EA039192B1 - Способ лечения рака и набор для лечения рака - Google Patents

Способ лечения рака и набор для лечения рака Download PDF

Info

Publication number
EA039192B1
EA039192B1 EA201791442A EA201791442A EA039192B1 EA 039192 B1 EA039192 B1 EA 039192B1 EA 201791442 A EA201791442 A EA 201791442A EA 201791442 A EA201791442 A EA 201791442A EA 039192 B1 EA039192 B1 EA 039192B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cells
medium
cell
placental
population
Prior art date
Application number
EA201791442A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201791442A1 (ru
Inventor
Линь Кан
Сяокуй Чжан
Джеффри Харрис
Владимир ЯНКОВИЧ
Original Assignee
Селджин Корпорейшн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Селджин Корпорейшн filed Critical Селджин Корпорейшн
Priority claimed from PCT/US2015/068069 external-priority patent/WO2016109668A1/en
Publication of EA201791442A1 publication Critical patent/EA201791442A1/ru
Publication of EA039192B1 publication Critical patent/EA039192B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/50—Placenta; Placental stem cells; Amniotic fluid; Amnion; Amniotic stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4613—Natural-killer cells [NK or NK-T]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6006—Cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/125—Stem cell factor [SCF], c-kit ligand [KL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/145—Thrombopoietin [TPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2307—Interleukin-7 (IL-7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/26—Flt-3 ligand (CD135L, flk-2 ligand)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/90—Polysaccharides
    • C12N2501/91—Heparin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/03—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from non-embryonic pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)

Abstract

Изобретение относится к способу лечения рака и набору для лечения рака.

Description

По заявке на данное изобретение испрашивается приоритет предварительной заявки на патент
США № 62/098547, поданной 31 декабря 2014 г., и предварительной заявки на патент США № 62/139952, поданной 30 марта 2015 г., раскрытия каждой из которых включены в настоящее изобретение во всей их полноте посредством ссылок.
1. Область техники, к которой относится изобретение
В настоящем изобретении представлены способы лечения гематологического нарушения, солидной опухоли или инфекционного заболевания у нуждающегося в этом субъекта с применением NK-клеток в комбинации со вторым средством или с применением NK-клеток с генетическими модификациями для специфичности нацеливания и/или специфичности хоминга.
2. Уровень техники
Естественные клетки-киллеры (NK) представляют собой цитотоксические лимфоциты, которые составляют основной компонент врожденной иммунной системы.
NK-клетки активируются в ответ на интерфероны или полученные из макрофага цитокины. NK-клетки имеют поверхностные рецепторы двух типов, называемых активирующими рецепторами и ингибирующими рецепторами, которые управляют цитотоксической активностью клеток.
Помимо других активностей, NK-клетки играют роль в отторжении опухолей организмом, и было показано, что они способны уничтожать инфицированные вирусами клетки. Естественные клеткикиллеры могут стать активированными посредством того, что у клеток отсутствуют белки или они демонстрируют сниженные уровни белков главного комплекса гистосовместимости (МНС). Активированные и расширенные NK-клетки и LAK-клетки из периферической крови использовались и в терапии ex vivo (вне организма), и в лечении in vivo (в организме) пациентов, имевших рак на поздней стадии, с некоторым успехом в отношении связанных с костным мозгом заболеваний, таких как лейкемия; рака молочной железы; и лимфом определенных типов.
Несмотря на выгодные свойства NK-клеток в уничтожении опухолевых клеток и инфицированных вирусами клеток, остается большая потребность в разработке более эффективных NK-клеток и более эффективных схем лечения, в которых применяются NK-клетки.
3. Сущность изобретения
Настоящее изобретение представляет способы лечения заболевания (например, гематологического нарушения, солидной опухоли или инфекционного заболевания) у нуждающегося в этом субъекта с применением естественных клеток-киллеров (NK) в комбинации со вторым средством, которое может применяться для лечения заболевания. Также в настоящем изобретении представлены способы лечения заболевания (например, гематологического нарушения, солидной опухоли или инфекционного заболевания) у нуждающегося в этом субъекта с применением NK-клеток с генетическими модификациями (например, NK-клеток, которые содержат химерный антигенный рецептор (CAR) и/или хоминг-рецептор) для специфичности нацеливания и/или хоминг-специфичности.
В одном из аспектов, представленных в настоящем раскрытии, способы лечения рака у нуждающегося в этом субъекта включают в себя (а) введение указанному субъекту изолированной популяции естественных клеток-киллеров (NK) или фармацевтической композиции с ними и (b) введение указанному субъекту второго средства или фармацевтической композиции с ним, при этом указанное второе средство может применяться для лечения указанного рака. В конкретном варианте осуществления указанный рак представляет собой множественную миелому.
В определенных вариантах осуществления второе средство представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфично связывается с ассоциированным с опухолью антигеном (ТАА). В конкретных вариантах осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело. В конкретных вариантах осуществления ТАА выбирают из группы, состоящей из CD123, CLL-1, CD38, CS-1 (также называемого SLAM7, SLAMF7, CD319 и CRACC), CD138, ROR1, FAP, MUC1, PSCA, EGFRvIII, ЕРНА2 и GD2. В более конкретном варианте осуществления второе средство представляет собой антитело, которое связывается с CS-1. В более конкретных вариантах осуществления второе средство представляет собой элотузумаб (HuLuc63, гуманизированное моноклональное антитело против CS-1 компаний Бристол-Майерс Сквибб/ЭббВи).
В определенных вариантах осуществления второе средство представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфично связывается с ассоциированным с микроокружением опухоли антигеном (ТМАА). В конкретных вариантах осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело. В конкретных вариантах осуществления ТМАА выбирают из группы, состоящей из VEGF-A, EGF, PDGF, IGF и bFGF.
В определенных вариантах осуществления второе средство представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфично связывается и является антагонистом активности белка иммунной контрольной точки. В конкретных вариантах осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело. В конкретных вариантах осуществления белок иммунной контрольной точки выбирают из группы, состоящей из CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2 и LAG-3.
В определенных вариантах осуществления второе средство представляет собой биспецифичный активатор клеток-киллеров (BiKE). В конкретных вариантах осуществления BiKE содержит первый одно- 1 039192 цепочечный вариабельный фрагмент (scFv), который специфично связывается с ТАА. В дальнейших конкретных вариантах осуществления ТАА выбирают из группы, состоящей из CD123, CLL-1, CD38,
CS-1, CD138, ROR1, FAP, MUC1, PSCA, EGFRvIII, EPHA2 и GD2. В конкретных вариантах осуществления BiKE содержит второй scFv, который специфично связывается с CD16.
В определенных вариантах осуществления второе средство представляет собой противовоспалительное средство.
В определенных вариантах осуществления второе средство представляет собой иммуномодулирующее средство. В конкретных вариантах осуществления второе средство представляет собой леналидомид или помалидомид.
В определенных вариантах осуществления второе средство представляет собой цитотоксическое средство.
В определенных вариантах осуществления второе средство представляет собой вакцину против рака.
В определенных вариантах осуществления второе средство представляет собой химиотерапевтический препарат.
В определенных вариантах осуществления второе средство представляет собой ингибитор HDAC. В других конкретных вариантах осуществления второе средство представляет собой ромидепсин (истодакс®, Celgene).
В определенных вариантах осуществления второе средство представляет собой миРНК.
В некоторых вариантах осуществления изолированную популяцию NK-клеток или фармацевтическую композицию с ней вводят перед вторым средством или фармацевтической композицией с ним. В некоторых вариантах осуществления изолированную популяцию NK-клеток или фармацевтическую композицию с ней вводят после второго средства или фармацевтической композиции с ним. В других вариантах осуществления изолированную популяцию NK-клеток или фармацевтическую композицию с ней вводят одновременно со вторым средством или фармацевтической композицией с ним.
В конкретных вариантах осуществления этап введения указанному субъекту изолированной популяции NK-клеток или фармацевтической композиции с ней выполняют посредством инъекции, инфузии, внутривенного (IV) введения, внутрибедренного введения или внутриопухолевого введения. В конкретных вариантах осуществления этап введения указанному субъекту изолированной популяции NK-клеток или фармацевтической композиции с ней выполняют с помощью устройства, матрицы или скаффолда. В конкретных вариантах осуществления этап введения указанному субъекту изолированной популяции NK-клеток или фармацевтической композиции с ней выполняют посредством инъекции. В конкретных вариантах осуществления инъекция NK-клеток представляет собой местную инъекцию. В более конкретных вариантах осуществления местную инъекцию выполняют непосредственно в солидную опухоль (например, саркому). В конкретных вариантах осуществления введение NK-клеток выполняют посредством инъекции шприцем. В конкретных вариантах осуществления введению NK-клеток посредством инъекции способствуют лапароскопией, эндоскопией, ультразвуком, компьютерной томографией, магнитным резонансом или рентгенологией.
В конкретных вариантах осуществления этап введения указанному субъекту второго средства или фармацевтической композиции с ним выполняют посредством инъекции, инфузии, внутривенного (IV) введения, внутрибедренного введения или внутриопухолевого введения. В конкретных вариантах осуществления этап введения указанному субъекту второго средства или фармацевтической композиции с ним выполняют с помощью устройства, матрицы или скаффолда.
В различных вариантах осуществления NK-клетки являются фукозилированными на поверхности клеток.
В некоторых вариантах осуществления изолированную популяцию NK-клеток или фармацевтическую композицию с ней вводят в однократной дозе. В других вариантах осуществления изолированную популяцию NK-клеток или фармацевтическую композицию с ней вводят во множестве доз.
В некоторых вариантах осуществления второе средство или фармацевтическую композицию с ним вводят в однократной дозе. В других вариантах осуществления второе средство или фармацевтическую композицию с ним вводят во множестве доз.
В другом аспекте настоящего изобретения представлены способы лечения рака у нуждающегося в этом субъекта, включающие в себя введение указанному субъекту изолированной популяции NK-клеток или фармацевтической композиции с ней, при этом NK-клетки содержат химерный антигенный рецептор (CAR), и при этом указанный CAR содержит внеклеточный домен, трансмембранный домен, внутриклеточный стимулирующий домен и, необязательно, дополнительно костимулирующий домен. Также в настоящем изобретении представлены способы лечения рака у нуждающегося в этом субъекта, включающие в себя введение указанному субъекту изолированной популяции NK-клеток или фармацевтической композиции с ней, при этом NK-клетки содержат хоминг-рецептор и способы лечения рака у нуждающегося в этом субъекта, включающие в себя введение указанному субъекту изолированной популяции естественных клеток-киллеров (NK) или фармацевтической композиции с ней, при этом NK-клетки содержат химерный антигенный рецептор (CAR) и хоминг-рецептор, при этом указанный CAR содержит внекле- 2 039192 точный домен, трансмембранный домен, внутриклеточный стимулирующий домен и, необязательно, дополнительно костимулирующий домен. В различных вариантах осуществления CAR содержит внеклеточный домен, трансмембранный домен, внутриклеточный стимулирующий домен и костимулирующий домен.
В конкретных вариантах осуществления NK-клетки, содержащие CAR и/или хоминг-рецептор, получают из CD34+ стволовых гематопоэтических клеток (HSC), которые конструируют таким образом, чтобы они экспрессировали CAR и/или хоминг-рецептор.
В различных вариантах осуществления внеклеточный домен CAR представляет собой антигенсвязывающий домен. В конкретных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен представляет собой scFv-домен. В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен специфично связывается с ТАА. В конкретных вариантах осуществления ТАА выбирают из группы, состоящей из CD123, CLL-1, CD38, CD20 и CS-1. В более конкретных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит одноцепочечный Fv (scFv) или антигенсвязывающий фрагмент, полученный из антитела, которое связывает CS-1. В более конкретных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит одноцепочечную версию элотузумаба и/или антигенсвязывающего фрагмента элотузумаба. В конкретных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит одноцепочечный Fv (scFv) или антигенсвязывающий фрагмент, полученный из антитела, которое связывает CD20.
В различных вариантах осуществления внутриклеточный стимулирующий домен CAR представляет собой сигнальный домен дзэта-CD3.
В различных вариантах осуществления костимулирующий домен CAR содержит внутриклеточный домен CD28, 4-1ВВ, PD-1, ОХ40, CTLA-4, NKp46, NKp44, NKp30, DAP10 или DAP12.
В различных вариантах осуществления хоминг-рецептор представляет собой хемотаксический рецептор. В конкретных вариантах осуществления хемотаксический рецептор выбирают из группы, состоящей из CXCR4, VEGFR2 и CCR7.
В одном из вариантов осуществления, представленном в настоящем раскрытии, способ лечения индивида, имеющего множественную миелому, включает в себя введение индивиду (1) леналидомида или помалидомида и (2) NK-клеток, которые содержат CAR (CAR NK-клетки), при этом указанные CAR NK-клетки являются эффективными для лечения множественной миеломы у указанного индивида. В конкретных вариантах осуществления способа лечения индивида со множественной миеломой указанные CAR NK-клетки содержат внеклеточный домен CAR, и этот внеклеточный домен является связывающим CS-1 доменом. В конкретных вариантах осуществления связывающий CS-1 домен содержит scFv или антигенсвязывающий фрагмент антитела, которое связывает CS-1. В определенных конкретных вариантах осуществления связывающий CS-1 домен содержит одноцепочечную версию элотузумаба и/или антигенсвязывающего фрагмента элотузумаба.
В другом варианте осуществления, представленном в настоящем раскрытии, способ лечения индивида, имеющего множественную миелому, включает в себя введение индивиду (1) леналидомида или помалидомида; (2) элотузумаба и (3) CAR NK-клеток, при этом указанные CAR NK-клетки являются эффективными для лечения множественной миеломы у указанного индивида. В определенных конкретных вариантах осуществления способа лечения индивида с множественной миеломой указанные CAR NK-клетки содержат внеклеточный домен CAR, и этот внеклеточный домен является связывающим CS-1 доменом. В конкретных вариантах осуществления связывающий CS-1 домен содержит scFv или антигенсвязывающий фрагмент антитела, которое связывает CS-1.
В другом варианте осуществления, представленном в настоящем раскрытии, способ лечения индивида, имеющего рак крови (например, лимфому Беркитта), включает в себя введение индивиду (1) ромидепсина и (2) CAR NK-клеток, при этом указанные CAR NK-клетки являются эффективными для лечения рака крови (например, лимфомы Беркитта) у указанного индивида. В определенных конкретных вариантах осуществления способа лечения индивида с раком крови (например, лимфомой Беркитта) указанные CAR NK-клетки содержат внеклеточный домен CAR, и этот внеклеточный домен является связывающим CD20 доменом. В конкретных вариантах осуществления связывающий CD20 домен содержит scFv или антигенсвязывающий фрагмент антитела, которое связывает CD20.
В конкретных вариантах осуществления этап введения указанному субъекту изолированной популяции NK-клеток или фармацевтической композиции с ней выполняют посредством инъекции, инфузии, внутривенного (IV) введения, внутрибедренного введения или внутриопухолевого введения. В конкретных вариантах осуществления этап введения указанному субъекту изолированной популяции NK-клеток или фармацевтической композиции с ней выполняют с помощью устройства, матрицы или скаффолда. В конкретных вариантах осуществления этап введения указанному субъекту изолированной популяции NK-клеток или фармацевтической композиции с ней выполняют посредством инъекции. В конкретных вариантах осуществления инъекция NK-клеток представляет собой местную инъекцию. В более конкретных вариантах осуществления местную инъекцию выполняют непосредственно в солидную опухоль (например, саркому). В конкретных вариантах осуществления введение NK-клеток выполняют посредством инъекции шприцем. В конкретных вариантах осуществления введению NK-клеток посредством инъекции способствуют лапароскопией, эндоскопией, ультразвуком, компьютерной томографией, магнит- 3 039192 ным резонансом или рентгенологией.
В различных вариантах осуществления NK-клетки являются фукозилированными на поверхности клеток.
В некоторых вариантах осуществления изолированную популяцию NK-клеток или фармацевтическую композицию с ней вводят в однократной дозе. В других вариантах осуществления изолированную популяцию NK-клеток или фармацевтическую композицию с ней вводят во множестве доз.
В другом аспекте, представленном в настоящем раскрытии, способы лечения вирусной инфекции у нуждающегося в этом субъекта включают в себя (а) введение указанному субъекту изолированной популяции естественных клеток-киллеров (NK) или фармацевтической композиции с ней и (b) введение указанному субъекту второго средства или фармацевтической композиции с ним, при этом указанное второе средство может применяться для лечения указанной вирусной инфекции.
В определенных вариантах осуществления второе средство представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфично связывается и является антагонистом активности белка иммунной контрольной точки. В конкретных вариантах осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело. В конкретных вариантах осуществления белок иммунной контрольной точки выбирают из группы, состоящей из CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2 и LAG-3.
В определенных вариантах осуществления второе средство представляет собой биспецифичный активатор клеток-киллеров (BiKE).
В некоторых вариантах осуществления изолированную популяцию NK-клеток или фармацевтическую композицию с ней вводят перед вторым средством или фармацевтической композицией с ним. В некоторых вариантах осуществления изолированную популяцию NK-клеток или фармацевтическую композицию с ней вводят после второго средства или фармацевтической композиции с ним. В других вариантах осуществления изолированную популяцию NK-клеток или фармацевтическую композицию с ней вводят одновременно со вторым средством или фармацевтической композицией с ним.
В конкретных вариантах осуществления этап введения указанному субъекту изолированной популяции NK-клеток или фармацевтической композиции с ней выполняют посредством инъекции, инфузии, внутривенного (IV) введения, внутрибедренного введения или внутриопухолевого введения. В конкретных вариантах осуществления этап введения указанному субъекту изолированной популяции NK-клеток или фармацевтической композиции с ней выполняют с помощью устройства, матрицы или скаффолда. В конкретных вариантах осуществления этап введения указанному субъекту изолированной популяции NK-клеток или фармацевтической композиции с ней выполняют посредством инъекции. В конкретных вариантах осуществления инъекция NK-клеток представляет собой местную инъекцию. В более конкретных вариантах осуществления местную инъекцию выполняют непосредственно в солидную опухоль (например, саркома). В конкретных вариантах осуществления введение NK-клеток выполняют посредством инъекции шприцем. В конкретных вариантах осуществления введению NK-клеток посредством инъекции способствуют лапароскопией, эндоскопией, ультразвуком, компьютерной томографией, магнитным резонансом или рентгенологией.
В конкретных вариантах осуществления этап введения указанному субъекту второго средства или фармацевтической композиции с ним выполняют посредством инъекции, инфузии, внутривенного (IV) введения, внутрибедренного введения или внутриопухолевого введения. В конкретных вариантах осуществления этап введения указанному субъекту второго средства или фармацевтической композиции с ним выполняют с помощью устройства, матрицы или скаффолда.
В различных вариантах осуществления NK-клетки являются фукозилированными на поверхности клеток.
В некоторых вариантах осуществления изолированную популяцию NK-клеток или фармацевтическую композицию с ней вводят в однократной дозе. В других вариантах осуществления изолированную популяцию NK-клеток или фармацевтическую композицию с ней вводят во множестве доз.
В некоторых вариантах осуществления второе средство или фармацевтическую композицию с ним вводят в однократной дозе. В других вариантах осуществления второе средство или фармацевтическую композицию с ним вводят во множестве доз.
В другом аспекте, представленном в настоящем раскрытии, способы лечения вирусной инфекции у нуждающегося в этом субъекта включают в себя введение указанному субъекту изолированной популяции NK-клеток или фармацевтической композиции с ней, при этом NK-клетки содержат химерный антигенный рецептор (CAR), при этом указанный CAR содержит внеклеточный домен, трансмембранный домен, внутриклеточный стимулирующий домен и, необязательно, костимулирующий домен. Также в настоящем изобретении представлены способы лечения вирусной инфекции у нуждающегося в этом субъекта, включающие в себя введение указанному субъекту изолированной популяции NK-клеток или фармацевтической композиции с ней, при этом NK-клетки содержат хоминг-рецептор, и способы лечения вирусной инфекции у нуждающегося в этом субъекта, включающие в себя введение указанному субъекту изолированной популяции естественных клеток-киллеров (NK) или фармацевтической композиции с ней, при этом NK-клетки содержат химерный антигенный рецептор (CAR) и хоминг-рецептор, при этом указанный CAR содержит внеклеточный домен, трансмембранный домен, внутриклеточный
- 4 039192 стимулирующий домен и, необязательно, костимулирующий домен. В различных вариантах осуществления CAR содержит внеклеточный домен, трансмембранный домен, внутриклеточный стимулирующий домен и костимулирующий домен.
В конкретных вариантах осуществления NK-клетки, содержащие CAR и/или хоминг-рецептор, получают из CD34+ стволовых гематопоэтических клеток (HSC), которые конструируют таким образом, чтобы они экспрессировали CAR и/или хоминг-рецептор.
В различных вариантах осуществления внеклеточный домен CAR представляет собой антигенсвязывающий домен. В конкретных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен представляет собой scFv домен.
В различных вариантах осуществления внутриклеточный стимулирующий домен CAR представляет собой сигнальный домен дзэта-CD3.
В различных вариантах осуществления костимулирующий домен CAR содержит внутриклеточный домен CD28, 4-1ВВ, PD-1, ОХ40, CTLA-4, NKp46, NKp44, NKp30, DAP10 или DAP12.
В различных вариантах осуществления хоминг-рецептор представляет собой хемотаксический рецептор. В конкретных вариантах осуществления хемотаксический рецептор выбирают из группы, состоящей из CXCR4, VEGFR2 и CCR7.
В конкретных вариантах осуществления этап введения указанному субъекту изолированной популяции NK-клеток или фармацевтической композиции с ней выполняют посредством инъекции, инфузии, внутривенного (IV) введения, внутрибедренного введения или внутриопухолевого введения. В конкретных вариантах осуществления этап введения указанному субъекту изолированной популяции NK-клеток или фармацевтической композиции с ней выполняют с помощью устройства, матрицы или скаффолда. В конкретных вариантах осуществления этап введения указанному субъекту изолированной популяции NK-клеток или фармацевтической композиции с ней выполняют посредством инъекции. В конкретных вариантах осуществления инъекция NK-клеток представляет собой местную инъекцию. В более конкретных вариантах осуществления местную инъекцию выполняют непосредственно в солидную опухоль (например, саркому). В конкретных вариантах осуществления введение NK-клеток выполняют посредством инъекции шприцем. В конкретных вариантах осуществления введению NK-клеток посредством инъекции способствуют лапароскопией, эндоскопией, ультразвуком, компьютерной томографией, магнитным резонансом или рентгенологией.
В различных вариантах осуществления NK-клетки являются фукозилированными на поверхности клеток.
В некоторых вариантах осуществления изолированную популяцию NK-клеток или фармацевтическую композицию с ней вводят в однократной дозе. В других вариантах осуществления изолированную популяцию NK-клеток или фармацевтическую композицию с ней вводят во множестве доз.
Настоящее изобретение также представляет наборы для лечения заболевания (например, гематологическое нарушение, солидная опухоль или инфекционное заболевание) у нуждающегося в этом субъекта, которые включают в себя изолированную популяцию NK-клеток и второе средство, которое может применяться для лечения заболевания.
В одном из аспектов, представленных в настоящем раскрытии, наборы для лечения рака у нуждающегося в этом субъекта включают в себя (а) изолированную популяцию NK-клеток или фармацевтическую композицию с ней и (b) второе средство или фармацевтическую композицию с ним, при этом указанное второе средство может применяться для лечения указанного рака. Второе средство может являться любым средством, которое может применяться в способах лечения рака в соответствии с описанным выше.
В другом аспекте, представленном в настоящем раскрытии, наборы для лечения вирусной инфекции у нуждающегося в этом субъекта включаю в себя (а) изолированную популяцию NK-клеток или фармацевтическую композицию с ней и (b) второе средство или фармацевтическую композицию с ним, при этом указанное второе средство может применяться для лечения указанной вирусной инфекции. Второе средство может быть любым средством, которое может применяться в способах лечения вирусной инфекции в соответствии с описанным выше.
В различных вариантах осуществления способов или наборов, предоставленных в настоящем раскрытии, NK-клетки представляют собой плацентарные промежуточные естественные клетки-киллеры (PiNK). В определенных вариантах осуществления клетки PiNK получены из плацентарных клеток. В конкретных вариантах осуществления плацентарные клетки получены из плацентарного перфузата. В конкретных вариантах осуществления плацентарные клетки получены из плацентарной ткани, которая была механически и/или ферментативно разорвана.
В различных вариантах осуществления способов или наборов, предоставленных в настоящем раскрытии, NK-клетки представляют собой активированные NK-клетки. В определенных вариантах осуществления активированные NK-клетки продуцируют посредством процесса, включающего в себя (а) высевание популяции гематопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников в первой среде, содержащей интерлейкин-15 (IL-15) и, необязательно, один или более из фактора стволовых клеток (SCF) и интерлейкина-7 (IL-7), при этом указанный IL-15 и необязательные SCF и IL-7 не содержатся
- 5 039192 в пределах неопределенного компонента указанной среды, в результате чего популяция расширяется и множество гематопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников в пределах указанной популяции гематопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников дифференцируется в NK-клетки во время указанного расширения; и (b) расширение клеток с этапа (а) во второй среде, содержащей интерлейкин-2 (IL-2), с тем. чтобы продуцировать популяцию активированных NK-клеток. В определенных вариантах осуществления активированные NK-клетки продуцируют посредством процесса, включающего в себя расширение популяции гематопоэтических стволовых клеток или клетокпредшественников в первой питательной среде, содержащей одно или более из фактора стволовых клеток (SCF) интерлейкина-7 (IL-7) и интерлейкина-15 (IL-15), и при этом указанные SCF, IL-7 и IL-15 не содержатся в пределах неопределенного компонента указанной среды, и при этом множество гематопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников в пределах указанной популяции гематопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников дифференцируется в NK-клетки во время указанного расширения; и при этом второй этап указанного способа включает в себя расширение клеток с первого этапа во второй среде, содержащей интерлейкин-2 (IL-2), с тем чтобы продуцировать активированные NK-клетки.
В конкретных вариантах осуществления первая среда также содержит один или более из лиганда Fms-подобной тирозинкиназы 3 (Flt3-L), тромбопоэтина (Tpo), интерлейкина-2 (IL-2) или гепарина. В дальнейших конкретных вариантах осуществления первая среда дополнительно содежит эмбриональную бычью сыворотку или человеческую сыворотку. В дальнейших конкретных вариантах осуществления SCF присутствует в концентрации от около 1 до около 150 нг/мл в первой среде. В дальнейших конкретных вариантах осуществления Flt3-L присутствует в концентрации от около 1 до около 150 нг/мл в первой среде. В дальнейших конкретных вариантах осуществления IL-2 присутствует в концентрации от около 50 до около 1500 межд.ед./мл в первой среде. В дальнейших конкретных вариантах осуществления IL-7 присутствует в концентрации от около 1 до около 150 нг/мл в первой среде. В дальнейших конкретных вариантах осуществления IL-15 присутствует в концентрации от около 1 до около 150 нг/мл в первой среде. В дальнейших конкретных вариантах осуществления Tpo присутствует в концентрации от около 1 до около 150 нг/мл в первой среде. В дальнейших конкретных вариантах осуществления гепарин присутствует в концентрации от около 0,1 до около 30 ед/мл в первой среде.
В конкретных вариантах осуществления указанные IL-2 на приведенном выше втором этапе присутствуют в концентрации от 50 до около 1500 межд.ед./мл во второй питательной среде.
В конкретных вариантах осуществления указанная вторая среда дополнительно содержит одно или более из эмбриональной сыворотки теленка (FCS), трансферрина, инсулина, этаноламина, олеиновой кислоты, линолевой кислоты, пальмитиновой кислоты, бычьего сывороточного альбумина (BSA) и фитогемагглютинина.
В конкретных вариантах осуществления стволовые гематопоэтические клетки или клеткипредшественники являются CD34+.
В конкретных вариантах осуществления стволовые гематопоэтические клетки или клеткипредшественники включают стволовые гематопоэтические клетки или клетки-предшественники из человеческого плацентарного перфузата и стволовые гематопоэтические клетки или клетки-предшественники из пуповины, при этом указанный плацентарный перфузат и указанная пуповинная кровь берутся из одной и той же плаценты.
В конкретных вариантах осуществления питающие клетки на приведенном выше этапе (b) включают в себя обработанные митомицином-С одноядерные клетки периферической крови (РВМС), клетки K562 или прилипающие к культуре клеток стволовые клетки.
В конкретных вариантах осуществления NK-клетки являются CD3-CD56+CD16-. В дальнейшем конкретном варианте осуществления NK-клетки дополнительно являются CD94+CD117+. В другом дальнейшем конкретном варианте осуществления NK-клетки дополнительно являются CD161-. В другом дальнейшем конкретном варианте осуществления NK-клетки дополнительно являются NKG2D+. В другом дальнейшем конкретном варианте осуществления NK-клетки дополнительно являются NKp46+. В другом дальнейшем конкретном варианте осуществления NK-клетки дополнительно являются CD226+.
В различных вариантах осуществления способов или наборов, предоставленных в настоящем раскрытии, NK-клетки представляют собой полученные посредством трехэтапного процесса NK-клетки (TSPNK). В конкретных вариантах осуществления клетки TSPNK представляют собой клеткипредшественники NK. В определенных вариантах осуществления клетки TSPNK продуцируют посредством процесса, включающего в себя (а) культивирование гематопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников в первой среде, содержащей Flt3L, TPO, SCF, IL-7, G-CSF, IL-6 и GM-CSF; (b) последующее культивирование указанных клеток во второй среде, содержащей Flt3L, SCF, IL-15 и IL-7, IL-17 и IL-15, G-CSF, IL-6 и GM-CSF; и (с) последующее культивирование указанных клеток в третьей среде, содержащей SCF, IL-15, IL-7, IL-2, G-CSF, IL-6 и GM-CSF.
В конкретных вариантах осуществления продолжительность культивирования этапа (а) составляет 7-9 дней, продолжительность культивирования этапа (b) составляет 5-7 дней и продолжительность культивирования этапа (с) составляет 5-9 дней. В конкретных вариантах осуществления продолжительность
- 6 039192 культивирования этапа (а) составляет 7-9 дней, продолжительность культивирования этапа (b) составляет
5-7 дней и продолжительность культивирования этапа (с) составляет 21-35 дней.
В конкретных вариантах осуществления стволовые гематопоэтические клетки или клеткипредшественники, используемые в процессе, являются CD34+.
В конкретных вариантах осуществления стволовые гематопоэтические клетки или клеткипредшественники включают стволовые гематопоэтические клетки или клетки-предшественники из человеческого плацентарного перфузата и стволовые гематопоэтические клетки или клетки-предшественники из пуповины, при этом указанный плацентарный перфузат и указанная пуповинная кровь берутся из одной и той же плаценты.
В конкретных вариантах осуществления клетки CD34’содержат более чем 80% клеток TSPNK в конце этапа (а) процесса продуцирования клеток TSPNK, приведенного выше.
В конкретных вариантах осуществления клетки TSPNK содержат не более чем 40% CD3-CD56+ клеток.
В конкретных вариантах осуществления клетки TSPNK содержат клетки, которые являются CD52+ CD117+.
В различных вариантах осуществления способов или наборов, описанных в настоящем раскрытии, NK-клетки продуцируют посредством процесса, включающего в себя (а) культивирование гематопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников в первой питательной среде, содержащей средство активации стволовых клеток и тромбопоэтин (Tpo), с тем чтобы продуцировать первую популяцию клеток; (b) культивирование первой популяции клеток во второй питательной среде, содержащей средство активации стволовых клеток и интерлейкин 15 (IL-15) и не содержащей Tpo, с тем чтобы продуцировать вторую популяцию клеток; и (с) культивирование второй популяции клеток в третьей питательной среде, содержащей IL-2 и IL-15 и не содержащей средство активации стволовых клеток и LMWH, с тем чтобы продуцировать третью популяцию клеток; при этом третья популяция клеток содержит NKклетки, которые являются CD56+, CD3-, CD16’или CD16+, и CD94+ или CD94-, и при этом по меньшей мере 80% NK-клеток являются жизнеспособными.
Рак в любом из способов или наборов, предоставленных в настоящем раскрытии, может представлять собой гематологический рак или солидную опухоль.
В предпочтительном варианте осуществления любого из способов или наборов, предоставленных в настоящем раскрытии, субъектом является человек.
3.1. Терминология.
При использовании в настоящем изобретении естественная клетка-киллер или NK-клетки, без дополнительного изменения, включают NK-клетки, полученные из любого источника ткани, и включают в себя зрелые естественные клетки-киллеры, а также предшественники естественных клеток-киллеров. В некоторых вариантах осуществления NK-клетки представляют собой плацентарные промежуточные естественные клетки-киллеры (PiNK), как описано в разделе 5.1.1. В некоторых вариантах осуществления NK-клетки представляют собой активированные NK-клетки, как описано в разделе 5.1.2. В некоторых вариантах осуществления NK-клетки представляют собой полученные посредством трехэтапного процесса NK-клетки (TSPNK), как описано в разделе 5.1.3. NK-клетки могут быть получены из любого источника ткани и включают в себя зрелые естественные клетки-киллеры, а также клеткипредшественники NK.
При использовании в настоящем изобретении термин популяция клеток-предшественников NK относится к популяции клеток, содержащей последовательность клеточных поколений естественных клеток-киллеров, которые еще только будут развиваться в зрелые NK-клетки, что показывается, например, уровнем(ями) экспрессии одного или более фенотипических маркеров, например CD56, CD16 и KIR. В одном из вариантов осуществления популяция клеток-предшественников NK содержит клетки с низким CD16 и высоким CD56.
При использовании в настоящем изобретении PiNK и клетки PiNK относятся к плацентарным промежуточным естественным клеткам-киллерам, которые получают из человеческой плаценты, например человеческого плацентарного перфузата или плацентарной ткани, которая была механически и/или ферментативно разорвана. Клетки являются CD56+ и CD16-, например, в соответствии с определенным посредством проточной цитометрии, например, посредством активированной флуоресценцией сортировки клеток с использованием антител к CD56 и CD16.
При использовании в настоящем изобретении плацентарный перфузат означает перфузионный раствор, который прошел по меньшей мере через часть плаценты, например человеческой плаценты, например, через плацентарную сосудистую сеть, и содержит множество клеток, собранных перфузионным раствором во время прохождения через плаценту.
При использовании в настоящем изобретении клетки плацентарного перфузата означают клетки, содержащие ядро, например полные клетки, содержащие ядро, выделенные из или которые могут быть выделены из плацентарного перфузата.
При использовании в настоящем изобретении питающие клетки относится к клеткам одного типа, которые совместно культивируются с клетками второго типа, в целях обеспечения окружающей среды, в
- 7 039192 которой клетки второго типа могут поддерживаться и, возможно, пролиферировать. Вне связи с какойлибо теорией, питающие клетки могут представлять, например, пептиды, полипептиды, электрические сигналы, органические молекулы (например, стероиды), молекулы нуклеиновых кислот, факторы роста (например, bFGF), другие факторы (например, цитокины) и метаболические питательные вещества целевым клеткам. В определенных вариантах осуществления питающие клетки растут в монослое.
При использовании в настоящем изобретении термин гематопоэтические клетки включает в себя стволовые гематопоэтические клетки и гематопоэтические клетки-предшественники.
При использовании в настоящем изобретении неопределенный компонент является термином из области культуральных сред, который относится к компонентам, чьи составляющие, как правило, обычно не были предоставлены или не были определены количественно. Примеры неопределенного компонента включают, без ограничения, человеческую сыворотку (например, человеческую сыворотку АВ) и эмбриональную сыворотку (например, эмбриональную бычью сыворотку или эмбриональную сыворотку теленка).
При использовании в настоящем изобретении +, при использовании для указания наличия конкретного клеточного маркера, означает, что наличие клеточного маркера может быть обнаружено в активированной флуоресценцией клеточной сортировке поверх изотипического контроля; или может быть обнаружено выше фона в количественном или полуколичественном ПЦР-РВ.
При использовании в настоящем изобретении -, при использовании для указания наличия конкретного клеточного маркера, означает, что наличие клеточного маркера не может быть обнаружено в активированной флуоресценцией клеточной сортировке поверх изотипического контроля; или не может быть обнаружено выше фона в количественном или полуколичественном ПЦР-РВ.
При использовании в настоящем изобретении рак относится к гематологическому раку или солидной опухоли.
4. Краткое описание фигур
Фиг. 1 изображает активность антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) клеток PiNK в сравнении с клетками Daudi при различных концентрациях ритуксимаба.
Фиг. 2 изображает экспрессию PD-L1 и CS-1 в клеточных линиях MM MM285, ММ293, RPMI8226 и ОРМ2. Клетки были окрашены анти-PD-L1 АРС (Biolegend, Cat# 329708), анти-CS1 РЕ-Су7 (Biolegend, Cat# 331816) и 7-AAD (BD Bioscience BD, Cat# 559925) согласно протоколу производителя. Данные были получены на BD LSRFortessa (BD Bioscience BD) и проанализированы с использованием программного обеспечения FLOWJO® (Tree Star). Данные были выражены как % положительных клеток, запертых под единичными клетками 7-AAD-. Установка % положительного запирания была сделана с использованием неокрашенного образца в качестве контроля. Крайний левый пик на графиках указывает контроль, тогда как самый правый пик указывает образец. Процент клеток, положительных по PD-L1, был следующим: 71,6% ММ285, 70,7% ММ293, 66,2% ОРМ-2 и 94,4% RPMI8226. Процент клеток, положительных по CS-1 был следующим: 31,8% ММ285, 58,8% ММ293, 93,4% ОРМ-2 и 29,5% RPMI8226.
Фиг. 3 изображает 24-часовую пробу на цитотоксичность полученных посредством трехэтапного процесса NK-клеток в сравнении с указанными клеточными линиями ММ и первичными образцами ММ в отношении эффектор-мишень, составляющем 3:1. Количество жизнеспособных целевых клеток (PKH26+TO-PRO-3-) в каждом образце было определено количественно посредством проточной цитометрии с использованием гранул для подсчета в соответствии с протоколом, предоставленным производителем (Invitrogen, Cat# C36950). Гранулы для подсчета были введены в данную пробу в целях учета любой потенциальной пролиферации опухолевых клеток во время длительного 24-часового культивирования. После инкубации в течение 24 ч при 37°C и 5% СО2 клетки были собраны, после чего проводилось окрашивание 1 мкМ TO-PRO-3, чтобы идентифицировать мертвые клетки. Результаты изображены как среднее значение ± стандартное отклонение среднего значения.
Фиг. 4 изображает 24-часовую пробу на цитотоксичность полученных посредством трехэтапного процесса NK-клеток в сравнении с клетками ОРМ2 в отношении эффектор-мишень, составляющем 3:1, наряду со следующими дополнительными условиями: IL-15 (5 нг/мл) (Invitrogen, Cat# PHC9153); IL-2 (20о межд.ед./мл) (Invitrogen, Cat# PHC0023); анти-PD-L1 (10 нг/мл) (Affymetrix, Cat# 16-5983-82); антиIgG (10 нг/мл) (Affymetrix, Cat# 16-4714-82); ревлимид® (леналидомид; 1 мкМ) или диметилсульфоксид (0,1%) в планшетах с 48 лунками. Целевые клетки сами по себе были нанесены в планшет в качестве контролей. После инкубации в течение 24 ч при 37°C и 5% СО2 клетки были собраны, после чего проводилось окрашивание 1 мкМ TO-PRO-3, чтобы идентифицировать мертвые клетки. Результаты изображены как среднее значение ± стандартное отклонение среднего значения.
5. Подробное описание
В настоящем изобретении представлены способы лечения заболевания (например, гематологического нарушения, солидной опухоли или инфекционного заболевания) у нуждающегося в этом субъекта с применением естественных клеток-киллеров (NK) в комбинации со вторым средством, которое может применяться для лечения заболевания. Также в настоящем изобретении представлены способы лечения заболевания (например, гематологического нарушения, солидной опухоли или инфекционного заболева- 8 039192 ния) у нуждающегося в этом субъекта с применением NK-клеток с генетическими модификациями (например, NK-клеток, которые содержат химерный антигенный рецептор (CAR) и/или хоминг-рецептор) для специфичности нацеливания и/или хоминг-специфичности. Наборы для лечения заболевания (например, гематологического нарушения, солидной опухоли или инфекционного заболевания) у нуждающегося в этом субъекта включают в себя изолированную популяцию NK-клеток и второе средство, которое может применяться для лечения заболевания или которые включают в себя изолированную популяцию
NK-клеток с генетическими модификациями (например, NK-клетки, которые содержат химерный антигенный рецептор (CAR) и/или хоминг-рецептор), также представлены в настоящем раскрытии.
5.1. NK-клетки.
В настоящем изобретении описаны NK-клетки, включая клетки PiNK, активированные NK-клетки, клетки TSPNK и NK-клетки, полученные посредством трехэтапного процесса.
5.1.1. Плацентарные промежуточные естественные клетки-киллеры (PiNK).
В некоторых вариантах осуществления NK-клетки представляют собой плацентарные промежуточные естественные клетки-киллеры (PiNK) (см. также патент США № 8263065, изобретение которого включено в настоящее описание посредством ссылки во всей его полноте). В различных вариантах осуществления клетки PiNK получают из плацентарных клеток. В конкретных вариантах осуществления плацентарные клетки получают из плацентарного перфузата, например человеческого плацентарного перфузата. В конкретных вариантах осуществления плацентарные клетки получают из плацентарной ткани, которая была механически и/или ферментативно разорвана.
Клетки PiNK характеризуются как являющиеся CD56+CD16-, т.е. демонстрируют клеточный маркер CD56 и не имеют клеточного маркера CD16, например, в соответствии с определенным посредством проточной цитометрии, например активированной флуоресценцией сортировки клеток с применением антител против CD16 и CD56, как описано выше.
В определенных вариантах осуществления клетки PiNK являются CD3-.
В других вариантах осуществления клетки PiNK не демонстрируют одного или более клеточных маркеров, демонстрируемых полностью зрелыми NK-клетками (например, CD16), или демонстрируют такие один или более маркеров на детектируемо сниженном уровне по сравнению с полностью зрелыми NK-клетками, или демонстрируют один или более клеточных маркеров, ассоциированных с предшественниками естественных клеток-киллеров, но не с полностью зрелыми естественными клеткамикиллерами. В конкретном варианте осуществления клетка PiNK, описанная в настоящем раскрытии, экспрессирует NKG2D, CD94 и/или NKp46 на детектируемо более низком уровне, чем полностью зрелая NK-клетка. В другом конкретном варианте осуществления множество клеток PiNK, описанных в настоящем раскрытии, экспрессирует, суммарно, NKG2D, CD94 и/или NKp46 на детектируемо более низком уровне, чем эквивалентное количество полностью зрелых NK-клеток.
В определенных вариантах осуществления клетки PiNK экспрессируют одну или более микроРНК hsa-miR-100, hsa-miR-127, hsa-miR-211, hsa-miR-302c, hsa-miR-326, hsa-miR-337, hsa-miR-497, hsa-miR-512-3р, hsa-miR-515-5p, hsa-miR-517b, hsa-miR-517c, hsa-miR-518a, hsa-miR-518e, hsa-miR-519d, hsa-miR-520g, hsa-miR-520h, hsa-miR-564, hsa-miR-566, hsa-miR-618 и/или hsa-miR-99a на детектируемо более высоком уровне, чем естественные клетки-киллеры периферической крови.
Поскольку послеродовая плацента содержит ткань и клетки из плода и из плацентарного перфузата матери, в зависимости от способа сбора, клетки PiNK могут включать в себя только эмбриональные клетки или существенное большинство эмбриональных клеток (например, более чем около 90, 95, 98 или 99%) или могут включать в себя смесь эмбриональных и материнских клеток (например, эмбриональные клетки составляют менее чем около 90, 80, 70, 60 или 50% от суммарного количества содержащих ядро клеток перфузата). В одном из вариантов осуществления клетки PiNK получают только из эмбриональных плацентарных клеток, например клеток, полученных из замкнутой перфузии плаценты (см. выше), при этом перфузия производит перфузат, содержащий существенное большинство или только эмбриональные плацентарные клетки. В другом варианте осуществления клетки PiNK получают из эмбриональных и материнских клеток, например клеток, полученных посредством перфузии методом культивирования в кюветах (см. выше), при этом перфузия производит перфузат, содержащий смесь эмбриональных и материнских плацентарных клеток. Таким образом, в одном из вариантов осуществления NK-клетки представляют собой популяцию полученных из плаценты промежуточных NK-клеток, существенное большинство которых имеют эмбриональный генотип. В другом варианте осуществления NK-клетки представляют собой популяцию полученных из плаценты промежуточных NK-клеток, которые включают в себя NK-клетки, имеющие эмбриональный генотип, и NK-клетки, имеющие материнский фенотип.
5.1.2. Активированные NK-клетки.
В некоторых вариантах осуществления NK-клетки представляют собой активированные NK-клетки (т.е. полученные посредством двухэтапного процесса NK-клетки или клетки TSNK) (см. также публикацию заявки на патент США № 2012/0148553, изобретение которой включено в настоящее изобретение посредством ссылки во всей его полноте), которые представляют собой NK-клетки, продуцированные посредством любого способа/процесса, описанного ниже в разделе 5.2.4.
- 9 039192
В конкретном варианте осуществления активированные NK-клетки являются CD3-CD56+. В конкретном варианте осуществления активированные NK-клетки являются CD3-CD56+CD16-. В другом конкретном варианте осуществления активированные NK-клетки дополнительно являются CD94+CD117+. В другом конкретном варианте осуществления активированные NK-клетки дополнительно являются CD161-. В другом конкретном варианте осуществления активированные NK-клетки дополнительно являются NKG2D+. В другом конкретном варианте осуществления активированные NK-клетки дополнительно являются NKp46+. В другом конкретном варианте осуществления активированные NK-клетки дополнительно являются CD226+.
