用。
53.权利要求36-53任一项的方法，其中在所述接触或所述施用前，所述自然杀伤细胞冷冻保存。
54.权利要求36-53任一项的方法，其中在所述接触或所述施用前，所述自然杀伤细胞没有冷冻保存。
55.权利要求1-54任一项的群体，其中所述自然杀伤细胞是CD56+CD3-CD117+CD11a+，表达穿孔素和/或EOMES，并且不表达RORγt、芳基烃受体和IL1R1中的一种或多种。
56.权利要求55的群体，其中所述自然杀伤细胞表达穿孔素和EOMES，并且不表达RORγt、芳基烃受体和IL1R1中的任何一种。
57.权利要求55或56的群体，其中所述自然杀伤细胞另外表达T-bet、GZMB、NKp46、NKp30和/或NKG2D。
58.权利要求55-57任一项的群体，其中所述自然杀伤细胞表达CD94。
59.权利要求55-57任一项的群体，其中所述自然杀伤细胞不表达CD94。
60.源自胎盘或其部分，由此包含胎盘来源的NK细胞(pNK细胞)的自然杀伤细胞群体，其中所述pNK细胞进行遗传修饰，使得它们缺乏NK抑制性分子的表达或呈现出降低的NK抑制性分子的表达。
61.权利要求60的群体，其中所述NK抑制性分子是选自CBLB、NKG2A和TGFBR2的一种或多种NK抑制性分子。
62.权利要求60或61的群体，其中所述遗传修饰的NK细胞与其中所述NK抑制性分子的表达未被敲除或降低的NK细胞相比具有更高的对抗肿瘤细胞的细胞毒性。
63.权利要求62的群体，其中所述肿瘤细胞选自多发性骨髓瘤细胞、急性髓性白血病(AML)细胞、乳腺癌细胞、头颈癌细胞、肉瘤细胞、导管癌细胞、白血病细胞、急性T细胞白血病细胞、慢性髓性淋巴瘤细胞、慢性髓细胞性白血病(CML)细胞、多发性骨髓瘤(MM)、肺癌细胞、结肠腺癌细胞、组织细胞性淋巴瘤细胞、结肠直肠癌细胞、结直肠腺癌细胞和视网膜母细胞瘤细胞。
64.权利要求62的群体，其中所述肿瘤细胞是实体肿瘤细胞。
65.权利要求64的群体，其中所述实体肿瘤细胞选自肝肿瘤细胞、肺肿瘤细胞、胰腺肿瘤细胞、肾肿瘤细胞和多形性胶质母细胞瘤(GBM)细胞。
66.权利要求60的群体，其中所述NK抑制性分子的表达被敲除。
67.权利要求66的群体，其中所述NK抑制性分子的表达通过CRISPR/CAS9系统、锌指核酸酶或TALEN核酸酶敲除。
68.权利要求66的群体，其中所述NK抑制性分子的表达通过CRISPR相关技术敲除。
69.权利要求60或61的群体，其中所述NK抑制性分子是CBLB。
70.权利要求69的群体，其中CBLB表达的敲除产生在用ICAM-1和MICA刺激时与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比具有更高的IFNγ分泌的NK细胞群体。
71.权利要求69的群体，其中CBLB表达的敲除产生在用ICAM-1和MICA刺激时与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比具有更高的脱粒的NK细胞群体。
72.权利要求71的群体，其中所述脱粒通过CD107a的增加来测量。
73.权利要求69-72任一项的群体，其中CBLB表达的敲除产生与其中CBLB未被敲除的NK细胞相比，在与多发性骨髓瘤细胞共培养时具有GM-CSF、可溶性CD137(sCD137)、IFNγ、MIP1α、MIP1β、TNFα和/或穿孔素中一种或多种的分泌的变化的NK细胞群体。
74.权利要求60或61的群体，其中所述NK抑制性分子是NKG2A。
75.权利要求74的群体，其中NKG2A表达的敲除产生在NKG2A激动剂抗体存在下用ICAM-1和MICA刺激时与其中NKG2A未被敲除的NK细胞相比具有更高的脱粒的NK细胞群体。
76.权利要求75的群体，其中所述脱粒通过CD107a的增加来测量。
77.权利要求76的群体，其中所述CD107a的增加通过FACs来测量。
78.权利要求74-77任一项的群体，其中NKG2A表达的敲除产生与其中NKG2A未被敲除的NK细胞，如天然存在的NK细胞，相比具有GM-CSF、可溶性CD137(sCD137)、IFNγ、MIP1α、MIP1β、TNFα和/或穿孔素中一种或多种的分泌的变化的NK细胞群体。
79.胎盘来源的自然杀伤细胞(pNK)的群体，其中所述pNK细胞经遗传修饰以包含修饰的CD16。
80.权利要求79的群体，其中所述修饰的CD16比野生型CD16具有更高的对于IgG的亲和力。
81.权利要求80的群体，其中所述修饰的CD16在CD16a的位置158处具有缬氨酸。
82.权利要求79的群体，其中所述修饰的CD16对ADAM17切割是抗性的。
83.权利要求82的群体，其中所述修饰的CD16在CD16a的位置197处具有脯氨酸。
84.权利要求79-83任一项的群体，其中所述修饰的CD16含有IgK信号肽或CD16信号肽。
85.权利要求79-84任一项的群体，其中所述修饰的CD16通过病毒感染引入所述NK细胞中。
86.权利要求85的群体，其中所述修饰的CD16通过病毒感染引入造血细胞中，随后该造血细胞分化成NK细胞。
87.权利要求85或86的群体，其中所述修饰的CD16通过慢病毒载体引入。
88.权利要求87的群体，其中所述慢病毒载体具有CMV或EF1α启动子。
89.权利要求85或86的群体，其中所述慢病毒载体包含一个或多个药物选择标记。
90.权利要求89的群体，其中所述选择标记包括编码赋予对选择剂的抗性的蛋白的基因，如PuroR基因、ZeoR基因、HygroR基因、neoR基因和/或杀稻瘟菌素抗性基因。
91.权利要求85或86的群体，其中所述修饰的CD16通过逆转录病毒载体引入。
92.权利要求91的群体，其中所述逆转录病毒载体包含一个或多个药物选择标记。
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