В определенных вариантах осуществления более чем 50, 60, 70, 80, 90, 92, 94, 96, 98% указанных активированных NK-клеток являются CD56+ и CD16. В других вариантах осуществления по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 82, 84, 86, 88 или 90% указанных активированных NK-клеток являются CD3- и CD56+. В других вариантах осуществления по меньшей мере 50, 52, 54, 56, 58 или 60% указанных активированных NK-клеток являются NKG2D+. В других вариантах осуществления меньше чем 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 или 3% указанных клеток являются NKB1+. В определенных других вариантах осуществления менее чем 30, 20, 10, 8, 6, 4 или 2% указанных активированных NK-клеток являются NKAT2+. В определенных других вариантах осуществления менее чем 30, 20, 10, 8, 6, 4 или 2% указанных активированных NK-клеток являются CD56+ и CD16+. В более конкретных вариантах осуществления по меньшей мере 10, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65 или 70% указанных активированных NK-клеток CD3-CD56+ являются NKp46+. В других более конкретных вариантах осуществления по меньшей мере 10, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 или 85% указанных активированных NK-клеток CD3-CD56+ являются CD117+. В других более конкретных вариантах осуществления по меньшей мере 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50% указанных активированных NK-клеток CD3-CD56+ являются CD94+. В других более конкретных вариантах осуществления по меньшей мере 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50% указанных активированных NK-клеток CD3-CD56+ являются CD161-. В других более конкретных вариантах осуществления по меньшей мере 10, 12, 14, 16, 18 или 20% указанных активированных NK-клеток CD3-CD56+ являются CD226+. В более конкретных вариантах осуществления по меньшей мере 20, 25, 30, 35 или 40% указанных активированных NK-клеток CD3-CD56+ являются CD7+. В более конкретных вариантах осуществления по меньшей мере 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60% указанных активированных NK-клеток CD3-CD56+ являются CD5+.
Активированные NK-клетки могут иметь эмбриональный генотип или материнский генотип. Например, поскольку послеродовая плацента, в качестве источника гематопоэтических клеток, подходящих для продуцирования активированных NK-клеток, содержит ткань и клетки от плода и от матери, плацентарный перфузат может содержать только эмбриональные клетки или существенное большинство эмбриональных клеток (например, более чем около 90, 95, 98 или 99%) или может содержать смесь эмбриональных и материнских клеток (например, эмбриональные клетки составляют менее чем около 90, 80, 70, 60 или 50% от суммарного количества содержащих ядро клеток перфузата). В одном из вариантов осуществления активированные NK-клетки получают только из эмбриональных плацентарных гематопоэтических клеток, например клеток, полученных из замкнутой перфузии плаценты, при этом перфузия производит перфузат, содержащий существенное большинство или только эмбриональные плацентарные гематопоэтические клетки. В другом варианте осуществления активированные NK-клетки получают из эмбриональных и материнских клеток, например, клеток, полученных посредством перфузии методом культивирования в кюветах (см. выше), при этом перфузия производила перфузат, содержащий смесь эмбриональных и материнских плацентарных клеток. Таким образом, в одном из вариантов осуществления активированные NK-клетки получают из популяции полученных из плаценты промежуточных NK-клеток, существенное большинство которых имеет эмбриональный генотип. В другом варианте осуществления активированные NK-клетки получают из популяции полученных из плаценты промежуточных NK-клеток, которые включают в себя естественные клетки-киллеры, имеющие эмбриональный генотип, и естественные клетки-киллеры, имеющие материнский фенотип.
В определенных вариантах осуществления активированные NK-клетки или популяции, обогащенные активированными NK-клетками, могут быть оценены посредством обнаружения одного или более функционально соответствующих маркеров, например, CD94, CD161, NKp44, DNAM-1, 2B4, NKp46, CD94, KIR и семейство NKG2 активирующих рецепторов (например, NKG2D).
Необязательно, цитотоксическая активность изолированных или обогащенных естественных клеток-киллеров может быть оценена, например, в пробе на цитотоксичность с использованием опухолевых клеток, например культивированных опухолевых клеток K562, LN-18, U937, WERI-RB-1, U-118MG, НТ-29, НСС2218, KG-1 или U266 и т.п. в качестве клеток-мишеней.
5.1.3. NK-клетки, полученные посредством трехэтапного процесса (TSPNK).
В некоторых вариантах осуществления NK-клетки представляют собой полученные посредством трехэтапного процесса NK-клетки (TSPNK), которые являются клетками NK, продуцированными любым способом/процессом, описанным ниже в разделе 5.2.5. В конкретных вариантах осуществления клетки TSPNK являются клетками-предшественниками NK (см. также публикацию заявки на патент США № 2012/0148553, изобретение которой включено в настоящее описание посредством ссылки во всей его
- 10 039192 полноте).
5.1.3.1. Клетки TSPNK.
В одном из вариантов осуществления указанная изолированная популяция клеток TSPNK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, содержит больший процент клеток CD3-CD56+, чем популяция клеток-предшественников NK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, например, популяция клетокпредшественников NK, продуцированная посредством того же самого трехэтапного процесса, за исключением того, что третий этап культивирования, применявшийся для продуцирования популяции клетокпредшественников NK, был более коротким по времени, чем третий этап культивирования, применявшийся для продуцирования популяции клеток TSPNK. В конкретном варианте осуществления указанная популяция клеток TSPNK содержит около 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% клеток CD3-CD56+. В другом конкретном варианте осуществления указанная популяция клеток TSPNK содержит не менее чем 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% клеток CD3-CD56+. В другом конкретном варианте осуществления указанная популяция клеток TSPNK содержит между 65-70%, 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95% или 95-99% клеток CD3-CD56+. В другом конкретном варианте осуществления указанная популяция клеток TSPNK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, продуцируется с применением трехэтапного процесса, который включает в себя длинный третий этап культивирования, например, третий этап культивирования продолжительностью 18-20, 19-21, 20-22 или 21-23 дня.
В определенных вариантах осуществления указанные клетки CD3-CD56+ в указанной популяции клеток TSPNK включают в себя клетки CD3-CD56+, которые дополнительно являются CD117+, при этом указанная популяция клеток TSPNK содержит меньший процент клеток CD3-CD56+CD117+ чем популяция клеток-предшественников NK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, например, популяция клеток-предшественников NK, продуцированная посредством того же самого трехэтапного процесса за исключением того, что третий этап культивирования, применявшийся для продуцирования популяции клеток-предшественников NK, имел меньшую продолжительность, чем третий этап культивирования, применявшийся для продуцирования популяции клеток TSPNK.
В определенных вариантах осуществления указанные клетки CD3-CD56+ в указанной популяции клеток TSPNK включают в себя клетки CD3-CD56+, которые дополнительно являются CD161+, при этом указанная популяция клеток TSPNK содержит меньший процент клеток CD3-CD56+CD161+, чем популяция клеток-предшественников NK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, например, популяция клеток-предшественников NK, продуцированная посредством того же самого трехэтапного процесса за исключением того, что третий этап культивирования, применявшийся для продуцирования популяции клеток-предшественников NK, имел меньшую продолжительность, чем третий этап культивирования, применявшийся для продуцирования популяции клеток TSPNK.
В определенных вариантах осуществления указанные клетки CD3-CD56+ в указанной популяции клеток TSPNK включают в себя клетки CD3-CD56+, которые дополнительно являются NKp46+, при этом указанная популяция клеток TSPNK содержит больший процент клеток CD3 CD56+NKp46+, чем популяция клеток-предшественников NK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, например, популяция клеток-предшественников NK, продуцированная посредством того же самого трехэтапного процесса, за исключением того, что третий этап культивирования, применявшийся для продуцирования популяции клеток-предшественников NK, имел меньшую продолжительность, чем третий этап культивирования, применявшийся для продуцирования популяции клеток TSPNK.
В определенных вариантах осуществления указанные клетки CD3-CD56+ в указанной популяции клеток TSPNK включают в себя клетки CD3-CD56+, которые дополнительно являются CD16-, при этом указанная популяция клеток TSPNK содержит больший процент клеток CD3-CD56+CD16-, чем популяция клеток-предшественников NK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, например, популяция клеток-предшественников NK, продуцированная посредством того же самого трехэтапного процесса, за исключением того, что третий этап культивирования, применявшийся для продуцирования популяции клеток-предшественников NK, имел меньшую продолжительность, чем третий этап культивирования, применявшийся для продуцирования популяции клеток TSPNK. В другом варианте осуществления клетки TSPNK, продуцированные посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, обладают более длинными теломерами, чем полученные из периферической крови (РВ) NK-клетки.
В одном из вариантов осуществления популяция клеток TSPNK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, включает в себя клетки, которые являются CD117+. В конкретном варианте осуществления указанные популяции клеток TSPNK содержат не более чем около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или 90% клеток CD117+. В одном из вариантов осуществления популяция клеток TSPNK, продуцированная посредством трехэтапного про
- 11 039192 цесса, описанного в настоящем раскрытии, содержит клетки, которые являются NKG2D+. В конкретном варианте осуществления указанные популяции клеток TSPNK содержат не более чем около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или 90% клеток NKG2D+. В одном из вариантов осуществления популяция клеток TSPNK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, содержит клетки, которые являются NKp44+. В конкретном варианте осуществления указанные популяции клеток TSPNK содержат не более чем около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или 90% клеток NKp44+. В одном из вариантов осуществления популяция клеток TSPNK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, содержит клетки, которые являются CD52+. В конкретном варианте осуществления указанные популяции клеток TSPNK содержат не более чем около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или 90% клеток CD52+. В конкретном варианте осуществления указанная популяция клеток TSPNK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, содержит клетки, которые являются CD52+CD117+. В одном из вариантов осуществления популяция клеток TSPNK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, содержит клетки, которые являются CD244+. В конкретном варианте осуществления указанные популяции клеток TSPNK содержат не более чем около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или 90% клеток CD244+. В конкретном варианте осуществления указанная популяция клеток TSPNK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, содержит клетки, которые являются CD244+CD117+. В одном из вариантов осуществления популяция клеток TSPNK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, содержит, которые являются LFA-1+. В конкретном варианте осуществления указанные популяции клеток TSPNK содержат не более чем около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или 90% клеток LFA-1+. В одном из вариантов осуществления популяция клеток TSPNK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, содержит клетки, которые являются CD94+. В конкретном варианте осуществления указанные популяции клеток TSPNK содержат не более чем около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или 90% клеток CD94+.
5.1.3.2. Клетки-предшественники NK.
В одном из вариантов осуществления указанная изолированная популяция клетокпредшественников NK содержит низкий процент клеток CD3-CD56+ по сравнению с процентом клеток CD3-CD56+, ассоциированных с популяциями клеток, не являющимися предшественниками NK-клеток, такие как популяции клеток, не являющиеся предшественниками NK-клеток, продуцированные посредством трехэтапных способов, описанных в настоящем раскрытии, например популяция клетокпредшественников NK содержит около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50% клеток CD3-CD56+. В другом конкретном варианте осуществления указанная популяция клеток-предшественников NK содержит не более чем 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50% клеток CD3-CD56+. В другом конкретном варианте осуществления указанная популяция клеток-предшественников NK содержит между 0-5%, 5-10%, 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-30%, 30-35%, 35-40%, 40-45% или 45-50% клеток CD3-CD56+. В некоторых вариантах осуществления указанные популяции клеток-предшественников NK, например популяции клеток-предшественников NK, которые содержат низкий процент клеток CD3-CD56+ по сравнению с процентом клеток CD3-CD56+, ассоциированных с популяциями клеток, не являющимися предшественниками NK-клеток, содержат не более чем 1%, не более чем 2%, не более чем 3%, не более чем 4%, не более чем 5%, не более чем 10% или не более чем 15% клеток CD3-CD56+. В другом конкретном варианте осуществления указанные популяции клеток-предшественников NK, продуцированные посредством трехэтапных процессов, описанных в настоящем раскрытии, продуцируют с применением трехэтапного процесса, который включает в себя короткий третий этап культивирования, например, третий этап культивирования продолжительностью 4-6, 5-7, 6-8 или 7-9 дней.
В определенных вариантах осуществления указанные клетки CD3-CD56+ в указанных популяциях клеток-предшественников NK дополнительно являются CD117+. В конкретном варианте осуществления около 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% указанных клеток CD3-CD56+ в указанных популяциях клетокпредшественников NK являются CD117+. В другом конкретном варианте осуществления не менее чем 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% указанных клеток CD3-CD56+ в указанных популяциях клетокпредшественников NK являются CD117+. В другом конкретном варианте осуществления, между 65-70%, 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95% или 95-99% указанных клеток CD3-CD56+ в указанных популяциях клеток-предшественников NK являются CD117+.
В определенных вариантах осуществления указанные клетки CD3-CD56+ в указанных популяциях клеток-предшественников NK дополнительно являются CD161+. В конкретном варианте осуществления, около 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 или 75% указанных клеток CD3-CD56+ в указанных популяциях клетокпредшественников NK являются CD161+. В другом конкретном варианте осуществления, не менее чем 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 или 75% указанных клеток CD3-CD56+ в указанных популяциях клетокпредшественников NK являются CD161+. В другом конкретном варианте осуществления между 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70% или 70-75% указанных клеток CD3-CD56+ в указанных популяциях клеток-предшественников NK являются CD161+.
- 12 039192
В определенных вариантах осуществления указанные клетки CD3-CD56+ в указанных популяциях клеток-предшественников NK дополнительно являются NKp46+. В конкретном варианте осуществления около 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90% или больше указанных клеток CD3-CD56+ в указанных популяциях клеток-предшественников NK являются NKp46+. В более конкретном варианте осуществления около 25, 30, 35, 40, 45, 50 или 55% указанных клеток CD3-CD56+ в указанных популяциях клеток-предшественников NK являются NKp46+. В другом конкретном варианте осуществления не более чем 25, 30, 35, 40, 45, 50 или 55% указанных клеток CD3-CD56+ в указанных популяциях клетокпредшественников NK являются NKp46+. В другом конкретном варианте осуществления между 25-30%, 30-35%, 35-40%, 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90% или больше указанных клеток CD3-CD56+ в указанных популяциях клеток-предшественников NK являются NKp46+. В более конкретном варианте осуществления между 25-30%, 30-35%, 35-40%, 40-45%, 45-50% или 50-55% указанных клеток CD3-CD56+ в указанных популяциях клеток-предшественников NK являются NKp46+.
В определенных вариантах осуществления указанная популяция клеток-предшественников NK содержит клетки, которые являются CD56+CD16-. В определенных вариантах осуществления клетки CD3-CD56+ в указанных популяциях клеток-предшественников NK являются CD16-. В определенных вариантах осуществления клетки CD3-CD56+ в указанных популяциях клеток-предшественников NK являются CD16+. В конкретном варианте осуществления указанные популяции клеток-предшественников NK содержат не более чем 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50% клеток CD16+. В другом конкретном варианте осуществления указанные популяции клеток-предшественников NK содержат между 0-5%, 5-10%, 10-15%, 15-20% или 20-25% клеток CD16+. В некоторых вариантах осуществления указанные популяции клеток-предшественников NK содержат не более чем 1%, не более чем 2%, не более чем 3%, не более чем 4%, не более чем 5%, не более чем 10% или не более чем 15% клеток CD16+.
В определенных вариантах осуществления указанные клетки CD3-CD56+ в указанных популяциях клеток-предшественников NK дополнительно являются CD16-. В определенных вариантах осуществления указанные клетки CD3-CD56+ в указанных популяциях клеток-предшественников NK дополнительно являются CD117+ и CD161+. В определенных вариантах осуществления указанные клетки CD3-CD56+ в указанных популяциях клеток-предшественников NK дополнительно являются CD16-, CD117+ и CD161+. В определенных вариантах осуществления указанные клетки CD3-CD56+ в указанных популяциях клеток-предшественников NK дополнительно являются CD16-, CD117+, CD161+ и NKp46+.
В одном из вариантов осуществления популяция клеток-предшественников NK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, содержит не более чем около 40% клеток CD3-CD56+. В одном из вариантов осуществления популяция клеток-предшественников NK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, включает в себя клетки, которые являются CD117+. В конкретном варианте осуществления указанные популяции клеток-предшественников NK содержат не более чем около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или 90% клеток CD117+. В одном из вариантов осуществления популяция клетокпредшественников NK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, включает в себя клетки, которые являются CD52+. В конкретном варианте осуществления указанные популяции клеток-предшественников NK содержат не более чем около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или 90% клеток CD52+. В конкретном варианте осуществления указанная популяция клеток-предшественников NK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, включает в себя клетки, которые являются CD52+CD117+. В одном из вариантов осуществления популяция клеток-предшественников NK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, включает в себя клетки, которые являются CD244+. В конкретном варианте осуществления указанные популяции клеток-предшественников NK содержат не более чем около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или 90% клеток CD244+. В конкретном варианте осуществления указанная популяция клеток-предшественников NK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, включает в себя клетки, которые являются CD244+ CD117+. В одном из вариантов осуществления популяция клетокпредшественников NK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, включает в себя клетки, которые являются LFA-1+. В конкретном варианте осуществления указанные популяции клеток-предшественников NK содержат не более чем около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или 90% клеток LFA-1+. В одном из вариантов осуществления популяция клеток-предшественников NK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, включает в себя клетки, которые являются CD94+. В конкретном варианте осуществления указанные популяции клеток-предшественников NK содержат не более чем около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или 90% клеток CD94+.
В конкретных вариантах осуществления популяция клеток-предшественников NK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, содержит большую долю клеток CD56-, чем клеток CD56+. В конкретных вариантах осуществления популяция клетокпредшественников NK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем
- 13 039192 раскрытии, дифференцируется in vivo или ex vivo в популяцию с увеличенной долей клеток CD56+.
В конкретном варианте осуществления популяция клеток-предшественников NK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, содержит низкий процент клеток CD34-CD117+ по сравнению с процентом клеток CD34-CD117+, ассоциированных с популяциями клеток, не являющимися предшественниками NK-клеток, например, популяция клетокпредшественников NK содержит около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50% клеток CD34-CD117+. В другом конкретном варианте осуществления указанная популяция клеток-предшественников NK содержит не более чем 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50% клеток CD34-CD117+. В другом конкретном варианте осуществления указанная популяция клеток-предшественников NK содержит между 0-5%, 5-10%, 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-30%, 30-35%, 35-40%, 40-45% или 45-50% клеток ОШ(.'Ш17'. В некоторых вариантах осуществления указанная популяция клеток-предшественников NK содержит не более чем 1%, не более чем 2%, не более чем 3%, не более чем 4%, не более чем 5%, не более чем 10% или не более чем 15% клеток CD34-CD117+. В другом конкретном варианте осуществления указанная популяция клеток-предшественников NK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, продуцируется с применением трехэтапного процесса, который включает в себя короткий третий этап культивирования, например третий этап культивирования продолжительностью 4-6, 5-7, 6-8 или 7-9 дней.
В конкретном варианте осуществления популяция клеток-предшественников NK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, содержит низкий процент клеток CD161+ по сравнению с процентом клеток CD161+, ассоциированных с популяциями клеток, не являющимися предшественниками NK-клеток, например, популяция клеток-предшественников NK содержит около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50% клеток CD161+. В другом конкретном варианте осуществления указанная популяция клеток-предшественников NK содержит не более чем 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50% клеток CD161+. В другом конкретном варианте осуществления указанная популяция клеток-предшественников NK содержит между 0-5%, 5-10%, 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-30%, 30-35%, 35-40%, 40-45% или 45-50% клеток CD161+. В некоторых вариантах осуществления указанная популяция клеток-предшественников NK содержит не более чем 1%, не более чем 2%, не более чем 3%, не более чем 4%, не более чем 5%, не более чем 10% или не более чем 15% клеток CD161+. В другом конкретном варианте осуществления указанная популяция клеток-предшественников NK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, продуцируется с применением трехэтапного процесса, который включает в себя короткий третий этап культивирования, например третий этап культивирования продолжительностью 4-6, 5-7, 6-8 или 7-9 дней.
В конкретном варианте осуществления популяция клеток-предшественников NK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, содержит низкий процент клеток NKp46+ по сравнению с процентом клеток NKp46+, ассоциированных с популяциями клеток, не являющимися предшественниками NK-клеток, например, популяция клеток-предшественников NK содержит около 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50% клеток NKp46+. В другом конкретном варианте осуществления указанная популяция клеток-предшественников NK содержит не более чем 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50% клеток NKp46+. В другом конкретном варианте осуществления указанная популяция клеток-предшественников NK содержит между 0-5%, 5-10%, 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-30%, 30-35%, 35-40%, 40-45% или 45-50% клеток NKp46+. В некоторых вариантах осуществления указанная популяция клеток-предшественников NK содержит не более чем 1%, не более чем 2%, не более чем 3%, не более чем 4%, не более чем 5%, не более чем 10% или не более чем 15% клеток NKp46+. В другом конкретном варианте осуществления указанная популяция клеток-предшественников NK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, продуцируется с применением трехэтапного процесса, который включает в себя короткий третий этап культивирования, например третий этап культивирования продолжительностью 4-6, 5-7, 6-8 или 7-9 дней.
В конкретном варианте осуществления популяция клеток-предшественников NK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, содержит низкий процент клеток CD56+CD16- по сравнению с процентом клеток CD56+CD16-, ассоциированных с популяцией клеток, не являющихся предшественниками NK-клеток, например популяция клеток-предшественников NK содержит около 1%, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50% клеток CD56+CD16-. В другом конкретном варианте осуществления указанная популяция клеток-предшественников NK содержит не более чем 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50% клеток CD56+CD16-. В другом конкретном варианте осуществления указанная популяция клеток-предшественников NK содержит между 0-5%, 5-10%, 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-30%, 30-35%, 35-40%, 40-45% или 45-50% клеток CD56+CD16-. В некоторых вариантах осуществления указанная популяция клеток-предшественников NK содержит не более чем 1%, не более чем 2%, не более чем 3%, не более чем 4%, не более чем 5%, не более чем 10% или не более чем 15% клеток CD56+CD16-. В другом конкретном варианте осуществления указанная популяция клетокпредшественников NK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, продуцируется с применением трехэтапного процесса, который включает в себя короткий третий этап культивирования, например, третий этап культивирования продолжительностью 4-6, 5-7, 6-8
- 14 039192 или 7-9 дней.
В одном из вариантов осуществления популяция клеток-предшественников NK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, включает в себя клетки, которые являются CD52+CD117+. В конкретном варианте осуществления популяция клетокпредшественников NK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, содержит более высокий процент клеток CD52+CD117+ по сравнению с процентом клеток CD52+CD117+, ассоциированных с популяцией гематопоэтических клеток-предшественников. В конкретном варианте осуществления популяция клеток-предшественников NK, продуцированная посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, содержит более высокий процент клеток CD52+CD117+ по сравнению с процентом клеток CD52+CD117+, ассоциированных с популяциями клеток, не являющимися предшественниками NK-клеток, например, популяция клетокпредшественников NK содержит около 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90% или больше клеток CD52+CD117+. В другом конкретном варианте осуществления указанная популяция клетокпредшественников NK содержит не менее чем 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или 90% клеток CD52+CD117+. В другом конкретном варианте осуществления указанная популяция клеток-предшественников NK содержит между 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95% или больше клеток CD52+CD117+. В другом конкретном варианте осуществления указанная популяция клетокпредшественников NK, которая включает в себя клетки CD52+CD117+, продуцируется посредством трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, продуцируются с применением трехэтапного процесса, который включает в себя короткий третий этап культивирования, например третий этап культивирования продолжительностью 4-6, 5-7, 6-8 или 7-9 дней. В конкретном варианте осуществления указанная популяция клеток-предшественников NK, которая включает в себя клетки CD52+CD117+, продуцируется с применением трехэтапного процесса, который включает в себя культивирование в течение суммарно 12 дней или больше, 13 дней или больше, 14 дней или больше, 15 дней или больше, 16 дней или больше, 17 дней или больше, 18 дней или больше, 19 дней или больше, 20 дней или больше или 21 дня или больше. В конкретном варианте осуществления указанная популяция клеток-предшественников NK, которая включает в себя клетки CD52+CD117+, продуцируется с применением трехэтапного процесса, который включает в себя культивирование в течение суммарно 12 дней, 13 дней или 14 дней, но не более чем 21-25 дней, 25-30 дней или 30-35 дней культивирования. В конкретном варианте осуществления указанная популяция клеток-предшественников NK, которая включает в себя клетки CD52+CD117+, продуцируется с применением трехэтапного процесса, который включает в себя суммарно 21 день культивирования.
В конкретном варианте осуществления клетки-предшественники NK, описанные в настоящем раскрытии, обладают большей способностью к пересадке в костный мозг (например, in vivo), чем не являющиеся предшественниками NK-клетки, например не являющиеся предшественниками NK-клетки, продуцированные посредством сопоставимого способа. Например, в определенных вариантах осуществления клетки-предшественники NK, продуцированные с применением трехэтапного способа, который включает в себя короткий третий этап культивирования, например третий этап культивирования продолжительностью 4-6, 5-7, 6-8 или 7-9 дней, при пересадке в костный мозг (например, in vivo) обладают более высокой эффективностью, чем не являющиеся предшественниками NK-клетки, продуцированные с применением трехэтапного способа, который включает более длинный третий этап культивирования, например третий этап культивирования продолжительностью 18-20, 19-21, 20-22 или 21-23 дня. В другом варианте осуществления клетки-предшественники NK, описанные в настоящем раскрытии, обладают более длинными теломерами, чем полученные из периферической крови (РВ) NK-клетки.
5.1.4. NK-клетки, продуцированные посредством трехэтапного способа.
В одном из вариантов осуществления в настоящем изобретении предоставлена изолированная популяция NK-клеток, при этом указанные NK-клетки продуцируют согласно трехэтапному способу, описанному ниже.
В одном из вариантов осуществления в настоящем изобретении предоставлена изолированная популяция NK-клеток, продуцированная посредством трехэтапного способа, описанного в настоящем раскрытии, при этом указанная популяция NK-клеток содержит больший процент клеток CD3-CD56+, чем популяция клеток-предшественников NK, продуцированная посредством трехэтапного способа, описанного в настоящем раскрытии, например популяция клеток-предшественников NK, продуцированная посредством того же самого трехэтапного способа, за исключением того, что третий этап культивирования, применявшийся для продуцирования популяции клеток-предшественников NK, имел меньшую продолжительность, чем третий этап культивирования, применявшийся для продуцирования популяции NKклеток. В конкретном варианте осуществления указанная популяция NK-клеток содержит около 70% или больше, в некоторых вариантах осуществления 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% клеток CD3-CD56+. В другом конкретном варианте осуществления указанная популяция NK-клеток содержит не менее чем 80, 85, 90, 95, 98 или 99% клеток CD3-CD56+. В другом конкретном варианте осуществления указанная популяция NK-клеток содержит между 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95% или 95-99% клеток 0)3 0)56'.
- 15 039192
В определенных вариантах осуществления указанные клетки CD3-CD56+ в указанной популяции NK-клеток включают в себя клетки CD3-CD56+, которые дополнительно являются NKp46+. В определенных вариантах осуществления указанные клетки CD3-CD56+ в указанной популяции NK-клеток включают в себя клетки CD3-CD56+, которые дополнительно являются CD16-. В определенных вариантах осуществления указанные клетки CD3-CD56+ в указанной популяции NK-клеток включают в себя клетки CD3-CD56+, которые дополнительно являются CD16+. В определенных вариантах осуществления указанные клетки CD3-CD56+ в указанной популяции NK-клеток включают в себя клетки CD3-CD56+, которые дополнительно являются CD94-. В определенных вариантах осуществления указанные клетки CD3-CD56+ в указанной популяции NK-клеток включают в себя клетки CD3-CD56+, которые дополнительно являются CD94+.
В одном из вариантов осуществления популяция NK-клеток, продуцированная посредством трехэтапного способа, описанного в настоящем раскрытии, включает в себя клетки, которые являются CD117+. В одном из вариантов осуществления популяция NK-клеток, продуцированная посредством трехэтапного способа, описанного в настоящем раскрытии, включает в себя клетки, которые являются NKG2D+. В одном из вариантов осуществления популяция NK-клеток, продуцированная посредством трехэтапного способа, описанного в настоящем раскрытии, включает в себя клетки, которые являются NKp44+. В одном из вариантов осуществления популяция NK-клеток, продуцированная посредством трехэтапного способа, описанного в настоящем раскрытии, включает в себя клетки, которые являются CD244+.
5.1.5. Комбинации клеток и комбинации клеток/перфузата.
NK-клетки, например активированные NK-клетки и/или клетки TSPNK, могут быть дополнительно объединены с плацентарным перфузатом, клетками плацентарного перфузата и/или прилипающими плацентарными клетками в настоящем изобретении.
5.1.5.1. Комбинации NK-клеток и перфузата или клеток перфузата.
В конкретных вариантах осуществления NK-клетки включают в себя клетки PiNK CD56+CD16- в комбинации с естественными клетками-киллерами CD56+CD16+. В более конкретных вариантах осуществления естественные клетки-киллеры CD56+CD16+ могут быть изолированы из плаценты или из другого источника, например периферической крови, пуповинной крови, костного мозга и т.п. Таким образом, в различных других вариантах осуществления клетки PiNK могут быть объединены с естественными клетками-киллерами CD56+CD16+ в соотношениях, например, около 1:10, 2:9, 3:8, 4:7, 5:6, 6:5, 7:4, 8:3, 9:2, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1 или около 9:1. При использовании в данном контексте изолированные означает, что клетки были удалены из их обычной окружающей среды, например плаценты.
В различных конкретных вариантах осуществления изолированная популяция NK-клеток содержит по меньшей мере около 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или по меньшей мере около 99% клеток PiNK. В другом варианте осуществления множество клеток PiNK включает в себя или состоит из клеток PiNK, которые не были расширены; например, находятся в том же состоянии, в котором были собраны из плацентарного перфузата. В другом варианте осуществления множество клеток PiNK включает в себя или состоит из клеток PiNK, которые были расширены. Способы расширения NK-клеток описываются в других местах в настоящем раскрытии, а также были описаны, например, в Ohno и др., публикации заявки на патент США № 2003/0157713; см. также Yssel et al., J. Immunol. Methods, 72(1):219-227 (1984) и Litwin et al., J. Exp. Med. 178(4):1321-1326 (1993).
В конкретных вариантах осуществления изолированная популяция NK-клеток представляет собой популяцию плацентарных клеток, включающих в себя клетки PiNK. В конкретном варианте осуществления изолированная популяция NK-клеток представляет собой тотальные содержащие ядро клетки из плацентарного перфузата, например, клетки плацентарного перфузата, включающие в себя аутогенные изолированные клетки PiNK. В различных других вариантах осуществления активированные NK-клетки могут быть объединены, например, с NK-клетками, при этом указанные NK-клетки были изолированы из источника ткани и не были расширены, NK-клетками, изолированными из источника ткани и расширенными, или NK-клетками, продуцированными посредством другого способа, например NK-клетки CD56+CD16+, например, в соотношениях, например, около 1:10, 2:9, 3:8, 4:7, 5:6, 6:5, 7:4, 8:3, 9:2, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1 или около 9:1. При использовании в данном контексте изолированные означает, что клетки были удалены из их обычной тканевой окружающей среды.
В конкретных вариантах осуществления активированные NK-клетки могут также быть объединены, например, с NK-клетками, при этом указанные NK-клетки были изолированы из источника ткани и не были расширены, NK-клетками, изолированными из источника ткани и расширенными, или NK-клетками, продуцированными посредством другого способа, например NK-клетки CD56+CD16+, например, в соотношениях, например, около 1:10, 2:9, 3:8, 4:7, 5:6, 6:5, 7:4, 8:3, 9:2, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1 или около 9:1. При использовании в данном контексте изолированные означает, что клетки были удалены из их обычной тканевой окружающей среды.
В одном из вариантов осуществления, например, используется объем плацентарного перфузата, до
- 16 039192 полненного NK-клетками, продуцированными с применением процессов, описанных в настоящем раскрытии, например, активированными NK-клетками или клетками TSPNK (например, клеткамипредшественниками NK). В конкретных вариантах осуществления, например, каждый миллилитр плацентарного перфузата дополнен около 1х104, 5х104, 1x105, 5x105, 1х106, 5х106, 1х107, 5х107, 1х108, 5х108 или более NK-клетками, продуцированными с применением процессов, описанных в настоящем раскрытии, например, активированными NK-клетками или клетками TSPNK (например, клеткамипредшественниками NK). В другом варианте осуществления клетки плацентарного перфузата дополнены NK-клетками, продуцированными с применением процессов, описанных в настоящем раскрытии, например активированными NK-клетками или клетками TSPNK (например, клетками-предшественники NK). В определенных других вариантах осуществления, когда клетки плацентарного перфузата объединяют с NK-клетками, продуцированными с применением процессов, описанных в настоящем раскрытии, например активированными NK-клетками или клетками TSPNK (например, клетками-предшественниками NK), клетки плацентарного перфузата обычно составляют около, более чем около или менее чем около 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 8, 6, 4, 2 или 1% общего количества клеток. В определенных других вариантах осуществления, когда NK-клетки, продуцированные с применением процессов, описанных в настоящем раскрытии, например активированные NK-клетки или клетки TSPNK (например, клеткипредшественники NK), объединяют с множеством клеток плацентарного перфузата и/или объединенных естественных клеток-киллеров, NK-клетки обычно составляют около, более чем около или менее чем около 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 8, 6, 4, 2 или 1% общего количества клеток. В определенных других вариантах осуществления, когда NK-клетки, продуцированные с применением процессов, описанных в настоящем раскрытии, например активированные NK-клетки или клетки TSPNK (например, клеткипредшественники NK) используют для дополнения плацентарного перфузата, объем раствора (например, физиологического раствора, культуральной среды и т.п.), в котором суспендируют клетки, содержит около, более чем около или менее чем около 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 8, 6, 4, 2 или 1% суммарного объема перфузата и клеток, при этом NK-клетки суспендируют до около 1х104, 5х104, 1х105, 5х105, 1х106, 5х106, 1х107, 5х107, 1х108, 5х108 или более клеток на 1 мл до добавления.
В других вариантах осуществления любую из указанных выше комбинаций клеток, в свою очередь, объединяют с пуповинной кровью или содержащими ядро клетками из пуповинной крови.
Объединенный в пул плацентарный перфузат, который получают из двух или более источников, например двух или более плацент, и объединяют, например, объединяют в пул, может также использоваться в настоящем изобретении. Такой объединенный в пул перфузат может содержать приблизительно равные объемы перфузата из каждого источника или может содержать различные объемы из каждого источника. Относительные объемы из каждого источника могут быть выбраны случайным образом или могут быть основаны, например, на концентрации или количестве одного или более клеточных факторов, например цитокинов, факторов роста, гормонов и т.п.; количестве плацентарных клеток в перфузате из каждого источника или других характеристиках перфузата из каждого источника. Перфузат от множества перфузии одной и той же плаценты может быть аналогичным образом объединен в пул.
Аналогично, клетки плацентарного перфузата и полученные из плаценты промежуточные естественные клетки-киллеры, которые получают из двух или более источников, например двух или более плацент, и объединяют в пул, могут также использоваться в настоящем изобретении. Такие объединенные в пул клетки могут содержать приблизительно равные количества клеток из этих двух или более источников или различные количества клеток из одного или более объединенных в пул источников. Относительные количества клеток из каждого источника могут быть выбраны на основании, например, количества клеток одного или более конкретных типов среди клеток, которые будут объединены в пул, например количества клеток CD34+ и т.д.
NK-клетки, продуцированные с применением процессов, описанных в настоящем раскрытии, например активированные NK-клетки или клетки TSPNK (например, клетки-предшественники NK) и комбинации таких клеток с плацентарным перфузатом и/или клетками плацентарного перфузата могут анализировать в целях определения степени или объема супрессии опухоли/инфекции (т.е. потенциальной активности), которые можно ожидать, например, от заданного количества NK-клеток или заданного объема перфузата. Например, аликвоту или пробное количество клеток вводят в контакт или размещают вблизи с известным количеством клеток опухоли/инфицированных клеток при условиях, в которых клетки опухоли/инфицированные клетки в других случаях пролиферировали бы, и скорость пролиферации клеток опухоли/инфицированных клеток в присутствии плацентарного перфузата, клеток перфузата, плацентарных естественных клеток-киллеров или комбинаций указанного, в течение долгого времени (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 недель или дольше) сравнивают с пролиферацией эквивалентного количества клеток опухоли/инфицированных клеток в отсутствие перфузата, клеток перфузата, плацентарных естественных клеток-киллеров или комбинаций указанного. Потенциальная активность клеток может быть выражена, например, как число клеток или объем раствора, требуемые для подавления роста клеток опухоли/распространения инфекции, например, на около 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50% и т.п.
В определенных вариантах осуществления NK-клетки, продуцированные с применением процессов,
- 17 039192 описанных в настоящем раскрытии, например активированные NK-клетки или клетки TSPNK (например, клетки-предшественники NK), предоставляют как вводимые единицы фармацевтической категории. Такие единицы могут быть предоставлены в дискретных объемах, например, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 мл и т.п. Такие единицы могут быть предоставлены как содержащие конкретное количество клеток, например NK-клеток, или популяций NK-клеток, или популяций клеток-предшественников NK в комбинации с другими NK-клетками или клетками перфузата, например 1х104, 5х104, 1x105, 5x105, 1x106, 5x106, 1х107, 5х107, 1x108, 5x108 или более клеток/мл, или 1x104, 5x104, 1x105, 5x105, 1x106, 5x106, 1x107, 5x107, 1x108, 5x108, 1x109, 5x109, 1x1010, 5x1010, 1x1011 или более клеток на единицу. В конкретных вариантах осуществления единицы могут содержать около, по меньшей мере около или самое большее около 1x104, 5x104, 1x105, 5x105, 1x106, 5x106 или более NK-клеток/мл, или 1x104, 5x104, 1x105, 5x105, 1x106, 5x106, 1x107, 5x107, 1x108, 5x108, 1x109, 5x109, 1x1010, 5x1010, 1x1011 или более клеток на единицу. Такие единицы могут быть предоставлены как содержащие конкретные количества NK-клеток и/или любых других клеток.
В приведенных выше вариантах осуществления NK-клетки или комбинации NK-клеток с клетками перфузата или перфузатом могут являться аутогенными для реципиента (т.е. быть полученными от реципиента) или аллогенными для реципиента (т.е. быть полученными по меньшей мере от одного индивида, отличного от указанного реципиента).
В определенных вариантах осуществления каждая единица клеток маркируется в целях указания одного или более из объема, числа клеток, типа клеток, была ли единица обогащена клетками конкретного типа и/или потенциальной активности заданного числа клеток в единице или заданного количества миллилитров единицы, т.е. вызывают ли клетки в единице измеримую супрессию пролиферации конкретного типа или типов опухолевых клеток.
5.1.5.2. Комбинация клеток NK из соответствующего перфузата и пуповинной крови.
NK-клетки могут быть также получены из комбинаций соответствующих единиц плацентарного перфузата и пуповинной крови по настоящему изобретению, и в настоящем изобретении они называются комбинированными естественными клетками-киллерами. Соответствующие единицы при использовании в настоящем изобретении указывают, что NK-клетки получают из клеток плацентарного перфузата и клеток пуповинной крови, при этом клетки пуповинной крови получают из пуповинной крови из той же плаценты, из которой получают плацентарный перфузат, т.е. клетки плацентарного перфузата и клетки пуповинной крови, и, таким образом, естественные клетки-киллеры из них, происходят из одного и того же индивида.
В определенных вариантах осуществления комбинированные плацентарные клетки-киллеры включают в себя только, или по существу только, естественные клетки-киллеры, которые являются CD56+ и CD16-. В определенных других вариантах осуществления комбинированные плацентарные клеткикиллеры включают в себя NK-клетки, которые являются CD56+ и CD16-, и NK-клетки, которые являются CD56+ и CD16+. В определенных конкретных вариантах осуществления комбинированные плацентарные клетки-киллеры включают в себя по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 99,5% естественных клеток-киллеров CD56+CD16- (клетки PiNK).
В одном из вариантов осуществления комбинированные естественные клетки-киллеры не культивировались. В конкретном варианте осуществления комбинированные естественные клетки-киллеры содержат детектируемо более высокое количество естественных клеток-киллеров CD3-CD56+CD16, чем эквивалентное количество естественных клеток-киллеров из периферической крови. В другом конкретном варианте осуществления комбинированные естественные клетки-киллеры содержат детектируемо более низкое количество естественных клеток-киллеров CD3-CD56+CD16-, чем эквивалентное количество естественных клеток-киллеров из периферической крови. В другом конкретном варианте осуществления комбинированные естественные клетки-киллеры содержат детектируемо более высокое количество естественных клеток-киллеров CD3-CD56+KIR2DL2/L3+, чем эквивалентное количество естественных клеток-киллеров из периферической крови. В другом конкретном варианте осуществления комбинированные естественные клетки-киллеры содержат детектируемо более низкое количество естественных клеток-киллеров CD3’CD56+NKp46+, чем эквивалентное количество естественных клеток-киллеров из периферической крови. В другом конкретном варианте осуществления комбинированные естественные клетки-киллеры содержат детектируемо более низкое количество естественных клеток-киллеров CD3 CD56+NKp30+ , чем эквивалентное количество естественных клеток-киллеров из периферической крови. В другом конкретном варианте осуществления комбинированные естественные клетки-киллеры содержат детектируемо более низкое количество естественных клеток-киллеров CD3-CD56+2B4+, чем эквивалентное количество естественных клеток-киллеров из периферической крови. В другом конкретном варианте осуществления комбинированные естественные клетки-киллеры содержат детектируемо более низкое количество естественных клеток-киллеров CD3-CD56+CD94 +, чем эквивалентное количество естественных клеток-киллеров из периферической крови.
В другом варианте осуществления комбинированные естественные клетки-киллеры культивировались, например, в течение 21 дня. В конкретном варианте осуществления комбинированные естествен
- 18 039192 ные клетки-киллеры содержат детектируемо более низкое количество естественных клеток-киллеров CD3-CD56+KIR2DL2/L3+, чем эквивалентное количество естественных клеток-киллеров из периферической крови. В другом конкретном варианте осуществления комбинированные естественные клеткикиллеры не культивировались. В другом конкретном варианте осуществления комбинированные естественные клетки-киллеры содержат детектируемо более высокое количество естественных клетоккиллеров CD3’CD56+NKp444 , чем эквивалентное количество естественных клеток-киллеров из периферической крови. В конкретном варианте осуществления комбинированные естественные клетки-киллеры содержат детектируемо более высокое количество естественных клеток-киллеров CD3CD56+NKp30+, чем эквивалентное количество естественных клеток-киллеров из периферической крови.
В другом варианте осуществления комбинированные естественные клетки-киллеры экспрессируют детектируемо более высокое количество гранзима В, чем эквивалентное количество естественных клеток-киллеров периферической крови.
Комбинированные NK-клетки могут быть дополнительное объединены с пуповинной кровью. В различных вариантах осуществления пуповинную кровь объединяют с комбинированными естественными клетками-киллерами в количестве около 1х104, 5х104, 1x105, 5x105, 1x106, 5x106, 1х107, 5х107, 1х108, 5х108 комбинированных естественных клеток-киллеров на миллилитр пуповинной крови.
5.1.5.3. Комбинации NK-клеток с прилипающими плацентарными стволовыми клетками.
В других вариантах осуществления NK-клетки, продуцированные с применением процессов, описанных в настоящем раскрытии, например активированные NK-клетки или клетки TSPNK (например, клетки-предшественники NK), продуцированные с применением трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, по отдельности или в комбинации с плацентарным перфузатом или клетками плацентарного перфузата, дополняют изолированными прилипающими плацентарными клетками, например, плацентарными стволовыми клетками и плацентарными мультипотентными клетками, как описано, например, в патентах США № 7045148 и 7255879 Харири и в публикации заявки на патент США № 2007/0275362, раскрытия которых включены в настоящее изобретение посредством ссылок во всей их полноте. Прилипающие плацентарные клетки означает, что клетки прилипают к поверхности культуры ткани, например, пластику с культурой тканей. Прилипающие плацентарные клетки, являющиеся целесообразными в композициях и способах, раскрытых в настоящем раскрытии, не являются трофобластами, эмбриональными зародышевыми клетками или эмбриональными стволовыми клетками. В определенных вариантах осуществления прилипающие плацентарные стволовые клетки используются в качестве питающих клеток во время процессов (например, двухэтапного способа), как описано выше.
NK-клетки продуцированные с применением процессов, описанных в настоящем раскрытии, например, активированные NK-клетки или клетки TSPNK (например, клетки-предшественники NK), по отдельности или в комбинации с плацентарным перфузатом или клетками плацентарного перфузата, могут быть дополнены, например, 1x104, 5x104, 1x105, 5x105, 1x106, 5x106, 1х107, 5х107, 1х108, 5х108 или более прилипающих плацентарных клеток на 1 мл или 1x104, 5x104, 1x105, 5x105, 1x106, 5x106, 1х107, 5х107, 1х108, 5х108, 1x109, 5x109, 1х1010, 5х1010, 1x1011 или более прилипающих плацентарных клеток. Прилипающие плацентарные клетки в комбинациях могут представлять собой, например, прилипающие плацентарные клетки, которые культивировались в течение, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, з4, 36, 38 или 40 дупликаций популяции или более.
Изолированные прилипающие плацентарные клетки при культивации в первичных культурах или при расширении в клеточной культуре прилипают к подложке, например к поверхности контейнера культуры тканей (например, пластику культуры тканей). Прилипающие плацентарные клетки в культуре принимают обычно фибробластоидный звездообразный вид с рядом эндоплазматических выступов, простирающихся от центрального клеточного тела.
Прилипающие плацентарные клетки, однако, морфологически отличаются от фибробластов, культивируемых при тех же самых условиях, так как прилипающие плацентарные клетки демонстрируют большее число таких выступов, чем фибробласты. Морфологически прилипающие плацентарные клетки также отличаются от гематопоэтических стволовых клеток, которые обычно принимают более округленную или булыжную морфологию в культуре.
Изолированные прилипающие плацентарные клетки и популяции прилипающих плацентарных клеток, являющиеся целесообразными в композициях и способах, представленных в настоящем раскрытии, экспрессируют множество маркеров, которые могут применяться для идентификации и/или изоляции клеток или популяций клеток, которые содержат прилипающие плацентарные клетки. Прилипающие плацентарные клетки и популяции прилипающих плацентарных клеток, являющиеся целесообразными в композициях и способах, представленных в настоящем раскрытии, включают в себя прилипающие плацентарные клетки и содержащие прилипающие плацентарные клетки популяции клеток, полученные непосредственно из плаценты или любой ее части (например, амнион, хорион, амниональнохориональная пластинка, плацентарные котиледоны, пуповина и т.п.). Популяция прилипающих стволовых плацентарных клеток, в одном из вариантов осуществления, представляет собой популяцию (т.е. две или более) прилипающих плацентарных клеток в культуре, например популяцию в контейнере, например
- 19 039192 резервуаре.
Прилипающие плацентарные клетки обычно экспрессируют маркеры CD73, CD105 и CD200 и/или ОСТ-4 и не экспрессируют CD34, CD38 или CD45. Прилипающие плацентарные стволовые клетки могут также экспрессировать HLA-ABC (МНС-1) и HLA-DR. Эти маркеры могут применяться для идентификации прилипающих плацентарных клеток и для различения прилипающих плацентарных клеток от клеток других типов. Поскольку прилипающие плацентарные клетки могут экспрессировать CD73 и CD105, они могут обладать характеристиками, аналогичными характеристикам мезенхимальных стволовых клеток. Отсутствие экспрессии CD34, CD38 и/или CD45 идентифицирует прилипающие плацентарные стволовые клетки как не являющиеся стволовыми гематопоэтическими клетками.
В определенных вариантах осуществления изолированные прилипающие плацентарные клетки, описанные в настоящем раскрытии, детектируемо подавляют пролиферацию раковых клеток или рост опухоли.
В определенных вариантах осуществления изолированные прилипающие плацентарные клетки представляют собой изолированные плацентарные стволовые клетки. В определенных других вариантах осуществления изолированные прилипающие плацентарные клетки представляют собой плацентарные мультипотентные клетки. В конкретном варианте осуществления изолированные прилипающие плацентарные клетки являются CD34-, CD10+ и CD105+ в соответствии с обнаруженным посредством проточной цитометрии. В более конкретном варианте осуществления изолированные CD34-, CD10+, CD105+ прилипающие плацентарные клетки представляют собой плацентарные стволовые клетки. В другом более конкретном варианте осуществления изолированные CD34-, CD10+, CD105+ плацентарные клетки представляют собой мультипотентные прилипающие плацентарные клетки. В другом конкретном варианте осуществления изолированные CD34-, CD10+, CD105+ плацентарные клетки обладают потенциалом для дифференцирования в клетки нейронного фенотипа, клетки остеогенного фенотипа или клетки хондрогенного фенотипа. В более конкретном варианте осуществления изолированные CD34-, CD10+, CD105+ прилипающие плацентарные клетки дополнительно являются CD200+. В другом более конкретном варианте осуществления изолированные CD34-, CD10+, CD105+ прилипающие плацентарные клетки дополнительно являются CD90+ или CD45- в соответствии с обнаруженным посредством проточной цитометрии. В другом более конкретном варианте осуществления изолированные CD34-, CD10+, CD105+ прилипающие плацентарные клетки дополнительно являются CD90+ или CD45-, в соответствии с обнаруженным посредством проточной цитометрии. В более конкретном варианте осуществления CD34-, CD10+, CD105+, CD200+ прилипающие плацентарные клетки дополнительно являются CD90+ или CD45- в соответствии с обнаруженным посредством проточной цитометрии. В другом более конкретном варианте осуществления CD34-, CD10+, CD105+, CD200+ прилипающие плацентарные клетки дополнительно являются CD90+ и CD45-, в соответствии с обнаруженным посредством проточной цитометрии. В другом более конкретном варианте осуществления CD34-, CD10+, CD105+, CD200+, CD90+, CD45- прилипающие плацентарные клетки дополнительно являются CD8CT и CD86- в соответствии с обнаруженным посредством проточной цитометрии.
В одном из вариантов осуществления изолированные прилипающие плацентарные клетки являются CD200+, HLA-G+. В конкретном варианте осуществления указанные изолированные прилипающие плацентарные клетки также являются CD73+ и CD105+. В другом конкретном варианте осуществления указанные изолированные прилипающие плацентарные клетки также являются CD34-, CD38- или CD45-. В более конкретном варианте осуществления указанные изолированные прилипающие плацентарные клетки также являются CD34-, CD38-, CD45-, CD73+ и CD105+. В другом варианте осуществления указанные изолированные прилипающие плацентарные клетки продуцируют одно или более подобных эмбриоидным тел при культивировании в условиях, которые допускают формирование подобных эмбриоидным тел.
В другом варианте осуществления изолированные прилипающие плацентарные клетки являются CD73+, CD105+, CD200+. В конкретном варианте осуществления указанные изолированные прилипающие плацентарные клетки также являются HLA-G+. В другом конкретном варианте осуществления указанные изолированные прилипающие плацентарные клетки также являются CD34-, CD38- или CD45-. В другом конкретном варианте осуществления указанные изолированные прилипающие плацентарные клетки также являются CD34-, CD38- и CD45-. В более конкретном варианте осуществления указанные изолированные прилипающие плацентарные клетки также являются CD34-, CD38-, CD45- и HLA-G+. В другом конкретном варианте осуществления указанные изолированные прилипающие плацентарные клетки продуцируют одно или более подобных эмбриоидным тел при культивировании в условиях, которые допускают формирование подобных эмбриоидным тел.
В другом варианте осуществления изолированные прилипающие плацентарные клетки являются CD200+, ОСТ-4+. В конкретном варианте осуществления указанные изолированные прилипающие плацентарные клетки также являются CD73+ и CD105+. В другом конкретном варианте осуществления указанные изолированные прилипающие плацентарные клетки также являются HLA-G+. В другом конкретном варианте осуществления указанные изолированные прилипающие плацентарные клетки также являются CD34-, CD38- и CD45-. В более конкретном варианте осуществления указанные изолированные
- 20 039192 прилипающие плацентарные клетки также являются CD34-, CD38-, CD45-, CD73+, CD105+ и HLA-G+. В другом конкретном варианте осуществления изолированные прилипающие плацентарные клетки также продуцируют одно или более подобных эмбриоидным тел при культивировании в условиях, которые допускают формирование подобных эмбриоидным тел.
В другом варианте осуществления изолированные прилипающие плацентарные клетки являются CD73+, CD105+ и HLA-G+. В конкретном варианте осуществления указанные изолированные прилипающие плацентарные клетки также являются CD34-, CD38- или CD45-. В другом конкретном варианте осуществления указанные изолированные прилипающие плацентарные клетки также являются CD34-, CD38 и CD45-. В другом конкретном варианте осуществления указанные прилипающие стволовые клетки также являются ОСТ-4+. В другом конкретном варианте осуществления указанные прилипающие стволовые клетки также являются CD200+. В более конкретном варианте осуществления указанные прилипающие стволовые клетки также являются CD34-, CD38-, CD45-, OCT-4+ и CD200+.
В другом варианте осуществления изолированные прилипающие плацентарные клетки представляют собой стволовые клетки CD73+, CD105+, при этом указанные клетки продуцируют одно или более подобных эмбриоидным тел при культивировании в условиях, которые допускают формирование подобных эмбриоидным тел. В конкретном варианте осуществления указанные изолированные прилипающие плацентарные клетки также являются CD34-, CD38- или CD45-. В другом конкретном варианте осуществления изолированные прилипающие плацентарные клетки также являются CD34-, CD38- и CD45-. В другом конкретном варианте осуществления изолированные прилипающие плацентарные клетки также являются ОСТ-4+. В более конкретном варианте осуществления указанные изолированные прилипающие плацентарные клетки также являются ОСТ-4+, CD34-, CD38-u CD45-.
В другом варианте осуществления прилипающие плацентарные стволовые клетки представляют собой стволовые клетки ОСТ-4+, при этом указанные прилипающие плацентарные стволовые клетки продуцируют одно или более подобных эмбриоидным тел при культивировании в условиях, которые допускают формирование подобных эмбриоидным тел, и при этом указанные стволовые клетки были идентифицированы как детектируемо подавляющие пролиферацию раковых клеток или рост опухоли.
В различных вариантах осуществления по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50% по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% указанных изолированных прилипающих плацентарных клеток являются ОСТ-4+. В конкретном варианте осуществления указанные изолированные прилипающие плацентарные клетки также являются CD73+ и CD105+. В другом конкретном варианте осуществления указанные изолированные прилипающие плацентарные клетки также являются CD34-, CD38- или CD45-. В другом конкретном варианте осуществления указанные стволовые клетки являются CD200+. В более конкретном варианте осуществления указанные изолированные прилипающие плацентарные клетки также являются CD73+, CD105+, CD200+, CD34-, CD38- и CD45-. В другом конкретном варианте осуществления указанные изолированные прилипающие плацентарные клетки были расширены, например пересеяны, по меньшей мере один раз, по меньшей мере три раза, по меньшей мере пять раз, по меньшей мере 10 раз, по меньшей мере 15 раз или по меньшей мере 20 раз.
В более конкретном варианте осуществления любого из приведенных выше вариантов осуществления изолированные прилипающие плацентарные клетки экспрессируют АВС-р (специфичный для плаценты белок-транспортер ABC; см., например, Allikmets et al., Cancer Res. 58(23):5337-9 (1998)).
В другом варианте осуществления изолированные прилипающие плацентарные клетки являются CD29+, CD44+, CD73+, CD90+, CD105+, CD200+, CD34- и CD133-. В другом варианте осуществления изолированные прилипающие плацентарные клетки конститутивно секретируют IL-6, IL-8 и моноцитарный хемоатрактантный белок (МСР-1).
Каждая из вышеупомянутых изолированных прилипающих плацентарных клеток может представлять собой клетки, полученные и изолированные непосредственно из плаценты млекопитающего, или клетки, которые культивировались и пересеивались по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30 или более раз, или комбинацию указанного. Множества подавляющих опухолевые клетки из изолированных прилипающих плацентарных клеток, описанных выше, могут содержать около, по меньшей мере или не более чем, 1x105, 5x105, 1x106, 5x106, 1х107, 5х107, 1x108, 5x108, 1x109, 5x109, 1х1010, 5x1010, 1x1011 или более изолированных прилипающих плацентарных клеток.
5.1.5.4. Композиции, содержащие кондиционированные среды прилипающих плацентарных клеток.
Также в настоящем изобретении может применяться композиция, содержащая NK-клетки, продуцированные с применением процессов, описанных в настоящем раскрытии, например, активированные NK-клетки или клетки TSPNK (например, клетки-предшественники NK), продуцированные с применением трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, и, дополнительно, кондиционированной среды, при этом указанная композиция подавляет опухоль или является эффективной при лечении рака или вирусной инфекции. Прилипающие плацентарные клетки в соответствии с описанным в настоящем изобретении могут применяться для продуцирования кондиционированной среды, которая является подавляющей опухоль, противораковой или противовирусной, т.е. среды, содержащей одну или
- 21 039192 более биомолекул, секретированных или экскретируемых клетками, которые обладают детектируемым эффектом подавления опухолевых клеток, противораковым эффектом или противовирусным эффектом. В различных вариантах осуществления кондиционированная среда включает среду, в которой клетки разрастались (т.е. культивировались) в течение по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или более дней. В других вариантах осуществления кондиционированная среда включает среду, в которой такие клетки выросли по меньшей мере до 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% смыкания или до 100% смыкания. Такая кондиционированная среда может применяться для поддержания культивирования отдельной популяции клеток, например плацентарных клеток или клеток другого вида. В другом варианте осуществления кондиционированная среда, предоставленная в настоящем раскрытии, включает питательную среду, в которой культивировались изолированные прилипающие плацентарные клетки, например изолированные прилипающие плацентарные стволовые клетки или изолированные прилипающие плацентарные мультипотентные клетки и клетки, отличные от изолированных прилипающих плацентарных клеток, например неплацентарные стволовые клетки или мультипотентные клетки.
Такая кондиционированная среда может быть объединена с любыми клетками или с любой комбинацией NK-клеток, продуцированных с применением процессов, описанных в настоящем раскрытии, например активированными NK-клетками или клетками TSPNK (например, клеткамипредшественниками NK), плацентарным перфузатом, клетками плацентарного перфузата, с тем чтобы сформировать композицию, которая является подавляющей опухолевые клетки, противораковой или противовирусной. В определенных вариантах осуществления композиция содержит менее чем половину кондиционированной среды по объему, например около или менее чем около 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 или 1% по объему.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления в настоящем изобретении применяется композиция, содержащая NK-клетки, продуцированные с применением процессов, описанных в настоящем раскрытии, например активированные NK-клетки или клетки TSPNK (например, клеткипредшественники NK), и культуральную среду от культивирования изолированных прилипающих плацентарных клеток, при этом указанные изолированные прилипающие плацентарные клетки (а) прилипают к субстрату и (b) являются CD34-, CD10+ и CD105+; при этом указанная композиция детектируемо подавляет рост или пролиферацию опухолевых клеток или является противораковой или противовирусной. В конкретном варианте осуществления изолированные прилипающие плацентарные клетки являются CD34-, CD10+ и CD105+ в соответствии с обнаруженным посредством проточной цитометрии. В более конкретном варианте осуществления изолированные CD34-, CD10+, CD105+ прилипающие плацентарные клетки представляют собой плацентарные стволовые клетки. В другом более конкретном варианте осуществления изолированные CD34-, CD10+, CD105+ плацентарные клетки представляют собой мультипотентные прилипающие плацентарные клетки. В другом конкретном варианте осуществления изолированные CD34-, CD10+, CD105+ плацентарные клетки обладают потенциалом для дифференцирования в клетки нейронного фенотипа, клетки остеогенного фенотипа или клетки хондрогенного фенотипа. В более конкретном варианте осуществления изолированные CD34-, CD10+, CD105+ прилипающие плацентарные клетки дополнительно являются CD200+. В другом более конкретном варианте осуществления изолированные CD34-, CD10+, CD105+ прилипающие плацентарные клетки дополнительно являются CD90+ или CD45- в соответствии с обнаруженным посредством проточной цитометрии. В другом более конкретном варианте осуществления изолированные CD34-, CD10+, CD105+ прилипающие плацентарные клетки дополнительно являются CD90+ или CD45- в соответствии с обнаруженным посредством проточной цитометрии. В более конкретном варианте осуществления, CD34-, CD10+, CD105+, CD200+ прилипающие плацентарные клетки дополнительно являются CD90+ или CD45- в соответствии с обнаруженным посредством проточной цитометрии. В другом более конкретном варианте осуществления, CD34-, CD10+, CD105+, CD200+ прилипающие плацентарные клетки дополнительно являются CD90+ и CD45- в соответствии с обнаруженным посредством проточной цитометрии. В другом более конкретном варианте осуществления CD34-, CD10+, CD105+, CD200+, CD90+, CD45- прилипающие плацентарные клетки дополнительно являются CD8CT и CD86- в соответствии с обнаруженным посредством проточной цитометрии.
В другом варианте осуществления в настоящем изобретении применяется композиция, содержащая NK-клетки, продуцированные с применением процессов, описанных в настоящем раскрытии, например активированные NK-клетки или клетки TSPNK (например, клетки-предшественники NK), и культуральную среду от культивирования изолированных прилипающих плацентарных клеток, при этом указанные изолированные прилипающие плацентарные клетки (а) прилипают к субстрату и (b) экспрессируют CD200 и HLA-G, или экспрессируют CD73, CD105 и CD200, или экспрессируют CD200 и ОСТ-4, или экспрессируют CD73, CD105 и HLA-G, или экспрессируют CD73 и CD105 и способствуют образованию одного или более подобных эмбриоидным тел в популяции плацентарных клеток, которая содержит плацентарные стволовые клетки, когда указанную популяцию культивируют в условиях, которые допускают формирование подобных эмбриоидным тел, или экспрессируют ОСТ-4 и способствуют образованию одного или более подобных эмбриоидным тел в популяции плацентарных клеток, которая содержит плацентарные стволовые клетки, когда указанную популяцию культивируют в условиях, которые допускают
- 22 039192 формирование подобных эмбриоидным тел; при этом указанная композиция детектируемо подавляет рост или пролиферацию опухолевых клеток или является противораковой или противовирусной. В конкретном варианте осуществления композиция дополнительно содержит множество указанных изолированных прилипающих плацентарных клеток. В другом конкретном варианте осуществления композиция содержит множество неплацентарных клеток. В более конкретном варианте осуществления указанные неплацентарные клетки включают в себя клетки CD34+, например гематопоэтические клеткипредшественники, такие как гематопоэтические клетки-предшественники периферической крови, гематопоэтические клетки-предшественники пуповинной крови или гематопоэтические клеткипредшественники плацентарной крови. Неплацентарные клетки могут также включать в себя стволовые клетки, такие как мезенхимальные стволовые клетки, например полученные из костного мозга мезенхимальные стволовые клетки. Неплацентарные клетки могут также представлять собой один или более типов взрослых клеток или клеточных линий. В другом конкретном варианте осуществления композиция содержит антипролиферативное средство, например антитело анти-MIP-1α или анти-MIP-1β.
В конкретном варианте осуществления культуральную среду, кондиционированную одной из клеток или комбинаций клеток, описанных выше, получают из множества изолированных прилипающих плацентарных клеток, совместно культивированных с множеством опухолевых клеток в соотношении около 1:1, около 2:1, около 3:1, около 4:1 или около 5:1 изолированных прилипающих плацентарных клеток к опухолевым клеткам. Например, кондиционированная культуральная среда или супернатант могут быть получены из культуры, содержащей около 1x105 изолированных прилипающих плацентарных клеток, около 1x106 изолированных прилипающих плацентарных клеток, около 1x107 изолированных прилипающих плацентарных клеток или около 1x108 изолированных прилипающих плацентарных клеток или более. В другом конкретном варианте осуществления кондиционированную культуральную среду или супернатант получают из совместной культуры, содержащей от около 1x105 до около 5x105 изолированных прилипающих плацентарных клеток и около 1x105 опухолевых клеток; от около 1x106 до около 5x106 изолированных прилипающих плацентарных клеток и около 1x106 опухолевых клеток; от около 1x107 до около 5x107 изолированных прилипающих плацентарных клеток и около 1x107 опухолевых клеток; или от около 1x108 до около 5x108 изолированных прилипающих плацентарных клеток и около 1x108 опухолевых клеток.
5.2. Способы продуцирования NK-клеток.
NK-клетки могут быть продуцированы из гематопоэтических клеток, например гематопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников из любого источника, например плацентарной ткани, плацентарного перфузата, пуповинной крови, плацентарной крови, периферической крови, селезенки, печени и т.п.
Одним важным источником естественных клеток-киллеров и клеток, которые могут использоваться для получения естественных клеток-киллеров, в соответствии с описанным выше, является плацента, например плацента полного срока, например человеческая плацента полного срока. Плацентарный перфузат содержит клетки плацентарного перфузата, которые могут быть получены, например, посредством способов, раскрытых в патентах США № 7045148 и 7468276 и публикации заявки на патент США № 2009/0104164, раскрытия каждого из которых включены в настоящее описание во всей их полноте.
5.2.1. Композиция для сбора клеток.
Плацентарный перфузат и клетки перфузата, из которых могут быть изолированы гематопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники или которые являются полезными в подавлении опухоли или лечении индивида, имеющего опухолевые клетки, рак или вирусную инфекцию, например, в комбинации с NK-клетками, например популяциями NK-клеток, продуцированными в соответствии с трехэтапным способом, представленным в настоящем раскрытии, могут быть собраны посредством перфузии через послеродовую плаценту млекопитающего, например человека, с применением плацентарной композиции для сбора клеток. Перфузат может быть собран из плаценты посредством перфузии через плаценту любого физиологически приемлемого раствора, например физиологического раствора, культуральной среды или более сложной композиции для сбора клеток. Композиция для сбора клеток, подходящая для перфузии через плаценту и для сбора и сохранения клеток перфузата, описывается подробно в родственной заявке на патент США № 2007/0190042, которая включена в настоящее изобретение посредством ссылки во всей ее полноте.
Композиция для сбора клеток может содержать любой физиологически приемлемый раствор, подходящий для сбора и/или культивирования стволовых клеток, например физиологический раствор (например, фосфатно-солевой буферный раствор, раствор Кребса, модифицированный раствор Кребса, раствор Игла, 0,9% NaCl и т.д.), культуральная среда (например, DMEM, H.DMEM и т.д.) и т.п.
Композиция для сбора клеток может содержать один или более компонентов, которые имеют тенденцию к сохранению плацентарных клеток, т.е. могут препятствовать тому, чтобы плацентарные клетки умерли, или могут задерживать смерть плацентарных клеток, сокращать количество плацентарных клеток в популяции клеток, которые умирают и т.п., с момента сбора до момента культивирования. Такие компоненты могут представлять собой, например, ингибитор апоптоза (например, ингибитор каспазы
- 23 039192 или ингибитор JNK); сосудорасширяющее средство (например, сульфат магния, гипотензивное средство, предсердный натрийуретический пептид (ANP), адренокортикотропин, кортикотропинвысвобождающий гормон, пентацианонитрозо-железо(3)-кислый натрий, гидралазин, аденозинтрифосфат, аденозин, индометацин или сульфат магния, ингибитор фосфодиэстеразы и т.д.); ингибитор некроза (например, 2-(1Н-индол-3-ил)-3-пентиламино-малеимид, пирролидиндитиокарбамат или клоназепам); ингибитор TNF-α и/или несущий кислород перфторуглерод (например, перфтороктил бромид, перфтордецил бромид и т.д.).
Композиция для сбора клеток может содержать один или более разлагающих ткань ферментов, например металлопротеазу, сывороточную протеазу, нейтральную протеазу, гиалуронидазу, РНКазу или ДНКазу и т.п. Такие ферменты включают в себя, но не ограничены указанным, коллагеназы (например, коллагеназу I или IV, коллагеназу из Clostridium histolyticum и т.д.); диспазу, термолизин, эластазу, трипсин, либеразу, гиалуронидазу и т.п.
Композиция для сбора клеток может содержать бактерицидно или бактериостатически эффективное количество антибиотика. В определенных неограничивающих вариантах осуществления антибиотик представляет собой макролид (например, тобрамицин), цефалоспорин (например, цефалексин, цефрадин, цефуроксим, цефпрозил, цефаклор, цефиксим или цефадроксил), клэритромицин, эритромицин, пенициллин (например, пенициллин V) или хинолон (например, офлоксацин, ципрофлоксацин или норфлоксацин), тетрациклин, стрептомицин и т.д. В конкретном варианте осуществления антибиотик является активным против грамположительных и/или грамотрицательных бактерий, например Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus и т.п.
Композиция для сбора клеток может также содержать одно или более следующих соединений: аденозин (от около 1 до около 50 мкМ);
D-глюкоза (от около 20 до около 100 мкМ);
ионы магния (от около 1 до около 50 мкМ);
макромолекула с молекулярным весом более чем 20000 Да в одном из вариантов осуществления, присутствующая в количестве, достаточном для поддержания целостности эндотелия и клеточной жизнеспособности (например, синтетический или естественный коллоид, полисахарид, такой как декстран или полиэтиленгликоль, присутствующий в количестве от около 25 до около 100 г/л или от около 40 до около 60 г/л);
антиоксидант (например, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, глютатион, витамин С или витамин Е, присутствующие в концентрации от около 25 до около 100 мкМ);
восстановитель (например, N-ацетилцистеин, присутствующий в концентрации от около 0,1 до около 5 мкМ);
средство, которое предотвращает поступление кальция в клетки (например, верапамил, присутствующий в концентрации от около 2 до около 25 мкМ);
нитроглицерин (например, от около 0,05 до около 0,2 г/л);
противосвертывающее средство, в одном из вариантов осуществления, присутствующее в количестве, достаточном, чтобы помочь предотвратить свертывание остаточной крови (например, гепарин или гирудин, присутствующие в концентрации от около 1000 до около 100000 единиц/л); или содержащее амилорид соединение (например, амиролид, этилизопропил амиролид, циклогексан амиролид, этан амиролид или изобутил амиролид, присутствующие в количестве от около 1,0 до около 5 мкМ).
5.2.2. Сбор и обработка плаценты.
Обычно человеческую плаценту извлекают вскоре после ее выталкивания после рождения. В одном из вариантов осуществления плаценту извлекают из пациента после получения информированного согласия и после того, как полная история болезни пациента была получена и ассоциирована с плацентой. В одном из вариантов осуществления история болезни продолжается после родов.
До восстановления перфузата удаляются пуповинная кровь и плацентарная кровь. В определенных вариантах осуществления после родов извлекают пуповинную кровь из плаценты. Плацента может быть подвергнута обычному процессу извлечения пуповинной крови. Обычно игла или канюля используются при помощи силы тяжести, для того, чтобы обескровить плаценту (см., например, Андерсон, патент США № 5372581; Гессель et al., патент США № 5415665). Игла или канюля обычно размещаются в пупочной вене, и плацента может мягко массироваться в целях способствования дренирования пуповинной крови из плаценты. Такое извлечение пуповинной крови может быть выполнено коммерчески, например, компаниями LifeBank Inc., Cedar Knolls, N.J., ViaCord, Cord Blood Registry и CryoCell. В одном из вариантов осуществления дренирование плаценты выполняется посредством свободного вытекания, без дополнительных манипуляций, с тем чтобы минимизировать разрыв ткани во время извлечения пуповинной крови.
Как правило, плацента транспортируется из родильного зала или родовой палаты в другое место, например лабораторию, для извлечения пуповинной крови и сбора перфузата. Плацента может транспортироваться в стерильном теплоизолированном устройстве транспортировки (поддерживающем темпера
- 24 039192
ТУРУ плаценты в диапазоне 20-28°C), например, путем помещения плаценты, с зажатым внутренним концом пуповины, в стерильный герметизируемый полиэтиленовый пакет, который затем размещают в изотермическом контейнере. В другом варианте осуществления плаценту транспортируют в наборе для сбора пуповинной крови, по существу таком, как описан в патенте США № 7147626. В одном из вариантов осуществления плаценту доставляют в лабораторию в течение от 4 до 24 ч после родов. В определенных вариантах осуществления внутренний конец пуповины зажимают, например, в пределах 4-5 см от вставки в плацентарный диск до извлечения пуповинной крови. В других вариантах осуществления внутренний конец пуповины зажимают после извлечения пуповинной крови, но до дальнейшей обработки плаценты.
Плацента, до сбора перфузата, может храниться в стерильных условиях при комнатной температуре или при температуре 5-25°C (по шкале Цельсия). Плацента может храниться в течение периода более чем 48 ч или в течение периода от 4 до 24 ч до выполнения перфузии через плаценту, с тем чтобы удалить любую остаточную пуповинную кровь. Плацента может храниться в растворе противосвертывающего средства при температуре от 5 до 25°C (по шкале Цельсия). Соответствующие растворы противосвертывающего средства известны в технике. Например, может использоваться раствор гепарина или варфарина натрия. В одном из вариантов осуществления раствор противосвертывающего средства содержит раствор гепарина (например, 1% вес./вес. в растворе 1:1000). В некоторых вариантах осуществления обескровленная плацента хранится в течение не более чем 36 ч до того, как будет собран плацентарный перфузат.
5.2.3. Плацентарная перфузия.
Способы выполнения перфузии через плаценту млекопитающего и получения плацентарного перфузата раскрываются, например, в Харири, патенты США № 7045148 и 7255879, и в публикациях заявок на патент США № 2009/0104164, 2007/0190042 и 20070275362, выпущенных как патент США № 8057788, раскрытия каждого из которых включены в настоящее изобретение посредством ссылки во всей их полноте.
Перфузат может быть получен путем прохождения перфузионного раствора, например физиологического раствора, культуральной среды или композиций для сбора клеток, описанных выше, через плацентарную сосудистую сеть. В одном из вариантов осуществления перфузию через плаценту млекопитающего выполняют путем прохождения перфузионного раствора через пупочную артерию, или пупочную вену, или через них обеих. Поток перфузионного раствора через плаценту может быть осуществлен, например, через протекание посредством свободного вытекания. Например, перфузионный раствор проталкивают через плаценту с использованием насоса, например перистальтического насоса. Пупочная вена может быть, например, канюлирована с помощью канюли, например тефлоновой (TEFLON®) или пластиковой канюли, которая соединена со стерильным соединяющим устройством, таким как стерильный трубопровод. Стерильное соединяющее устройство соединяют с коллектором перфузии.
При подготовке к перфузии плацента может быть ориентирована таким образом, чтобы пупочная артерия и пупочная вена располагались в самой высокой точке плаценты. Плацента может быть подвергнута перфузии путем прохождения перфузионного раствора через плацентарную сосудистую сеть или через плацентарную сосудистую сеть и окружающую ткань. В одном из вариантов осуществления пупочную артерию и пупочную вену одновременно соединяют с пипеткой, которая соединяется через гибкий соединитель с резервуаром перфузионного раствора. Перфузионный раствор проходит в пупочную вену и артерию. Перфузионный раствор выделяется из и/или проходит через стенки кровеносных сосудов в окружающие ткани плаценты и собирается в соответствующем сосуде открытого типа с поверхности плаценты, которая была присоединена к матке матери во время беременности. Перфузионный раствор может также быть введен путем открытия пуповины и обеспечения возможности протекания или просачивания из отверстий в стенке плаценты, которая соединялась со стенкой матки матери. В другом варианте осуществления перфузионный раствор проходит через пупочные вены и собирается из пупочной артерии, или проходит через пупочную артерию и собирается из пупочных вен, т.е. проходит только через плацентарную сосудистую сеть (эмбриональную ткань).
В одном из вариантов осуществления, например, пупочная артерия и пупочная вена соединяются одновременно, например, с пипеткой, которая соединяется через гибкий соединитель с резервуаром перфузионного раствора. Перфузионный раствор проходит в пупочную вену и артерию. Перфузионный раствор выделяется из и/или проходит через стенки кровеносных сосудов в окружающие ткани плаценты и собирается в соответствующем сосуде открытого типа с поверхности плаценты, которая была присоединена к матке матери во время беременности. Перфузионный раствор может также быть введен путем открытия пуповины и обеспечения возможности протекания или просачивания из отверстий в стенке плаценты, которая соединялась со стенкой матки матери. Плацентарные клетки, которые собирают этим способом, который может называться методом кюветы, обычно представляют собой смесь эмбриональных и материнских клеток.
В другом варианте осуществления перфузионный раствор проходит через пупочные вены и собирается из пупочной артерии или проходит через пупочную артерию и собирается из пупочных вен. Плацентарные клетки, собранные этим способом, который может называться способом замкнутого конту
- 25 039192 ра, обычно являются практически исключительно эмбриональными.
Способ перфузии замкнутого контура в одном из вариантов осуществления может быть выполнен следующим образом. Послеродовую плаценту получают в течение около 48 ч после рождения. Пуповину зажимают и отрезают выше зажима. Пуповина может быть утилизирована или может быть обработана с целью извлечения, например, стволовых клеток пуповины и/или обработки мембраны пуповины для производства биоматериала. Амниотическая мембрана может быть сохранена во время перфузии или может быть отделена от хориона, например, с применением тупого отделения пальцами. Если амниотическую мембрану отделяют от хориона до перфузии, она может быть, например, утилизирована или обработана, например, с целью получения стволовых клеток посредством ферментативного расщепления или для производства, например, амниотического мембранного биоматериала, например биоматериала, описанного в публикации заявки на патент США № 2004/0048796. После очистки плаценты от всех видимых кровяных сгустков и остаточной крови, например, с использованием стерильной марли сосуды пуповины раскрывают, например, путем частичного разрезания мембраны пуповины, с тем чтобы раскрыть поперечное сечение пуповины. Сосуды идентифицируют и открывают, например, путем продвижения закрытого зажима типа крокодил через разрезанный конец каждого сосуда. Устройство, например пластмассовую трубку, соединенную с устройством перфузии или перистальтическим насосом, затем вставляют в каждую из плацентарных артерий. Насос может быть любым насосом, подходящим для данной цели, например перистальтическим насосом. Пластмассовую трубку, соединенную со стерильным накопительным резервуаром, например мешком для крови, таким как 250 мл мешок для сбора крови, затем вставляют в плацентарную вену. Альтернативно, трубку, соединенную с насосом, вставляют в плацентарную вену и трубки к накопительному(ым) резервуару(ам) вставляют в одну или обе плацентарные артерии. Плаценту затем подвергают перфузии с некоторым объемом перфузионного раствора, например около 750 мл перфузионного раствора. Клетки в перфузате затем собирают, например, посредством центрифугирования.
В одном из вариантов осуществления внутренний конец пуповины зажимают во время перфузии и, более конкретно, может быть зажато в пределах 4-5 см (сантиметров) вставки пуповины в плацентарный диск.
Первый сбор жидкости перфузии из плаценты млекопитающего во время процесса кровоизвлечения обычно окрашен остаточными эритроцитами пуповинной крови и/или плацентарной крови. Жидкость перфузии становится более бесцветной с продолжением перфузии и вымыванием остаточных клеток пуповинной крови из плаценты. Обычно от 30 до 100 мл жидкости перфузии является подходящим для первоначального вымывания крови из плаценты, но больше или меньше жидкости перфузии может использоваться в зависимости от наблюдаемых результатов.
В определенных вариантах осуществления пуповинную кровь удаляют из плаценты до перфузии (например, посредством свободного стекания), но плаценту не промывают (например, подвергают перфузии) раствором для удаления остаточной крови. В определенных вариантах осуществления пуповинную кровь удаляют из плаценты до перфузии (например, посредством свободного стекания), и плаценту промывают (например, подвергают перфузии) раствором для удаления остаточной крови.
Объем жидкости перфузии, используемый для выполнения перфузии через плаценту, может изменяться в зависимости от количества плацентарных клеток, которые должны быть собраны, размера плаценты, количества сборов, которое должно быть сделано для одной плаценты и т.д. В различных вариантах осуществления объем жидкости перфузии может составлять от 50 до 5000 мл, от 50 до 4000 мл, от 50 до 3000 мл, от 100 до 2000 мл, от 250 до 2000 мл, от 500 до 2000 мл или от 750 до 2000 мл. Как правило, перфузию через плаценту выполняют 700-800 мл жидкости перфузии после кровоизвлечения.
Плацента может подвергаться перфузии множество раз в течение нескольких часов или нескольких дней. Если плацента должна быть подвергнута перфузии множество раз, она может поддерживаться или культивироваться в асептических условиях в контейнере или другом подходящем сосуде и подвергаться перфузии композицией для сбора клеток или стандартным перфузионным раствором (например, физиологическим раствором, таким как фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) с противосвертывающим средством или без него (например, гепарин, варфарин натрия, кумарин, бис-гидроксикумарин) и/или с антимикробной добавкой или без нее (например, β-меркаптоэтанол (0,1 мМ); с антибиотиками, такими как стрептомицин (например, в концентрации 40-100 мкг/мл), пенициллин (например, в концентрации 40 ед./мл), амфотерицин В (например, в концентрации 0,5 мкг/мл). В одном из вариантов осуществления изолированная плацента поддерживается или культивируется в течение некоторого периода времени без сбора перфузата таким образом, что плацента поддерживается или культивируется в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 ч или 2, или 3, или более дней до перфузии и сбора перфузата. Перфузированная плацента может поддерживаться в течение одного или более дополнительных периодов времени, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ч или более, и подвергаться перфузии во второй раз, например 700-800 мл жидкости перфузии. Плацента может подвергаться перфузии 1, 2, 3, 4, 5 или более раз, например один раз в каждые 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ч. В одном из вариантов осуществления перфузию через плаценту и сбор перфузионного раствора, например композиции для сбора плацентарных клеток, повторяют до тех пор, пока количество
- 26 039192 извлекаемых клеток не упадет ниже 100 клеток/мл. Перфузаты в различные моменты времени могут быть дополнительно обработаны индивидуально в целях извлечения зависящих от времени популяций клеток, например тотальных содержащих ядро клеток. Перфузаты, полученные в различные моменты времени, также могут быть объединены.
5.2.4. Плацентарный перфузат и клетки плацентарного перфузата.
Как правило, плацентарный перфузат от единственной плацентарной перфузии содержит от около 100 до около 500 миллионов имеющих ядро клеток, включая гематопоэтические клетки, из которых NK-клетки, например NK-клетки, продуцированные согласно трехэтапному способу, описанному в настоящем раскрытии, могут быть продуцированы посредством способа, раскрытого в настоящем раскрытии. В определенных вариантах осуществления плацентарный перфузат или клетки перфузата включают в себя CD34+ клетки, например стволовые гематопоэтические клетки или клетки-предшественники. Такие клетки, в более конкретном варианте осуществления, могут содержать стволовые клетки или клеткипредшественники CD34+CD45, стволовые клетки или клетки-предшественники CD34+CD45+ и т.п. В определенных вариантах осуществления перфузат или клетки перфузата хранятся посредством криозамораживания до изоляции из них гематопоэтических клеток. В определенных других вариантах осуществления плацентарный перфузат содержит, или клетки перфузата содержат, только эмбриональные клетки или комбинацию эмбриональных клеток и материнских клеток.
5.2.5. Гематопоэтические клетки.
В различных вариантах осуществления NK-клетки продуцируют из гематопоэтических клеток, например гематопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников.
Гематопоэтические клетки при использовании в настоящем изобретении могут представлять собой любые гематопоэтические клетки, способные дифференцироваться в NK-клетки, например клеткипредшественники, гематопоэтические клетки-предшественники, стволовые гематопоэтические клетки и т.п. Гематопоэтические клетки могут быть получены из источников ткани, таких как, например, костный мозг, пуповинная кровь, плацентарная кровь, периферическая кровь, печень и т.п. или комбинации указанного. Гематопоэтические клетки могут быть получены из плаценты. В конкретном варианте осуществления гематопоэтические клетки получают из плацентарного перфузата. Гематопоэтические клетки из плацентарного перфузата могут содержать смесь эмбриональных и материнских гематопоэтических клеток, например, смесь, в которой материнские клетки составляют более чем 5% общего количества гематопоэтических клеток. В одном из вариантов осуществления гематопоэтические клетки из плацентарного перфузата содержат по меньшей мере около 90, 95, 98, 99 или 99,5% эмбриональных клеток.
В другом конкретном варианте осуществления гематопоэтические клетки, например стволовые гематопоэтические клетки или клетки-предшественники, получают из плацентарного перфузата, пуповинной крови или периферической крови. В другом конкретном варианте осуществления гематопоэтические клетки, например стволовые гематопоэтические клетки или клетки-предшественники, представляют собой объединенные клетки из плацентарного перфузата и пуповинной крови, например, пуповинной крови из той же самой плаценты, что и перфузат. В другом конкретном варианте осуществления указанная пуповинная кровь выделяется из плаценты, отличной от плаценты, из которой получают указанный плацентарный перфузат. В определенных вариантах осуществления объединенные клетки могут быть получены путем объединения в пул или объединения пуповинной крови и плацентарного перфузата. В определенных вариантах осуществления пуповинная кровь и плацентарный перфузат объединяют в соотношении 100:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45: 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 65:1, 60:1, 55:1, 50:1, 45:1, 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95, 1:100 и т.п. по объему для получения объединенных клеток. В конкретном варианте осуществления пуповинную кровь и плацентарный перфузат объединяют в соотношении от 10:1 до 1:10, от 5:1 до 1:5 или от 3:1 до 1:3. В другом конкретном варианте осуществления пуповинную кровь и плацентарный перфузат объединяют в соотношении 10:1, 5:1, 3:1, 1:1, 1:3, 1:5 или 1:10. В более конкретном варианте осуществления пуповинную кровь и плацентарный перфузат объединяют в соотношении 8,5:1,5 (85%:15%).
В определенных вариантах осуществления пуповинную кровь и плацентарный перфузат объединяют в соотношении 100:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45: 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 65:1, 60:1, 55:1, 50:1, 45:1, 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95, 1:100 и т.п. по суммарному содержанию имеющих ядро клеток (TNC) для получения объединенных клеток. В конкретном варианте осуществления пуповинную кровь и плацентарный перфузат объединяют в соотношении от 10:1 до 1:10, от 5:1 до 1:5 или от 3:1 до 1:3. В другом конкретном варианте осуществления пуповинную кровь и плацентарный перфузат объединяют в соотношении 10:1, 5:1, 3:1, 1:1, 1:3, 1:5 или 1:10.
В другом конкретном варианте осуществления гематопоэтические клетки, например стволовые гематопоэтические клетки или клетки-предшественники, берут и из пуповинной крови и из плацентарного перфузата, но при этом указанную пуповинную кровь выделяют из плаценты, отличной от плаценты, из
- 27 039192 которой получают указанный плацентарный перфузат.
В определенных вариантах осуществления гематопоэтические клетки являются клетками CD34+. В конкретных вариантах осуществления гематопоэтические клетки, целесообразные в способах, раскрытых в настоящем раскрытии, являются CD34+CD38+ или CD34+CD38-. В более конкретном варианте осуществления гематопоэтические клетки являются CD34+CD38-Lin-. В другом конкретном варианте осуществления гематопоэтические клетки являются одним или более из CD2-, CD3-, CD11b-, CD11c-, CD14-, CD16 , CD19-, CD24-, CD56-, CD66b- и/или гликофорин А-. В другом конкретном варианте осуществления гематопоэтические клетки являются CD2-, CD3-, CD11b-, CD11c-, CD14-, CD16-, CD19-, CD24-, CD56-, CD66b и гликофорин А-. В другом более конкретном варианте осуществления гематопоэтические клетки являются CD34+CD38-CD33-CD117-. В другом более конкретном варианте осуществления гематопоэтические клетки являются CD34+CD38-CD33-CD117-CD235-CD36-
В другом варианте осуществления гематопоэтические клетки являются CD45+. В другом конкретном варианте осуществления гематопоэтические клетки являются CD34+CD45+. В другом варианте осуществления гематопоэтическая клетка является Thy-1+. В конкретном варианте осуществления гематопоэтическая клетка является CD34+Thy-1+. В другом варианте осуществления гематопоэтические клетки являются CD133+. В конкретных вариантах осуществления гематопоэтические клетки являются CD34+CD133+ или CD133+Thy-1+. В другом конкретном варианте осуществления гематопоэтические клетки CD34+являются CXCR4+. В другом конкретном варианте осуществления гематопоэтические клетки CD34+ являются CXCR4-. В другом варианте осуществления гематопоэтические клетки являются положительными по KDR (рецептор 2 сосудистого фактора роста). В конкретных вариантах осуществления гематопоэтические клетки являются CD34+KDR+, CD133+KDR+ или Thy-1+KDR+. В определенных других вариантах осуществления гематопоэтические клетки являются положительными по альдегиддегидрогеназе (ALDH+), например, клетками CD34+ALDH+.
В определенных других вариантах осуществления клетки CD34+ являются CD45-. В конкретных вариантах осуществления клетки CD34+, например клетки CD34+, CD45,-экспрессируют одну или более, или все, миРНК hsa-miR-380, hsa-miR-512, hsa-miR-517, hsa-miR-518c, hsa-miR-519b и/или hsa-miR-520a.
В определенных вариантах осуществления гематопоэтические клетки являются CD34-.
Гематопоэтические клетки могут также не иметь определенных маркеров, которые показывают детерминацию клеточной дифференцировки или отсутствие необученности в развитии. Например, в другом варианте осуществления гематопоэтические клетки являются HLA-DR-. В конкретных вариантах осуществления гематопоэтические клетки являются CD34+HLA-DR-, CD133+HLA-DR-, Thy-1+HLA-DR или ALDH+HLA-DR- В другом варианте осуществления гематопоэтические клетки являются отрицательными по одному или более, предпочтительно по всем, маркерам клеточной линии CD2, CD3, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD19, CD24, CD56, CD66b и гликофорину А.
Таким образом, гематопоэтические клетки могут быть отобраны для применения в способах, раскрытых в настоящем изобретении, на основании наличия маркеров, которые указывают недифференцированное состояние, или на основании отсутствия маркеров клеточной линии, указывающих, что по меньшей мере некоторая дифференцировка клеточной линии имела место. Способы изоляции клеток, включая гематопоэтические клетки, на основании наличия или отсутствия конкретных маркеров подробно обсуждаются ниже.
Гематопоэтические клетки, при использовании в настоящем раскрытии, могут представлять собой по существу однородную популяцию, например популяцию, содержащую по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или по меньшей мере около 99% гематопоэтических клеток из единственного источника ткани, или популяцию, содержащую гематопоэтические клетки, демонстрирующие одни и те же ассоциированные с гематопоэтическими клетками клеточные маркеры. Например, в различных вариантах осуществления гематопоэтические клетки могут содержать по меньшей мере около 95, 98 или 99% гематопоэтических клеток из костного мозга, пуповинной крови, плацентарной крови, периферической крови или плаценты, например, перфузата плаценты.
Гематопоэтические клетки при использовании в настоящем изобретении могут быть получены от одного индивида, например из единственной плаценты, или от множества индивидов, например, могут быть объединены в пул. Если гематопоэтические клетки получают от множества индивидов и объединяют в пул, гематопоэтические клетки могут быть получены из одного и того же источника ткани. Таким образом, в различных вариантах осуществления все объединенные в пул гематопоэтические клетки взяты из плаценты, например плацентарного перфузата, все взяты из плацентарной крови, все взяты из пуповинной крови, все взяты из периферической крови и т.п.
Гематопоэтические клетки при использовании в настоящем изобретении в определенных вариантах осуществления могут включать в себя гематопоэтические клетки из двух или более источников ткани. Например, в определенных вариантах осуществления, когда гематопоэтические клетки из двух или более источников объединяют для использования в способах по настоящему раскрытию, множество гематопоэтических клеток, используемое для продуцирования NK-клеток, включает в себя гематопоэтические клетки из плаценты, например перфузата плаценты. В различных вариантах осуществления гематопоэтические клетки, используемые для продуцирования NK-клеток, включают в себя гематопоэтические клет
- 28 039192 ки из плаценты и из пуповинной крови; из плаценты и периферической крови; из плаценты и плацентарной крови, или плаценты и костного мозга. В предпочтительном варианте осуществления гематопоэтические клетки включают в себя гематопоэтические клетки из плацентарного перфузата в комбинации с гематопоэтическими клетками из пуповинной крови, при этом пуповинная кровь и плацента взяты из одного и того же индивида, т.е. при этом перфузат и пуповинная кровь сочетаются друг с другом. В вариантах осуществления, в которых гематопоэтические клетки включают в себя гематопоэтические клетки из двух источников ткани, гематопоэтические клетки из этих источников могут быть объединены в соотношении, например, 1:10, 2:9, 3:8, 4:7: 5:6, 6:5, 7:4, 8:3, 9:2, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1 или 9:1.
5.2.5.1. Плацентарные стволовые гематопоэтические клетки.
В определенных вариантах осуществления гематопоэтические клетки представляют собой плацентарные гематопоэтические клетки. При использовании в настоящем изобретении плацентарные гематопоэтические клетки означают гематопоэтические клетки, полученные непосредственно из плаценты, а не из плацентарной крови или из пуповинной крови. В одном из вариантов осуществления плацентарные гематопоэтические клетки являются CD34+. В конкретном варианте осуществления плацентарные гематопоэтические клетки преимущественно (например, по меньшей мере около 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 98%) являются клетками CD34+CD38-. В другом конкретном варианте осуществления плацентарные гематопоэтические клетки преимущественно (например, по меньшей мере около 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 98%) являются клетками CD34+CD38+. Плацентарные гематопоэтические клетки могут быть получены из послеродовой плаценты млекопитающего (например, человека) любыми средствами, известными специалистам в данной области техники, например, посредством перфузии.
В другом варианте осуществления плацентарная гематопоэтическая клетка является CD45-. В конкретном варианте осуществления гематопоэтическая клетка является CD34+CD45-. В другом конкретном варианте осуществления плацентарные гематопоэтические клетки являются CD34+CD45+.
5.2.6. Способы продуцирования клеток PiNK.
В различных вариантах осуществления клетки PiNK получают из плацентарных клеток. В конкретных вариантах осуществления плацентарные клетки получают из плацентарного перфузата, например человеческого плацентарного перфузата. В конкретных вариантах осуществления плацентарные клетки получают из плацентарной ткани, которая была механически и/или ферментативно разорвана.
5.2.6.1. Получение клеток PiNK из плацентарного перфузата.
В одном из вариантов осуществления клетки PiNK собирают путем получения плацентарного перфузата, последующего контактирования плацентарного перфузата с композицией, которая специфично связывает клетки CD56+, например, антителом против CD56, после чего производится изоляция клеток CD56+ на основании указанного связывания, с тем чтобы сформировать популяцию клеток CD56+. Популяция клеток CD56+ включает в себя изолированную популяцию NK-клеток. В конкретном варианте осуществления клетки CD56+ контактируют с композицией, которая специфично связывается с клетками CD16+, например, антителом против CD16, и клетки CD16+ исключают из популяции клеток CD56+. В другом конкретном варианте осуществления клетки CD3+ также исключают из популяции клеток CD56+.
В одном из вариантов осуществления клетки PiNK получают из плацентарного перфузата следующим образом. Послеродовую человеческую плаценту обескровливают и подвергают перфузии, например, около 200-800 мл перфузионного раствора, только через плацентарную сосудистую сеть. В конкретном варианте осуществления плаценту дренируют от пуповинной крови и промывают, например, перфузионным раствором, через плацентарную сосудистую сеть, с тем чтобы удалить остаточную кровь до выполнения указанной перфузии. Перфузат собирают и обрабатывают, с тем чтобы удалить любые остаточные эритроциты. Естественные клетки-киллеры в тотальных содержащих ядро клетках в перфузате могут быть изолированы на основании экспрессии CD56 и CD16. В определенных вариантах осуществления изоляция клеток PiNK включает в себя изоляцию с применением антитела к CD56, при этом изолированные клетки являются CD56+. В другом варианте осуществления изоляция клеток PiNK включает в себя изоляцию с применением антитела к CD16, при этом изолированные клетки являются CD16-. В другом варианте осуществления изоляция клеток PiNK включает в себя изоляцию с применением антитела к CD56 и исключение множества не являющихся PiNK клеток с применением антитела к CD16, при этом изолированные клетки включают в себя клетки CD56+, CD16-.
Разделение клеток может быть выполнено любым способом, известным в технике, например посредством сортировки клеток с возбуждением флуоресценции (FACS) или предпочтительно магнитной сортировки клеток с использованием микрогранул, конъюгированных со специфичными антителами. Магнитное разделение клеток может быть выполнено и автоматизировано с применением, например, сепаратора AUTOMACS™ (Miltenyi).
В другом аспекте процесс изоляции плацентарных NK-клеток (например, клеток PiNK) включает в себя получение множества плацентарных клеток и изоляцию естественных клеток-киллеров из указанного множества плацентарных клеток. В конкретном варианте осуществления плацентарные клетки представляют собой или содержат клетки плацентарного перфузата, например тотальные содержащие ядро клетки из плацентарного перфузата. В другом конкретном варианте осуществления указанное множество
- 29 039192 плацентарных клеток представляет собой или содержит плацентарные клетки, полученные механическим и/или ферментативным расщеплением плацентарной ткани. В другом варианте осуществления указанную изоляцию выполняют с применением одного или более антител. В более конкретном варианте осуществления указанные одно или более антител включают в себя одно или более антител к CD3, CD16 или CD56. В более конкретном варианте осуществления указанная изоляция включает в себя изоляцию клеток CD56+ от клеток CD56- в указанном множестве плацентарных клеток. В более конкретном варианте осуществления указанная изоляция включает в себя изоляцию плацентарных клеток CD56+, CD16-, например, плацентарных естественных клеток-киллеров, например, клеток PiNK, от плацентарных клеток, которые являются CD56- или CD16+. В более конкретном варианте осуществления указанная изоляция включает в себя изоляцию плацентарных клеток CD56+, CD16-, CD3- от плацентарных клеток, которые являются CD56-, CD16+ или CD3+. В другом варианте осуществления указанный процесс изоляции плацентарных естественных клеток-киллеров приводит к формированию популяции плацентарных клеток, которая содержит по меньшей мере 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или по меньшей мере 99% естественных клеток-киллеров CD56+, CD16-.
В определенных вариантах осуществления плацентарные NK-клетки, например, клетки PiNK, были расширены в культуре. В определенных других вариантах осуществления клетки плацентарного перфузата были расширены в культуре. В конкретном варианте осуществления указанные клетки плацентарного перфузата были расширены в присутствии питающего слоя и/или в присутствии по меньшей мере одного цитокина. В более конкретном варианте осуществления указанный питающий слой содержит клетки K562 или мононуклеары периферической крови. В другом более конкретном варианте осуществления указанный по меньшей мере один цитокин представляет собой интерлейкин-2. В конкретных вариантах осуществления клетки PiNK культивировались, например расширялись в культуре, в течение по меньшей мере около или самое большее 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 дней. В конкретном варианте осуществления клетки PiNK культивируют в течение около 21 дня.
5.2.6.2. Разрыв и расщепление плацентарной ткани с целью получения клеток PiNK.
Плацентарные NK-клетки, например клетки PiNK, могут также быть получены из плацентарной ткани, которая была механически и/или ферментативно разорвана.
Плацентарная ткань может быть разорвана с применением одного или более разлагающих ткань ферментов, например металлопротеазы, серин-протеазы, нейтральной протеазы, РНК-азы или ДНК-азы и т.п. Такие ферменты включают, но не ограничены указанным, коллагеназы (например, коллагеназа I или IV, коллагеназа из Clostridium histolyticum и т.д.); диспазу, термолизин, эластазу, трипсин, либеразу, гиалуронидазу и т.п. Обычно после расщепления расщепленную ткань пропускают через натягиватель или фильтр, чтобы удалить частично расщепленные скопления клеток, оставляя по существу одноклеточную суспензию.
После того как суспензия плацентарных клеток была получена, естественные клетки-киллеры могут быть изолированы с использованием, например, антител к CD3 и CD56. В конкретном варианте осуществления плацентарные естественные клетки-киллеры изолируют путем отбора клеток, которые являются CD56+, с получением первой популяции клеток; производят контактирование указанной первой популяции клеток с антителами, специфичными для CD3 и/или CD16; и удаляют клетки из указанной первой популяции клеток, которые являются CD3+ или CD56+, посредством чего получают вторую популяцию клеток, которая является по существу CD56+ и CD3-, CD56+ и CD16- или CD56+, CD3- и CD16В одном из вариантов осуществления магнитные гранулы используют для изолирования плацентарных естественных клеток-киллеров из суспензии плацентарных клеток. Клетки могут быть изолированы, например, с применением методики магнитно активируемой сортировки клеток (MACS), способа для разделения частиц на основании их способности связывать магнитные гранулы (например, диаметром около 0,5-100 мкм), которые содержат одно или более специфичных антител, например антител против CD56. Множество полезных модификаций может быть выполнено на магнитных микросферах, включая ковалентное добавление антитела, которое специфично распознает конкретную молекулу поверхности клеток или гаптен. Гранулы затем смешивают с клетками, чтобы обеспечить возможность связывания. Клетки затем проходят через магнитное поле, с тем чтобы выделить клетки, имеющие конкретный маркер поверхности клеток. В одном из вариантов осуществления эти клетки могут затем быть изолированы и повторно смешаны с магнитными гранулами, соединенными с антителом против дополнительных маркеров поверхности клеток. Клетки снова проходят через магнитное поле, в результате чего выделяют клетки, которые связываются с обоими антителами. Такие клетки могут затем быть разведены в отдельных кюветах, таких как кюветы для микротитрования, в целях клональной изоляции.
5.2.7. Способы продуцирования активированных NK-клеток.
Активированные NK-клетки могут быть продуцированы из гематопоэтических клеток, которые описаны выше. В определенном варианте осуществления активированные NK-клетки продуцируют из расширенных гематопоэтических клеток, например гематопоэтических стволовых клеток и/или гематопоэтических клеток-предшественников. В конкретном варианте осуществления гематопоэтические клетки расширяются и дифференцируются непрерывно в первой среде без использования питающих клеток.
- 30 039192
Клетки затем культивируют во второй среде в присутствии питающих клеток. Такая изоляция, расширение и дифференцировка могут быть выполнены на централизованном производстве, которое предоставляет расширенные гематопоэтические клетки для доставки в целях децентрализованного расширения и дифференцировки в точки использования, например больницы, военные базы, на линию фронта и т.п.
В некоторых вариантах осуществления продуцирование активированных NK-клеток включает в себя расширение популяции гематопоэтических клеток. Во время расширения клеток множество гематопоэтических клеток в пределах гематопоэтической популяции клеток дифференцируется в NK-клетки.
В одном из вариантов осуществления процесс продуцирования популяции активированных естественных клеток-киллеров (NK) включает в себя (а) высевание популяции гематопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников в первой среде, содержащей интерлейкин-15 (IL-15) и, необязательно, один или более из фактора стволовых клеток (SCF) и интерлейкина-7 (IL-7), при этом указанный IL-15 и необязательные SCF и IL-7 не содержатся в пределах неопределенного компонента указанной среды, в результате чего популяция расширяется и множество гематопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников в пределах указанной популяции гематопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников дифференцируется в NK-клетки во время указанного расширения; и (b) расширение клеток с этапа (а) во второй среде, содержащей интерлейкин-2 (IL-2), с тем чтобы продуцировать популяцию активированных NK-клеток.
В другом варианте осуществления активированные NK-клетки в соответствии с описанным в настоящем изобретении продуцируют посредством двухэтапного процесса расширения/дифференцирования и созревания NK-клеток. Первые и вторые этапы включают в себя культивирование клеток в средах с уникальной комбинацией клеточных факторов. В определенных вариантах осуществления процесс включает в себя (а) культивирование и расширение популяции гематопоэтических клеток в первой среде, при этом множество гематопоэтических стволовых клеток или клетокпредшественников в пределах гематопоэтической популяции клеток дифференцируется в NK-клетки; и (b) расширение NK-клеток с этапа (а) во второй среде, при этом NK-клетки дополнительно расширяются и дифференцируются, и при этом NK-клетки созревают (например, становятся активированными или получают цитотоксическую активность другим способом). В определенных вариантах осуществления процесс не включает в себя промежуточных этапов между этапом (а) и (b), каких-либо дополнительных этапов культивирования до этапа (а) и/или каких-либо дополнительных этапов (например, этапа созревания) после этапа (b).
5.2.7.1. Первый этап.
В определенных вариантах осуществления процесс продуцирования активированных NK-клеток включает в себя первый этап культивирования и расширения популяции гематопоэтических клеток в первой среде, при этом множество гематопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников в пределах гематопоэтической популяции клеток дифференцируется в NK-клетки.
Вне связи с каким-либо параметром, механизмом или теорией, культивирование гематопоэтических клеток в соответствии с описанным в настоящем изобретении приводит к непрерывному расширению гематопоэтических клеток и дифференцированию NK-клеток из указанных клеток. В определенных вариантах осуществления гематопоэтические клетки, например стволовые клетки или клеткипредшественники, используемые в процессах, описанных в настоящем раскрытии, расширяются и дифференцируются на первом этапе с использованием питающего слоя. В других вариантах осуществления гематопоэтические клетки, например стволовые клетки или клетки-предшественники, расширяются и дифференцируются на первом этапе без использования питающего слоя.
Независимое от питающих клеток расширение и дифференцирование гематопоэтических клеток может происходить в любом контейнере, подходящем для культивирования и расширения клеток, например колбе, пробирке, мензурке, кювете, многолуночном планшете, мешке и т.п. В конкретном варианте осуществления независимое от питающих клеток расширение гематопоэтических клеток происходит в мешке, например гибком газопроницаемом фторуглеродном мешке для культивирования (например, от производства American Fluoroseal). В конкретном варианте осуществления контейнер, в котором расширяются гематопоэтические клетки, является подходящим для транспортировки, например, в такое место, как больница или военная зона, где расширенные NK-клетки далее расширяются и дифференцируются.
В определенных вариантах осуществления гематопоэтические клетки расширяются и дифференцируются, например, непрерывным образом, в первой культуральной среде. В одном из вариантов осуществления первая культуральная среда является не содержащей животных компонентов культуральной средой. Типовые не содержащие животных компонентов культуральные среды, полезные в процессах, описанных в настоящем раскрытии, включают, но не ограничены указанным, основную питательную среду Игла (ВМЕ), модифицированную по способу Дульбекко среду Игла (DMEM), минимальную поддерживающую среду Глазго (GMEM), модифицированную по способу Дульбекко среду Игла/питательную смесь F-12 Ham (DMEM/F-12), минимальную поддерживающую среду (MEM), среду Дульбекко, модифицированную по способу Исков (IMDM), питательную смесь F-10 Ham (F-10 Ham), питательную смесь F-12 Ham (F-12 Ham), среду RPMI-1640, среду Е Уильямса, STEMSPAN® (Cat. No.
- 31 039192
Stem Cell Technologies, Ванкувер, Канада), основную питательную среду Glycostem (GBGM®), среду
AIM-V® (Invitrogen), X-VIVO™ 10 (Lonza), X-VIVO™ 15 (Lonza), OPTMIZER (Invitrogen), STEMSPAN®
H3000 (STEMCELL Technologies), CELLGRO COMPLETE™ (Mediatech) или любые модифицированные варианты или комбинации указанного. В конкретном варианте осуществления любого из вариантов осуществления в настоящем изобретении среда не является GBGM®.
В предпочтительных вариантах осуществления первая культуральная среда содержит одну или более добавок к среде (например, питательные вещества, цитокины и/или факторы). Добавки к среде, подходящие для использования в процессах, описанных в настоящем раскрытии, включают в себя, например, но без ограничения, сыворотку, такую как человеческая сыворотка АВ, эмбриональная бычья сыворотка (FBS) или эмбриональная сыворотка теленка (FCS), витамины, бычий сывороточный альбумин (BSA), аминокислоты (например, L-глютамин), жирные кислоты (например, олеиновая кислота, линолевая кислота или пальмитиновая кислота) инсулин (например, рекомбинантный человеческий инсулин), трансферрин (насыщенный железом человеческий трансферрин), β-меркаптоэтанол, фактор стволовых клеток (SCF), лиганд Fms-подобной тирозинкиназы (Flt3-L), цитокины, такие как интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкин-7 (IL-7), интерлейкин-15 (IL-15), тромбопоэтин (Tpo), гепарин или О-ацетилкарнитин (также называемый ацетилкарнитин, О-ацетил-Ь-карнитин или OAC). В конкретном варианте осуществления культуральная среда, используемая в настоящем раскрытии, содержит человеческую сыворотку АВ. В другом конкретном варианте осуществления культуральная среда, используемая в настоящем раскрытии, содержит FBS. В другом конкретном варианте осуществления культуральная среда, используемая в настоящем раскрытии, содержит ОАС.
В определенных вариантах осуществления первая культуральная среда не содержит одного или более из колониестимулирующего фактора гранулоцитов (G-CSF), колониестимулирующего фактора гранулоцитов/макрофага (GM-CSF) интерлейкина-6 (IL-6), воспалительного белка макрофагов 1α (MIPla) или фактора, ингибирующего лейкемию (LIF).
Таким образом, в одном из аспектов в настоящем изобретении описан двухэтапный процесс продуцирования NK-клеток, в котором указанный первый этап включает в себя расширение и дифференциацию популяции гематопоэтических клеток в первой среде в отсутствие питающих клеток, при этом множество гематопоэтических клеток в пределах указанной популяции гематопоэтических клеток дифференцируется в NK-клетки во время указанного расширения, и при этом культуральная среда содержит SCF в концентрации от около 1 до около 150 нг/мл, IL-2 в концентрации от около 50 до около 1500 межд.ед./мл, IL-7 в концентрации от около 1 до около 150 нг/мл, IL-15 в концентрации от 1 до около 150 нг/мл и гепарин в концентрации от около 0,1 до около 30 межд.ед./мл, и при этом указанные SCF, IL-2, IL-7, IL-15 и гепарин не содержатся в пределах неопределенного компонента указанной среды (например, сыворотки). В определенных вариантах осуществления указанная среда содержит одно или более из O-ацетил-карнитина (также называемого ацетилкарнитин, О-ацетил-L-карнитин или ОАС) или соединения, которое воздействует на цикл ацетил-СоА в митохондрии, тиазовивина, Y-27632, pY-интегрина, ингибиторов Rho-киназы (ROCK), ингибиторов каспазы или других антиапоптотических соединений/пептидов, NOVA-RS (Sheffield Bio-Science) или других усилителей выращивания малых молекул. В определенных вариантах осуществления указанная среда содержит никотинамид. В определенных вариантах осуществления указанная среда содержит около 0,5-10 мМ ОАС. В одном из вариантов осуществления указанная среда содержит Stemspan® H3000 и/или DMEM:F12 и около 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мМ ОАС. В конкретном варианте осуществления указанная среда представляет собой GBGM®. В другом конкретном варианте осуществления среда не является GBGM®. В другом конкретном варианте осуществления указанная среда содержит Stemspan® H3000 и около 5 мМ ОАС. В другом конкретном варианте осуществления указанная среда содержит DMEM:F12 и около 5 мМ ОАС. ОАС может быть добавлен в любое время во время процессов культивирования, описанных в настоящем раскрытии. В определенных вариантах осуществления указанный ОАС добавляют к первой среде и/или во время первого этапа культивирования. В некоторых вариантах осуществления указанный ОАС добавляют к первой среде в день 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 культивирования. В конкретном варианте осуществления указанный ОАС добавляют к первой среде в день 7 первого этапа культивирования. В более конкретном варианте осуществления указанный ОАС добавляют к первой среде в день 7 культивирования, и он присутствует в течение всего первого и второго этапов культивирования. В определенных вариантах осуществления указанный ОАС добавляют ко второй среде и/или во время второго этапа культивирования. В некоторых вариантах осуществления указанный ОАС добавляют ко второй среде в день 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 культивирования.
В другом конкретном варианте осуществления указанная среда представляет собой IMDM, дополненный около 5-20% BSA, около 1-10 мкг/мл рекомбинантного человеческого инсулина, около 10-50 мкг/мл насыщенного железом человеческого трансферрина и около 10-50 мкМ β-меркаптоэтанола. В другом конкретном варианте осуществления указанная среда не содержит одного или более или не содержит ничего из IL-11, IL-3, гомеобокса-В4 (НохВ4) и/или метилцеллюлозы.
В других конкретных вариантах осуществления указанная среда содержит SCF в концентрации от
- 32 039192 около 0,1 до около 500 нг/мл; от около 5 до около 100 нг/мл или около 20 нг/мл. В других конкретных вариантах осуществления указанная среда содержит IL-2 в концентрации от около 10 до около 2000 межд.ед./мл; или от около 100 до около 500 межд.ед./мл; или около 200 межд.ед./мл. В других конкретных вариантах осуществления указанная среда содержит IL-7 в концентрации от около 0,1 до около 500 нг/мл; от около 5 до около 100 нг/мл или около 20 нг/мл. В других конкретных вариантах осуществления указанная среда содержит IL-15 в концентрации от около 0,1 до около 500 нг/мл; от около 5 до около 100 нг/мл или около 10 нг/мл. В других конкретных вариантах осуществления указанная среда содержит гепарин в концентрации от около 0,05 до около 100 ед/мл; или от около 0,5 до около 20 ед./мл; или около 1,5 ед/мл.
В еще одном конкретном варианте осуществления указанная среда дополнительно содержит лиганд Fms-подобной тирозинкиназы 3 (Flt-3L) в концентрации от около 1 до около 150 нг/мл, тромбопоэтин (Tpo) в концентрации от около 1 до около 150 нг/мл или комбинацию того и другого. В других конкретных вариантах осуществления указанная среда содержит Flt-3L в концентрации от около 0,1 до около 500 нг/мл; от около 5 до около 100 нг/мл или около 20 нг/мл. В других конкретных вариантах осуществления указанная среда содержит Tpo в концентрации от около 0,1 до около 500 нг/мл; от около 5 до около 100 нг/мл или около 20 нг/мл.
В более конкретном варианте осуществления первая культуральная среда представляет собой GBGM®, которая содержит около 20 нг/мл SCF, около 20 нг/мл IL-7, около 10 нг/мл IL-15. В другом более конкретном варианте осуществления первая культуральная среда представляет собой GBGM®, которая содержит около 20 нг/мл SCF, около 20 нг/мл Flt3-L, около 200 межд.ед./мл IL-2, около 20 нг/мл IL-7, около 10 нг/мл IL-15, около 20 нг/мл Tpo и около 1,5 ед/мл гепарина. В другом конкретном варианте осуществления указанная первая культуральная среда дополнительно содержит 10% человеческую сыворотку (например, человеческую сыворотку АВ) или эмбриональную сыворотку (например, FBS). В конкретном варианте осуществления любого из вариантов осуществления в настоящем изобретении культуральная среда не является GBGM®.
В другом варианте осуществления гематопоэтические клетки расширяются посредством культивирования указанных клеток, например, в указанной первой среде, в контакте с иммуномодулирующим соединением, например ингибирующим TNF-α соединением, в течение периода времени и в количестве, являющимися достаточными для вызывания детектируемого увеличения пролиферации гематопоэтических клеток за данный период времени, по сравнению с эквивалентным количеством гематопоэтических клеток, с которыми не контактирует иммуномодулирующее соединение. См., например, публикацию заявки на патент США № 2003/0235909, изобретение которой включено в настоящее изобретение посредством ссылки во всей его полноте. В определенных вариантах осуществления иммуномодулирующее соединение представляет собой аминозамещенный изоиндолин. В предпочтительном варианте осуществления иммуномодулирующее соединение представляет собой 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)-пиперидин-2,6-дион; 3 -(4'аминоизолиндолин-1 '-он)-1 -пиперидин-2,6-дион; 4-(амино)-2-(2,6диоксо(3 -пиперидил))-изоиндолин-1,3-дион или 4-амино-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)изоиндол-1,3 дион. В другом предпочтительном варианте осуществления иммуномодулирующее соединение представляет собой помалидомид или леналидомид.
Конкретные примеры иммуномодулирующих соединений включают, но не ограничены указанным, циано- и карбокси-производные замещенных стиролов, такие как раскрытые в патенте США № 5929117; 1-оксо-2-(2,6-диоксо-3-фторпиперидин-3-ил)изоиндолины и 1,3-диоксо-2-(2,6-диоксо-3-фторпиперидин3-ил)изоиндолины, такие как описанные в патенте США № 5874448; тетра-замещенные 2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-охоизоиндолины, описанные в патенте США № 5798368; 1-оксо и 1,3-диоксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)изоиндолины (например, 4-метил-производные талидомида и ЕМ-12), включая раскрытые в патенте США № 5635517, но не ограничиваясь ими; и класс неполипептидных циклических амидов, раскрытых в патентах США № 5698579 и 5877200; аналоги и производные талидомида, включая продукты гидролиза, метаболиты, производные и предшественники талидомида, такие как описанные в патентах США № 5593990, 5629327 и 6071948 Д'Амато; аминоталидомид, а также аналоги, продукты гидролиза, метаболиты, производные и предшественники аминоталидомида, и замещенные 2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)фталимиды и замещенные 2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1охоизоиндолы, такие как описанные в патентах США № 6281230 и 6316471; изоиндол-имидные соединения, такие как описанные в заявке на патент США № 09/972487, поданной 5 октября 2001 г., заявке на патент США № 10/032286, поданной 21 декабря 2001 г., и международной заявке № PCT/US01/50401 (международная публикация № WO 02/059106). Каждый из патентов и заявок на патент, идентифицированных в настоящем раскрытии, включается в настоящее изобретение посредством ссылки во всей его полноте. Иммуномодулирующие соединения не включают талидомид.
В другом варианте осуществления иммуномодулирующие соединения включают, но не ограничены указанным, 1-оксо- и 1,3-диоксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)изоиндолины, аминозамещенные в бензольном кольце, как описано в патенте США № 5635517, который включен в настоящее изобретение посредством ссылки. Эти соединения имеют структуру
- 33 039192
где один из X и Y представляет собой С=О;
другие из X и Y представляют собой С=О или CH2;
R2 представляет собой водород или нижний алкил, или фармацевтически приемлемую соль, гидрат, сольват, клатрат, зеркальный изомер, диастереоизомер, рацемат или смесь стереоизомеров указанного.
В другом варианте осуществления конкретные иммуномодулирующие соединения включают, но не ограничены указанным:
-оксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3 -ил)-4-аминоизоиндолин;
-оксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3 -ил)-5 -аминоизоиндолин;
-оксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3 -ил)-6-аминоизоиндолин;
-оксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3 -ил)-7-аминоизоиндолин;
1,3-диоксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-4-аминоизоиндолин и
1,3-диоксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-5-аминоизоиндолин.
Другие конкретные иммуномодулирующие соединения принадлежат к классу замещенных 2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)фталимидов и замещенных 2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1оксоизоиндолов, такие как описанные в патентах США № 6281230; 6316471; 6335349; и 6476052 и международной заявке на патент № PCT/US97/13375 (международная публикация WO 98/03502), каждый из которых включается в настоящее изобретение посредством ссылки. Соединения, представляющие данный класс, имеют формулы:
где R1 представляет собой водород или метил.
В отдельном варианте осуществления изобретение охватывает использование энантиомерно чистых форм (например, оптически чистых (R) или (S) зеркальных изомеров) этих соединений.
Тем не менее другие конкретные иммуномодулирующие соединения принадлежат к классу изоиндол-имидов, раскрытых в заявке на патент США № 10/032286 и 09/972487 и международной заявке № PCT/US01/50401 (международная публикация WO 02/059106), каждая из которых включена в настоящее изобретение посредством ссылки. В одном представительном варианте осуществления указанное иммуномодулирующее соединение представляет собой соединение, имеющее структуру
где один из X и Y представляет собой С=О и другой представляет собой CH2 или С=О;
R1 представляет собой Н, (C1-C8)алкил, (С3-С7)циклоалкил, (С2-С8)алкенил, (С2-С8)алкинил, бензил, арил, (С0-С4)алкил(C1-С6)гетероциклоалкил, (С0-С4)алкил(С2-С5)гетероарил, C(O)R3, C(S)R3, C(O)OR4, (C1-C8)алкил-N(R6)2, (C1-C8)алкил-OR5, (C1-С8)алкил-С(O)OR5, C(O)NHR3, C(S)NHR3, C(O)NR3R3', C(S)NR3R3' или (C1-C8)алкил-O(CO)R5;
R2 представляет собой H, F, бензил, (C1-C8)алкил, (С2-C8)алкенил или (C2-C8) алкинил;
R3 и R3' независимо представляют собой (C1-C8)алкил, (С3-С7)циклоалкил, (С2-С8)алкенил, (С2-С8)алкинил, бензил, арил, (Со-С4)алкил(C1-С6)гетероциклоалкил, (С0-С4)алкил(С2-С5)гетероарил,
- 34 039192 (Сo-С8)алкил-N(R6)2, (C1-C8)алкил-OR5, (C1-C8)алкил-С(О)OR5, (C гОалкил-ОК'())IR или С (O)OR5;
R4 представляет собой (С1-С8)алкил, (С2-С8)алкенил, (С2-С8)алкинил, (C1-C4)алкил-OR5, бензил, арил, (С0-С4)алкил- (С1-С6)гетероциклоалкил или (С0-С4)алкил(С2-С5)гетероарил;
R5 представляет собой (С1-С8)алкил, (С2-С8)алкенил, (С2-С8)алкинил, бензил, арил или (С2-С5)гетероарил;
каждый из R6 независимо представляет собой Н, (С1-С8)алкил, (С2-С8)алкенил, (С2-С8)алкинил, бензил, арил, (С2-С5)гетероарил или (С0-С8)алкил-С(О)O-R5 или группы R6 могут соединяться с формированием гетероциклоалкильной группы;
n равно 0 или 1;
* представляет хирально-углеродистый центр;
или фармацевтически приемлемую соль, гидрат, сольват, клатрат, зеркальный изомер, диастереои зомер, рацемат или смесь стереоизомеров указанного.
В конкретных соединениях, имеющих приведенную выше формулу, когда n равно 0, то R1 представляет собой (С3-С7)циклоалкил, (С2-С8)алкенил, (С2-С8)алкинил, бензил, арил, (С0-С4)алкил(С1-С6)гетероциклоалкил, (С0-С4)алкил(С2-С5)гетероарил, C(O)R3, G(O)OR4, (C1-C8)алкилN(R6)2, (C1-C8)алкил-OR5, (C1-C8)алкил-C(O)OR5, C(S)NHR3 или (C1-C8)алкил-O(СО)R5;
R2 представляет собой Н или (С1-С8)алкил;
R3 представляет собой (С1-С8)алкил, (С3-С7)циклоалкил, (С2-С8)алкенил, (С2-С8)алкинил, бензил, арил, (С0-С4)алкил(С1-С6)гетероциклоалкил, (С0-С4)алкил(С2-С5)гетероарил, (С5-С8)алкил-N(R6)2, (Сo-С8)алкил-NH-C(О)O-R5; (C1-C8)алкил-OR5, (C1-C8)алкил-C(O)OR5, (C1-C8)алкил-O(CO)R5 или С(O)OR5 и другие переменные имеют те же самые определения.
В других конкретных соединениях, имеющих приведенную выше формулу, R2 представляет собой Н или (С1-С4)алкил.
В других конкретных соединениях, имеющих приведенную выше формулу, R1 представляет собой (С1-С8)алкил или бензил.
В других конкретных соединениях, имеющих приведенную выше формулу, R1 представляет собой _сн О
Н, (С1-С8)алкил, бензил, CH2OCH3, CH2CH2OCH3 или 2 .
В другом варианте осуществления соединений, имеющих приведенную выше формулу, R1 представляет собой
R7 R7
-СН2^ , -сн2-^ ог-снД^^, где Q представляет собой О или С и каждое из обозначений R7 независимо представляет собой Н, (C1-C8)алкил, бензил, CH2OCH3 или CH2CH2OCH3.
В других конкретных соединениях, имеющих приведенную выше формулу, R1 представляет собой C(O)R3.
В других конкретных соединениях, имеющих приведенную выше формулу, R3 представляет собой (С0-С4)алкил(С2-С5)гетероарил, (C1-C8)алкил, арил или (С0-С4)алкил-OR5.
В других конкретных соединениях, имеющих приведенную выше формулу, гетероарил представляет собой пиридил, фурил или тиенил.
В других конкретных соединениях, имеющих приведенную выше формулу, R1 представляет собой С (O)OR4.
В других конкретных соединениях, имеющих приведенную выше формулу, HC(O)NHC(O) может быть заменен на (C1-C4)алкил, арил или бензил.
В другом варианте осуществления указанное иммуномодулирующее соединение представляет собой соединение, имеющее структуру
где один из X и Y представляет собой С=O и другой представляет собой CH2 или С=O;
R представляет собой Н или CH2OCOR';
(i) каждый из R1, R2, R3 или R4, независимо от других, представляет собой гало, алкил из 1-4 атомов углерода или алкокси из 1 -4 атомов углерода или (ii) один из R1, R2, R3 или R4 представляет собой нитро или -NHR5, и остальные из R1, R2, R3 или R4 представляют собой водород;
R5 представляет собой водород или алкил с 1-8 углеродами;
R6 представляет собой водород, алкил с 1-8 атомами углерода, бензо, хлоро или фторо;
R' представляет собой R7-CHR10-N (R8R9);
R7 представляет собой m-фенилен или р-фенилен или - (CnH2n), где n имеет значение от 0 до 4;
- 35 039192 каждый из R8 и R9, взятые независимо друг от друга, представляет собой водород или алкил с 1-8 атомами углерода или R8 и R9, взятые вместе, представляют собой тетраметилен, циклопентан, циклогексан или -CH2CH2X1CH2CH2-, где X1 представляет собой -O-, -S- или -NH-;
R10 представляет собой водород, алкил с 8 атомами углерода или фенил;
* представляет хирально-углеродистый центр;
или фармацевтически приемлемую соль, гидрат, сольват, клатрат, зеркальный изомер, диастереоизомер, рацемат или смесь стереоизомеров указанного.
В конкретном варианте осуществления расширение гематопоэтических клеток выполняют в IMDM, дополненной 20% BITS (бычий сывороточный альбумин, рекомбинантный человеческий инсулин и трансферрин), SCF, лигандом Flt-3, IL-3 и 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-дионом (10 мкМ 0,05% DMSO). В более конкретном варианте осуществления около 5х107 гематопоэтических клеток, например клеток CD34+, расширяются в среде до количества от около 5х1010 до около 5х1012 клеток, которые ресуспендируют в 100 мл IMDM, с тем чтобы продуцировать популяцию расширенных гематопоэтических клеток. Популяция расширенных гематопоэтических клеток предпочтительно хранится замороженной в целях облегчения пересылки.
В различных конкретных вариантах осуществления по меньшей мере 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% гематопоэтических клеток дифференцируются в клетки NK.
В определенных вариантах осуществления процесс расширения и дифференцирования гематопоэтических клеток, в соответствии с описанным в настоящем раскрытии, включает в себя поддержание популяции клеток, содержащей указанные гематопоэтические клетки в количестве между около 2х104 и около 2х105 клеток/мл во время расширения и дифференцирования. В определенных других вариантах осуществления процесс расширения и дифференцирования гематопоэтических клеток, в соответствии с описанным в настоящем раскрытии, включает в себя поддержание популяции клеток, содержащей указанные гематопоэтические клетки в количестве не более чем около 1х105 клеток/мл.
Время для расширения и дифференцирования гематопоэтических клеток в NK-клетки может составлять, например, от около 3 до около 120 дней. В одном из вариантов осуществления время дифференцирования составляет от около 7 до около 75 дней. В другом варианте осуществления время дифференцирования составляет от около 14 до около 50 дней. В конкретном варианте осуществления время дифференцирования составляет от около 21 до около 28 дней.
5.2.7.2. Второй этап.
Гематопоэтические клетки, например стволовые клетки или клетки-предшественники, и естественные клетки-киллеры, полученные на первом этапе, далее расширяются и дифференцируются на втором этапе, например, без использования питающего слоя или в присутствии питающих клеток. Культивирование клеток в соответствии с описанным в настоящем изобретении приводит к непрерывному расширению, дифференцированию, а также созреванию NK-клеток с первого этапа. Во втором этапе NK-клетки расширяются, дифференцируются и созревают непрерывным образом во второй культуральной среде, например, содержащей другие цитокины и/или биоактивные молекулы по сравнению с указанной первой средой. В определенных вариантах осуществления вторая культуральная среда представляет собой не содержащую животных компонентов среду. Типовые не содержащие животных компонентов клеточные культуральные среды описываются в раскрытии.
Таким образом, в одном из аспектов в настоящем изобретении описан процесс продуцирования активированных NK-клеток, включающий в себя расширение NK-клеток с первого этапа, описанного выше, во второй среде в присутствии питающих клеток и в контакте с интерлейкином-2 (IL-2). В конкретных вариантах осуществления указанная вторая среда содержит питательную среду роста клеток, содержащую IL-2, например от 10 до 1000 межд.ед./мл, и одно или более из следующего: человеческая сыворотка (например, человеческая сыворотка АВ), эмбриональная бычья сыворотка (FBS) или эмбриональная сыворотка теленка (FCS), например, 5-15% FCS об./об.; трансферрин, например, от 10 до 50 мкг/мл; инсулин, например, от 5 до 20 мкг/мл; этаноламин, например, от 5х10-4 до 5х10-5 М; олеиновая кислота, например, от 0,1 до 5 мкг/мл; линолевая кислота, например, от 0,1 до 5 мкг/мл; пальмитиновая кислота, например, от 0,05 до 2 мкг/мл; бычий сывороточный альбумин (BSA), например, от 1 до 5 мкг/мл и/или фитогемагглютинин, например, от 0,01 до 1 мкг/мл. В более конкретном варианте осуществления указанная вторая среда содержит питательную среду роста клеток, содержащую FBS или FCS, например 10% FCS об./об., IL-2, трансферрин, инсулин, этаноламин, олеиновую кислоту, линолевую кислоту, пальмитиновую кислоту, бычий сывороточный альбумин (BSA) и фитогемагглютинин. В более конкретном варианте осуществления указанная вторая среда содержит среду Дульбекко, модифицированную по способу Исков (IMDM), 10% FBS или FCS, 400 межд.ед. IL-2, 35 мкг/мл трансферрина, 5 мкг/мл инсулина, 2х10-5 М этаноламина, 1 мкг/мл олеиновой кислоты, 1 мкг/мл линолевой кислоты (Sigma-Aldrich), 0,2 мкг/мл пальмитиновой кислоты (Sigma-Aldrich), 2,5 мкг/мл BSA (Sigma-Aldrich) и 0,1 мкг/мл фитогемагглютинина.
В определенных вариантах осуществления вторая среда не содержит один или более из колониестимулирующего фактора гранулоцитов (G-CSF), колониестимулирующего фактора гранулоци- 36 039192 тов/макрофага (GM-CSF), интерлейкина-6 (IL-6), воспалительного белка макрофагов 1a (ΜΙΡΙα) или фактора, ингибирующего лейкемию (LIF).
Питающие клетки, когда они используются, могут быть основаны на клетках различных типов. Примеры этих типов клеток включают в себя, без ограничения, фибробласты, стволовые клетки (например, прилипающие к культуре тканей плацентарные стволовые клетки), клетки крови (например, мононуклеары периферической крови (РВМС)) и раковые клетки (например, клетки хронической миелогенной лейкемии (CML), такие как K562). В конкретном варианте осуществления указанное культивирование в указанной второй среде включает в себя культивирование с использованием питающих клеток, например клеток K562 и/или мононуклеаров периферической крови (РВМС), например, в то время, когда клетки запускаются в указанную вторую среду или через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дней после этого. В определенных вариантах осуществления питающие клетки, необязательно, являются клетками вида, отличного от вида клеток, которые они поддерживают. Например, человеческие NK-клетки могут поддерживаться мышиными эмбриональными фибробластами (из первичной культуры или теломеризованной линии).
В определенных вариантах осуществления питающие клетки, необязательно, деактивированные посредством облучения (например, γ-облучения) или обработки антимитотическим средством, таким как митомицин С, чтобы препятствовать тому, чтобы они переросли клетки, которые они поддерживают, но при этом допускать возможность синтеза важных факторов, которые поддерживают NK-клетки. Например, клетки могут быть облучены в такой дозе, чтобы ингибировать пролиферацию, но допустить возможность синтеза важных факторов, которые поддерживают человеческие эмбриональные стволовые клетки (hES) (гамма облучение около 4000 радов).
Культивирование NK-клеток для второго этапа может происходить в любом контейнере, совместимом с культивированием и расширением клеток, например колбе, пробирке, мензурке, кювете, многолуночном планшете, мешке и т.п. В конкретном варианте осуществления зависящее от питающих клеток культивирование NK-клеток происходит в резервуаре, например гибком газопроницаемом фторуглеродном мешке для культивирования (например, производства American Fluoroseal). В конкретном варианте осуществления контейнер, в которой культивируются NK-клетки, является подходящим для пересылки, например, в такое место, как больница или военная зона, и в котором расширенные NK-клетки далее расширяются, дифференцируются и созревают.
Дифференцирование клеток с этапа 1 в активированные NK-клетки может быть оценено путем детектирования специфичных для NK-клеток маркеров, например, посредством проточной цитометрии. Специфичные для NK-клеток маркеры включают, но не ограничены указанным, CD56, CD94, CD117 и NKp46. Дифференцировка может также быть оценена по морфологическим характеристикам NK-клеток, например, большой размер, высокая активность синтеза белков в избыточном эндоплазматическом ретикулуме (ER) и/или с предварительно сформированными гранулами.
Время для расширения и дифференцирования клеток с этапа 1 в активированные NK-клетки может составлять, например, от около 3 около до 120 дней. В одном из вариантов осуществления время дифференцирования составляет от около 7 до около 75 дней. В другом варианте осуществления время дифференцирования составляет от около 14 до около 50 дней. В конкретном варианте осуществления время дифференцирования составляет от около 10 до около 21 дня.
Дифференцирование гематопоэтических клеток в NK-клетки может быть оценено путем обнаружения маркеров, например, CD56, CD94, CD117, NKG2D, DNAM-1 и NKp46, например, посредством проточной цитометрии. Дифференцирование может также быть оценено по морфологическим характеристикам NK-клеток, например, большой размер, высокая активность синтеза белков в избыточном эндоплазматическом ретикулуме (ER) и/или с предварительно сформированными гранулами. Созревание NK-клеток (например, активированных NK-клеток) может быть оценено путем обнаружения одного или более функционально соответствующих маркеров, например, CD94, CD161, NKp44, DNAM-1, 2B4, NKp46, CD94, KIR и семейства NKG2 активирующих рецепторов (например, NKG2D). Созревание NKклеток (например, активированных NK-клеток) может также быть оценено путем обнаружения конкретных маркеров в течение различных стадий развития. Например, в одном из вариантов осуществления, клетки pro-NK являются CD34+, CD45RA+, CD10+, CD117- и/или CD161-. В другом варианте осуществления клетки pre-NK являются CD34+, CD45RA+, CD10-, CD117+ и/или CD161. В другом варианте осуществления незрелые NK-клетки являются CD34-, CD117+, CD161+, NKp46- и/или CD94/NKG2A-. В другом варианте осуществления, CD56bright NK-клетки являются CD117+, NKp46+, CD94/NKG2A+, CD16- и/или KIR+/-. В другом варианте осуществления, CD56dim NK-клетки являются CD117-, NKp46+, CD94/NKG2A+, CD16+ и/или KIR+. В конкретном варианте осуществления созревание NK-клеток (например, активированных NK-клеток) определяют по проценту NK-клеток (например, активированных NK-клеток), которые являются CD161-, CD94+ и/или NKp46+. В более конкретном варианте осуществления по меньшей мере 10, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65 или 70% зрелых NK-клеток (например, активированных NKклеток) являются NKp46+. В другом более конкретном варианте осуществления по меньшей мере 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50% зрелых NK-клеток (например, активированных NK-клеток) являются CD94+. В
- 37 039192 другом более конкретном варианте осуществления по меньшей мере 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50% зрелых NK-клеток (например, активированных NK-клеток) являются CD161-.
В определенных вариантах осуществления дифференцирование гематопоэтических клеток в NK-клетки оценивают путем детектирования уровня экспрессии, например, CD3, CD7 или CD 127, CD10, CD14, CD15, CD16, CD33, CD34, CD56, CD94, CD117, CD161, NKp44, NKp46, NKG2D, DNAM-1, 2B4 или TO-PRO-3 с использованием, например, антител к одному или более из этих клеточных маркеров. Такие антитела могут быть конъюгированы с детектируемой меткой, например, такой как флуоресцентная метка, например FITC, R-PE, PerCP, PerCP-Cy5.5, APC, APC-Cy7 или APC-H7.
5.2.8. Способы продуцирования клеток TSPNK.
Клетки TSPNK могут быть продуцированы из гематопоэтических клеток, которые описаны выше. В определенном варианте осуществления клетки TSPNK продуцируют из расширенных гематопоэтических клеток, например гематопоэтических стволовых клеток и/или гематопоэтических клетокпредшественников.
В одном из вариантов осуществления клетки TSPNK продуцируют посредством трехэтапного процесса. В определенных вариантах осуществления процесс расширения и дифференцировки гематопоэтических клеток, в соответствии с описанным в настоящем раскрытии, для продуцирования популяции клеток-предшественников NK или популяции NK-клеток согласно трехэтапному процессу, описанному в настоящем раскрытии, включает в себя поддержание популяции клеток, содержащей указанные гематопоэтические клетки в количестве между около 2х104 и около 6x106 клеток/мл, например, между около 2х104 и около 2x105 клеток/мл, во время расширения и дифференцировки. В определенных вариантах осуществления процесс расширения и дифференцировки гематопоэтических клеток, в соответствии с описанным в настоящем раскрытии, включает в себя поддержание популяции клеток, содержащей указанные гематопоэтические клетки в количестве не более чем около 1x105 клеток/мл. В определенных других вариантах осуществления процесс расширения и дифференцировки гематопоэтических клеток, в соответствии с описанным в настоящем раскрытии, включает в себя поддержание популяции клеток, содержащей указанные гематопоэтические клетки в количестве не более чем около 1x105 клеток/мл, 2x105 клеток/мл, 3x105 клеток/мл, 4x105 клеток/мл, 5x105 клеток/мл, 6x105 клеток/мл, 7x105 клеток/мл,
8x105 клеток/мл, 9x105 клеток/мл, 1x106 клеток/мл, 2x106 клеток/мл, 3x106 клеток/мл, 4x106 клеток/мл,
5x106 клеток/мл, 6x106 клеток/мл, 7x106 клеток/мл, 8x106 клеток/мл или 9x106 клеток/мл.
В определенном варианте осуществления трехэтапный процесс включает в себя первый этап (этап 1), включающий в себя культивирование гематопоэтических стволовых клеток или клетокпредшественников, например CD34+ стволовых клеток или клеток-предшественников, в первой среде в течение заданного периода времени, например, в соответствии с описанным в настоящем раскрытии. В определенных вариантах осуществления первая среда содержит один или более факторов, которые вызывают расширение гематопоэтических клеток-предшественников, один или более факторов для инициирования лимфоидного дифференцирования в пределах расширяющейся популяции гематопоэтической клеток-предшественников и/или один или более факторов, которые имитируют стромальную питающую поддержку. В определенных вариантах осуществления первая среда содержит один или более цитокинов (например, Flt3L, TPO, SCF). В определенных вариантах осуществления первая среда содержит IL-7. В определенных вариантах осуществления первая среда содержит суб-нг/мл концентрации GCSF, IL-6 и/или GM-CSF. В конкретном варианте осуществления первая среда содержит цитокины Flt3L, TPO и SCF, IL-7 и суб-нг/мл концентрации G-CSF, IL-6 и GM-CSF. В конкретных вариантах осуществления в первой среде CD34+ клетки подвергаются расширению в линиеспецифические клеткипредшественники, которые затем становятся CD34-. В определенных вариантах осуществления это расширение происходит быстро. В определенных вариантах осуществления клетки CD34- составляют более чем 50%, более чем 55%, более чем 60%, более чем 65%, более чем 70%, более чем 75%, более чем 80% или более от общей численности популяции в конце этапа 1. В более конкретном варианте осуществления, клетки CD34- составляют более чем 80% общей численности популяции в конце этапа 1.
В определенных вариантах осуществления далее на этапе 2 указанные клетки культивируют во второй среде в течение заданного периода времени, например, в соответствии с описанным в настоящем раскрытии. В определенных вариантах осуществления вторая среда содержит факторы, которые могут способствовать дальнейшему расширению лимфоидных клеток-предшественников, факторы, которые могут внести вклад в развитие клеточной линии NK, и/или факторы, которые имитируют стромальную питающую поддержку. В определенных вариантах осуществления вторая среда содержит один или более цитокинов (например, Flt3L, SCF, IL-15 и/или IL-7). В определенных вариантах осуществления вторая среда содержит IL-17 и/или IL-15. В определенных вариантах осуществления вторая среда содержит субнг/мл концентрации G-CSF, IL-6 и/или GM-CSF. В конкретном варианте осуществления вторая среда содержит цитокины Flt3L, SCF, IL-15 и IL-7, IL-17 и IL-15 и суб-нг/мл концентрации G-CSF, IL-6 и GM-CSF.
В определенных вариантах осуществления далее на этапе 3 указанные клетки культивируют в третьей среде в течение заданного периода времени, например, в соответствии с описанным в настоящем
- 38 039192 раскрытии. В определенных вариантах осуществления третья среда содержит факторы, которые вызывают дифференцировку и функциональную активацию клеток CD56+CD3-CD16-, которые могут являться клетками-предшественниками NK. В одном из вариантов осуществления такие факторы включают в себя IL2 и IL12 и IL18, IL12 и IL15, IL12 и IL18, IL2 и IL12 и IL15 и IL18 или IL2 и IL15 и IL18. В определенных вариантах осуществления третья среда содержит факторы, которые имитируют стромальную питающую поддержку. В определенных вариантах осуществления третья среда содержит один или более цитокинов (например, SCF, IL-15, IL-7, IL-2). В определенных вариантах осуществления третья среда содержит суб-нг/мл концентрации G-CSF, IL-6 и/или GM-CSF. В конкретном варианте осуществления третья среда содержит цитокины SCF, IL-15, IL-7, IL-2 и суб-нг/мл концентрации G-CSF, IL-6 и GM-CSF.
В конкретных вариантах осуществления трехэтапный процесс применяют для продуцирования популяций NK-клеток (например, зрелых клеток NK). В конкретных вариантах осуществления трехэтапный процесс применяют для продуцирования популяций клеток-предшественников NK. В определенных вариантах осуществления трехэтапный процесс проводят в отсутствие клеток стромальной питающей поддержки. В определенных вариантах осуществления трехэтапный процесс проводят в отсутствие добавленных экзогенным образом стероидов (например, кортизон, гидрокортизон или их производные).
В определенных вариантах осуществления первая среда, используемая в трехэтапных процессах, описанных в настоящем раскрытии, может содержать любой из компонентов первой или второй среды, описанных в разделе 5.2.4 в отношении двухэтапного способа. В определенных вариантах осуществления указанная первая среда, используемая в трехступенчатом процессе, включает питательную среду, содержащую одно или более из следующего: животная сыворотка, например человеческая сыворотка (например, человеческая сыворотка АВ), эмбриональная бычья сыворотка (FBS) или эмбриональная сыворотка теленка (FCS), например, от 1 до 20% об./об. сыворотки, например от 5 до 20% об./об. сыворотки; фактор стволовых клеток (SCF), например, от 1 до 50 нг/мл SCF; лиганд FMS-подобной тирозинкиназы 3 (лиганд Flt-3), например, от 1 до 30 нг/мл лиганда Flt-3; интерлейкин-7 (IL-7), например, от 1 до 50 нг/мл IL-7; тромбопоэтин (ТРО), например, от 1 до 100 нг/мл, например от 1 до 50 нг/мл ТРО; интерлейкин-2 (IL- 2), например, до 2000 межд.ед./мл, например от 50 до 500 межд.ед./мл; и/или гепарин, например легковесный гепарин (LWH), например, от 0,1 до 10 межд.ед./мл гепарина. В определенных вариантах осуществления указанная первая среда дополнительно содержит одно или более из следующего: антибиотики, такие как гентамицин; антиоксиданты, такие как трансферрин, инсулин и/или бетамеркаптоэтанол; селенистокислый натрий; аскорбиновая кислота; этаноламин и глютатион. В определенных вариантах осуществления указанная первая среда дополнительно содержит ОАС. В определенных вариантах осуществления указанная первая среда дополнительно содержит интерлейкин-6 (IL-6), фактор, ингибирующий лейкемию (LIF), G-CSF, GM-CSF и/или MIP-1a. В определенных вариантах осуществления указанная первая среда дополнительно содержит один или более антиоксидантов, например голо-трансферрин, раствор инсулина, восстановленный глутатион, селенистокислый натрий, этаноламин, аскорбиновую кислоту, b-меркаптоэтанол, О-ацетил-Ь-карнитин, N-ацетилцистеин, (+/-) липоевую кислоту, никотинамид или резвератрол. В определенных вариантах осуществления среда, которая обеспечивает основу для первой среды, является культуральной средой клеток/тканей, известной специалистам в данной области техники, например, коммерчески доступной культуральной средой клеток/тканей, такой как GBGM®, AIM-V®, X-VIVO™ 10, X-VIVO™ 15, OPTMIZER, STEMSPAN® H3000, CELLGRO COMPLETE™, DMEM: Ham's F12 (F12) (например, в соотношении 2:1 или DMEM с высоким содержанием глюкозы или низким содержанием глюкозы), улучшенная DMEM (Gibco), EL08-1D2, Myelocult™ H5100, IMDM и/или RPMI-1640; или средой, которая содержит компоненты, обычно включаемые в известные культуральные среды клеток/тканей, такие как компоненты, включенные в GBGM®, AIM-V®, X-VIVOTM 10, X-VIVOTM 15, OPTMIZER, STEMSPAN® H3000, CELLGRO COMPLETETM, DMEM:Ham's F12 (F12) (например, в соотношении 2:1 или DMEM с высоким содержанием глюкозы или низким содержанием глюкозы), улучшенную DMEM (Gibco), EL08-1D2, Myelocult™ H5100, IMDM и/или RPMI-1640. В конкретном варианте осуществления любого из вариантов осуществления в настоящем изобретении среда не является GBGM®.
В определенных вариантах осуществления вторая среда, используемая в трехэтапных процессах, описанных в настоящем раскрытии, может содержать любой из компонентов первой или второй среды, описанных в разделе 5.2.4 в отношении двухэтапного способа. В определенных вариантах осуществления указанная вторая среда, используемая в трехступенчатом процессе, включает питательную среду, содержащую одно или более из следующего: животная сыворотка, например человеческая сыворотка (например, человеческая сыворотка АВ), FBS или FCS, например, от 5 до 20% об./об. сыворотки; SCF, например, от 1 до 50 нг/мл SCF; лиганд Flt-3, например, от 1 до 30 нг/мл лиганда Flt-3; IL-7, например, от 1 до 50 нг/мл IL-7; интерлейкин-15 (IL-15), например, от 1 до 50 нг/мл IL-15 и/или гепарин, например LWH, например, от 0,1 до 10 межд.ед./мл гепарина. В определенных вариантах осуществления указанная вторая среда дополнительно содержит один или более следующего: антибиотики, такие как гентамицин; антиоксиданты, такие как трансферрин, инсулин и/или бета-меркаптоэтанол; селенистокислый натрий; аскорбиновая кислота; этаноламин; и глютатион. В определенных вариантах осуществления указанная
- 39 039192 вторая среда дополнительно содержит ОАС. В определенных вариантах осуществления указанная вторая среда дополнительно содержит интерлейкин-6 (IL-6), фактор, ингибирующий лейкемию (LIF), G-CSF, GM-CSF и/или MIP-1a. В определенных вариантах осуществления указанная вторая среда дополнительно содержит один или более антиоксидантов, например голо-трансферрин, раствор инсулина, восстановленный глутатион, селенистокислый натрий, этаноламин, аскорбиновую кислоту, b-меркаптоэтанол, О-ацетил-Е-карнитин, N-ацетилцистеин, (+/-) липоевую кислоту, никотинамид или резвератрол. В определенных вариантах осуществления среда, которая обеспечивает основу для второй среды, является культуральной средой клеток/тканей, известной специалистам в данной области техники, например коммерчески доступной культуральной средой клеток/тканей, такой как GBGM®, AIM-V®, X-VIVO™ 10, X-VIVO™ 15, OPTMIZER, STEMSPAN® H3000, CELLGRO COMPLETE™, DMEM: Ham's F12 (F12) (например, в соотношении 2:1 или DMEM с высоким содержанием глюкозы или низким содержанием глюкозы), улучшенная DMEM (Gibco), EL08-1D2, Myelocult™ H5100, IMDM и/или RPMI-1640; или средой, которая содержит компоненты, обычно включаемые в известные культуральные среды клеток/тканей, такие как компоненты, включенные в GBGM®, AIM-V®, X-VIVOTM 10, X-VIVOTM 15, OPTMIZER, STEMSPAN® H3000, CELLGRO COMPLETETM, DMEM:Ham's F12 (F12) (например, в соотношении 2:1 или DMEM с высоким содержанием глюкозы или низким содержанием глюкозы), улучшенную DMEM (Gibco), EL08-1D2, Myelocult™ H5100, IMDM и/или RPMI-1640. В конкретном варианте осуществления любого из вариантов осуществления в настоящем изобретении среда не является GBGM®.
В определенных вариантах осуществления третья среда, используемая в трехэтапных процессах, описанных в настоящем раскрытии, может содержать любой из компонентов первой или второй культуральной среды, описанных в разделе 5.2.4 в отношении двухэтапного способа. В определенных вариантах осуществления указанная третья среда, используемая в трехэтапном процессе, включает питательную среду, содержащую одно или более из следующего: животная сыворотка, например, человеческая сыворотка (например, человеческая сыворотка АВ), FBS или FCS, например, от 5 до 20% об./об. сыворотки; SCF, например, от 1 до 50 нг/мл SCF; лиганд Flt-3, например, от 1 до 30 нг/мл лиганда Flt-3; IL-7, например, от 1 до 50 нг/мл IL-7; IL-15, например, от 1 до 50 нг/мл IL-15 и интерлейкин-2 (IL-2), например, в диапазоне от 0 до 2000 межд.ед./мл, например от 50 до 1000 межд.ед./мл IL-2. В определенных вариантах осуществления указанная третья среда дополнительно содержит один или более следующего: антибиотики, такие как гентамицин; антиоксиданты, такие как трансферрин инсулин и/или бета-меркаптоэтанол; селенистокислый натрий; аскорбиновая кислота; этаноламин и глютатион. В определенных вариантах осуществления указанная третья среда дополнительно содержит ОАС. В определенных вариантах осуществления указанная вторая среда дополнительно содержит один или более следующего: антибиотики, такие как гентамицин; антиоксиданты, такие как трансферрин, инсулин и/или бета-меркаптоэтанол; селенистокислый натрий; аскорбиновая кислота; этаноламин и глютатион. В определенных вариантах осуществления указанная вторая среда дополнительно содержит ОАС. В определенных вариантах осуществления указанная третья среда дополнительно содержит интерлейкин-6 (IL-6), фактор, ингибирующий лейкемию (LIF), G-CSF, GM-CSF и/или MIP-1a. В определенных вариантах осуществления указанная третья среда дополнительно содержит один или более антиоксидантов, например, голо-трансферрин, раствор инсулина, восстановленный глутатион, селенистокислый натрий, этаноламин, аскорбиновую кислоту, b-меркаптоэтанол, О-ацетил-L-карнитин, N-ацетилцистеин, (+/-) липоевую кислоту, никотинамид или резвератрол. В определенных вариантах осуществления среда, которая обеспечивает основу для третьей среды, является культуральной средой клеток/тканей, известной специалистам в данной области техники, например, коммерчески доступной культуральной средой клеток/тканей, такой как GBGM®, AIM-V®, X-VIVO™ 10, X-VIVO™ 15, OPTMIZER, STEMSPAN® H3000, CELLGRO COMPLETE™, DMEM: Ham's F12 (F12) (например, в соотношении 2:1 или DMEM с высоким содержанием глюкозы или низким содержанием глюкозы), улучшенная DMEM (Gibco), EL08-1D2, Myelocult™ H5100, IMDM и/или RPMI-1640; или средой, которая содержит компоненты, обычно включаемые в известные культуральные среды клеток/тканей, такие как компоненты, включенные в GBGM®, AIM-V®, X-VIVOTM 10, X-VIVOTM 15, OPTMIZER, STEMSPAN® H3000, CELLGRO COMPLETETM, DMEM:Ham's F12 (F12) (например, в соотношении 2:1 или DMEM с высоким содержанием глюкозы или низким содержанием глюкозы), улучшенную DMEM (Gibco), EL08-1D2, Myelocult™ H5100, IMDM и/или RPMI-1640. В конкретном варианте осуществления любого из вариантов осуществления в настоящем изобретении среда не является GBGM®.
В определенных вариантах осуществления в трехэтапных процессах, описанных в настоящем раскрытии, указанные стволовые гематопоэтические клетки или клетки-предшественники культивируют в указанной первой среде в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней до указанного культивирования в указанной второй среде. В определенных вариантах осуществления клетки, культивированные в указанной первой среде, культивируют в указанной второй среде в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней до указанного культивирования в указанной третьей среде. В определенных вариантах осуществления клетки, культивированные в указанной
- 40 039192 первой среде и указанной второй среде, культивируют в указанной третьей среде в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6,
7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 дней или более.
В определенных вариантах осуществления, в трехэтапных процессах, описанных в настоящем раскрытии, указанные стволовые гематопоэтические клетки или клетки-предшественники культивируют в указанной первой среде в течение 2-12 дней, 3-11 дней, например 3-5, 4-6, 5-7, 6-8, 7-9, 8-10 или 9-11 дней, до указанного культивирования в указанной второй среде. В определенных вариантах осуществления клетки, культивируемые в указанной первой среде, культивируют в указанной второй среде в течение 1-10 дней, например 1-3, 2-4, 3-5, 4-6, 5-7, 6-8 или 7-9 дней, до указанного культивирования в указанной третьей среде. В определенных вариантах осуществления, клетки, культивируемые в указанной первой среде и указанной второй среде, культивируют в указанной третьей среде в течение 2-27 дней, например 3-25 дней, например в течение 3-5, 4-6, 5-7, 6-8, 7-9, 8-10, 9-11, 10-12, 11-13, 12-14, 13-15, 14-16, 15-17, 16-18, 17-19, 18-20, 19-21, 20-22, 21-23, 22-24 или 23-25 дней.
В конкретном варианте осуществления в трехэтапных процессах, описанных в настоящем раскрытии, указанные стволовые гематопоэтические клетки или клетки-предшественники культивируют в указанной первой среде в течение 9 дней до указанного культивирования в указанной второй среде; культивируют в указанной второй среде в течение 5 дней до указанного культивирования в указанной третьей среде; и культивируют в указанной третьей среде в течение 7 дней, т.е. клетки культивируют в общей сложности 21 день.
В конкретном варианте осуществления в трехэтапных процессах, описанных в настоящем раскрытии, указанные стволовые гематопоэтические клетки или клетки-предшественники культивируют в указанной первой среде в течение 7-9 дней до указанного культивирования в указанной второй среде; культивируют в указанной второй среде в течение 5-7 дней до указанного культивирования в указанной третьей среде; и культивируют в указанной третьей среде в течение 21-35 дней, т.е. клетки культивируют в общей сложности 35 дней. В более конкретном варианте осуществления в трехэтапных процессах, описанных в настоящем раскрытии, указанные стволовые гематопоэтические клетки или клеткипредшественники культивируют в указанной первой среде в течение 9 дней до указанного культивирования в указанной второй среде; культивируют в указанной второй среде в течение 5 дней до указанного культивирования в указанной третьей среде; и культивируют в указанной третьей среде в течение 21 дня, т.е. клетки культивируют в общей сложности 35 дней.
5.2.9. Способы трехэтапного продуцирования NK-клеток.
Продуцирование NK-клеток и популяций NK-клеток посредством трехэтапного способа включает в себя расширение популяции гематопоэтических клеток. Во время расширения клеток множество гематопоэтических клеток в пределах популяции гематопоэтических клеток дифференцируется в NK-клетки. В одном из аспектов в настоящем изобретении представлен способ продуцирования NK-клеток, включающий в себя культивирование гематопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников, например CD34+ стволовых клеток или клеток-предшественников, в первой среде, содержащей средство активации стволовых клеток и тромбопоэтин (Tpo), с тем чтобы продуцировать первую популяцию клеток, далее культивирование указанной первой популяции клеток во второй среде, содержащей средство активации стволовых клеток и интерлейкин-15 (IL-15) и не содержащей Tpo, с тем чтобы продуцировать вторую популяцию клеток, и далее культивирование указанной второй популяции клеток в третьей среде, содержащей IL-2 и IL-15 и не содержащей средство активации стволовых клеток и LMWH, с тем чтобы продуцировать третью популяция клеток, при этом третья популяция клеток содержит естественные клетки-киллеры, которые являются CD56+, CD3-, и при этом по меньшей мере 70%, например 80%, естественных клеток-киллеров являются жизнеспособными в определенных вариантах осуществления, и такие естественные клетки-киллеры содержат естественные клетки-киллеры, которые являются CD16-. В определенных вариантах осуществления такие естественные клетки-киллеры содержат естественные клетки-киллеры, которые являются CD94-.
В одном из вариантов осуществления в настоящем изобретении представлен трехэтапный способ продуцирования популяций NK-клеток. В определенных вариантах осуществления в настоящем изобретении способ расширения и дифференцировки гематопоэтических клеток, в соответствии с описанным в настоящем раскрытии, для продуцирования популяции NK-клеток согласно трехэтапному способу, описанному в настоящем раскрытии, включает в себя поддержание популяции клеток, содержащей указанные гематопоэтические клетки в количестве между около 2х104 и около 6x106 клеток/мл. В определенных аспектах указанные стволовые гематопоэтические клетки или клетки-предшественники первоначально инокулируются в указанной первой среде в количестве от 1x104 до 1x105 клеток/мл. В конкретном аспекте указанные стволовые гематопоэтические клетки или клетки-предшественники первоначально инокулируются в указанной первой среде в количестве около 3x104 клеток/мл.
В определенных вариантах осуществления указанные стволовые гематопоэтические клетки или клетки-предшественники являются клетками млекопитающих. В конкретных вариантах осуществления указанные стволовые гематопоэтические клетки или клетки-предшественники являются клетками человека. В конкретных вариантах осуществления указанные стволовые гематопоэтические клетки или клет- 41 039192 ки-предшественники являются клетками примата. В конкретных вариантах осуществления указанные стволовые гематопоэтические клетки или клетки-предшественники являются клетками собаки. В конкретных вариантах осуществления указанные стволовые гематопоэтические клетки или клеткипредшественники представляет собой клетки грызунов.
В определенных аспектах указанная первая популяция клеток первоначально инокулируется в указанную вторую среду в количестве от 5х104 до 5x105 клеток/мл. В конкретном аспекте указанная первая популяция клеток первоначально инокулируется в указанную вторую среду в количестве около 1x105 клеток/мл.
В определенных аспектах указанная вторая популяция клеток первоначально инокулируется в указанную третью среду в количестве от 1x105 до 5x106 клеток/мл. В определенных аспектах указанная вторая популяция клеток первоначально инокулируется в указанную третью среду в количестве от 1x105 до 1x106 клеток/мл. В конкретном аспекте указанная вторая популяция клеток первоначально инокулируется в указанную третью среду в количестве около 5x105 клеток/мл. В более конкретном аспекте указанная вторая популяция клеток первоначально инокулируется в указанную третью среду в количестве около 5x105 клеток/мл в центрифужной пробирке. В конкретном аспекте указанная вторая популяция клеток первоначально инокулируется в указанную третью среду в количестве около 3x105 клеток/мл. В более конкретном аспекте указанная вторая популяция клеток первоначально инокулируется в указанную третью среду в количестве около 3x105 клеток/мл в статической культуре.
В определенном варианте осуществления трехэтапный способ включает в себя первый этап (этап 1), включающий в себя культивирование гематопоэтических стволовых клеток или клетокпредшественников, например CD34+ стволовых клеток или клеток-предшественников, в первой среде в течение заданного периода времени, например, в соответствии с описанным в настоящем раскрытии, для продуцирования первой популяции клеток. В определенных вариантах осуществления первая среда содержит средство активации стволовых клеток и тромбопоэтин (Tpo). В определенных вариантах осуществления первая среда содержит, в дополнение к средству активации стволовых клеток и Tpo, один или более из LMWH, Flt-3L, SCF, IL-6, IL-7, G-CSF и GM-CSF. В конкретном варианте осуществления первая среда содержит, в дополнение к активации стволовых клеток и Tpo, каждый из LMWH, Flt-3L, SCF, IL-6, IL-7, G-CSF и GM-CSF.
В определенных вариантах осуществления, далее, на этапе 2 указанные клетки культивируют во второй среде в течение заданного периода времени, например, в соответствии с описанным в настоящем раскрытии, для продуцирования второй популяции клеток. В определенных вариантах осуществления вторая среда содержит средство активации стволовых клеток и интерлейкин-15 (IL-15) и не содержит Tpo. В определенных вариантах осуществления вторая среда содержит, в дополнение к средству активации стволовых клеток и IL-15, один или более из LMWH, Flt-3, sCf, IL-6, IL-7, G-CSF и GM-CSF. В определенных вариантах осуществления вторая среда содержит, в дополнение к средству активации стволовых клеток и IL-15, каждый из LMWH, Flt-3, SCF, IL-6, IL-7, G-CSF и GM-CSF.
В определенных вариантах осуществления, далее, на этапе 3 указанные клетки культивируют в третьей среде в течение заданного периода времени, например, в соответствии с описанным в настоящем раскрытии, для продуцирования третьей популяции клеток, например, NK-клеток. В определенных вариантах осуществления третья среда содержит IL-2 и IL-15, и не содержит средство активации стволовых клеток и LMWH. В определенных вариантах осуществления третья среда содержит, в дополнение к IL-2 и IL-15, один или более SCF, IL-6, IL-7, G-CSF и GM-CSF. В определенных вариантах осуществления третья среда содержит, в дополнение к IL-2 и IL-15, каждый из SCF, IL-6, IL-7, G-CSF и GM-CSF.
В конкретном варианте осуществления трехэтапный способ применяют для продуцирования популяции NK-клеток. В определенных вариантах осуществления трехэтапный способ выполняют в отсутствие поддержки стромальными питающими клетками. В определенных вариантах осуществления трехэтапный способ выполняют в отсутствие экзогенным образом добавленных стероидов (например, кортизона, гидрокортизона или их производных).
В определенных аспектах указанная первая среда, используемая в трехэтапном способе, содержит средство активации стволовых клеток и тромбопоэтин (Tpo). В определенных аспектах первая среда, используемая в трехэтапном способе, содержит, в дополнение к средству активации стволовых клеток и Tpo, один или более из низкомолекулярного гепарина (LMWH), лиганда Flt-3 (Flt-3L), фактора стволовых клеток (SCF), IL-6, IL-7, колониестимулирующего фактора гранулоцитов (G-CSF) или колониестимулирующего фактора гранулоцитов/макрофага. В определенных аспектах первая среда, используемая в трехэтапном способе, содержит, в дополнение к средству активации стволовых клеток и Tpo, каждый из LMWH, Flt-3L, SCF, IL-6, IL-7, G-CSF и GM-CSF. В определенных аспектах указанный Tpo присутствует в первой среде в концентрации от 1 до 100 нг/мл, от 1 до 50 нг/мл, от 20 до 30 нг/мл или около 25 нг/мл. В определенных аспектах в первой среде LMWH присутствует в концентрации от 1 до 10 ед/мл; Flt-3L присутствует в концентрации от 1 до 50 нг/мл; SCF присутствует в концентрации от 1 до 50 нг/мл; IL-6 присутствует в концентрации от 0,01 до 0,1 нг/мл; IL-7 присутствует в концентрации от 1 до 50 нг/мл; G-CSF присутствует в концентрации от 0,01 до 0,50 нг/мл; и GM-CSF присутствует в концен- 42 039192 трации от 0,005 до 0,1 нг/мл. В определенных аспектах в первой среде, LMWH присутствует в концентрации от 4 до 5 ед/мл; Flt-3L присутствует в концентрации от 20 до 30 нг/мл; SCF присутствует в концентрации от 20 до 30 нг/мл; IL-6 присутствует в концентрации от 0,04 до 0,06 нг/мл; IL-7 присутствует в концентрации от 20 до 30 нг/мл; G-CSF присутствует в концентрации от 0,20 до 0,30 нг/мл; и GM-CSF присутствует в концентрации от 0,005 до 0,5 нг/мл. В определенных аспектах в первой среде LMWH присутствует в концентрации около 4,5 ед/мл; Flt-3L присутствует в концентрации около 25 нг/мл; SCF присутствует в концентрации около 27 нг/мл; IL-6 присутствует в концентрации около 0,05 нг/мл; IL-7 присутствует в концентрации около 25 нг/мл; G-CSF присутствует в концентрации около 25 нг/мл; и GM-CSF присутствует в концентрации около 0,01 нг/мл. В определенных вариантах осуществления указанная первая среда дополнительно содержит одно или более из следующего: антибиотики, такие как гентамицин; антиоксиданты, такие как трансферрин, инсулин и/или бета-меркаптоэтанол; селенистокислый натрий; аскорбиновая кислота; этаноламин; и глютатион. В определенных вариантах осуществления среда, которая обеспечивает основу для первой среды, является культуральной средой клеток/тканей, известной специалистам в данной области техники, например, коммерчески доступной культуральной средой клеток/тканей, такой как GBGM®, AIM-V®, X-VIVO™ 10, X-VIVO™ 15, OPTMIZER, STEMSPAN® H3000, CELLGRO COMPLETE™, DMEM: Ham's F12 (F12) (например, в соотношении 2:1 или DMEM с высоким содержанием глюкозы или низким содержанием глюкозы), улучшенная DMEM (Gibco), EL08-1D2, Myelocult™ H5100, IMDM и/или RPMI-1640; или средой, которая содержит компоненты, обычно включаемые в известные культуральные среды клеток/тканей, такие как компоненты, включенные в GBGM®, AIM-V®, X-VIVOTM 10, X-VIVOTM 15, OPTMIZER, STEMSPAN® H3000, CELLGRO COMPLETETM, DMEM:Ham's F12 (F12) (например, в соотношении 2:1 или DMEM с высоким содержанием глюкозы или низким содержанием глюкозы), улучшенную DMEM (Gibco), EL08-1D2, Myelocult™ H5100, IMDM и/или RPMI-1640. В конкретном варианте осуществления любого из вариантов осуществления в настоящем изобретении среда не является GBGM®.
В определенных аспектах указанная вторая среда, используемая в трехэтапном способе, содержит средство активации стволовых клеток и интерлейкин-15 (IL-15) и не содержит Tpo. В определенных аспектах вторая среда, используемая в трехэтапном способе, содержит, в дополнение к средству активации стволовых клеток и IL-15, один или более из LMWH, Flt-3, SCF, IL-6, IL-7, G-CSF и GM-CSF. В определенных аспектах вторая среда, используемая в трехэтапном способе, содержит, в дополнение к средству активации стволовых клеток и IL-15, каждый из LMWH, Flt-3, SCF, IL-6, IL-7, G-CSF и GM-CSF. В определенных аспектах указанный IL-15 присутствует в указанной второй среде в концентрации от 1 до 50 нг/мл, от 10 до 30 нг/мл или около 20 нг/мл. В определенных аспектах в указанной второй среде, LMWH присутствует в концентрации от 1 до 10 ед/мл; Flt-3L присутствует в концентрации от 1 до 50 нг/мл; SCF присутствует в концентрации от 1 до 50 нг/мл; IL-6 присутствует в концентрации от 0,01 до 0,1 нг/мл; IL-7 присутствует в концентрации от 1 до 50 нг/мл; G-CSF присутствует в концентрации от 0,01 до 0,50 нг/мл; и GM-CSF присутствует в концентрации от 0,005 до 0,1 нг/мл. В определенных аспектах во второй среде LMWH присутствует во второй среде в концентрации от 4 до 5 ед/мл; Flt-3L присутствует в концентрации от 20 до 30 нг/мл; SCF присутствует в концентрации от 20 до 30 нг/мл; IL-6 присутствует в концентрации от 0,04 до 0,06 нг/мл; IL-7 присутствует в концентрации от 20 до 30 нг/мл; G-CSF присутствует в концентрации от 0,20 до 0,30 нг/мл; и GM-CSF присутствует в концентрации от 0,005 до 0.5 нг/мл. В определенных аспектах во второй среде LMWH присутствует во второй среде в концентрации от 4 до 5 ед/мл; Flt-3L присутствует в концентрации от 20 до 30 нг/мл; SCF присутствует в концентрации от 20 до 30 нг/мл; IL-6 присутствует в концентрации от 0,04 до 0,06 нг/мл; IL-7 присутствует в концентрации от 20 до 30 нг/мл; G-CSF присутствует в концентрации от 0,20 до 0,30 нг/мл; и GM-CSF присутствует в концентрации от 0,005 до 0.5 нг/мл. В определенных аспектах во второй среде LMWH присутствует во второй среде в концентрации около 4,5 ед/мл; Flt-3L присутствует в концентрации около 25 нг/мл; SCF присутствует в концентрации около 27 нг/мл; IL-6 присутствует в концентрации около 0,05 нг/мл; IL-7 присутствует в концентрации около 25 нг/мл; G-CSF присутствует в концентрации около 0,25 нг/мл; и GM-CSF присутствует в концентрации около 0,01 нг/мл. В определенных вариантах осуществления указанная вторая среда дополнительно содержит одно или более из следующего: антибиотики, такие как гентамицин; антиоксиданты, такие как трансферрин, инсулин и/или бета-меркаптоэтанол; селенистокислый натрий; аскорбиновая кислота; этаноламин и глютатион. В определенных вариантах осуществления среда, которая обеспечивает основу для второй среды, является культуральной средой клеток/тканей, известной специалистам в данной области техники, например коммерчески доступной культуральной средой клеток/тканей, такой как GBGM®, AIM-V®, X-VIVO™ 10, X-VIVO™ 15, OPTMIZER, STEMSPAN® H3000, CELLGRO COMPLETE™, DMEM: Ham's F12 (F12) (например, в соотношении 2:1 или DMEM с высоким содержанием глюкозы или низким содержанием глюкозы), улучшенная DMEM (Gibco), EL08-1D2, Myelocult™ H5100, IMDM и/или RPMI-1640; или средой, которая содержит компоненты, обычно включаемые в известные культуральные среды клеток/тканей, такие как компоненты, включенные в GBGM®, AIM-V®, X-VIVOTM 10, X-VIVOTM 15, OPTMIZER, STEMSPAN® H3000, CELLGRO COMPLETETM,
- 43 039192
DMEM:Ham's F12 (F12) (например, в соотношении 2:1 или DMEM с высоким содержанием глюкозы или низким содержанием глюкозы), улучшенную DMEM (Gibco), EL08-1D2, Myelocult™ H5100, IMDM и/или RPMI-1640. В конкретном варианте осуществления любого из вариантов осуществления в настоящем изобретении среда не является GBGM®.
В определенных вариантах осуществления третья среда, используемая в трехэтапном способе, содержит среду. В определенных аспектах указанная третья среда, используемая в трехэтапном способе, содержит IL-2 и IL-15 и не содержит средство активации стволовых клеток и LMWH. В определенных аспектах третья среда, используемая в трехэтапном способе, содержит, в дополнение к IL-2 и IL-15, один или более из SCF, IL-6, IL-7, G-CSF или GM-CSF. В определенных аспектах третья среда, используемая в трехэтапном способе, содержит, в дополнение к IL-2 и IL-15, каждый из SCF, IL-6, IL-7, G-CSF и GM-CSF. В определенных аспектах указанный IL-2 присутствует в указанной третьей среде в концентрации от 10 до 10000 ед/мл, и указанный IL-15 присутствует в указанной третьей среде в концентрации от 1 до 50 нг/мл. В определенных аспектах указанный IL-2 присутствует в указанной третьей среде в концентрации от 100 до 10000 ед/мл, и указанный IL-15 присутствует в указанной третьей среде в концентрации от 1 до 50 нг/мл. В определенных аспектах указанный IL-2 присутствует в указанной третьей среде в концентрации от 300 до 3000 ед/мл и указанный IL-15 присутствует в указанной третьей среде в концентрации от 10 до 30 нг/мл. В определенных аспектах указанные IL-2 присутствует в указанной третьей среде в концентрации около 1000 ед/мл и указанный IL-15 присутствует в указанной третьей среде в концентрации около 20 нг/мл. В определенных аспектах, в указанной третьей среде SCF присутствует в концентрации от 1 до 50 нг/мл; IL-6 присутствует в концентрации от 0,01 до 0,1 нг/мл; IL-7 присутствует в концентрации от 1 до 50 нг/мл; G-CSF присутствует в концентрации от 0,01 до 0,50 нг/мл; и GM-CSF присутствует в концентрации от 0,005 до 0,1 нг/мл. В определенных аспектах в указанной третьей среде SCF присутствует в концентрации от 20 до 30 нг/мл; IL-6 присутствует в концентрации от 0,04 до 0,06 нг/мл; IL-7 присутствует в концентрации от 20 до 30 нг/мл; G-CSF присутствует в концентрации от 0,20 до 0,30 нг/мл; и GM-CSF присутствует в концентрации от 0,005 до 0,5 нг/мл. В определенных аспектах в указанной третьей среде SCF присутствует в концентрации около 22 нг/мл; IL-6 присутствует в концентрации около 0,05 нг/мл; IL-7 присутствует в концентрации около 20 нг/мл; G-CSF присутствует в концентрации около 0,25 нг/мл; и GM-CSF присутствует в концентрации около 0,01 нг/мл. В определенных вариантах осуществления указанная третья среда дополнительно содержит одно или более следующего: антибиотики, такие как гентамицин; антиоксиданты, такие как трансферрин, инсулин и/или бетамеркаптоэтанол; селенистокислый натрий; аскорбиновая кислота; этаноламин; и глютатион. В определенных вариантах осуществления среда, которая обеспечивает основу для третьей среды, является культуральной средой клеток/тканей, известной специалистам в данной области техники, например, коммерчески доступной культуральной средой клеток/тканей, такой как GBGM®, AIM-V®, X-VIVO™ 10, X-VIVO™ 15, OPTMIZER, STEMSPAN® Н3000, CELLGRO COMPLETE™, DMEM: Ham's F12 (F12) (например, в соотношении 2:1 или DMEM с высоким содержанием глюкозы или низким содержанием глюкозы), улучшенная DMEM (Gibco), EL08-1D2, Myelocult™ H5100, IMDM и/или RPMI-1640; или средой, которая содержит компоненты, обычно включаемые в известные культуральные среды клеток/тканей, такие как компоненты, включенные в GBGM®, AIM-V®, X-VIVOTM 10, X-VIVOTM 15, OPTMIZER, STEMSPAN® H3000, CELLGRO COMPLETETM, DMEM:Ham's F12 (F12) (например, в соотношении 2:1 или DMEM с высоким содержанием глюкозы или низким содержанием глюкозы), улучшенную DMEM (Gibco), EL08-1D2, Myelocult™ H5100, IMDM и/или RPMI-1640. В конкретном варианте осуществления любого из вариантов осуществления в настоящем изобретении среда не является GBGM®.
Обычно конкретно указанные компоненты среды не относятся к возможным составляющим в неопределенном компоненте указанной среды. Например, указанные Tpo, IL-2 и IL-15 не содержатся в пределах неопределенного компонента первой среды, второй среды или третьей среды, например указанные Tpo, IL-2 и IL-15 не содержатся в пределах сыворотки. Кроме того, указанные LMWH, Flt-3, SCF, IL-6, IL-7, G-CSF и/или GM-CSF не содержатся в пределах неопределенного компонента первой среды, второй среды или третьей среды, например указанные LMWH, Flt-3, SCF, IL-6, IL-7, G-CSF и/или GM-CSF не содержатся в пределах сыворотки.
В определенных аспектах указанные первая среда, вторая среда или третья среда содержат человеческую сыворотку-АВ. В определенных аспектах любая указанная первая среда, вторая среда или третья среда содержат от 1 до 20% человеческой сыворотки-АВ, от 5 до 15% человеческой сыворотки-АВ или около 2, 5 или 10% человеческой сыворотки-АВ.
В определенных вариантах осуществления в трехэтапных способах, описанных в настоящем раскрытии, указанные стволовые гематопоэтические клетки или клетки-предшественники культивируют в указанной первой среде в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней. В определенных вариантах осуществления в трехэтапных способах, описанных в настоящем раскрытии, клетки культивируют в указанной второй среде в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней. В определенных вариантах осуществления в трехэтапных способах, описанных в
- 44 039192 настоящем раскрытии, клетки культивируют в указанной третьей среде в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,
10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 дней или более.
В конкретном варианте осуществления в трехэтапных способах, описанных в настоящем раскрытии, указанные стволовые гематопоэтические клетки или клетки-предшественники культивируют в указанной первой среде за 7-13 дней для продуцирования первой популяции клеток, до указанного культивирования в указанной второй среде; указанную первую популяцию клеток культивируют в указанной второй среде в течение 2-6 дней для продуцирования второй популяции клеток до указанного культивирования в указанной третьей среде; и указанную вторую популяцию клеток культивируют в указанной третьей среде в течение 10-30 дней, т.е. клетки культивируют в общей сложности 19-49 дней.
В конкретном варианте осуществления в трехэтапных способах, описанных в настоящем раскрытии, указанные стволовые гематопоэтические клетки или клетки-предшественники культивируют в указанной первой среде в течение 8-12 дней для продуцирования первой популяции клеток, до указанного культивирования в указанной второй среде; указанную первую популяцию клеток культивируют в указанной второй среде в течение 3-5 дней для продуцирования второй популяции клеток до указанного культивирования в указанной третьей среде; и указанную вторую популяцию клеток культивируют в указанной третьей среде в течение 15-25 дней, т.е. клетки культивируют в общей сложности 26-42 дня.
В конкретном варианте осуществления в трехэтапных способах, описанных в настоящем раскрытии, указанные стволовые гематопоэтические клетки или клетки-предшественники культивируют в указанной первой среде в течение около 10 дней для продуцирования первой популяции клеток, до указанного культивирования в указанной второй среде; указанную первую популяцию клеток культивируют в указанной второй среде в течение в течение около 4 дней для продуцирования второй популяции клеток до указанного культивирования в указанной третьей среде; и указанную вторую популяцию клеток культивируют в указанной третьей среде в течение около 21 дня, т.е. клетки культивируют в общей сложности около 35 дней.
В определенных аспектах указанное культивирование в указанной первой среде, второй среде и третьей среде выполняют в статических условиях культивирования, например, в чашке для культивирования или колбе для культивирования. В определенных аспектах указанное культивирование по меньшей мере в одной из указанной первой среды, второй среды или третьей среды выполняют в центрифужной пробирке. В определенных аспектах указанное культивирование в указанной первой среде и указанной второй среде выполняется в статических условиях культивирования и указанное культивирование в указанной третьей среде выполняют в центрифужной пробирке.
В определенных аспектах указанное культивирование выполняют в центрифужной пробирке. В других аспектах указанное культивирование выполняют в устройстве G-Rex. В других аспектах указанное культивирование выполняют в биореакторе WAVE.
В определенных аспектах указанные стволовые гематопоэтические клетки или клеткипредшественники первоначально инокулируются в указанной первой среде в количестве от 1х104 до 1x105 клеток/мл. В конкретном аспекте указанные стволовые гематопоэтические клетки или клеткипредшественники первоначально инокулируются в указанной первой среде в количестве около 3x104 клеток/мл.
В определенных аспектах указанная первая популяция клеток первоначально инокулируется в указанной второй среде в количестве от 5x104 до 5x105 клеток/мл. В конкретном аспекте указанная первая популяция клеток первоначально инокулируется в указанной второй среде в количестве около 1x105 клеток/мл.
В определенных аспектах указанная вторая популяция клеток первоначально инокулируется в указанной третьей среде в количестве от 1x105 до 5x106 клеток/мл. В определенных аспектах указанная вторая популяция клеток первоначально инокулируется в указанной третьей среде в количестве от 1x105 до 1x106 клеток/мл. В конкретном аспекте указанная вторая популяция клеток первоначально инокулируется в указанной третьей среде в количестве около 5x105 клеток/мл. В более конкретном аспекте указанная вторая популяция клеток первоначально инокулируется в указанной третьей среде в количестве около 5x105 клеток/мл в центрифужной пробирке. В конкретном аспекте указанная вторая популяция клеток первоначально инокулируется в указанной третьей среде в количестве 3x105 клеток/мл. В более конкретном аспекте указанная вторая популяция клеток первоначально инокулируется в указанной третьей среде в количестве около 3x105 клеток/мл в статической культуре.
5.2.10. Изоляция клеток.
Способы изоляции NK-клеток известны в технике и могут применяться для изоляции естественных клеток-киллеров, например активированных NK-клеток или клеток TSPNK (например, клетокпредшественников NK), продуцированных с применением трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии. NK-клетки могут быть изолированы или обогащены посредством окрашивания клеток из источника ткани, например периферической крови, антителами к CD56 и CD3 и отбора клеток CD56+CD3-. NK-клетки, например активированные NK-клетки или клетки TSPNK, могут быть изолированы с применением коммерчески доступного набора, например набора для изоляции NK-клеток
- 45 039192 (Miltenyi Biotec). NK-клетки, например активированные NK-клетки или клетки TSPNK, могут также быть изолированы или обогащены посредством удаления клеток, отличных от NK-клеток, из популяции клеток, которая содержит NK-клетки, например активированные NK-клетки или клетки TSPNK. Например, NK-клетки, например активированные NK-клетки или клетки TSPNK, могут быть изолированы или обогащены посредством деплеции клеток, демонстрирующих маркеры не являющихся NK клеток, например, антитела к одному или более из CD3, CD4, CD14, CD19, CD20, CD36, CD66b, CD123, HLA DR и/или CD235a (гликофорин А). Отрицательная изоляция может быть выполнена с применением коммерчески доступного набора, например, набора для отрицательной изоляции NK-клеток (Dynal Biotech). Клетки, изолированные этими способами, могут быть дополнительно отсортированы, например, с тем чтобы разделить клетки CD16+ и CD 16.
Разделение клеток может быть выполнено, например, посредством проточной цитометрии, сортировки клеток с возбуждением флуоресценции (FACS) или предпочтительно магнитной сортировки клеток с использованием микрогранул, конъюгированных со специфичными антителами. Клетки могут быть изолированы, например, с применением методики магнитно активируемой сортировки клеток (MACS), способа для разделения частиц на основании их способности связывать магнитные гранулы (например, около диаметром 0,5-100 мкм), которые содержат одно или более специфичных антител, например антител против CD56. Магнитное разделение клеток может быть выполнено и автоматизировано с применением, например, разделителя AUTOMACS™ (Miltenyi). Множество полезных модификаций может быть выполнено на магнитных микросферах, включая ковалентное добавление антитела, которое специфично распознает конкретную молекулу поверхности клеток или гаптен. Гранулы затем смешивают с клетками, чтобы обеспечить возможность связывания. Клетки затем проходят через магнитное поле, с тем чтобы выделить клетки, имеющие конкретный маркер поверхности клеток. В одном из вариантов осуществления эти клетки могут затем быть изолированы и повторно смешаны с магнитными гранулами, соединенными с антителом против дополнительных маркеров поверхности клеток. Клетки снова проходят через магнитное поле, в результате чего выделяют клетки, которые связываются с обоими антителами. Такие клетки могут затем быть разведены в отдельных кюветах, такие как кюветы для микротитрования, в целях клональной изоляции.
В некоторых вариантах осуществления чистота изолированных или обогащенных NK-клеток может быть подтверждена посредством обнаружения одного или более из CD56, CD3 и CD16.
5.2.11. Хранение клеток/перфузата.
Клетки, например NK-клетки, продуцированные с применением способов, описанных в настоящем раскрытии, например активированные NK-клетки или клетки TSPNK (например, клеткипредшественники NK), продуцированные с применением трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, или клетки плацентарного перфузата, включающие стволовые гематопоэтические клетки или клетки-предшественники, или плацентарный перфузат могут храниться, т.е. размещаться в условиях, которые допускают длительное хранение, или в условиях, которые подавляют смерть клеток, например, в результате апоптоза или некроза.
Плацентарный перфузат может быть произведен путем прохождения композиции для сбора клеток по меньшей мере через часть плаценты, например через плацентарную сосудистую сеть. Композиция для сбора клеток содержит одно или более соединений, которые действуют для сохранения клеток, содержащихся в пределах перфузата. Такая композиция для сбора плацентарных клеток может содержать ингибитор апоптоза, ингибитор некроза и/или несущий кислород перфторуглерод, как описано в публикации родственной заявки на патент США № 20070190042, изобретение которой включено в настоящее описание посредством ссылки во всей его полноте.
В одном из вариантов осуществления перфузат или популяцию плацентарных клеток собирают из послеродовой плаценты млекопитающего, например человека, путем приведения перфузата или популяции клеток в близость с композицией для сбора клеток, содержащей ингибитор апоптоза и несущий кислород перфторуглерод, в которой указанный ингибитор апоптоза присутствует в количестве и в течение времени, являющимися достаточными для снижения или предотвращения апоптоза в популяции плацентарных клеток, например прилипающих плацентарных клеток, например плацентарных стволовых клеток или плацентарных мультипотентных клеток, по сравнению с популяцией клеток, которые не контактировали и не были приведены в близость с ингибитором апоптоза. Например, плацента может подвергаться перфузии композицией для сбора клеток, и плацентарные клетки, например тотальные имеющие ядро плацентарные клетки, изолируют из нее. В конкретном варианте осуществления ингибитор апоптоза является ингибитором каспазы. В другом конкретном варианте осуществления указанный ингибитор апоптоза является ингибитором JNK. В более конкретном варианте осуществления указанный ингибитор JNK не модулирует дифференцировку или пролиферацию прилипающих плацентарных клеток, например прилипающих плацентарных клеток или прилипающих плацентарных мультипотентных клеток. В другом варианте осуществления композиция для сбора клеток содержит указанный ингибитор апоптоза и указанный несущий кислород перфторуглерод в отдельных фазах. В другом варианте осуществления композиция для сбора клеток содержит указанный ингибитор апоптоза и указанный несущий кислород перфторуглерод в эмульсии. В другом варианте осуществления композиция для сбора клеток дополни
- 46 039192 тельно содержит эмульгатор, например лецитин. В другом варианте осуществления указанный ингибитор апоптоза и указанный перфторуглерод находятся при температуре между около 0 и около 25°C во время приведения плацентарных клеток в близость с композицией для сбора клеток. В другом более конкретном варианте осуществления указанный ингибитор апоптоза и указанный перфторуглерод находятся при температуре между около 2 и 10°C или между около 2 и около 5°C во время приведения плацентарных клеток в близость с композицией для сбора клеток. В другом более конкретном варианте осуществления указанное приведение в близость выполняют во время транспортировки указанной популяции клеток. В другом более конкретном варианте осуществления указанное приведение в близость выполняют во время замораживания и размораживания указанной популяции клеток.
В другом варианте осуществления плацентарный перфузат и/или плацентарные клетки могут быть собраны и сохранены путем приведения перфузата и/или клеток в близость с ингибитором апоптоза и сохраняющим органы соединением, при этом указанный ингибитор апоптоза присутствует в количестве и в течение времени, являющимися достаточными для снижения или предотвращения апоптоза клеток, по сравнению с перфузатом или плацентарными клетками, которые не входили в контакт и не приводили в близость с ингибитором апоптоза. В конкретном варианте осуществления сохраняющее органы соединение представляет собой раствор UW (описанный в патенте США № 4798824; также известный как VIASPAN™; см. также Southard et al., Transplantation, 49(2):251-257 (1990), или раствор, описанный в Стерне et al., патент США № 5552267, раскрытия которых включены в настоящее изобретение посредством ссылки во всей их полноте. В другом варианте осуществления указанная сохраняющая орган композиция представляет собой гидроксиэтиловый крахмал, лактобионовую кислоту, рафинозу или комбинацию указанного. В другом варианте осуществления плацентарная композиция для сбора клеток дополнительно содержит несущий кислород перфторуглерод или в двух фазах, или как эмульсию.
В другом варианте осуществления плацентарные клетки приводятся в близость с композицией для сбора клеток, содержащей ингибитор апоптоза и несущий кислород перфторуглерод, сохраняющее орган соединение или комбинацию указанного, во время перфузии. В другом варианте осуществления плацентарные клетки приводятся в близость с указанным соединением для сбора клеток после сбора посредством перфузии.
Как правило, во время сбора, обогащения и изоляции плацентарных клеток предпочтительно минимизировать или устранить клеточный стресс вследствие гипоксии и механического стресса. В другом варианте осуществления способа, таким образом, плацентарный перфузат или популяция плацентарных клеток подвергается воздействию состояния гипоксии во время сбора, обогащения или изоляции в течение менее 6 ч во время указанного хранения, при этом состояние гипоксии представляет собой концентрацию кислорода, которая составляет меньше, чем нормальная концентрация кислорода в крови. В более конкретном варианте осуществления указанный перфузат или популяция плацентарных клеток подвергаются воздействию указанного состояния гипоксии в течение менее двух ч во время указанного хранения. В другом более конкретном варианте осуществления указанная популяция плацентарных клеток подвергается воздействию указанного состояния гипоксии в течение менее 1 ч или менее 30 мин или не подвергается воздействию состояния гипоксии во время сбора, обогащения или изоляции. В другом конкретном варианте осуществления указанная популяция плацентарных клеток не подвергается воздействию механического напряжения во время сбора, обогащения или изоляции.
Клетки, например клетки плацентарного перфузата, гематопоэтические клетки, например CD34+ стволовые гематопоэтические клетки; NK-клетки, продуцированные с применением процессов, описанных в настоящем раскрытии, например активированные NK-клетки или клетки TSPNK (например, клетки-предшественники NK); изолированные прилипающие плацентарные клетки, представленные в настоящем раскрытии, могут быть подвергнуты криосохранению, например, в среде криоконсервации в малых емкостях, например ампулах или пробирках с перегородками. В конкретных вариантах осуществления клетки подвергаются или подвергались криосохранению в концентрации около 1х10-5х108 клеток/мл. В конкретных вариантах осуществления клетки подвергаются или подвергались криосохранению в концентрации около 1x106-1,5x107 клеток/мл. В более конкретных вариантах осуществления предоставленные в настоящем изобретении клетки подвергаются или подвергались криосохранению в концентрации около 1x104, 5x104, 1x105, 5x105, 1x106, 5x106, 1x107, 1,5x107 клеток/мл. В определенных вариантах осуществления NK-клетки были подвергнуты криосохранению до введения. В определенных вариантах осуществления NK-клетки не были подвергнуты криосохранению до введения.
Подходящие среды для криоконсервации включают, но не ограничены указанным, нормальный солевой раствор, культуральную среду, включая, например, среду для выращивания или среду для замораживания клеток, например, коммерчески доступную среду для замораживания клеток, например С2695, С2639 или С6039 (Sigma); CryoStor® CS2, CryoStor® CS5 или CryoStor®CS10 (BioLife Solutions). В одном из вариантов осуществления культуральная среда для криоконсервации содержит DMSO (диметилсульфоксид) в концентрации, например, около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10% (об./об.). Среда для криоконсервации может содержать дополнительные средства, например метилцеллюлозу, декстран, белок (например, человеческий сывороточный альбумин), трегалозу и/или глицерин. В определенных вариантах
- 47 039192 осуществления среда для криоконсервации содержит около 1-10% DMSO, около 25-75% декстрана и/или около 20-60% человеческого сывороточного альбумина (HSA). В определенных вариантах осуществления среда для криоконсервации содержит около 1-10% DMSO около 25-75% трегалозы и/или около 2060% человеческого HSA. В конкретном варианте осуществления среда для криоконсервации содержит 5% DMSO, 55% декстрана и 40% HSA. В более конкретном варианте осуществления среда для криоконсервации содержит 5% DMSO, 55% декстрана (10% вес./об. в нормальном солевом растворе) и 40% HSA. В другом конкретном варианте осуществления среда для криоконсервации содержит 5% DMSO, 55% трегалозы и 40% HSA. В более конкретном варианте осуществления среда для криоконсервации содержит 5% DMSO, 55% трегалозы (10% вес./об. в нормальном солевом растворе) и 40% HSA. В другом конкретном варианте осуществления среда для криоконсервации содержит CryoStor® CS5. В другом конкретном варианте осуществления среда для криоконсервации содержит CryoStor®CS10.
Клетки могут подвергаться криосохранению посредством любого из множества способов, известных в технике, и на любой стадии культивирования, расширения или дифференцировки клеток. Например, клетки, представленные в настоящем раскрытии, могут подвергаться криосохранению непосредственно после изоляции из исходных тканей или органов, например, плацентарного перфузата или пуповинной крови, или в течение, или после первого или после второго этапа способов, описанных выше. В определенных вариантах осуществления гематопоэтические клетки, например стволовые гематопоэтические клетки или клетки-предшественники, подвергаются криосохранению в течение около 1, 5, 10, 15, 20, 30, 45 мин или в течение около 1, 2, 4, 6, 10, 12, 18, 20 или 24 ч после изоляции из исходных тканей или органов. В определенных вариантах осуществления указанные клетки подвергаются криосохранению в течение 1, 2 или 3 дней после изоляции из исходных тканей или органов. В определенных вариантах осуществления указанные клетки подвергаются криосохранению после культивирования в первой среде, как описано выше, в течение около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 дней. В некоторых вариантах осуществления указанные клетки подвергаются криосохранению после культивирования в первой среде, как описано выше, в течение около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 дней и во второй среде в течение около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 дней, как описано выше. В некоторых вариантах осуществления, когда клетки TSPNK (например, клетки-предшественники NK) получают с применением трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, указанные клетки подвергаются криосохранению после культивирования в первой среде в течение около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 дней; и/или культивирования во второй среде в течение около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 дней; и/или культивирования в третьей среде в течение около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 дней. В конкретном варианте осуществления клетки-предшественники NK получают с применением трехэтапного процесса, описанного в настоящем раскрытии, и указанные клетки подвергаются криосохранению после культивирования в первой среде в течение 9 дней; культивирования во второй среде в течение 5 дней и культивирования в третьей среде в течение 7 дней.
В одном из аспектов популяцию NK-клеток, например активированных NK-клеток, продуцируют посредством процесса, включающего в себя (а) отбор популяции гематопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников в первой среде, содержащей интерлейкин-15 (IL-15) и, необязательно, один или более из фактора стволовых клеток (SCF) и интерлейкина-7 (IL-7), при этом указанный IL-15 и необязательные SCF и IL-7 не содержатся в пределах неопределенного компонента указанной среды, в результате чего популяция расширяется и множество гематопоэтических стволовых клеток или клетокпредшественников в пределах указанной популяции гематопоэтических стволовых клеток или клетокпредшественников дифференцируется в NK-клетки во время указанного расширения; (b) расширение клеток с этапа (а) во второй среде, содержащей интерлейкин-2 (IL-2), с продуцированием популяции активированных NK-клеток и (с) охлаждение подвергаемых криосохранению NK-клеток с этапа (b) в среде для криоконсервации. В конкретном варианте осуществления указанный этап (с) дополнительно включает в себя (1) приготовления раствора суспензии клеток; (2) добавление среды для криоконсервации к раствору суспензии клеток с этапа (1), с тем чтобы получить подвергнутую криосохранению суспензию клеток; (3) охлаждение подвергнутой криосохранению суспензии клеток с этапа (3), чтобы получить подвергнутый криосохранению образец; и (4) хранение подвергнутого криосохранению образца при температуре ниже -80°C. В определенных вариантах осуществления способ не включает в себя промежуточные этапы между этапом (а) и (b) и между этапом (b) и (с) и/или какие-либо дополнительные этапы культивирования до этапа (а).
В другом варианте осуществления криоосохранение популяции NK-клеток, например активированных NK-клеток или клеток TSPNK (например, клеток-предшественников NK), включает в себя (а) расширение популяции гематопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников в первой среде, содержащей один или более из фактора стволовых клеток (SCF), IL-2, интерлейкина-7 (IL-7) интерлейкина-15 (IL-15) и гепарина, и в которой указанные SCF, IL-2, IL-7 и IL-15 не содержатся в преде
- 48 039192 лах неопределенного компонента указанной среды, и при этом множество гематопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников в пределах указанной популяции гематопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников дифференцируется в NK-клетки во время указанного расширения; (b) расширение клеток с этапа (а) во второй среде, содержащей интерлейкин-2 (IL-2) с продуцированием популяции активированных NK-клеток; и (с) охлаждение подвергаемых криосохранению NK-клеток с этапа (b) в среде для криоконсервации. В конкретном варианте осуществления указанный этап (с) дополнительно включает в себя (1) приготовление раствора суспензии клеток; (2) добавление среды для криоконсервации к раствору суспензии клеток с этапа (1), с тем чтобы получить подвергнутую криосохранению суспензию клеток; (3) охлаждение подвергнутой криосохранению суспензии клеток с этапа (3), чтобы получить подвергнутый криосохранению образец; и (4) хранение подвергнутого криосохранению образца при температуре ниже -80°C. В определенных вариантах осуществления способ не включает в себя промежуточные этапы между этапом (а) и (b) и между этапом (b) и (с) и/или какие-либо дополнительные этапы культивирования до этапа (а).
Клетки предпочтительно охлаждаются в программируемом криозамораживателе, например, около 0,1, 0,3, 0,5, 1 или 2°С/мин в течение криоконсервации. Предпочтительная температура криоконсервации составляет от около -80 до около -180°C, предпочтительно от около -125 до около -140°C. Криосохраненные клетки могут быть перенесены в жидкий азот до размораживания в целях использования. В некоторых вариантах осуществления, например, как только ампулы достигли около -90°C, их переносят в место хранения в жидком азоте. Криосохраненные клетки предпочтительно размораживают при температуре от около 25 до около 40°C, предпочтительно при температуре около 37°C. В определенных вариантах осуществления криосохраненные клетки размораживают после криоконсервации в течение около 1, 2, 4, 6, 10, 12, 18, 20 или 24 ч или около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 дней. В определенных вариантах осуществления криосохраненные клетки размораживают после криоконсервации в течение около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 месяцев. В определенных вариантах осуществления криосохраненные клетки размораживают после криоконсервации в течение около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 лет.
Подходящая среда для размораживания содержит, но не ограничена указанным, нормальный солевой раствор, плазмалитическую культуральную среду, включая, например, среду для выращивания, например культуральную среду RPMI. В предпочтительных вариантах осуществления среда для размораживания содержит одну или более добавок к среде (например, питательные вещества, цитокины и/или факторы). Добавки к среде, подходящие для размораживания клеток, представленных в настоящем раскрытии, включают, например, но без ограничения, сыворотку, такую как человеческая сыворотка АВ, эмбриональная бычья сыворотка (FBS) или эмбриональная сыворотка теленка (FCS), витамины, человеческий сывороточный альбумин (HSA), бычий сывороточный альбумин (BSA), аминокислоты (например, L-глютамин), жирные кислоты (например, олеиновая кислота, линолевая кислота или пальмитиновая кислота) инсулин (например, рекомбинантный человеческий инсулин), трансферрин (насыщенный железом человеческий трансферрин), β-меркаптоэтанол, фактор стволовых клеток (SCF), лиганд Fms-подобной тирозинкиназы 3 (Flt3-L), цитокины, такие как интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкин-7 (IL-7), интерлейкин-15 (IL-15), тромбопоэтин (Tpo) или гепарин. В конкретном варианте осуществления представленная в настоящем изобретении среда для размораживания, целесообразная для способов, содержит RPMI. В другом конкретном варианте осуществления указанная среда для размораживания содержит плазмалит. В другом конкретном варианте осуществления указанная среда для размораживания содержит около 0,5-20% FBS. В другом конкретном варианте осуществления указанная среда для размораживания содержит около 1, 2, 5, 10, 15 или 20% FBS. В другом конкретном варианте осуществления указанная среда для размораживания содержит около 0,5-20% HSA. В другом конкретном варианте осуществления указанная среда для размораживания содержит около 1, 2,5, 5, 10, 15 или 20% HSA. В более конкретном варианте осуществления указанная среда для размораживания содержит RPMI и около 10% FBS. В другом более конкретном варианте осуществления указанная среда для размораживания содержит плазмалит и около 5% HSA.
Способы криоконсервации, предоставленные в настоящем раскрытии, могут быть оптимизированы в целях обеспечения возможности длительного хранения или для условий, которые ингибируют некроз клеток, например апоптоз или некроз. В вариантах осуществления клетки после размораживания содержат более чем 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 98% жизнеспособных клеток, как определено, например, автоматическим устройством подсчета клеток или способом с окрашиванием трипановым синим. В другом варианте осуществления клетки после размораживания содержат около 0,5, 1, 5, 10, 15, 20 или 25% мертвых клеток. В другом варианте осуществления клетки после размораживания содержат около 0,5, 1, 5, 10, 15, 20 или 25% ранних апоптотических клеток. В другом варианте осуществления около 0,5, 1, 5, 10, 15 или 20% клеток после размораживания подвергаются апоптозу после 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 дней после размораживания в соответствии с определенным, например, посредством анализа апоптоза (например, набор для анализа апоптоза TO-PRO3 или AnnV/PI). В определенных вариантах осуществления клетки после размораживания под- 49 039192 вергаются повторному криосохранению после культивирования, расширения или дифференцировки с применением способов, представленных в настоящем раскрытии.
5.3. Генетически модифицированные NK-клетки.
В другом аспекте NK-клетки могут быть генетически модифицированы, чтобы повысить специфичность нацеливания и/или хоминг-специфичность.
В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированные NK-клетки представляют собой NK-клетки, которые содержат химерный антигенный рецептор (CAR). CAR представляет собой искусственный мембраносвязанный белок, который направляет иммуноцит (например, Т-лимфоцит) к антигену и стимулирует иммуноцит на уничтожение клетки, демонстрирующей антиген. См., например, Эсхар, патент США № 7741465; публикацию заявки на патент США № 2012/0093842; публикацию международной заявки № WO 2014/100385 и публикацию международной заявки № WO 2014/124143. Как минимум CAR содержит внеклеточный домен, который связывается с антигеном, например антигеном на клетке, трансмембранный домен и внутриклеточный (эндоплазматический) сигнальный домен (т.е. внутриклеточный стимулирующий домен), который передает первичный сигнал активации иммуноциту. Если все другие условия удовлетворены, то, когда CAR экспрессируется на поверхности, например, Т-лимфоцита, например первичного Т-лимфоцита, и внеклеточный домен CAR связывается с антигеном, внутриклеточный сигнальный домен передает сигнал Т-лимфоциту на активацию и/или пролиферацию и, если антиген присутствует на поверхности клеток, на уничтожение клетки, экспрессирующей антиген. Поскольку некоторые иммуноциты, например Т-лимфоциты и NK-клетки, требуют двух сигналов, первичный сигнал активации и костимулирующий сигнал, для того чтобы максимально активироваться, то CAR могут также дополнительно содержать костимулирующий домен, в результате чего связывание антигена с внеклеточным доменом приводит к передаче и первичного сигнала активации, и костимулирующего сигнала.
Адаптивные иммунные ответы инициируются во вторичных лимфоидных органах, включая лимфатические узлы. В-клетки и Т-клетки изолируются в различных областях лимфатических узлов, называемых зона В-клеток, расположенная во внешней коре лимфатического узла или фолликулах, и зона Т-клеток, которая является более диффузно распределенной в области, окружающей фолликулы (также известной как паракортекс) соответственно. В-клетки и Т-клетки экспрессируют рецепторы, которые позволяют им перемещаться к этим соответствующим зонам, с тем чтобы они могли быть подвергнуты воздействию антигена. Интактные антигены присутствуют в зоне В-клеток, тогда как в зоне Т-клеток антигены представлены антигенпредставляющими клетками, такими как дендритные клетки. Интактные антигены, такие как антигены опухоли, также присутствуют в местоположении опухоли.
В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированные NK-клетки представляют собой NK-клетки, которые содержат хоминг-рецептор, который вызывает перемещение клетки, содержащей указанный хоминг-рецептор, к специфической анатомической зоне, специфической ткани или специфическому типу клеток, например к зоне В-клеток лимфатических узлов, желудочно-кишечному тракту или коже.
В определенных вариантах осуществления генетически модифицированные NK-клетки представляют собой NK-клетки, которые содержат и CAR, и хоминг-рецептор в соответствии с описанным в настоящем раскрытии.
Не желая быть связанным каким-либо конкретным механизмом или теорией, считается, что, когда генетически модифицированные клетки по настоящему раскрытию экспрессируют хоминг-рецепторы, которые вызывают перемещение клетки, экспрессирующей указанный хоминг-рецептор, к специфической зоне, они имеют большую вероятность подвергнуться воздействию нативного антигена, где клетки, например, клетки, экспрессирующие CAR, могут стать активированными.
NK-клетки, которые содержат CAR и/или хоминг-рецептор, могут генерироваться любым способом, известным в технике. В некоторых вариантах осуществления NK-клетки, содержащие CAR и/или хоминг-рецептор, сначала продуцируют, как описано в разделе 5.2 (например, посредством двухэтапного процесса или трехэтапного процесса), и затем конструируют таким образом, чтобы они экспрессировали CAR и/или хоминг-рецептор, путем внесения в NK-клетки (например, трансфекцией) одного или более векторов, содержащих последовательность(и) нуклеиновых кислот, кодирующую(ие) CAR и/или хомингрецептор. В некоторых вариантах осуществления клетки (например, CD34+ стволовые гематопоэтические клетки), из которых могут быть продуцированы NK-клетки, сначала конструируют таким образом, чтобы они экспрессировали CAR и/или хоминг-рецептор, путем внесения в клетки (например, трансфекцией) одного или более векторов, содержащих последовательность(и) нуклеиновых кислот, кодирующую(ие) CAR и/или хоминг-рецептор, и затем применяют для получения NK-клеток, содержащих CAR и/или хоминг-рецептор посредством любого процесса, описанного в разделе 5.2 (например, посредством двухэтапного процесса или трехэтапного процесса).
5.3.1. Общая структура и внутриклеточный домен CAR.
В определенных вариантах осуществления внутриклеточный домен CAR представляет собой или содержит внутриклеточный домен или мотив белка, который экспрессируется на поверхности иммуноцитов и вызывает активацию и/или пролиферацию указанных NK-клеток. Такой домен или мотив спосо- 50 039192 бен передавать первичный антигенсвязывающий сигнал, который является необходимым для активации NK-клетки в ответ на связывание антигена с внеклеточной частью CAR. Как правило, этот домен или мотив содержат или представляют собой ITAM (иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив). ITAM-содержащие полипептиды, подходящие для CAR, содержат, например, дзэта-цепь CD3 (CD3Z) или ее ITAM-содержащие части. В конкретном варианте осуществления внутриклеточный домен представляет собой внутриклеточный сигнальный домен CD3Z. В других конкретных вариантах осуществления внутриклеточный домен состоит из цепи рецептора лимфоцитов, белкового комплекса TCR/CD3, субъединицы Fc-рецептора или субъединицы рецептора IL-2.
В определенных вариантах осуществления CAR дополнительно содержит один или более костимулирующих доменов или мотивов, например, в качестве части внутриклеточного домена полипептида. Один или более костимулирующих доменов или мотивов могут представлять собой или могут содержать одну или более последовательностей из последовательности костимулирующего полипептида CD27, последовательности костимулирующего полипептида CD28, последовательности костимулирующего полипептида ОХ40 (CD134), последовательности костимулирующего полипептида 4-1ВВ (CD137), последовательности костимулирующего индуцируемого Т-клеточного костимулирующего пептида (ICOS), последовательности костимулирующего полипептида PD-1, последовательности костимулирующего полипептида CTLA-4, последовательности костимулирующего полипептида NKp46, последовательности костимулирующего полипептида NKp44, последовательности костимулирующего полипептида NKp30, последовательности костимулирующего полипептида NKG2D, последовательности костимулирующего полипептида DAP10, последовательности костимулирующего полипептида DAP12 или другого костимулирующего домена или мотива.
Трансмембранная область может представлять собой произвольную трансмембранную область, которая может быть встроена в функциональный CAR, обычно, трансмембранную область из молекулы CD4 или CD8.
5.3.2. Внеклеточный домен CAR.
Внеклеточный домен полипептида связывается с необходимым антигеном. В определенных вариантах осуществления внеклеточный домен содержит рецептор или часть рецептора, который(ая) связывается с указанным антигеном. Внеклеточный домен может представлять собой, например, рецептор или часть рецептора, который(ая) связывается с указанным антигеном. В определенных вариантах осуществления внеклеточный домен содержит или представляет собой антитело или его антигенсвязывающую часть. В конкретных вариантах осуществления внеклеточный домен содержит или представляет собой одноцепочечный домен Fv. Одноцепочечный доменкером, Fv может содержать, например, VL, соединенную с VH гибким линкером, при этом указанные VL и VH взяты из антитела, которое связывает указанный антиген.
Антиген, с которым внеклеточный домен полипептида связывается, может представлять собой любой необходимый антиген, например может представлять собой антиген на опухолевой клетке или антиген на инфицированной клетке. Опухолевая клетка может являться, например, клеткой в солидной опухоли или клеткой рака крови. Антиген может представлять собой любой антиген, который экспрессируется на клетке любого типа опухоли или рака, например клетках лимфомы, рака легких, рака молочной железы, рака простаты, адренокортикального рака, рака щитовидной железы, носоглоточного рака, меланомы, например, злокачественной меланомы, рака кожи, колоректального рака, десмоидной опухоли, десмопластической мелкокруглоклеточной опухоли, эндокринной опухоли, саркомы Юинга, периферической примитивной нейроэктодермальной опухоли, солидной эмбрионально-клеточной опухоли, гептобластомы, нейробластомы, не являющейся рабдомиосаркомой саркомы мягкой ткани, остеогенной саркомы, ретинобластомы, рабдомиосаркомы, опухоли Вильмса, глиобластомы, миксомы, фибромы, липомы и т.п. В более конкретных вариантах осуществления указанная лимфома может представлять собой хронический лимфоцитарный лейкоз (лимфому из малых лимфоцитов), В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, лимфоплазмоцитарную лимфому, макроглобулинемию Вальденстрема, лимфому маргинальной зоны селезенки, миеломная болезнь плазматических клеток, плазмоцитомы, экстранодальную В-клеточную лимфому из клеток маргинальной зоны, лимфому MALT, нодальную В-клеточную лимфому из клеток маргинальной зоны, фолликулярную лимфому, лимфому из клеток мантии, диффузную Вкрупноклеточную лимфому, средостенную (тимусную) В-крупноклеточную лимфому, внутрисосудистую В-крупноклеточную лимфому, первичную выпотную лимфому, лимфому Беркитта, Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, Т-клеточный лейкоз из больших гранулированных лимфоцитов, агрессивный NK-клеточный лейкоз, Т-клеточный лейкоз/лимфому взрослых, экстранодальную NK/T-клеточную лимфому, носовой тип, Т-клеточный лейкоз энтеропатического типа, Т-клеточную лимфому печени и селезенки, бластическую NK-клеточную лимфому, фунгоидный микоз, синдром Сезари, первичную кожную анапластическую крупноклеточную лимфому, лимфоматоидный папулез, ангиоиммунобластическую лимфому Т-лимфоцитов, периферическую лимфому Т-лимфоцитов (неопределенную), анапластическую крупноклеточную лимфому, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфома или множественную миелому.
- 51 039192
В определенных вариантах осуществления антиген представляет собой ассоциированный с опухолью антиген (ТАА) или специфичный для опухоли антиген (TSA). В различных конкретных вариантах осуществления, без ограничения, ассоциированный с опухолью антиген (ТАА) или специфичный для опухоли антиген представляет собой Her2, антиген стволовых клеток предстательной железы (PSCA), альфа-фетопротеин (AFP), карциноэмбриональный антиген (СЕА), раковый антиген-125 (СА-125), СА19-9, калретинин, MUC-1, эпителиальный мембранный белок (ЕМА), эпителиальный антиген опухоли (ЕТА), тирозиназу, ассоциированный с меланомой антиген (MAGE), CD19, CD20, CD34, CD45, CD99, CD117, хромогранин, цитокератин, десмин, глиофибриллярный кислый белок(GF AP), белок жидкости макроскопического поликистоза (GCDFP-15), антиген НМВ-45, высокомолекулярный ассоциированный с меланомой антиген (HMW-MAA), белок мелан-А (MART-1), мио-DI, мышцеспецифичный актин (MSA), нейрофиламент, нейрон-специфическую енолазу (NSE), плацентарную щелочную фосфатазу, синаптофизин, тиреоглобулин, транскрипционный фактор щитовидной железы-1, димерную форму изофермента пируваткиназы типа M2 (опухоль M2-PK), патологический ras-белок или патологический белок р53.
В определенных вариантах осуществления ТАА или TSA представляет собой антиген рака/яичек (СТ), например BAGE, CAGE, CTAGE, FATE, GAGE, HCA661, HOM-TES-85, MAGEA, MAGEB, MAGEC, NA88, NY-ESO-1, NY-SAR-35, OY-TES-1, SPANXB1, SPA17, SSX, SYCP1 или ТРТЕ.
В определенных других вариантах осуществления ТАА или TSA представляет собой углевод или ганглиозид, например fuc-GM1, GM2 (онкофетальный иммуногенный антиген-1; OFA-I-1); GD2 (OFA-I-2), GM3, GD3 и т.п.
В определенных других вариантах осуществления ТАА или TSA представляет собой альфаактинин-4, Bage-1, BCR-ABL, слитый белок Bcr-Abl, бета-катенин, СА 125, Са 15-3 (СА 27.29/ВСАА), СА 195, СА 242, СА 50, САМ43, Casp-8, cdc27, cdk4, cdkn2a, CEA, coa-1, слитый белок dek-can, EBNA, EF2, антигены вируса Эпштейна-Барр, слитый белок ETV6-AML1, HLA-A2, HLA-A11, hsp70-2, KIAAO205, Mart2, Mum-1, 2 и 3, neo-PAP, миозин класса I, OS-9, слитый белок pml-RARa, PTPRK, K-ras, N-ras, триозофосфатизомеразу, Gage 3, 4, 5, 6, 7, GnTV, Herv-K-mel, Lage-1, NA-88, NY-Eso-1/Lage-2, SP17, SSX-2, TRP2-Int2, gp100 (Pmel 17), тирозиназу, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, RAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15 (58), RAGE, SCP-1, Hom/Mel-40, PRAME, p53, H-Ras, HER-2/neu, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, антигены вируса папилломы человека (HPV) Е6 и Е7, TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 13-катенин, Mum-1, p16, TAGE, PSMA, CT7, теломеразу, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 13HCG, BCA225, BTAA, CD68/KP1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7 Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, ТА 90, TAAL6, TAG72, TLP, TPS, CD19, CD22, CD27, CD30, CD70, GD2 (ганглиозид G2), EGFRvIII (вариант III эпидермального фактора роста), белок спермы 17 (Sp17), мезотелин, PAP (простатическая кислая фосфатаза), простенин, TARP (белок альтернативной рамки считывания гамма-цепи Т-клеточного рецептора), Trpp8, STEAP1 (шестой трансмембранный эпителиальный антиген предстательной железы-1), патологический ras-белок или патологический белок р53. В другом конкретном варианте осуществления указанный ассоциированный с опухолью антиген или специфичный для опухоли антиген представляет собой интегрин αΎβ3 (CD61), галактин, K-Ras (вирусный онкоген крысиной саркомы Кирстена V-Ki-ras2) или Ral-В.
В конкретных вариантах осуществления ТАА или TSA представляет собой CD20, CD123, CLL-1, CD38, CS-1, CD138, ROR1, FAP, MUC1, PSCA, EGFRvIII, EPHA2 или GD2. В дальнейших конкретных вариантах осуществления ТАА или TSA представляет собой CD123, CLL-1, CD38 или CS-1. В конкретном варианте осуществления внеклеточный домен CAR связывает CS-1. В дальнейшем конкретном варианте осуществления внеклеточный домен содержит одноцепочечную версию элотузумаба и/или антигенсвязывающего фрагмента элотузумаба. В конкретном варианте осуществления внеклеточный домен CAR связывает CD20. В более конкретном варианте осуществления внеклеточный домен CAR представляет собой scFv или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с CD20.
Другие ассоциированные с опухолью и специфичные для опухоли антигены известны специалистам в данной области техники.
Антитела и scFv, которые связываются с TSA и ТАА, известны в технике, так же как и нуклеотидные последовательности, которые кодируют их.
В определенных конкретных вариантах осуществления антиген представляет собой антиген, который не считают являющимся TSA или ТАА, но который тем не менее ассоциирован с опухолевыми клетками или повреждениями, вызываемыми опухолью. В конкретных вариантах осуществления антиген представляет собой ассоциированный с микроокружением опухоли антиген (ТМАА). В определенных вариантах осуществления, например, ТМАА представляет собой, например, фактор роста, цитокин или интерлейкин, например фактор роста, цитокин или интерлейкин, ассоциированный с ангиогенезом или образованием и развитием сосудов. Такие факторы роста, цитокины или интерлейкины могут включать в себя, например, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), основной фактор роста фибробластов (bFGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), фактор роста гепатоцитов (HGF), инсулиноподобный фактор ро
- 52 039192 ста (IGF) или интерлейкин-8 (IL-8). Опухоли могут также создавать гипоксическую среду, локальную для опухоли. Также в других конкретных вариантах осуществления ТМАА представляет собой ассоциированный с гипоксией фактор, например, HIF-1a, HIF-1a, HIF-2a, HIF-2e, HIF-3a или HIF-3e. Опухоли могут также вызывать повреждение здоровой ткани, вызывая высвобождение молекул, о которых известно, что они вызывают повреждение ассоциированных молекул молекулярных паттернов (DAMP; также известные как алармины). В определенных других конкретных вариантах осуществления, таким образом, ТМАА представляет собой DAMP, например белок теплового шока, хроматинассоциированный Box1-белок из группы белков высокой мобильности (HMGB1), S100A8 (MRP8, калгранулин A), S100A9 (MRP14, калгранулин В), сывороточный амилоид (SAA), или может представлять собой дезоксирибонуклеиновую кислоту, аденозинтрифосфат, мочевую кислоту или гепаринсульфат. В конкретных вариантах осуществления ТМАА представляет собой VEGF-А, EGF, PDGF, IGF или bFGF.
В конкретном варианте осуществления, в котором рак представляет собой желудочно-кишечный рак, например рак печени, рак желудка, рак пищевода, рак желчного пузыря, рак ободочной и прямой кишки, рак анального канала или рак поджелудочной железы, антиген представляет собой антиген, специфичный или ассоциированный с желудочно-кишечным раком. В конкретном варианте осуществления NK-клетки содержат желудочно-кишечный хоминг-рецептор и также содержат CAR с внеклеточным доменом, который связывается с антигеном, ассоциированным с желудочно-кишечным раком. В конкретном варианте осуществления внеклеточный домен CAR связывает СЕА. В других конкретных вариантах осуществления внеклеточный домен CAR связывает Her2, CA242, MUC1, СА125 или СА19-9.
В конкретном варианте осуществления, в котором рак представляет собой рак кожи, например меланому, плоскоклеточную карциному или базально-клеточную карциному, антиген представляет собой антиген, специфичный или ассоциированный с раком кожи. В конкретном варианте осуществления NK-клетки содержат хоминг-рецептор для кожи и также содержат CAR с внеклеточным доменом, который связывается с антигеном, ассоциированным с раком кожи. В конкретном варианте осуществления внеклеточный домен CAR связывает HMW-MAA. В других конкретных вариантах осуществления внеклеточный домен CAR связывает Her2, GD2, GD3, СЕА или SPAG9.
В определенных вариантах осуществления внеклеточный домен соединяется с указанным трансмембранным доменом посредством линкера, спейсера или шарнирной полипептидной последовательности, например, последовательностью из CD28.
5.3.3. Хоминг-рецепторы системы кровообращения.
В определенных вариантах осуществления хоминг-рецептор вызывает перемещение клетки, содержащей указанный хоминг-рецептор, в систему кровообращения. Такой рецептор в настоящем изобретении называют хоминг-рецептор системы кровообращения. В различных вариантах осуществления хоминг-рецептор системы кровообращения является хемотаксическим рецептором. В конкретном варианте осуществления хемотаксический рецептор представляет собой CXCR4, VEGFR2 или CCR7.
В одном из вариантов осуществления хоминг-рецептор вызывает перемещение клетки, содержащей указанный хоминг-рецептор, в костный мозг. Такой рецептор в настоящем изобретении называют хоминг-рецептор костного мозга. В конкретных вариантах осуществления хоминг-рецептор костного мозга представляет собой CXCR4, например, человеческий CXCR4. Под кодами доступа GenBank™ NM 001008540.1 и NM 003467.2 представлены типовые нуклеотидные последовательности для человеческого CXCR4. Под кодами доступа GenBank™ NP 001008540,1 и NP 003458.1 представлены типовые аминокислотные последовательности для человеческого CXCR4. Типовые нуклеотидные и аминокислотные последовательности для человеческих хоминг-рецепторов можно найти в таблице.
В другом варианте осуществления хоминг-рецептор вызывает перемещение клетки, содержащей указанный хоминг-рецептор, к вторичному лимфоидному органу, например лимфатическому узлу. Такой рецептор в настоящем изобретении называют хоминг-рецептор вторичного лимфоидного органа. В конкретных вариантах осуществления хоминг-рецептор вторичного лимфоидного органа представляет собой CCR7, например, человеческий CCR7. Под кодами доступа GenBank™ NM 001301714.1, NM 001301716.1, NM 001301717.1, NM 001301718.1 и NM 001838.3 представлены типовые нуклеотидные последовательности для человеческого CCR7. Под кодами доступа GenBank™ NP 001288643.1, NP 001288645.1 NP 00128864 б.1, NP 001288647.1 и NP 001829.1 представлены типовые аминокислотные последовательности для человеческого CCR7. Типовые нуклеотидные и аминокислотные последовательности для человеческих хоминг-рецепторов можно найти в таблице.
В другом варианте осуществления хоминг-рецептор вызывает перемещение клетки, содержащей указанный хоминг-рецептор, в эндотелий сосудов. Такой рецептор в настоящем изобретении называют хоминг-рецептор эндотелия сосудов. В конкретных вариантах осуществления хоминг-рецептор эндотелия сосудов представляет собой VEGFR2, например человеческий VEGFR2. Под кодом доступа GenBank™ NM 002253.2 представлены типовые нуклеотидные последовательности для человеческого VEGFR2. Под кодом доступа GenBank™ NP 002244.1 представлены типовые аминокислотные последовательности для человеческого VEGFR2. Типовые нуклеотидные и аминокислотные последовательности для человеческих хоминг-рецепторов можно найти в таблице.
- 53 039192
В другом варианте осуществления хоминг-рецептор вызывает перемещение клетки, содержащей указанный хоминг-рецептор, в зону В-клеток лимфатических узлов, например фолликулы лимфатического узла. Такой рецептор в настоящем изобретении называют хоминг-рецептор зоны В-клеток. В конкретных вариантах осуществления хоминг-рецептор зоны В-клеток представляет собой CXCR5, например человеческий CXCR5. Под кодами доступа GenBank™ NM 001716.4 и NM 032966.2 представлены типовые нуклеотидные последовательности для человеческого CXCR5. Под кодами доступа GenBank™ NP 116743.1 и NP 001707.1 представлены типовые аминокислотные последовательности для человеческого CXCR5. Типовые нуклеотидные и аминокислотные последовательности для человеческих хоминг-рецепторов можно найти в таблице.
В некоторых вариантах осуществления этап конструирования NK-клетки, содержащей хомингрецептор системы кровообращения, включает в себя этап введения в клетки одного или более векторов, содержащих последовательность(и) нуклеиновых кислот рецептора(ов), т.е. последовательность(и) нуклеиновых кислот, кодирующую(ие) рецептор(ы). В конкретных вариантах осуществления вектор содержит нуклеотидную последовательность для человеческого CXCR4, CCR7, VEGFR2 или CXCR5. В определенном варианте осуществления этап конструирования NK-клетки, содержащей хоминг-рецептор системы кровообращения, выполняют любым способом, известным специалисту в данной области техники.
Также в настоящем изобретении описан способ генерации генно-инженерных NK-клеток, которые перемещаются в систему кровообращения, включающий в себя этап конструирования NK-клетки, содержащей хоминг-рецептор системы кровообращения, например CXCR4, CCR7, VEGFR2 или CXCR5, при этом указанный хоминг-рецептор системы кровообращения экспрессируется клеткой на достаточном уровне или в достаточном количестве, чтобы вызывать перемещение клетки в систему кровообращения. В некоторых вариантах осуществления этап конструирования NK-клетки, содержащей хоминг-рецептор системы кровообращения, включает в себя этап введения в клетки одного или более векторов, содержащих последовательность(и) нуклеиновых кислот рецептора(ов), т.е. последовательность(и) нуклеиновых кислот, кодирующую(ие) рецептор(ы). В конкретных вариантах осуществления вектор содержит нуклеотидную последовательность для человеческого CXCR4, CCR7, VEGFR2 или CXCR5. В определенном варианте осуществления этап конструирования NK-клетки, содержащей хоминг-рецептор системы кровообращения, выполняют любым способом, известным специалисту в данной области техники.
5.3.4. Желудочно-кишечные хоминг-рецепторы.
В одном из вариантов осуществления хоминг-рецептор вызывает перемещение клетки, содержащей указанный хоминг-рецептор, к желудочно-кишечному тракту, например желудочно-кишечным органам, тканям или клеткам. Такой рецептор, который вызывает перемещение клетки к желудочно-кишечному тракту, в настоящем изобретении называют желудочно-кишечный хоминг-рецептор. В определенных вариантах осуществления желудочно-кишечный хоминг-рецептор представляет собой CCR9 или интегрин α4β7, например человеческий CCR9 или человеческий интегрин α4β7. Под кодами доступа GenBank™ NM 031200,2 и NM001256369.1 представлены типовые нуклеотидные последовательности для человеческого CCR9. Под кодами доступа GenBank™ NP 112477.1 и NP 001243298.1 представлены типовые аминокислотные последовательности для человеческого CCR9. Под кодами доступа GenBank™ NM 0008 85.4 и NM 000889.2 представлены типовые нуклеотидные последовательности для человеческого α4 и человеческого β7 соответственно. Под кодами доступа GenBank™ NP 000876.3 и NP 000880.1 представлены типовые аминокислотные последовательности для человеческого α4 и человеческого β7 соответственно. Типовые нуклеотидные и аминокислотные последовательности для человеческих хоминг-рецепторов можно найти в таблице. В некоторых вариантах осуществления NK-клетки дополнительно содержат второй желудочно-кишечный хоминг-рецептор. В некоторых вариантах осуществления NK-клетки содержат первый желудочно-кишечный хоминг-рецептор, при этом первый желудочнокишечный хоминг-рецептор представляет собой CCR9, и дополнительно содержат второй желудочнокишечный хоминг-рецептор, при этом второй желудочно-кишечный хоминг-рецептор представляет собой интегрин α4β7. В других конкретных вариантах осуществления NK-клетки содержат желудочнокишечный хоминг-рецептор CXCR3.
В определенных вариантах осуществления NK-клетки, содержащие один или более желудочнокишечных хоминг-рецепторов, расширяются, активируются или и расширяются, и активируются в присутствии метаболита витамина А. В конкретных вариантах осуществления расширение, активация или и расширение, и активация происходят in vivo, in vitro или ex vivo. В конкретных вариантах осуществления метаболит витамина А представляет собой ретиноевую кислоту. В определенных вариантах осуществления NK-клетки, содержащие один или более желудочно-кишечных хоминг-рецепторов, дополнительно содержат хоминг-рецептор зоны В-клеток. В конкретных вариантах осуществления хоминг-рецептор зоны В-клеток представляет собой CXCR5.
Также в настоящем изобретении описаны способы генерации генетически модифицированных NK-клеток, которые перемещаются к желудочно-кишечному тракту, например желудочно-кишечным органам, коже или ткани. В определенных вариантах осуществления NK-клетки, содержащие один или более хоминг-рецепторов, которые вызывают перемещение клетки, содержащей один или более рецеп
- 54 039192 торов, к желудочно-кишечному тракту, например CCR9 или интегрин α4β7, генерируют посредством способа, включающего в себя этап конструирования NK-клетки, экспрессирующей один или более желудочно-кишечных хоминг-рецепторов. В некоторых вариантах осуществления этап конструирования NK-клетки, содержащей один или более желудочно-кишечных хоминг-рецепторов, включает в себя введение в клетки одного или более векторов, содержащих последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую хоминг-рецептор. В конкретных вариантах осуществления вектор содержит нуклеотидную последовательность для человеческого CCR9, нуклеотидную последовательность для человеческого интегрина α4β7, или обе последовательности.
В определенных вариантах осуществления NK-клетки, которые перемещаются к желудочнокишечному тракту, генерируют посредством способа, включающего в себя этап обработки клеток молекулой, которая индуцирует экспрессию одного или более желудочно-кишечных хоминг-рецепторов, например CCR9 или α4β7. В конкретных вариантах осуществления молекула представляет собой витамин А.
В определенных вариантах осуществления способ для генерации генетически модифицированных NK-клеток, которые содержат один или более рецепторов, которые вызывают перемещение клеток, содержащих эти один или более рецепторов, к желудочно-кишечному тракту, включает в себя этап расширения клеток, и данный этап выполняют в присутствии метаболита витамина А. В определенных вариантах осуществления способ для генерации генетически модифицированных NK-клеток, которые содержат один или более рецепторов, вызывающих перемещение к желудочно-кишечному тракту, включает в себя этап активирования клеток, и данный этап выполняют в присутствии метаболита витамина А. В определенных вариантах осуществления и этапы расширения, и этапы активирования выполняют в присутствии метаболита витамина А. В определенных вариантах осуществления метаболит витамина А представляет собой ретиноевую кислоту. В определенном варианте осуществления этап конструирования NK-клетки, содержащей желудочно-кишечный хоминг-рецептор, выполняют любым способом, известным специалисту в данной области техники.
5.3.5. Хоминг-рецепторы кожи.
В одном из вариантов осуществления хоминг-рецептор вызывает перемещение клетки, содержащей указанный хоминг-рецептор, в кожу, например ткани или клетки кожи. В определенных вариантах осуществления хоминг-рецептор кожи представляет собой CCR10, CCR8, CCR4 или CLA, например человеческий CCR10, человеческий CCR8, человеческий CCR4 или человеческий CLA. Под кодами доступа GenBank™ NM 016602.2 и AF215981.1 представлены типовые нуклеотидные последовательности для человеческого CCR10. Под кодами доступа GenBank™ NP 057 686.2 и Р46092.3 представлены типовые аминокислотные последовательности для человеческого CCR10. Под кодами доступа GenBank™ NM 005201.3 и ВС107159.1 представлены типовые нуклеотидные последовательности для человеческого CCR8. Под кодами доступа GenBank™ NP 005192.1 и AAI07160,1 представлены типовые аминокислотные последовательности для человеческого CCR8. Под кодом доступа GenBank™ NM 005508.4 представлена типовая нуклеотидная последовательность для человеческого CCR4. Под кодом доступа GenBank™ P51679.1 представлена типовая аминокислотная последовательность для человеческого CCR4. Под кодами доступа GenBank™ NM 001206609.1 и NM 003006.4 представлены типовые нуклеотидные последовательности для человеческого CLA. Под кодами доступа GenBank™ NP 001193538.1 и NP 002997.2 представлены типовые аминокислотные последовательности для человеческого CLA. Типовые нуклеотидные и аминокислотные последовательности для человеческих хоминг-рецепторов можно найти в таблице. В некоторых вариантах осуществления NK-клетки дополнительно содержат второй хоминг-рецептор кожи. В некоторых вариантах осуществления NK-клетки содержат первый хомингрецептор кожи, при этом первый хоминг-рецептор кожи представляет собой CCR10, и дополнительно содержат второй хоминг-рецептор кожи, при этом второй хоминг-рецептор кожи представляет собой CLA. В некоторых вариантах осуществления NK-клетки содержат первый хоминг-рецептор кожи, при этом первый хоминг-рецептор кожи представляет собой CCR10, и дополнительно содержат второй хоминг-рецептор кожи, при этом второй хоминг-рецептор кожи представляет собой CCR4. В некоторых вариантах осуществления NK-клетки содержат первый хоминг-рецептор кожи, при этом первый хомингрецептор кожи представляет собой CCR4, и дополнительно содержат второй хоминг-рецептор кожи, при этом второй хоминг-рецептор кожи представляет собой CLA. В некоторых вариантах осуществления NK-клетки дополнительно содержат третий хоминг-рецептор кожи. В некоторых вариантах осуществления NK-клетки содержат первый хоминг-рецептор кожи, при этом первый хоминг-рецептор кожи представляет собой CCR10, дополнительно содержат второй хоминг-рецептор кожи, при этом второй хомингрецептор кожи представляет собой CCR4, и дополнительно содержат третий хоминг-рецептор кожи, при этом третий хоминг-рецептор кожи представляет собой CLA. В некоторых вариантах осуществления NK-клетки содержат первый хоминг-рецептор кожи, при этом первый хоминг-рецептор кожи представляет собой CCR8, и дополнительно содержат второй хоминг-рецептор кожи, при этом второй хомингрецептор кожи представляет собой CLA, CCR4 или CCR10. В некоторых вариантах осуществления NK-клетки содержат первый хоминг-рецептор кожи, при этом первый хоминг-рецептор кожи представ
- 55 039192 ляет собой CCR8, и дополнительно содержат второй хоминг-рецептор кожи, при этом второй хомингрецептор кожи представляет собой CLA, CCR4 или CCR10, и дополнительно содержат третий хомингрецептор кожи, при этом третий хоминг-рецептор кожи отличается от второго хоминг-рецептора кожи и выбирается из группы, состоящей из CLA, CCR4 и CCR10. В некоторых вариантах осуществления NK-клетки дополнительно содержат третий хоминг-рецептор кожи. В некоторых вариантах осуществления NK-клетки содержат первый хоминг-рецептор кожи, при этом первый хоминг-рецептор кожи представляет собой CCR10, дополнительно содержат второй хоминг-рецептор кожи, при этом второй хомингрецептор кожи представляет собой CCR4, дополнительно содержат третий хоминг-рецептор кожи, при этом третий хоминг-рецептор кожи представляет собой CLA, и дополнительно содержат четвертый хоминг-рецептор кожи, при этом четвертый хоминг-рецептор кожи представляет собой CCR8. В определенных вариантах осуществления NK-клетки содержат один или более хоминг-рецепторов кожи. В других конкретных вариантах осуществления NK-клетки содержат хоминг-рецептор кожи CCR6.
В определенных вариантах осуществления NK-клетки, содержащие один или более хомингрецепторов кожи, расширяются, активируются или и расширяются, и активируются в присутствии метаболита витамина D. В конкретных вариантах осуществления расширение, активация или и расширение, и активация происходят in vivo, in vitro или ex vivo. В конкретных вариантах осуществления метаболит витамина D представляет собой 1,25-дигидроксихолекальциферол (1,25(OH)2D3). В определенных вариантах осуществления NK-клетки, содержащие один или более хоминг-рецепторов кожи, расширяются, активируются или и расширяются, и активируются в присутствии IL-12. В конкретных вариантах осуществления расширение, активация или и расширение, и активация происходят in vivo, in vitro или ex vivo. В более конкретных вариантах осуществления NK-клетки, содержащие один или более хомингрецепторов кожи, расширяются, активируются или и расширяются, и активируются в присутствии метаболита витамина D и IL-12. В конкретных вариантах осуществления расширение, активация или и расширение, и активация происходят in vivo, in vitro или ex vivo. В определенных вариантах осуществления NK-клетки, содержащие один или более хоминг-рецепторов кожи, дополнительно содержат хомингрецептор зоны В-клеток. В конкретных вариантах осуществления хоминг-рецептор зоны В-клеток представляет собой CXCR5.
Также в настоящем изобретении описаны способы генерации генетически модифицированных NK-клеток, которые перемещаются в кожу, например ткани или клетки кожи. В определенных вариантах осуществления NK-клетки, которые перемещаются в кожу, генерируют посредством способа, включающего в себя этап конструирования NK-клетки, содержащей хоминг-рецептор кожи, например CCR4, CCR8, CCR10 или CLA. В некоторых вариантах осуществления этап конструирования NK-клетки, содержащей хоминг-рецептор кожи, включает в себя введение в клетки одного или более векторов, содержащих последовательность(и) нуклеиновых кислот рецептора(ов), т.е. последовательность(и) нуклеиновых кислот, кодирующую(ие) рецептор(ы). В конкретных вариантах осуществления вектор содержит нуклеотидную последовательность для человеческого CCR10, нуклеотидную последовательность для человеческого CLA, или обе последовательности. В конкретных вариантах осуществления вектор содержит нуклеотидную последовательность для человеческого CCR4 и, необязательно, содержит нуклеотидную последовательность для человеческого CLA. В конкретных вариантах осуществления вектор содержит нуклеотидную последовательность для человеческого CCR4 и нуклеотидную последовательность для человеческого CCR10. В конкретных вариантах осуществления вектор содержит нуклеотидную последовательность для человеческого CCR10, нуклеотидную последовательность для человеческого CCR4 и нуклеотидную последовательность для человеческого CLA. В конкретных вариантах осуществления вектор содержит нуклеотидную последовательность для человеческого CCR8. В конкретных вариантах осуществления вектор содержит нуклеотидную последовательность для человеческого CCR8 и, необязательно, нуклеотидную последовательность для человеческого CLA. В конкретных вариантах осуществления вектор содержит нуклеотидную последовательность для человеческого CCR8 и нуклеотидную последовательность для человеческого CCR10. В конкретных вариантах осуществления вектор содержит нуклеотидную последовательность для человеческого CCR8, нуклеотидную последовательность для человеческого CCR4 и нуклеотидную последовательность для человеческого CLA. В конкретных вариантах осуществления вектор содержит нуклеотидную последовательность для человеческого CCR8, нуклеотидную последовательность для человеческого CCR10 и нуклеотидную последовательность для человеческого CLA. В конкретных вариантах осуществления вектор содержит нуклеотидную последовательность для человеческого CCR8, нуклеотидную последовательность для человеческого CCR4 и нуклеотидную последовательность для человеческого CCR10. В конкретных вариантах осуществления вектор содержит нуклеотидную последовательность для человеческого CCR8, нуклеотидную последовательность для человеческого CCR4, нуклеиновую кислоту для CCR10 и нуклеотидную последовательность для человеческого CLA.
В определенных вариантах осуществления клетки, например NK-клетки, которые перемещаются к коже, генерируют посредством способа, включающего в себя этап обработки клеток, например NK-клеток, молекулой, которая индуцирует, например повышает, экспрессию одного или более хомингрецепторов кожи, например CCR4, CCR10, CCR8 или CLA. В конкретных вариантах осуществления мо- 56 039192 лекула представляет собой витамин D. В определенных вариантах осуществления индуцированию экспрессии хоминг-рецепторов кожи способствуют посредством обработки клеток, например NK-клеток,
IL-12, например контактирования клеток с IL-12 в количестве и в течение периода времени, являющихся достаточными для повышения экспрессии одного или более из CCR4, CCR8, CCR10 или CLA указанными клетками.
В определенных вариантах осуществления способ для генерации NK-клеток, которые содержат один или более хоминг-рецепторов, которые вызывают перемещение клетки, содержащей один или более этих рецепторов, в кожу, включает в себя этап расширения клеток, и этот этап выполняют в присутствии метаболита витамина D и, необязательно, IL-12. В определенных вариантах осуществления способ для генерации NK-клеток, которые содержат один или более рецепторов, которые вызывают перемещение клетки, содержащей один или более этих рецепторов, к желудочно-кишечному тракту, включает в себя этап активирования клеток, и этот этап выполняют в присутствии метаболита витамина D и, необязательно, IL-12. В определенных вариантах осуществления и этапы расширения, и этапы активирования выполняют в присутствии метаболита витамина D и, необязательно, IL-12. В определенных вариантах осуществления метаболит витамина D представляет собой 1,25(OH)2D3. В определенном варианте осуществления этап конструирования NK-клетки, содержащей хоминг-рецептор кожи, выполняют любым способом, известным специалисту в данной области техники.
Типовые нуклеотидные и аминокислотные последовательности для человеческих хоминг-рецепторов
ID SEQ NO: Код доступа GenBank и описание Последовательность
1 NM_0010085 40.1 Типовая последоват ельность нуклеиновы х кислот, кодирующая изоформу а человеческ ого CXCR4 1 ttttttttct tccctctagt gggcggggca gaggagttag ccaagatgtg actttgaaac 61 cctcagcgtc tcagtgccct tttgttctaa acaaagaatt ttgtaattgg ttctaccaaa 121 gaaggatata atgaagtcac tatgggaaaa gatggggagg agagttgtag gattctacat 181 taattctctt gtgcccttag cccactactt cagaatttcc tgaagaaagc aagcctgaat 241 tggtttttta aattgcttta aaaatttttt ttaactgggt taatgcttgc tgaattggaa 301 gtgaatgtcc attcctttgc ctcttttgca gatatacact tcagataact acaccgagga 361 aatgggctca ggggactatg actccatgaa ggaaccctgt ttccgtgaag aaaatgctaa 421 tttcaataaa atcttcctgc ccaccatcta ctccatcatc ttcttaactg gcattgtggg 481 caatggattg gtcatcctgg tcatgggtta ccagaagaaa ctgagaagca tgacggacaa 541 gtacaggctg cacctgtcag tggccgacct cctctttgtc atcacgcttc ccttctgggc 601 agttgatgcc gtggcaaact ggtactttgg gaacttccta tgcaaggcag tccatgtcat 661 ctacacagtc aacctctaca gcagtgtcct catcctggcc ttcatcagtc tggaccgcta
- 57 039192
721 cctggccatc gtccacgcca ccaacagtca gaggccaagg
aagctgttgg ctgaaaaggt 781 ggtctatgtt ggcgtctgga tccctgccct cctgctgact
attcccgact tcatctttgc 841 caacgtcagt gaggcagatg acagatatat ctgtgaccgc
ttctacccca atgacttgtg 901 ggtggttgtg ttccagtttc agcacatcat ggttggcctt
atcctgcctg gtattgtcat 961 cctgtcctgc tattgcatta tcatctccaa gctgtcacac
tccaagggcc accagaagcg 1021 caaggccctc aagaccacag tcatcctcat cctggctttc
ttcgcctgtt ggctgcctta 1081 ctacattggg atcagcatcg actccttcat cctcctggaa
atcatcaagc aagggtgtga 1141 gtttgagaac actgtgcaca agtggatttc catcaccgag
gccctagctt tcttccactg 1201 ttgtctgaac cccatcctct atgctttcct tggagccaaa
tttaaaacct ctgcccagca 1261 cgcactcacc tctgtgagca gagggtccag cctcaagatc
ctctccaaag gaaagcgagg 1321 tggacattca tctgtttcca ctgagtctga gtcttcaagt
tttcactcca gctaacacag 1381 atgtaaaaga ctttttttta tacgataaat aacttttttt
taagttacac atttttcaga 1441 tataaaagac tgaccaatat tgtacagttt ttattgcttg
ttggattttt gtcttgtgtt 1501 tctttagttt ttgtgaagtt taattgactt atttatataa
attttttttg tttcatattg 1561 atgtgtgtct aggcaggacc tgtggccaag ttcttagttg
ctgtatgtct cgtggtagga 1621 ctgtagaaaa gggaactgaa cattccagag cgtgtagtga
atcacgtaaa gctagaaatg 1681 atccccagct gtttatgcat agataatctc tccattcccg
tggaacgttt ttcctgttct 1741 taagacgtga ttttgctgta gaagatggca cttataacca
aagcccaaag tggtatagaa 1801 atgctggttt ttcagttttc aggagtgggt tgatttcagc
- 58 039192
acctacagtg tacagtcttg 1861 tattaagttg ttaataaaag tacatgttaa acttaaaaaa aaaaaaaaaa aa
2 NM_003467. 2 Типовая последоват ельность нуклеиновы х кислот, кодирующая изоформу b человеческ ого CXCR4 1 aacttcagtt tgttggctgc ggcagcaggt agcaaagtga cgccgagggc ctgagtgctc 61 cagtagccac cgcatctgga gaaccagcgg ttaccatgga ggggatcagt atatacactt 121 cagataacta caccgaggaa atgggctcag gggactatga ctccatgaag gaaccctgtt 181 tccgtgaaga aaatgctaat ttcaataaaa tcttcctgcc caccatctac tccatcatct 241 tcttaactgg cattgtgggc aatggattgg tcatcctggt catgggttac cagaagaaac 301 tgagaagcat gacggacaag tacaggctgc acctgtcagt ggccgacctc ctctttgtca 361 tcacgcttcc cttctgggca gttgatgccg tggcaaactg gtactttggg aacttcctat 421 gcaaggcagt ccatgtcatc tacacagtca acctctacag cagtgtcctc atcctggcct 481 tcatcagtct ggaccgctac ctggccatcg tccacgccac caacagtcag aggccaagga 541 agctgttggc tgaaaaggtg gtctatgttg gcgtctggat ccctgccctc ctgctgacta 601 ttcccgactt catctttgcc aacgtcagtg aggcagatga cagatatatc tgtgaccgct 661 tctaccccaa tgacttgtgg gtggttgtgt tccagtttca gcacatcatg gttggcctta 721 tcctgcctgg tattgtcatc ctgtcctgct attgcattat catctccaag ctgtcacact 781 ccaagggcca ccagaagcgc aaggccctca agaccacagt catcctcatc ctggctttct 841 tcgcctgttg gctgccttac tacattggga tcagcatcga ctccttcatc ctcctggaaa 901 tcatcaagca agggtgtgag tttgagaaca ctgtgcacaa gtggatttcc atcaccgagg 961 ccctagcttt cttccactgt tgtctgaacc ccatcctcta
- 59 039192
tgctttcctt ggagccaaat 1021 ttaaaacctc tgcccagcac gcactcacct ctgtgagcag agggtccagc ctcaagatcc 1081 tctccaaagg aaagcgaggt ggacattcat ctgtttccac tgagtctgag tcttcaagtt 1141 ttcactccag ctaacacaga tgtaaaagac ttttttttat acgataaata actttttttt 1201 aagttacaca tttttcagat ataaaagact gaccaatatt gtacagtttt tattgcttgt 1261 tggatttttg tcttgtgttt ctttagtttt tgtgaagttt aattgactta tttatataaa 1321 ttttttttgt ttcatattga tgtgtgtcta ggcaggacct gtggccaagt tcttagttgc 1381 tgtatgtctc gtggtaggac tgtagaaaag ggaactgaac attccagagc gtgtagtgaa 1441 tcacgtaaag ctagaaatga tccccagctg tttatgcata gataatctct ccattcccgt 1501 ggaacgtttt tcctgttctt aagacgtgat tttgctgtag aagatggcac ttataaccaa 1561 agcccaaagt ggtatagaaa tgctggtttt tcagttttca ggagtgggtt gatttcagca 1621 cctacagtgt acagtcttgt attaagttgt taataaaagt acatgttaaa cttaaaaaaa 1681 aaaaaaaaaa a
3 NP_0010085 40.1 Типовая последоват ельность аминокисло т для изоформы а человеческ ого CXCR4 1 msiplpllqi ytsdnyteem gsgdydsmke pcfreenanf nkiflptiys iifltgivgn 61 glvilvmgyq kklrsmtdky rlhlsvadll fvitlpfwav davanwyfgn flckavhviy 121 tvnlyssvli lafisldryl aivhatnsqr prkllaekvv yvqvwipall Itipdfifan 181 vseaddryic drfypndlwv vvfqfqhimv glilpgivil scyciiiskl shskghqkrk 241 alkttvilil affacwlpyy igisidsfil leiikqgcef entvhkwisi tealaffhcc 301 Inpilyaflg akfktsaqha Itsvsrgssl kilskgkrgg hssvsteses ssfhss
- 60 039192
4 NP_003458. 1 Типовая последоват ельность аминокисло т для изоформы b человеческ ого CXCR4 1 megisiytsd nyteemgsgd ydsmkepcfr eenanfnkif Iptiysiifl tgivgnglvi 61 Ivmgyqkklr smtdkyrlhl svadllfvit Ipfwavdava nwyfgnflck avhviytvnl 121 yssvlilafi sldrylaivh atnsqrprkl laekvvyvgv wipallltip dfifanvsea 181 ddryicdrfy pndlwvvvfq fqhimvglil pgivilscyc iiisklshsk ghqkrkalkt 241 tvililaffa cwlpyyigis idsfilleii kqgcefentv hkwisiteal affhcclnpi 301 lyaflgakfk tsaqhaltsv srgsslkils kgkrgghssv stesesssfh ss
5 NM_0013017 14.1 Типовая последоват ельность нуклеиновы х кислот, кодирующая изоформу b человеческ ого CCR7 b 1 cacttcctcc ccagacaggg gtagtgcgag gccgggcaca gccttcctgt gtggttttac 61 cgcccagaga gcgtcatgga cctgggtatg cctgtgtcaa gatgaggtca cggacgatta 121 catcggagac aacaccacag tggactacac tttgttcgag tctttgtgct ccaagaagqa 181 cgtgcggaac tttaaagcct ggttcctccc tatcatgtac tccatcattt gtttcgtgqg 241 cctactgggc aatgggctgg tcgtgttgac ctatatctat ttcaagaggc tcaagaccat 301 gaccgatacc tacctgctca acctggcggt ggcagacatc ctcttcctcc tgacccttcc 361 cttctgggcc tacagcgcgg ccaagtcctg ggtcttcggt gtccactttt gcaagctcat 421 ctttgccatc tacaagatga gcttcttcag tggcatgctc ctacttcttt gcatcagcat 481 tgaccgctac gtggccatcg tccaggctgt ctcagctcac cgccaccgtg cccgcgtcct 541 tctcatcagc aagctgtcct gtgtgggcat ctggatacta gccacagtgc tctccatccc 601 agagctcctg tacagtgacc tccagaggag cagcagtgag caagcgatgc gatgctctct 661 catcacagag catgtggagg cctttatcac catccaggtg gcccagatgg tgatcggctt
- 61 039192
721 tctggtcccc ctgctggcca tgagcttctg ttaccttgtc
atcatccgca ccctgctcca 781 ggcacgcaac tttgagcgca acaaggccat caaggtgatc
atcgctgtgg tcgtggtctt 841 catagtcttc cagctgccct acaatggggt ggtcctggcc
cagacggtgg ccaacttcaa 901 catcaccagt agcacctgtg agctcagtaa gcaactcaac
atcgcctacg acgtcaccta 961 cagcctggcc tgcgtccgct gctgcgtcaa ccctttcttg
tacgccttca tcggcgtcaa 1021 gttccgcaac gatctcttca agctcttcaa ggacctgggc
tgcctcagcc aggagcagct 1081 ccggcagtgg tcttcctgtc ggcacatccg gcgctcctcc
atgagtgtgg aggccgagac 1141 caccaccacc ttctccccat aggcgactct tctgcctgga
ctagagggac ctctcccagg 1201 gtccctgggg tggggatagg gagcagatgc aatgactcag
gacatccccc cgccaaaagc 1261 tgctcaggga aaagcagctc tcccctcaga gtgcaagccc
ctgctccaga agatagcttc 1321 accccaatcc cagctacctc aaccaatgcc aaaaaaagac
agggctgata agctaacacc 1381 agacagacaa cactgggaaa cagaggctat tgtcccctaa
accaaaaact gaaagtgaaa 1441 gtccagaaac tgttcccacc tgctggagtg aaggggccaa
ggagggtgag tgcaaggggc 1501 gtgggagtgg cctgaagagt cctctgaatg aaccttctgg
cctcccacag actcaaatgc 1561 tcagaccagc tcttccgaaa accaggcctt atctccaaga
ccagagatag tggggagact 1621 tcttggcttg gtgaggaaaa gcggacatca gctggtcaaa
caaactctct gaacccctcc 1681 ctccatcgtt ttcttcactg tcctccaagc cagcgggaat
ggcagctgcc acgccgccct 1741 aaaagcacac tcatcccctc acttgccgcg tcgccctccc
aggctctcaa caggggagag 1801 tgtggtgttt cctgcaggcc aggccagctg cctccgcgtg
- 62 039192
atcaaagcca cactctgggc 1861 tccagagtgg ggatgacatg cactcagctc ttggctccac tgggatggga ggagaggaca 1921 agggaaatgt caggggcggg gagggtgaca gtggccgccc aaggcccacg agcttgttct 1981 ttgttctttg tcacagggac tgaaaacctc tcctcatgtt ctgctttcga ttcgttaaga 2041 gagcaacatt ttacccacac acagataaag ttttcccttg aggaaacaac agctttaaaa 2101 gaaaaagaaa aaaaaagtct ttggtaaatg gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa
6 NM_0013017 16.1 Типовая последоват ельность нуклеиновы х кислот, кодирующая изоформу с предшестве нника человеческ ого CCR7 1 ctctagatga gtcagtggag ggcgggtgga gcgttgaacc gtgaagagtg tggttgggcg 61 taaacgtgga cttaaactca ggagctaagg ggtaattcag tgaaaaaggg gaatgagcgg 121 tggggagctc tgttgcaaca gggtccaatc gcagcaggac tacaaatgcc cgagcgcagg 181 ctgggaacga ggggacagcg gctgcctgtc cccagaatag aaaatgcagc taggaagccc 241 tctttgagtg gacagcggag gactggactg ccaggccaag catcaggggc ttcatcctca 301 gggccggtta gagcccctga ggatttagga ggaagggaaa ccaatgaaaa gcgtgctggt 361 ggtggctctc cttgtcattt tccaggtatg cctgtgtcaa gatgaggtca cggacgatta 421 catcggagac aacaccacag tggactacac tttgttcgag tctttgtgct ccaagaagga 481 cgtgcggaac tttaaagcct ggttcctccc tatcatgtac tccatcattt gtttcgtggg 541 cctactgggc aatgggctgg tcgtgttgac ctatatctat ttcaagaggc tcaagaccat 601 gaccgatacc tacctgctca acctggcggt ggcagacatc ctcttcctcc tgacccttcc 661 cttctgggcc tacagcgcgg ccaagtcctg ggtcttcggt gtccactttt gcaagctcat 721 ctttgccatc tacaagatga gcttcttcag tggcatgctc
- 63 039192 ctacttcttt gcatcagcat
781 tgaccgctac gtggccatcg tccaggctgt ctcagctcac
cgccaccgtg cccgcgtcct 841 tctcatcagc aagctgtcct gtgtgggcat ctggatacta
gccacagtgc tctccatccc 901 agagctcctg tacagtgacc tccagaggag cagcagtgag
caagcgatgc gatgctctct 961 catcacagag catgtggagg cctttatcac catccaggtg
gcccagatgg tgatcggctt 1021 tctggtcccc ctgctggcca tgagcttctg ttaccttgtc
atcatccgca ccctgctcca 1081 ggcacgcaac tttgagcgca acaaggccat caaggtgatc
atcgctgtgg tcgtggtctt 1141 catagtcttc cagctgccct acaatggggt ggtcctggcc
cagacggtgg ccaacttcaa 1201 catcaccagt agcacctgtg agctcagtaa gcaactcaac
atcgcctacg acgtcaccta 1261 cagcctggcc tgcgtccgct gctgcgtcaa ccctttcttg
tacgccttca tcggcgtcaa 1321 gttccgcaac gatctcttca agctcttcaa ggacctgggc
tgcctcagcc aggagcagct 1381 ccggcagtgg tcttcctgtc ggcacatccg gcgctcctcc
atgagtgtgg aggccgagac 1441 caccaccacc ttctccccat aggcgactct tctgcctgga
ctagagggac ctctcccagg 1501 gtccctgggg tggggatagg gagcagatgc aatgactcag
gacatccccc cgccaaaagc 1561 tgctcaggga aaagcagctc tcccctcaga gtgcaagccc
ctgctccaga agatagcttc 1621 accccaatcc cagctacctc aaccaatgcc aaaaaaagac
agggctgata agctaacacc 1681 agacagacaa cactgggaaa cagaggctat tgtcccctaa
accaaaaact gaaagtgaaa 1741 gtccagaaac tgttcccacc tgctggagtg aaggggccaa
ggagggtgag tgcaaggggc 1801 gtgggagtgg cctgaagagt cctctgaatg aaccttctgg
cctcccacag actcaaatgc
- 64 039192
1861 tcagaccagc tcttccgaaa accaggcctt atctccaaga
ccagagatag tggggagact 1921 tcttggcttg gtgaggaaaa gcggacatca gctggtcaaa
caaactctct gaacccctcc 1981 ctccatcgtt ttcttcactg tcctccaagc cagcgggaat
ggcagctgcc acgccgccct 2041 aaaagcacac tcatcccctc acttgccgcg tcgccctccc
aggctctcaa caggggagag 2101 tgtggtgttt cctgcaggcc aggccagctg cctccgcgtg
atcaaagcca cactctgggc 2161 tccagagtgg ggatgacatg cactcagctc ttggctccac
tgggatggga ggagaggaca 2221 agggaaatgt caggggcggg gagggtgaca gtggccgccc
aaggcccacg agcttgttct 2281 ttgttctttg tcacagggac tgaaaacctc tcctcatgtt
ctgctttcga ttcgttaaga 2341 gagcaacatt ttacccacac acagataaag ttttcccttg
aggaaacaac agctttaaaa 2401 gaaaaagaaa aaaaaagtct ttggtaaatg gcaaaaaaaa
aaaaaaaaaa aaaaaaa
7 NM_0013017 1 ctctagatga gtcagtggag ggcgggtgga gcgttgaacc
17.1 Типовая gtgaagagtg tggttgggcg 61 taaacgtgga cttaaactca ggagctaagg gggaaaccaa
последоват ельность tgaaaagcgt gctggtggtg 121 gctctccttg tcattttcca ggtatgcctg tgtcaagatg
нуклеиновы X кислот, aggtcacgga cgattacatc 181 ggagacaaca ccacagtgga ctacactttg ttcgagtctt
кодирующая изоформу с tgtgctccaa gaaggacgtg 241 cggaacttta aagcctggtt cctccctatc atgtactcca
предшестве нника tcatttgttt cgtgggccta 301 ctgggcaatg ggctggtcgt gttgacctat atctatttca
человеческ ого CCR7 agaggctcaa gaccatgacc 361 gatacctacc tgctcaacct ggcggtggca gacatcctct
tcctcctgac ccttcccttc 421 tgggcctaca gcgcggccaa acttttgcaa gctcatcttt gtcctgggtc ttcggtgtcc
- 65 039192
481 gccatctaca agatgagctt cttcagtggc atgctcctac
ttctttgcat cagcattgac 541 cgctacgtgg ccatcgtcca ggctgtctca gctcaccgcc
accgtgcccg cgtccttctc 601 atcagcaagc tgtcctgtgt gggcatctgg atactagcca
cagtgctctc catcccagag 661 ctcctgtaca gtgacctcca gaggagcagc agtgagcaag
cgatgcgatg ctctctcatc 721 acagagcatg tggaggcctt tatcaccatc caggtggccc
agatggtgat cggctttctg 781 gtccccctgc tggccatgag cttctgttac cttgtcatca
tccgcaccct gctccaggca 841 cgcaactttg agcgcaacaa ggccatcaag gtgatcatcg
ctgtggtcgt ggtcttcata 901 gtcttccagc tgccctacaa tggggtggtc ctggcccaga
cggtggccaa cttcaacatc 961 accagtagca cctgtgagct cagtaagcaa ctcaacatcg
cctacgacgt cacctacagc 1021 ctggcctgcg tccgctgctg cgtcaaccct ttcttgtacg
ccttcatcgg cgtcaagttc 1081 cgcaacgatc tcttcaagct cttcaaggac ctgggctgcc
tcagccagga gcagctccgg 1141 cagtggtctt cctgtcggca catccggcgc tcctccatga
gtgtggaggc cgagaccacc 1201 accaccttct ccccataggc gactcttctg cctggactag
agggacctct cccagggtcc 1261 ctggggtggg gatagggagc agatgcaatg actcaggaca
tccccccgcc aaaagctgct 1321 cagggaaaag cagctctccc ctcagagtgc aagcccctgc
tccagaagat agcttcaccc 1381 caatcccagc tacctcaacc aatgccaaaa aaagacaggg
ctgataagct aacaccagac 1441 agacaacact gggaaacaga ggctattgtc ccctaaacca
aaaactgaaa gtgaaagtcc 1501 agaaactgtt cccacctgct ggagtgaagg ggccaaggag
ggtgagtgca aggggcgtgg 1561 gagtggcctg aagagtcctc tgaatgaacc ttctggcctc
- 66 039192 ссасадаetc aaatgctcag
1621 accagctctt ccgaaaacca ggccttatct ccaagaccag
agatagtggg gagacttctt 1681 ggcttggtga ggaaaagcgg acatcagctg gtcaaacaaa
ctctctgaac ccctccctcc 1741 atcgttttct tcactgtcct ccaagccagc gggaatggca
gctgccacgc cgccctaaaa 1801 gcacactcat cccctcactt gccgcgtcgc cctcccaggc
tctcaacagg ggagagtgtg 1861 gtgtttcctg caggccaggc cagctgcctc cgcgtgatca
aagccacact ctgggctcca 1921 gagtggggat gacatgcact cagctcttgg ctccactggg
atgggaggag aggacaaggg 1981 aaatgtcagg ggcggggagg gtgacagtgg ccgcccaagg
cccacgagct tgttctttgt 2041 tctttgtcac agggactgaa aacctctcct catgttctgc
tttcgattcg ttaagagagc 2101 aacattttac ccacacacag ataaagtttt cccttgagga
aacaacagct ttaaaagaaa 2161 aagaaaaaaa aagtctttgg taaatggcaa aaaaaaaaaa
aaaaaaaaaa aaa
8 NM_0013017 1 aggagaaggt gccttaaaca ggttcccacg catttcctgg
18.1 Типовая cgctattgag cttggagctg 61 ccaagggcct gccttcactt gtggcatcgc agttactgac
последоват ельность tctccagtgg gccaggccct 121 acctagctgg gacctgaggg tcaggatacg ggaagagggc
нуклеиновы х кислот, tactgccgcc ctgacttgta 181 gggaaaccaa tgaaaagcgt gctggtggtg gctctccttg
изоформу с предшестве tcattttcca ggtatgcctg 241 tgtcaagatg aggtcacgga cgattacatc ggagacaaca
нника человеческ ccacagtgga ctacactttg 301 ttcgagtctt tgtgctccaa gaaggacgtg cggaacttta
ого CCR7 aagcctggtt cctccctatc 361 atgtactcca tcatttgttt ggctggtcgt gttgacctat 421 atctatttca agaggctcaa cgtgggccta gaccatgacc ctgggcaatg gatacctacc
- 67 039192 tgctcaacct ggcggtggca
481 gacatcctct tcctcctgac ccttcccttc tgggcctaca
gcgcggccaa gtcctgggtc 541 ttcggtgtcc acttttgcaa gctcatcttt gccatctaca
agatgagctt cttcagtggc 601 atgctcctac ttctttgcat cagcattgac cgctacgtgg
ccatcgtcca ggctgtctca 661 gctcaccgcc accgtgcccg cgtccttctc atcagcaagc
tgtcctgtgt gggcatctgg 721 atactagcca cagtgctctc catcccagag ctcctgtaca
gtgacctcca gaggagcagc 781 agtgagcaag cgatgcgatg ctctctcatc acagagcatg
tggaggcctt tatcaccatc 841 caggtggccc agatggtgat cggctttctg gtccccctgc
tggccatgag cttctgttac 901 cttgtcatca tccgcaccct gctccaggca cgcaactttg
agcgcaacaa ggccatcaag 961 gtgatcatcg ctgtggtcgt ggtcttcata gtcttccagc
tgccctacaa tggggtggtc 1021 ctggcccaga cggtggccaa cttcaacatc accagtagca
cctgtgagct cagtaagcaa 1081 ctcaacatcg cctacgacgt cacctacagc ctggcctgcg
tccgctgctg cgtcaaccct 1141 ttcttgtacg ccttcatcgg cgtcaagttc cgcaacgatc
tcttcaagct cttcaaggac 1201 ctgggctgcc tcagccagga gcagctccgg cagtggtctt
cctgtcggca catccggcgc 1261 tcctccatga gtgtggaggc cgagaccacc accaccttct
ccccataggc gactcttctg 1321 cctggactag agggacctct cccagggtcc ctggggtggg
gatagggagc agatgcaatg 1381 actcaggaca tccccccgcc aaaagctgct cagggaaaag
cagctctccc ctcagagtgc 1441 aagcccctgc tccagaagat agcttcaccc caatcccagc
tacctcaacc aatgccaaaa 1501 aaagacaggg ctgataagct aacaccagac agacaacact
gggaaacaga ggctattgtc
- 68 039192
1561 ccctaaacca aaaactgaaa gtgaaagtcc agaaactgtt cccacctgct ggagtgaagg 1621 ggccaaggag ggtgagtgca aggggcgtgg gagtggcctg aagagtcctc tgaatgaacc 1681 ttctggcctc ccacagactc aaatgctcag accagctctt ccgaaaacca ggccttatct 1741 ccaagaccag agatagtggg gagacttctt ggcttggtga ggaaaagcgg acatcagctg 1801 gtcaaacaaa ctctctgaac ccctccctcc atcgttttct tcactgtcct ccaagccagc 1861 gggaatggca gctgccacgc cgccctaaaa gcacactcat cccctcactt gccgcgtcgc 1921 cctcccaggc tctcaacagg ggagagtgtg gtgtttcctg caggccaggc cagctgcctc 1981 cgcgtgatca aagccacact ctgggctcca gagtggggat gacatgcact cagctcttgg 2041 ctccactggg atgggaggag aggacaaggg aaatgtcagg ggcggggagg gtgacagtgg 2101 ccgcccaagg cccacgagct tgttctttgt tctttgtcac agggactgaa aacctctcct 2161 catgttctgc tttcgattcg ttaagagagc aacattttac ccacacacag ataaagtttt 2221 cccttgagga aacaacagct ttaaaagaaa aagaaaaaaa aagtctttgg taaatggcaa 2281 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa
9 NM_001838. 3 Типовая последоват ельность нуклеиновы х кислот, кодирующая изоформу а предшестве нника 1 cacttcctcc ccagacaggg gtagtgcgag gccgggcaca gccttcctgt gtggttttac 61 cgcccagaga gcgtcatgga cctggggaaa ccaatgaaaa gcgtgctggt ggtggctctc 121 cttgtcattt tccaggtatg cctgtgtcaa gatgaggtca cggacgatta catcggagac 181 aacaccacag tggactacac tttgttcgag tctttgtgct ccaagaagga cgtgcggaac 241 tttaaagcct ggttcctccc tatcatgtac tccatcattt gtttcgtggg cctactgggc 301 aatgggctgg tcgtgttgac ctatatctat ttcaagaggc
- 69 039192
человеческ tcaagaccat gaccgatacc
ого CCR7 361 tacctgctca acctggcggt tgacccttcc cttctgggcc ggcagacatc ctcttcctcc
421 tacagcgcgg ccaagtcctg gcaagctcat ctttgccatc ggtcttcggt gtccactttt
481 tacaagatga gcttcttcag gcatcagcat tgaccgctac tggcatgctc ctacttcttt
541 gtggccatcg tccaggctgt cccgcgtcct tctcatcagc ctcagctcac cgccaccgtg
601 aagctgtcct gtgtgggcat tctccatccc agagctcctg ctggatacta gccacagtgc
661 tacagtgacc tccagaggag gatgctctct catcacagag cagcagtgag caagcgatgc
721 catgtggagg cctttatcac tgatcggctt tctggtcccc catccaggtg gcccagatgg
781 ctgctggcca tgagcttctg ccctgctcca ggcacgcaac ttaccttgtc atcatccgca
841 tttgagcgca acaaggccat tcgtggtctt catagtcttc caaggtgatc atcgctgtgg
901 cagctgccct acaatggggt ccaacttcaa catcaccagt ggtcctggcc cagacggtgg
961 agcacctgtg agctcagtaa acgtcaccta cagcctggcc gcaactcaac atcgcctacg
1021 tgcgtccgct gctgcgtcaa tcggcgtcaa gttccgcaac ccctttcttg tacgccttca
1081 gatctcttca agctcttcaa aggagcagct ccggcagtgg ggacctgggc tgcctcagcc
1141 tcttcctgtc ggcacatccg aggccgagac caccaccacc gcgctcctcc atgagtgtgg
1201 ttctccccat aggcgactct ctctcccagg gtccctgggg tctgcctgga ctagagggac
1261 tggggatagg gagcagatgc cgccaaaagc tgctcaggga aatgactcag gacatccccc
1321 aaagcagctc tcccctcaga agatagcttc accccaatcc gtgcaagccc ctgctccaga
1381 cagctacctc aaccaatgcc agctaacacc agacagacaa aaaaaaagac agggctgata
- 70 039192
1441 cactgggaaa cagaggctat tgtcccctaa accaaaaact gaaagtgaaa gtccagaaac 1501 tgttcccacc tgctggagtg aaggggccaa ggagggtgag tgcaaggggc gtgggagtgg 1561 cctgaagagt cctctgaatg aaccttctgg cctcccacag actcaaatgc tcagaccagc 1621 tcttccgaaa accaggcctt atctccaaga ccagagatag tggggagact tcttggcttg 1681 gtgaggaaaa gcggacatca gctggtcaaa caaactctct gaacccctcc ctccatcgtt 1741 ttcttcactg tcctccaagc cagcgggaat ggcagctgcc acgccgccct aaaagcacac 1801 tcatcccctc acttgccgcg tcgccctccc aggctctcaa caggggagag tgtggtgttt 1861 cctgcaggcc aggccagctg cctccgcgtg atcaaagcca cactctgggc tccagagtgg 1921 ggatgacatg cactcagctc ttggctccac tgggatggga ggagaggaca agggaaatgt 1981 caggggcggg gagggtgaca gtggccgccc aaggcccacg agcttgttct ttgttctttg 2041 tcacagggac tgaaaacctc tcctcatgtt ctgctttcga ttcgttaaga gagcaacatt 2101 ttacccacac acagataaag ttttcccttg aggaaacaac agctttaaaa gaaaaagaaa 2161 aaaaaagtct ttggtaaatg gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa
10 NP_0012886 43.1 Типовая последоват ельность аминокисло т для изоформы b человеческ ого CCR7 1 mysiicfvgl Ignglvvlty iyfkrlktmt dtyllnlava dilflltlpf waysaakswv 61 fgvhfcklif aiykmsffsg mllllcisid ryvaivqavs ahrhrarvll isklscvgiw 121 ilatvlsipe llysdlqrss seqamrcsli tehveafiti qvaqmvigfl vpllamsfcy 181 Iviirtllqa rnfernkaik viiavvvvfi vfqlpyngvv laqtvanfni tsstcelskq 241 Iniaydvtys lacvrccvnp flyafigvkf rndlfklfkd Igclsqeqlr qwsscrhirr 301 ssmsveaett ttfsp
- 71 039192
11 NP_0012886 45.1 Типовая последоват ельность аминокисло т для изоформы с предшестве нника человеческ ого CCR7 1 mksvlvvall vifqvclcqd evtddyigdn ttvdytlfes Icskkdvrnf kawflpimys 61 iicfvgllgn glvvltyiyf krlktmtdty llnlavadil flltlpfway saakswvfgv 121 hfcklifaiy kmsffsgmll llcisidryv aivqavsahr hrarvllisk Iscvgiwila 181 tvlsipelly sdlqrssseq amrcsliteh veafitiqva qmvigflvpl lamsfcylvi 241 irtllqarnf ernkaikvii avvvvfivfq Ipyngvvlaq tvanfnitss tcelskqlni 301 aydvtyslac vrccvnpfly afigvkfrnd Ifklfkdlgc Isqeqlrqws scrhirrssm 361 sveaettttf sp
12 NP_0012886 46.1 Типовая последоват ельность аминокисло т для для изоформы с предшестве нника человеческ ого CCR7 1 mksvlvvall vifqvclcqd evtddyigdn ttvdytlfes Icskkdvrnf kawflpimys 61 iicfvgllgn glvvltyiyf krlktmtdty llnlavadil flltlpfway saakswvfgv 121 hfcklifaiy kmsffsgmll llcisidryv aivqavsahr hrarvllisk Iscvgiwila 181 tvlsipelly sdlqrssseq amrcsliteh veafitiqva qmvigflvpl lamsfcylvi 241 irtllqarnf ernkaikvii avvvvfivfq Ipyngvvlaq tvanfnitss tcelskqlni 301 aydvtyslac vrccvnpfly afigvkfrnd Ifklfkdlgc Isqeqlrqws scrhirrssm 361 sveaettttf sp
13 NP_0012886 47.1 Типовая последоват ельность аминокисло т для изоформы с предшестве нника 1 mksvlvvall vifqvclcqd evtddyigdn ttvdytlfes Icskkdvrnf kawflpimys 61 iicfvgllgn glvvltyiyf krlktmtdty llnlavadil flltlpfway saakswvfgv 121 hfcklifaiy kmsffsgmll llcisidryv aivqavsahr hrarvllisk Iscvgiwila 181 tvlsipelly sdlqrssseq amrcsliteh veafitiqva qmvigflvpl lamsfcylvi 241 irtllqarnf ernkaikvii avvvvfivfq Ipyngvvlaq tvanfnitss tcelskqlni
- 72 039192
человеческ ого CCR7 301 aydvtyslac vrccvnpfly afigvkfrnd Ifklfkdlgc Isqeqlrqws scrhirrssm 361 sveaettttf sp
14 NP_001829. 1 Типовая последоват ельность аминокисло т для изоформы а предшестве нника человеческ ого CCR7 1 mdlgkpmksv Ivvallvifq vclcqdevtd dyigdnttvd ytlfeslcsk kdvrnfkawf 61 Ipimysiicf vgllgnglvv Ityiyfkrlk tmtdtyllnl avadilfllt Ipfwaysaak 121 swvfgvhfck lifaiykmsf fsgmllllci sidryvaivq avsahrhrar vllisklscv 181 giwilatvls ipellysdlq rssseqamrc slitehveaf itiqvaqmvi gflvpllams 241 fcylviirtl Iqarnfernk aikviiavvv vfivfqlpyn gvvlaqtvan fnitsstcel 301 skqlniaydv tyslacvrcc vnpflyafig vkfrndlfkl fkdlgclsqe qlrqwsscrh 361 irrssmsvea ettttfsp
15 NM_002253. 2 Типовая последоват ельность нуклеиновы х кислот, кодирующая предшестве нник человеческ ого VEGFR2 1 actgagtccc qggaccccgg gagagcggtc aatgtgtggt cgctgcgttt cctctgcctg 61 cgccgggcat cacttgcgcg ccgcagaaag tccgtctggc agcctggata tcctctccta 121 ccggcacccg cagacgcccc tgcagccgcg gtcggcgccc gggctcccta gccctgtgcg 181 ctcaactgtc ctgcgctgcg gggtgccgcg agttccacct ccgcgcctcc ttctctagac 241 aggcgctggg agaaagaacc ggctcccgag ttctgggcat ttcgcccggc tcgaggtgca 301 ggatgcagag caaggtgctg ctggccgtcg ccctgtggct ctgcgtggag acccgggccg 361 cctctgtggg tttgcctagt gtttctcttg atctgcccag gctcagcata caaaaagaca 421 tacttacaat taaggctaat acaactcttc aaattacttg caggggacag agggacttgg 481 actggctttg gcccaataat cagagtggca gtgagcaaag ggtggaggtg actgagtgca 541 gcgatggcct cttctgtaag acactcacaa ttccaaaagt gatcggaaat gacactggag
- 73 039192
601 cctacaagtg cttctaccgg gaaactgact tggcctcggt
catttatgtc tatgttcaag 661 attacagatc tccatttatt gcttctgtta gtgaccaaca
tggagtcgtg tacattactg 721 agaacaaaaa caaaactgtg gtgattccat gtctcgggtc
catttcaaat ctcaacgtgt 781 cactttgtgc aagataccca gaaaagagat ttgttcctga
tggtaacaga atttcctggg 841 acagcaagaa gggctttact attcccagct acatgatcag
ctatgctggc atggtcttct 901 gtgaagcaaa aattaatgat gaaagttacc agtctattat
gtacatagtt gtcgttgtag 961 ggtataggat ttatgatgtg gttctgagtc cgtctcatgg
aattgaacta tctgttggag 1021 aaaagcttgt cttaaattgt acagcaagaa ctgaactaaa
tgtggggatt gacttcaact 1081 gggaataccc ttcttcgaag catcagcata agaaacttgt
aaaccgagac ctaaaaaccc 1141 agtctgggag tgagatgaag aaatttttga gcaccttaac
tatagatggt gtaacccgga 1201 gtgaccaagg attgtacacc tgtgcagcat ccagtgggct
gatgaccaag aagaacagca 1261 catttgtcag ggtccatgaa aaaccttttg ttgcttttgg
aagtggcatg gaatctctgg 1321 tggaagccac ggtgggggag cgtgtcagaa tccctgcgaa
gtaccttggt tacccacccc 1381 cagaaataaa atggtataaa aatggaatac cccttgagtc
caatcacaca attaaagcgg 1441 ggcatgtact gacgattatg gaagtgagtg aaagagacac
aggaaattac actgtcatcc 1501 ttaccaatcc catttcaaag gagaagcaga gccatgtggt
ctctctggtt gtgtatgtcc 1561 caccccagat tggtgagaaa tctctaatct ctcctgtgga
ttcctaccag tacggcacca 1621 ctcaaacgct gacatgtacg gtctatgcca ttcctccccc
gcatcacatc cactggtatt 1681 ggcagttgga ggaagagtgc gccaacgagc ccagccaagc
- 74 039192 tgtctcagtg acaaacccat
1741 acccttgtga agaatggaga agtgtggagg acttccaggg
aggaaataaa attgaagtta 1801 ataaaaatca atttgctcta attgaaggaa aaaacaaaac
tgtaagtacc cttgttatcc 1861 aagcggcaaa tgtgtcagct ttgtacaaat gtgaagcggt
caacaaagtc gggagaggag 1921 agagggtgat ctccttccac gtgaccaggg gtcctgaaat
tactttgcaa cctgacatgc 1981 agcccactga gcaggagagc gtgtctttgt ggtgcactgc
agacagatct acgtttgaga 2041 acctcacatg gtacaagctt ggcccacagc ctctgccaat
ccatgtggga gagttgccca 2101 cacctgtttg caagaacttg gatactcttt ggaaattgaa
tgccaccatg ttctctaata 2161 gcacaaatga cattttgatc atggagctta agaatgcatc
cttgcaggac caaggagact 2221 atgtctgcct tgctcaagac aggaagacca agaaaagaca
ttgcgtggtc aggcagctca 2281 cagtcctaga gcgtgtggca cccacgatca caggaaacct
ggagaatcag acgacaagta 2341 ttggggaaag catcgaagtc tcatgcacgg catctgggaa
tccccctcca cagatcatgt 2401 ggtttaaaga taatgagacc cttgtagaag actcaggcat
tgtattgaag gatgggaacc 2461 ggaacctcac tatccgcaga gtgaggaagg aggacgaagg
cctctacacc tgccaggcat 2521 gcagtgttct tggctgtgca aaagtggagg catttttcat
aatagaaggt gcccaggaaa 2581 agacgaactt ggaaatcatt attctagtag gcacggcggt
gattgccatg ttcttctggc 2641 tacttcttgt catcatccta cggaccgtta agcgggccaa
tggaggggaa ctgaagacag 2701 gctacttgtc catcgtcatg gatccagatg aactcccatt
ggatgaacat tgtgaacgac 2761 tgccttatga tgccagcaaa tgggaattcc ccagagaccg
gctgaagcta ggtaagcctc
- 75 039192
2821 ttggccgtgg tgcctttggc caagtgattg aagcagatgc
ctttggaatt gacaagacag 2881 caacttgcag gacagtagca gtcaaaatgt tgaaagaagg
agcaacacac agtgagcatc 2941 gagctctcat gtctgaactc aagatcctca ttcatattgg
tcaccatctc aatgtggtca 3001 accttctagg tgcctgtacc aagccaggag ggccactcat
ggtgattgtg gaattctgca 3061 aatttggaaa cctgtccact tacctgagga gcaagagaaa
tgaatttgtc ccctacaaga 3121 ccaaaggggc acgattccgt caagggaaag actacgttgg
agcaatccct gtggatctga 3181 aacggcgctt ggacagcatc accagtagcc agagctcagc
cagctctgga tttgtggagg 3241 agaagtccct cagtgatgta gaagaagagg aagctcctga
agatctgtat aaggacttcc 3301 tgaccttgga gcatctcatc tgttacagct tccaagtggc
taagggcatg gagttcttgg 3361 catcgcgaaa gtgtatccac agggacctgg cggcacgaaa
tatcctctta tcggagaaga 3421 acgtggttaa aatctgtgac tttggcttgg cccgggatat
ttataaagat ccagattatg 3481 tcagaaaagg agatgctcgc ctccctttga aatggatggc
cccagaaaca atttttgaca 3541 gagtgtacac aatccagagt gacgtctggt cttttggtgt
tttgctgtgg gaaatatttt 3601 ccttaggtgc ttctccatat cctggggtaa agattgatga
agaattttgt aggcgattga 3661 aagaaggaac tagaatgagg gcccctgatt atactacacc
agaaatgtac cagaccatgc 3721 tggactgctg gcacggggag cccagtcaga gacccacgtt
ttcagagttg gtggaacatt 3781 tgggaaatct cttgcaagct aatgctcagc aggatggcaa
agactacatt gttcttccga 3841 tatcagagac tttgagcatg gaagaggatt ctggactctc
tctgcctacc tcacctgttt 3901 cctgtatgga ggaggaggaa gtatgtgacc ccaaattcca
- 76 039192 ttatgacaac acagcaggaa
3961 tcagtcagta tctgcagaac agtaagcgaa agagccggcc
tgtgagtgta aaaacatttg 4021 aagatatccc gttagaagaa ccagaagtaa aagtaatccc
agatgacaac cagacggaca 4081 gtggtatggt tcttgcctca gaagagctga aaactttgga
agacagaacc aaattatctc 4141 catcttttgg tggaatggtg cccagcaaaa gcagggagtc
tgtggcatct gaaggctcaa 4201 accagacaag cggctaccag tccggatatc actccgatga
cacagacacc accgtgtact 4261 ccagtgagga agcagaactt ttaaagctga tagagattgg
agtgcaaacc ggtagcacag 4321 cccagattct ccagcctgac tcggggacca cactgagctc
tcctcctgtt taaaaggaag 4381 catccacacc cccaactcct ggacatcaca tgagaggtgc
tgctcagatt ttcaagtgtt 4441 gttctttcca ccagcaggaa gtagccgcat ttgattttca
tttcgacaac agaaaaagga 4501 cctcggactg cagggagcca gtcttctagg catatcctgg
aagaggcttg tgacccaaga 4561 atgtgtctgt gtcttctccc agtgttgacc tgatcctctt
tttcattcat ttaaaaagca 4621 tttatcatgc cccctgctgc gggtctcacc atgggtttag
aacaaagacg ttcaagaaat 4681 ggccccatcc tcaaagaagt agcagtacct ggggagctga
cacttctgta aaactagaag 4741 ataaaccagg caatgtaagt gttcgaggtg ttgaagatgg
gaaggatttg cagggctgag 4801 tctatccaag aggctttgtt taggacgtgg gtcccaagcc
aagccttaag tgtggaattc 4861 ggattgatag aaaggaagac taacgttacc ttgctttgga
gagtactgga gcctgcaaat 4921 gcattgtgtt tgctctggtg gaggtgggca tggggtctgt
tctgaaatgt aaagggttca 4981 gacggggttt ctggttttag aaggttgcgt gttcttcgag
ttgggctaaa gtagagttcg
- 77 039192
5041 ttgtgctgtt tctgactcct aatgagagtt ccttccagac cgttacgtgt ctcctggcca 5101 agccccagga aggaaatgat gcagctctgg ctccttgtct cccaggctga tcctttattc 5161 agaataccac aaagaaagga cattcagctc aaggctccct gccgtgttga agagttctga 5221 ctgcacaaac cagcttctgg tttcttctgg aatgaatacc ctcatatctg tcctgatgtg 5281 atatgtctga gactgaatgc gggaggttca atgtgaagct gtgtgtggtg tcaaagtttc 5341 aggaaggatt ttaccctttt gttcttcccc ctgtccccaa cccactctca ccccgcaacc 5401 catcagtatt ttagttattt ggcctctact ccagtaaacc tgattgggtt tgttcactct 5461 ctgaatgatt attagccaga cttcaaaatt attttatagc ccaaattata acatctattg 5521 tattatttag acttttaaca tatagagcta tttctactga tttttgccct tgttctgtcc 5581 tttttttcaa aaaagaaaat gtgttttttg tttggtacca tagtgtgaaa tgctgggaac 5641 aatgactata agacatgcta tggcacatat atttatagtc tgtttatgta gaaacaaatg 5701 taatatatta aagccttata tataatgaac tttgtactat tcacattttg tatcagtatt 5761 atgtagcata acaaaggtca taatgctttc agcaattgat gtcattttat taaagaacat 5821 tgaaaaactt gaaggaatcc ctttgcaagg ttgcattact gtacccatca tttctaaaat 5881 ggaagagggg gtggctgggc acagtggccg acacctaaaa acccagcact ttggggggcc 5941 aaggtgggag gatcgcttga gcccaggagt tcaagaccag tctggccaac atggtcagat 6001 tccatctcaa agaaaaaagg taaaaataaa ataaaatgga gaagaaggaa tcaga
16 NP_002244. 1 1 mqskvllava Iwlcvetraa svglpsvsld Iprlsiqkdi Itikanttlq itcrgqrdld
- 78 039192
Типовая 61 wlwpnnqsgs eqrvevtecs dglfcktlti pkvigndtga
последоват ельность ykcfyretdl asviyvyvqd 121 yrspfiasvs dqhgvvyite nknktvvipc Igsisnlnvs
нуклеиновы х кислот, Icarypekrf vpdgnriswd 181 skkqftipsy misyagmvfc eakindesyq simyivvvvg
кодирующая предшестве yriydvvlsp shgielsvge 241 klvlnctart elnvgidfnw eypsskhqhk klvnrdlktq
нник человеческ sgsemkkfls tltidgvtrs 301 dqglytcaas sglmtkknst fvrvhekpfv afgsgmeslv
ого VEGFR2 eatvgervri pakylgyppp 361 eikwykngip lesnhtikaq hvltimevse rdtgnytvil
tnpiskekqs hvvslvvyvp 421 pqiqekslis pvdsyqygtt qtltctvyai ppphhihwyw
qleeecanep sqavsvtnpy 481 pceewrsved fqggnkievn knqfaliegk nktvstlviq
aanvsalykc eavnkvgrge 541 rvisfhvtrg peitlqpdmq pteqesvslw ctadrstfen
Itwyklgpqp Ipihvgelpt 601 pvcknldtlw klnatmfsns tndilimelk naslqdqgdy
vclaqdrktk krhcvvrqlt 661 vlervaptit gnlenqttsi gesievscta sgnpppqimw
fkdnetlved sgivlkdgnr 721 nltirrvrke deglytcqac svlgcakvea ffiiegaqek
tnleiiilvg taviamffwl 781 llviilrtvk ranggelktg ylsivmdpde Ipldehcerl
pydaskwefp rdrlklgkpl 841 grgafgqvie adafgidkta tcrtvavkml kegathsehr
almselkili highhlnvvn 901 llgactkpgg plmvivefck fgnlstylrs krnefvpykt
kgarfrqgkd yvgaipvdlk 961 rrldsitssq ssassgfvee kslsdveeee apedlykdf1
tlehlicysf qvakgmefla 1021 srkcihrdla arnillsekn vvkicdfgla rdiykdpdyv
rkgdarlplk wmapetifdr 1081 vytiqsdvws fgvllweifs Igaspypgvk ideefcrrlk
egtrmrapdy ttpemyqtml 1141 dcwhgepsqr ptfselvehl gnllqanaqq dgkdyivlpi
- 79 039192
setlsmeeds glslptspvs 1201 cmeeeevcdp kfhydntagi sqylqnskrk srpvsvktfe dipleepevk vipddnqtds 1261 gmvlaseelk tledrtklsp sfggmvpsks resvasegsn qtsgyqsgyh sddtdttvys 1321 seeaellkli eigvqtgsta qilqpdsgtt Issppv
17 NM_001716. 4 Типовая последоват ельность нуклеиновы х кислот, кодирующая человеческ ий CXCR5 1 aaaaaaaaaa agtgatgagt tgtgaggcag gtcgcggccc tactgcctca ggagacgatg 61 cgcagctcat ttgcttaaat ttgcagctga cggctgccac ctctctagag gcacctggcg 121 gggagcctct caacataaga cagtgaccag tctggtgact cacagccggc acagccatga 181 actacccgct aacgctggaa atggacctcg agaacctgga ggacctgttc tgggaactgg 241 acagattgga caactataac gacacctccc tggtggaaaa tcatctctgc cctgccacag 301 aggggcccct catggcctcc ttcaaggccg tgttcgtgcc cgtggcctac agcctcatct 361 tcctcctggg cgtgatcggc aacgtcctgg tgctggtgat cctggagcgg caccggcaga 421 cacgcagttc cacggagacc ttcctgttcc acctggccgt ggccgacctc ctgctggtct 481 tcatcttgcc ctttgccgtg gccgagggct ctgtgggctg ggtcctgggg accttcctct 541 gcaaaactgt gattgccctg cacaaagtca acttctactg cagcagcctg ctcctggcct 601 gcatcgccgt ggaccgctac ctggccattg tccacgccgt ccatgcctac cgccaccgcc 661 gcctcctctc catccacatc acctgtggga ccatctggct ggtgggcttc ctccttgcct 721 tgccagagat tctcttcgcc aaagtcagcc aaggccatca caacaactcc ctgccacgtt 781 gcaccttctc ccaagagaac caagcagaaa cgcatgcctg gttcacctcc cgattcctct 841 accatgtggc gggattcctg ctgcccatgc tggtgatggg ctggtgctac gtgggggtag
- 80 039192
901 tgcacaggtt gcgccaggcc cagcggcgcc ctcagcggca
gaaggcagtc agggtggcca 961 tcctggtgac aagcatcttc ttcctctgct ggtcacccta
ccacatcgtc atcttcctgg 1021 acaccctggc gaggctgaag gccgtggaca atacctgcaa
gctgaatggc tctctccccg 1081 tggccatcac catgtgtgag ttcctgggcc tggcccactg
ctgcctcaac cccatgctct 1141 acactttcgc cggcgtgaag ttccgcagtg acctgtcgcg
gctcctgacg aagctgggct 1201 gtaccggccc tgcctccctg tgccagctct tccctagctg
gcgcaggagc agtctctctg 1261 agtcagagaa tgccacctct ctcaccacgt tctaggtccc
agtgtcccct tttattgctg 1321 cttttccttg gggcaggcag tgatgctgga tgctccttcc
aacaggagct gggatcctaa 1381 gggctcaccg tggctaagag tgtcctagga gtatcctcat
ttggggtagc tagaggaacc 1441 aacccccatt tctagaacat ccctgccagc tcttctgccg
gccctggggc taggctggag 1501 cccagggagc ggaaagcagc tcaaaggcac agtgaaggct
gtccttaccc atctgcaccc 1561 ccctgggctg agagaacctc acgcacctcc catcctaatc
atccaatgct caagaaacaa 1621 cttctacttc tgcccttgcc aacggagagc gcctgcccct
cccagaacac actccatcag 1681 cttaggggct gctgacctcc acagcttccc ctctctcctc
ctgcccacct gtcaaacaaa 1741 gccagaagct gagcaccagg ggatgagtgg aggttaaggc
tgaggaaagg ccagctggca 1801 gcagagtgtg gccttcggac aactcagtcc ctaaaaacac
agacattctg ccaggccccc 1861 aagcctgcag tcatcttgac caagcaggaa gctcagactg
gttgagttca ggtagctgcc 1921 cctggctctg accgaaacag cgctgggtcc accccatgtc
accggatcct gggtggtctg 1981 caggcagggc tgactctagg tgcccttgga ggccagccag
- 81 039192
tgacctgagg aagcgtgaag 2041 gccgagaagc aagaaagaaa cccgacagag ggaagaaaag agctttcttc ccgaacccca 2101 aggagggaga tggatcaatc aaacccggcg gtcccctccg ccaggcgaga tggggtgggg 2161 tggagaactc ctagggtggc tgggtccagg ggatgggagg ttgtgggcat tgatggggaa 2221 ggaggctggc ttgtcccctc ctcactccct tcccataagc tatagacccg aggaaactca 2281 gagtcggaac ggagaaaggt ggactggaag gggcccgtgg gagtcatctc aaccatcccc 2341 tccgtggcat caccttaggc agggaagtgt aagaaacaca ctgaggcagg gaagtcccca 2401 ggccccagga agccgtgccc tgcccccgtg aggatgtcac tcagatggaa ccgcaggaag 2461 ctgctccgtg cttgtttgct cacctggggt gtgggaggcc cgtccggcag ttctgggtgc 2521 tccctaccac ctccccagcc tttgatcagg tggggagtca gggacccctg cccttgtccc 2581 actcaagcca agcagccaag ctccttggga ggccccactg gggaaataac agctgtggct 2641 cacgtgagag tgtcttcacg gcaggacaac gaggaagccc taagacgtcc cttttttctc 2701 tgagtatctc ctcgcaagct gggtaatcga tgggggagtc tgaagcagat gcaaagaggc 2761 aagaggctgg attttgaatt ttctttttaa taaaaaggca cctataaaac aggtcaatac 2821 agtacaggca gcacagagac ccccggaaca agcctaaaaa ttgtttcaaa ataaaaacca 2881 agaagatgtc ttcacatatt gtaaaaaaaa aaaaaaaaa
18 NM_032966. 2 Типовая последоват ельность нуклеиновы 1 ccactctaag gaatgcggtc cctttgacag gcgaaaaact gaagttggaa aagacaaagt 61 gatttgttca aaattgaaat ttgaaacttg acatttggtc agtgggccct atgtaggaaa 121 aaacctccaa gagagctagg gttcctctca gagaggaaag acaggtcctt aggtcctcac
- 82 039192
X кислот, кодирующая человеческ ий CXCR5 181 cctcccgtct ccttgccctt gcagttctgg gaactggaca gattggacaa ctataacgac 241 acctccctgg tggaaaatca tctctgccct gccacagagg ggcccctcat ggcctccttc 301 aaggccgtgt tcgtgcccgt ggcctacagc ctcatcttcc tcctgggcgt gatcggcaac 361 gtcctggtgc tggtgatcct ggagcggcac cggcagacac gcagttccac ggagaccttc 421 ctgttccacc tggccgtggc cgacctcctg ctggtcttca tcttgccctt tgccgtggcc 481 gagggctctg tgggctgggt cctggggacc ttcctctgca aaactgtgat tgccctgcac 541 aaagtcaact tctactgcag cagcctgctc ctggcctgca tcgccgtgga ccgctacctg 601 gccattgtcc acgccgtcca tgcctaccgc caccgccgcc tcctctccat ccacatcacc 661 tgtgggacca tctggctggt gggcttcctc cttgccttgc cagagattct cttcgccaaa 721 gtcagccaag gccatcacaa caactccctg ccacgttgca ccttctccca agagaaccaa 781 gcagaaacgc atgcctggtt cacctcccga ttcctctacc atgtggcggg attcctgctg 841 cccatgctgg tgatgggctg gtgctacgtg ggggtagtgc acaggttgcg ccaggcccag 901 cggcgccctc agcggcagaa ggcagtcagg gtggccatcc tggtgacaag catcttcttc 961 ctctgctggt caccctacca catcgtcatc ttcctggaca ccctggcgag gctgaaggcc 1021 gtggacaata cctgcaagct gaatggctct ctccccgtgg ccatcaccat gtgtgagttc 1081 ctgggcctgg cccactgctg cctcaacccc atgctctaca ctttcgccgg cgtgaagttc 1141 cgcagtgacc tgtcgcggct cctgacgaag ctgggctgta ccggccctgc ctccctgtgc 1201 cagctcttcc ctagctggcg caggagcagt ctctctgagt cagagaatgc cacctctctc 1261 accacgttct aggtcccagt gtcccctttt attgctgctt
- 83 039192 ttccttgggg caggcagtga
1321 tgctggatgc tccttccaac aggagctggg atcctaaggg
ctcaccgtgg ctaagagtgt 1381 cctaggagta tcctcatttg gggtagctag aggaaccaac
ccccatttct agaacatccc 1441 tgccagctct tctgccggcc ctggggctag gctggagccc
agggagcgga aagcagctca 1501 aaggcacagt gaaggctgtc cttacccatc tgcacccccc
tgggctgaga gaacctcacg 1561 cacctcccat cctaatcatc caatgctcaa gaaacaactt
ctacttctgc ccttgccaac 1621 ggagagcgcc tgcccctccc agaacacact ccatcagctt
aggggctgct gacctccaca 1681 gcttcccctc tctcctcctg cccacctgtc aaacaaagcc
agaagctgag caccagggga 1741 tgagtggagg ttaaggctga ggaaaggcca gctggcagca
gagtgtggcc ttcggacaac 1801 tcagtcccta aaaacacaga cattctgcca ggcccccaag
cctgcagtca tcttgaccaa 1861 gcaggaagct cagactggtt gagttcaggt agctgcccct
ggctctgacc gaaacagcgc 1921 tgggtccacc ccatgtcacc ggatcctggg tggtctgcag
gcagggctga ctctaggtgc 1981 ccttggaggc cagccagtga cctgaggaag cgtgaaggcc
gagaagcaag aaagaaaccc 2041 gacagaggga agaaaagagc tttcttcccg aaccccaagg
agggagatgg atcaatcaaa 2101 cccggcggtc ccctccgcca ggcgagatgg ggtggggtgg
agaactccta gggtggctgg 2161 gtccagggga tgggaggttg tgggcattga tggggaagga
ggctggcttg tcccctcctc 2221 actcccttcc cataagctat agacccgagg aaactcagag
tcggaacgga gaaaggtgga 2281 ctggaagggg cccgtgggag tcatctcaac catcccctcc
gtggcatcac cttaggcagg 2341 gaagtgtaag aaacacactg aggcagggaa gtccccaggc
cccaggaagc cgtgccctgc
- 84 039192
2401 ccccgtgagg atgtcactca gatggaaccg caggaagctg ctccgtgctt gtttgctcac 2461 ctggggtgtg ggaggcccgt ccggcagttc tgggtgctcc ctaccacctc cccagccttt 2521 gatcaggtgg ggagtcaggg acccctgccc ttgtcccact caagccaagc agccaagctc 2581 cttgggaggc cccactgggg aaataacagc tgtggctcac gtgagagtgt cttcacggca 2641 ggacaacgag gaagccctaa gacgtccctt ttttctctga gtatctcctc gcaagctggg 2701 taatcgatgg gggagtctga agcagatgca aagaggcaag aggctggatt ttgaattttc 2761 tttttaataa aaaggcacct ataaaacagg tcaatacagt acaggcagca cagagacccc 2821 cggaacaagc ctaaaaattg tttcaaaata aaaaccaaga agatgtcttc acatattgta 2881 aaaaaaaaaa aaaaaa
19 NP_116743. 1 Типовая последоват ельность аминокисло т для предшестве нника человеческ ого CXCR5 1 masfkavfvp vayslifllg vignvlvlvi lerhrqtrss tetflfhlav adlllvfilp 61 favaegsvgw vlgtflcktv ialhkvnfyc sslllaciav drylaivhav hayrhrrlls 121 ihitcgtiwl vgfllalpei Ifakvsqghh nnslprctfs qenqaethaw ftsrflyhva 181 gfllpmlvmg wcyvgvvhrl rqaqrrpqrq kavrvailvt sifflcwspy hivifldtla 241 rlkavdntck Ingslpvait mceflglahc clnpmlytfa gvkfrsdlsr lltklgctqp 301 aslcqlfpsw rrsslsesen atslttf
20 NP_001707 . 1 Типовая последоват ельность аминокисло т для предшестве 1 mnypltlemd lenledlfwe Idrldnyndt slvenhlcpa tegplmasfk avfvpvaysl 61 ifllgvignv Ivlvilerhr qtrsstetfl fhlavadlll vfilpfavae gsvgwvlgtf 121 Icktvialhk vnfycsslll aciavdryla ivhavhayrh rrllsihitc gtiwlvgfll 181 alpeilfakv sqghhnnslp rctfsqenqa ethawftsrf lyhvagfllp mlvmgwcyvg
- 85 039192
нника человеческ ого CXCR5 241 vvhrlrqaqr rpqrqkavrv Idtlarlkav dntcklngsl 301 pvaitmcefl glahcclnpm gctgpaslcq Ifpswrrssl 361 sesenatslt tf ailvtsiffl lytfagvkfr cwspyhivi f sdlsrlltkl
21 NM_031200, 2 Типовая последоват ельность нуклеиновы х кислот, кодирующая человеческ ий CCR9 1 gcttcctttc tcgtgttgtt gaacccacaa agcctgcccc 61 tcatcccagg cagagagcaa ctgagagctg gtggtgcctg 121 ctgtcccagg gagagttgca ttgcatctga ctgacccacc 181 atgacaccca cagacttcac ctgatgacta tggctctgaa 241 tccacatctt ccatggaaga ctgacttcta ctgtgagaaa 301 aacaatgtca ggcagtttgc tgtactggct cgtgttcatc 361 gtgggtgcct tgggcaacag ggtactgcac aagagtgaag 421 accatgaccg acatgttcct acctcctctt tcttgtcact 481 cttcccttct gggccattgc tccagacctt catgtgcaag 541 gtggtcaaca gcatgtacaa tgttgctgat catgtgcatc 601 agcgtggaca ggtacattgc cacatacttg gagggagaaa 661 aggcttttgt acagcaaaat tattggcagc tgctctctgc 721 atcccagaaa tcttatacag gcattgctat ctgcaccatg 781 gtttacccta gcgatgagag tcttgaccct gaaggtcatt 841 ctggggttct tccttccctt ataccatcat cattcacacc 901 ctgatacaag ccaagaagtc atcgggtagc cccagctctt tcgccctcca aagccctatt ctacgttaac gagccatttc tcttgttatc tttgaatttg tgctgctgac gatgaacttc cattgcccag ggtttgcttt ccaaatcaag caccaaactg cgtggtcatg ttccaagcac tgcctgctca tccccagaca cagagcaggc cctaacatgg ttcaacttca ctcccaccct cttgtctact gcaattgctg cagtggaagt tacagctgtg gccatgagag accatctggg gaggaatccg aagtcagctg gcttgctgct aaagccctaa
-86039192 aagtgaccat cactgtcctg
961 accgtctttg tcttgtctca gtttccctac aactgcattt
tgttggtgca gaccattgac 1021 gcctatgcca tgttcatctc caactgtgcc gtttccacca
acattgacat ctgcttccag 1081 gtcacccaga ccatcgcctt cttccacagt tgcctgaacc
ctgttctcta tgtttttgtg 1141 ggtgagagat tccgccggga tctcgtgaaa accctgaaga
acttgggttg catcagccag 1201 gcccagtggg tttcatttac aaggagagag ggaagcttga
agctgtcgtc tatgttgctg 1261 gagacaacct caggagcact ctccctctga ggggtcttct
ctgaggtgca tggttctttt 1321 ggaagaaatg agaaatacag aaacagtttc cccactgatg
ggaccagaga gagtgaaaga 1381 gaaaagaaaa ctcagaaagg gatgaatctg aactatatga
ttacttgtag tcagaatttg 1441 ccaaagcaaa tatttcaaaa tcaactgact agtgcaggag
gctgttgatt ggctcttgac 1501 tgtgatgccc gcaattctca aaggaggact aaggaccggc
actgtggagc accctggctt 1561 tgccactcgc cggagcatca atgccgctgc ctctggagga
gcccttggat tttctccatg 1621 cactgtgaac ttctgtggct tcagttctca tgctgcctct
tccaaaaggg gacacagaag 1681 cactggctgc tgctacagac cgcaaaagca gaaagtttcg
tgaaaatgtc catctttggg 1741 aaattttcta ccctgctctt gagcctgata acccatgcca
ggtcttatag attcctgatc 1801 tagaaccttt ccaggcaatc tcagacctaa tttccttctg
ttctccttgt tctgttctgg 1861 gccagtgaag gtccttgttc tgattttgaa acgatctgca
ggtcttgcca gtgaacccct 1921 ggacaactga ccacacccac aaggcatcca aagtctgttg
gcttccaatc catttctgtg 1981 tcctgctgga ggttttaacc tagacaagga ttccgcttat
tccttggtat ggtgacagtg
- 87 039192
2041 tctctccatg gcctgagcag ggagattata acagctgggt tcgcaggagc cagccttggc 2101 cctgttgtag gcttgttctg ttgagtggca cttgctttgg gtccaccgtc tgtctgctcc 2161 ctagaaaatg ggctggttct tttggccctc ttctttctga ggcccacttt attctgagga 2221 atacagtgag cagatatggg cagcagccag gtagggcaaa ggggtgaagc gcaggccttg 2281 ctggaaggct atttacttcc atgcttctcc ttttcttact ctatagtggc aacattttaa 2341 aagcttttaa cttagagatt aggctgaaaa aaataagtaa tggaattcac ctttgcatct 2401 tttgtgtctt tcttatcatg atttggcaaa atgcatcacc tttgaaaata tttcacatat 2461 tggaaaagtg ctttttaatg tgtatatgaa gcattaatta cttgtcactt tctttaccct 2521 gtctcaatat tttaagtgtg tgcaattaaa gatcaaatag atacatt
22 NM00125636 9.1 Типовая последоват ельность нуклеиновы х кислот, кодирующая человеческ ий CCR9 1 gcttcctttc tcgtgttgtt atcgggtagc tgcctgctca gaacccacaa agcctgcccc 61 tcatcccagg cagagagcaa cccagctctt tccccagaca ctgagagctg gtggtgcctg 121 ctgtcccagg gagagttgca tcgccctcca cagagcaggc ttgcatctga ctgacccacc 181 atgacaccca cagacttcac atctcctcca ggccccgctc cagatcacct tccctcgctg 241 gcccaggaat ccatctcctt ccaggacctt agcccaggac taacacaagc cctattccta 301 acatggctga tgactatggc tctgaatcca catcttccat ggaagactac gttaacttca 361 acttcactga cttctactgt gagaaaaaca atgtcaggca gtttgcgagc catttcctcc 421 cacccttgta ctggctcgtg ttcatcgtgg gtgccttggg caacagtctt gttatccttg 481 tctactggta ctgcacaaga gtgaagacca tgaccgacat gttccttttg aatttggcaa 541 ttgctgacct cctctttctt gtcactcttc ccttctgggc
- 88 039192 cattgctgct gctgaccagt
601 ggaagttcca gaccttcatg tgcaaggtgg tcaacagcat
gtacaagatg aacttctaca 661 gctgtgtgtt gctgatcatg tgcatcagcg tggacaggta
cattgccatt gcccaggcca 721 tgagagcaca tacttggagg gagaaaaggc ttttgtacag
caaaatggtt tgctttacca 781 tctgggtatt ggcagctgct ctctgcatcc cagaaatctt
atacagccaa atcaaggagg 841 aatccggcat tgctatctgc accatggttt accctagcga
tgagagcacc aaactgaagt 901 cagctgtctt gaccctgaag gtcattctgg ggttcttcct
tcccttcgtg gtcatggctt 961 gctgctatac catcatcatt cacaccctga tacaagccaa
gaagtcttcc aagcacaaag 1021 ccctaaaagt gaccatcact gtcctgaccg tctttgtctt
gtctcagttt ccctacaact 1081 gcattttgtt ggtgcagacc attgacgcct atgccatgtt
catctccaac tgtgccgttt 1141 ccaccaacat tgacatctgc ttccaggtca cccagaccat
cgccttcttc cacagttgcc 1201 tgaaccctgt tctctatgtt tttgtgggtg agagattccg
ccgggatctc gtgaaaaccc 1261 tgaagaactt gggttgcatc agccaggccc agtgggtttc
atttacaagg agagagggaa 1321 gcttgaagct gtcgtctatg ttgctggaga caacctcagg
agcactctcc ctctgagggg 1381 tcttctctga ggtgcatggt tcttttggaa gaaatgagaa
atacagaaac agtttcccca 1441 ctgatgggac cagagagagt gaaagagaaa agaaaactca
gaaagggatg aatctgaact 1501 atatgattac ttgtagtcag aatttgccaa agcaaatatt
tcaaaatcaa ctgactagtg 1561 caggaggctg ttgattggct cttgactgtg atgcccgcaa
ttctcaaagg aggactaagg 1621 accggcactg tggagcaccc tggctttgcc actcgccgga
gcatcaatgc cgctgcctct
- 89 039192
1681 ggaggagccc ttggattttc tccatgcact gtgaacttct gtggcttcag ttctcatgct 1741 gcctcttcca aaaggggaca cagaagcact ggctgctgct acagaccgca aaagcagaaa 1801 gtttcgtgaa aatgtccatc tttgggaaat tttctaccct gctcttgagc ctgataaccc 1861 atgccaggtc ttatagattc ctgatctaga acctttccag gcaatctcag acctaatttc 1921 cttctgttct ccttgttctg ttctgggcca gtgaaggtcc ttgttctgat tttgaaacga 1981 tctgcaggtc ttgccagtga acccctggac aactgaccac acccacaagg catccaaagt 2041 ctgttggctt ccaatccatt tctgtgtcct gctggaggtt ttaacctaga caaggattcc 2101 gcttattcct tggtatggtg acagtgtctc tccatggcct gagcagggag attataacag 2161 ctgggttcgc aggagccagc cttggccctg ttgtaggctt gttctgttga gtggcacttg 2221 ctttgggtcc accgtctgtc tgctccctag aaaatgggct ggttcttttg gccctcttct 2281 ttctgaggcc cactttattc tgaggaatac agtgagcaga tatgggcagc agccaggtag 2341 ggcaaagggg tgaagcgcag gccttgctgg aaggctattt acttccatgc ttctcctttt 2401 cttactctat agtggcaaca ttttaaaagc ttttaactta gagattaggc tgaaaaaaat 2461 aagtaatgga attcaccttt gcatcttttg tgtctttctt atcatgattt ggcaaaatgc 2521 atcacctttg aaaatatttc acatattgga aaagtgcttt ttaatgtgta tatgaagcat 2581 taattacttg tcactttctt taccctgtct caatatttta agtgtgtgca attaaagatc 2641 aaatagatac att
23 NP_112477. 1 Типовая 1 mtptdftspi pnmaddygse stssmedyvn fnftdfycek nnvrqfashf Ipplywlvfi 61 vgalgnslvi Ivywyctrvk tmtdmfllnl aiadllflvt
- 90 039192
последоват ельность аминокисло т для предшестве нника человеческ ого CCR9 Ipfwaiaaad qwkfqtfmck 121 vvnsmykmnf yscvllimci svdryiaiaq amrahtwrek rllyskmvcf tiwvlaaalc 181 ipeilysqik eesgiaictm vypsdestkl ksavltlkvi Igfflpfvvm accytiiiht 241 liqakksskh kalkvtitvl tvfvlsqfpy ncillvqtid ayamfisnca vstnidicfq 301 vtqtiaffhs clnpvlyvfv gerfrrdlvk tlknlgcisq aqwvsftrre gslklssmll 361 ettsgalsl
24 NP_0012432 98.1 Типовая последоват ельность аминокисло т для предшестве нника человеческ ого CCR9 1 maddygsest ssmedyvnfn ftdfyceknn vrqfashflp plywlvfivg algnslvilv 61 ywyctrvktm tdmfllnlai adllflvtlp fwaiaaadqw kfqtfmckvv nsmykmnfys 121 cvllimcisv dryiaiaqam rahtwrekrl lyskmvcfti wvlaaalcip eilysqikee 181 sgiaictmvy psdestklks avltlkvilg fflpfvvmac cytiiihtli qakksskhka 241 Ikvtitvltv fvlsqfpync illvqtiday amfisncavs tnidicfqvt qtiaffhscl 301 npvlyvfvge rfrrdlvktl knlgcisqaq wvsftrregs Iklssmllet tsgalsl
25 NM_000885. 4 Типовая последоват ельность нуклеиновы х кислот, кодирующая человеческ ий а4 1 ataacgtctt tgtcactaaa atgttcccca ggggccttcg gcgagtcttt ttgtttggtt 61 ttttgttttt aatctgtggc tcttgataat ttatctagtg gttgcctaca cctgaaaaac 121 aagacacagt gtttaactat caacgaaaga actggacggc tccccgccgc agtcccactc 181 cccgagtttg tggctggcat ttgggccacg ccgggctggg cggtcacagc gaggggcgcg 241 cagtttgggg tcacacagct ccgcttctag gccccaacca ccgttaaaag gggaagcccg 301 tgccccatca ggtccgctct tgctgagccc agagccatcc cgcgctctgc gggctgggag 361 gcccgggcca ggacgcgagt cctgcgcagc cgaggttccc cagcgccccc tgcagccgcg
- 91 039192
421 cgtaggcaga gacggagccc ggccctgcgc ctccgcacca
cgcccgggac cccacccagc 481 ggcccgtacc cggagaagca gcgcgagcac ccgaagctcc
cggctggcgg cagaaaccgg 541 gagtggggcc gggcgagtgc gcggcatccc aggccggccc
gaacgctccg cccgcggtgg 601 gccgacttcc cctcctcttc cctctctcct tcctttagcc
cgctggcgcc ggacacgctg 661 cgcctcatct cttggggcgt tcttccccgt tggccaaccg
tcgcatcccg tgcaactttg 721 gggtagtggc cgtttagtgt tgaatgttcc ccaccgagag
cgcatggctt gggaagcgag 781 gcgcgaaccc ggcccccgaa gggccgccgt ccgggagacg
gtgatgctgt tgctgtgcct 841 gggggtcccg accggccgcc cctacaacgt ggacactgag
agcgcgctgc tttaccaggg 901 cccccacaac acgctgttcg gctactcggt cgtgctgcac
agccacgggg cgaaccgatg 961 gctcctagtg ggtgcgccca ctgccaactg gctcgccaac
gcttcagtga tcaatcccgg 1021 ggcgatttac agatgcagga tcggaaagaa tcccggccag
acgtgcgaac agctccagct 1081 gggtagccct aatggagaac cttgtggaaa gacttgtttg
gaagagagag acaatcagtg 1141 gttgggggtc acactttcca gacagccagg agaaaatgga
tccatcgtga cttgtgggca 1201 tagatggaaa aatatatttt acataaagaa tgaaaataag
ctccccactg gtggttgcta 1261 tggagtgccc cctgatttac gaacagaact gagtaaaaga
atagctccgt gttatcaaga 1321 ttatgtgaaa aaatttggag aaaattttgc atcatgtcaa
gctggaatat ccagttttta 1381 cacaaaggat ttaattgtga tgggggcccc aggatcatct
tactggactg gctctctttt 1441 tgtctacaat ataactacaa ataaatacaa ggctttttta
gacaaacaaa atcaagtaaa 1501 atttggaagt tatttaggat attcagtcgg agctggtcat
- 92 039192 tttcggagcc agcatactac
1561 cgaagtagtc ggaggagctc ctcaacatga gcagattggt
aaggcatata tattcagcat 1621 tgatgaaaaa gaactaaata tcttacatga aatgaaaggt
aaaaagcttg gatcgtactt 1681 tggagcttct gtctgtgctg tggacctcaa tgcagatggc
ttctcagatc tgctcgtggg 1741 agcacccatg cagagcacca tcagagagga aggaagagtg
tttgtgtaca tcaactctgg 1801 ctcgggagca gtaatgaatg caatggaaac aaacctcgtt
ggaagtgaca aatatgctgc 1861 aagatttggg gaatctatag ttaatcttgg cgacattgac
aatgatggct ttgaagatgt 1921 tgctatcgga gctccacaag aagatgactt gcaaggtgct
atttatattt acaatggccg 1981 tgcagatggg atctcgtcaa ccttctcaca gagaattgaa
ggacttcaga tcagcaaatc 2041 gttaagtatg tttggacagt ctatatcagg acaaattgat
gcagataata atggctatgt 2101 agatgtagca gttggtgctt ttcggtctga ttctgctgtc
ttgctaagga caagacctgt 2161 agtaattgtt gacgcttctt taagccaccc tgagtcagta
aatagaacga aatttgactg 2221 tgttgaaaat ggatggcctt ctgtgtgcat agatctaaca
ctttgtttct catataaggg 2281 caaggaagtt ccaggttaca ttgttttgtt ttataacatg
agtttggatg tgaacagaaa 2341 ggcagagtct ccaccaagat tctatttctc ttctaatgga
acttctgacg tgattacagg 2401 aagcatacag gtgtccagca gagaagctaa ctgtagaaca
catcaagcat ttatgcggaa 2461 agatgtgcgg gacatcctca ccccaattca gattgaagct
gcttaccacc ttggtcctca 2521 tgtcatcagt aaacgaagta cagaggaatt cccaccactt
cagccaattc ttcagcagaa 2581 gaaagaaaaa gacataatga aaaaaacaat aaactttgca
aggttttgtg cccatgaaaa
- 93 039192
2641 ttgttctgct gatttacagg tttctgcaaa gattgggttt
ttgaagcccc atgaaaataa 2701 aacatatctt gctgttggga gtatgaagac attgatgttg
aatgtgtcct tgtttaatgc 2761 tggagatgat gcatatgaaa cgactctaca tgtcaaacta
cccgtgggtc tttatttcat 2821 taagatttta gagctggaag agaagcaaat aaactgtgaa
gtcacagata actctggcgt 2881 ggtacaactt gactgcagta ttggctatat atatgtagat
catctctcaa ggatagatat 2941 tagctttctc ctggatgtga gctcactcag cagagcggaa
gaggacctca gtatcacagt 3001 gcatgctacc tgtgaaaatg aagaggaaat ggacaatcta
aagcacagca gagtgactgt 3061 agcaatacct ttaaaatatg aggttaagct gactgttcat
gggtttgtaa acccaacttc 3121 atttgtgtat ggatcaaatg atgaaaatga gcctgaaacg
tgcatggtgg agaaaatgaa 3181 cttaactttc catgttatca acactggcaa tagtatggct
cccaatgtta gtgtggaaat 3241 aatggtacca aattctttta gcccccaaac tgataagctg
ttcaacattt tggatgtcca 3301 gactactact ggagaatgcc actttgaaaa ttatcaaaga
gtgtgtgcat tagagcagca 3361 aaagagtgca atgcagacct tgaaaggcat agtccggttc
ttgtccaaga ctgataagag 3421 gctattgtac tgcataaaag ctgatccaca ttgtttaaat
ttcttgtgta attttgggaa 3481 aatggaaagt ggaaaagaag ccagtgttca tatccaactg
gaaggccggc catccatttt 3541 agaaatggat gagacttcag cactcaagtt tgaaataaga
gcaacaggtt ttccagagcc 3601 aaatccaaga gtaattgaac taaacaagga tgagaatgtt
gcgcatgttc tactggaagg 3661 actacatcat caaagaccca aacgttattt caccatagtg
attatttcaa gtagcttgct 3721 acttggactt attgtacttc tgttgatctc atatgttatg
- 94 039192 tggaaggctg gcttctttaa
3781 aagacaatac aaatctatcc tacaagaaga aaacagaaga
gacagttgga gttatatcaa 3841 cagtaaaagc aatgatgatt aaggacttct ttcaaattga
gagaatggaa aacagactca 3901 ggttgtagta aagaaattta aaagacactg tttacaagaa
aaaatgaatt ttgtttggac 3961 ttcttttact catgatcttg tgacatatta tgtcttcatg
caaggggaaa atctcagcaa 4021 tgattactct ttgagataga agaactgcaa aggtaataat
acagccaaag ataatctctc 4081 agcttttaaa tgggtagaga aacactaaag cattcaattt
attcaagaaa agtaagccct 4141 tgaagatatc ttgaaatgaa agtataactg agttaaatta
tactggagaa gtcttagact 4201 tgaaatacta cttaccatat gtgcttgcct cagtaaaatg
aaccccactg ggtgggcaga 4261 ggttcatttc aaatacatct ttgatacttg ttcaaaatat
gttctttaaa aatataattt 4321 tttagagagc tgttcccaaa ttttctaacg agtggaccat
tatcacttta aagcccttta 4381 tttataatac atttcctacg ggctgtgttc caacaaccat
tttttttcag cagactatga 4441 atattatagt attataggcc aaactggcaa acttcagact
gaacatgtac actggtttga 4501 gcttagtgaa attacttctg gataattatt tttttataat
tatggatttc accatctttc 4561 tttctgtata tatacatgtg tttttatgta ggtatatatt
taccattctt cctatctatt 4621 cttcctataa cacaccttta tcaagcatac ccaggagtaa
tcttcaaatc ttttgttata 4681 ttctgaaaca aaagattgtg agtgttgcac tttacctgat
acacgctgat ttagaaaata 4741 cagaaaccat acctcactaa taactttaaa atcaaagctg
tgcaaagact agggggccta 4801 tacttcatat gtattatgta ctatgtaaaa tattgactat
cacacaacta tttccttgga
- 95 039192
4861 tgtaattctt tgttaccctt tacaagtata agtgttacct
tacatggaaa cgaagaaaca 4921 aaattcataa atttaaattc ataaatttag ctgaaagata
ctgattcaat ttgtatacag 4981 tgaatataaa tgagacgaca gcaaaatttt catgaaatgt
aaaatatttt tatagtttgt 5041 tcatactata tgaggttcta ttttaaatga ctttctggat
tttaaaaaat ttctttaaat 5101 acaatcattt ttgtaatatt tattttatgc ttatgatcta
gataattgca gaatatcatt 5161 ttatctgact ctgccttcat aagagagctg tggccgaatt
ttgaacatct gttataggga 5221 gtgatcaaat tagaaggcaa tgtggaaaaa caattctggg
aaagatttct ttatatgaag 5281 tccctgccac tagccagcca tcctaattga tgaaagttat
ctgttcacag gcctgcagtg 5341 atggtgagga atgttctgag atttgcgaag gcatttgagt
agtgaaatgt aagcacaaaa 5401 cctcctgaac ccagagtgtg tatacacagg aataaacttt
atgacattta tgtattttta 5461 aaaaactttg tatcgttata aaaaggctag tcattctttc
aggagaacat ctaggatcat 5521 agatgaaaaa tcaagccccg atttagaact gtcttctcca
ggatggtctc taaggaaatt 5581 tacatttggt tctttcctac tcagaactac tcagaaacaa
ctatatattt caggttatct 5641 gagcacagtg aaagcagagt actatggttg tccaacacag
gcctctcaga tacaagggga 5701 acacaattac atattgggct agattttgcc cagttcaaaa
tagtatttgt tatcaactta 5761 ctttgttact tgtatcatga attttaaaac cctaccactt
taagaagaca gggatgggtt 5821 attctttttt ggcaggtagg ctatataact atgtgatttt
gaaatttaac tgctctggat 5881 tagggagcag tgaatcaagg cagacttatg aaatctgtat
tatatttgta acagaatata 5941 ggaaatttaa cataattgat gagctcaaat cctgaaaaat
- 96 039192
gaaagaatcc aaattatttc
6001 agaattatct aggttaaata caaagttttt ttgtgtgtcc 6061 aataaacaca ttgtaaaaaa aa ttgatgtatt atgatggttg
26 NM_000889. 2 Типовая последоват ельность нуклеиновы х кислот, кодирующая человеческ ий β7 1 aaatcttccc caccctgggg cgtctcccag atcagtacac 61 aaaggctgct gctgccgcca gcacctatgt ggaaactaaa 121 gcccagagag aaagtctgac gactgcagca gcaccagaat 181 ctggtctgtt tcctgtttgg gggatctcgg gcatggtggc 241 tttgccaatg gtccttgttt ggtgagagtg aattggacgc 301 caagatccca tccacagggg cctcacctgt ccatgctggg 361 gtcctgccag ccagccccct tcacacccca gctgtgcatg 421 gtgcaagcaa ctgaacttca gcgcggcgct gcgcccgacg 481 agaggagctg ctggctcgag gaggagcccc gcggccagca 541 ggaggtgctg caggaccagc ggagagggtg ccacccagct 601 ggcgccgcag cgggtccggg ccccagcagc tccaggtccg 661 cttccttcgt gctgagggat cttatggacc tgagctactc 721 catgaaggac gacctggaac gctctgctgg tccggctgca 781 ggaagtcacc cattctgtgc gtggacaaaa cggtgctgcc 841 ctttgtgagc acagtaccct cccacccggc tggagcgctg 901 ccagtcacca ttcagctttc ggggacgcac aagccttcga agtgtcactt gaggaaggac ttgccccaca ctcttctacc tgctgctggt atgccacaga cctgccagaa ccgcgtcggg gctgcccgct cgctcagcca tcacgctgcg acccggtgga gcgtgcgcca gcattggttt ccaaactgcg accatgtgct cctcctctgc tgctctgcac gccagtgagt actacggctt cctgagcaga atggcggaat gtgcatcctc agaggcggag ggaggagctg gggcgcccgc gcctggggag cctgtactac gctcgggcac tggttccttt ccacccctgc gtccctgacg
- 97 039192
961 gcgggaggtg gggcgccaga gtgtgtccgg caatctggac
tcgcctgaag gtggcttcga 1021 tgccattctg caggctgcac tctgccagga gcagattggc
tggagaaatg tgtcccggct 1081 gctggtgttc acttcagacg acacattcca tacagctggg
gacgggaagt tgggcggcat 1141 tttcatgccc agtgatgggc actgccactt ggacagcaat
ggcctctaca gtcgcagcac 1201 agagtttgac tacccttctg tgggtcaggt agcccaggcc
ctctctgcag caaatatcca 1261 gcccatcttt gctgtcacca gtgccgcact gcctgtctac
caggagctga gtaaactgat 1321 tcctaagtct gcagttgggg agctgagtga ggactccagc
aacgtggtac agctcatcat 1381 ggatgcttat aatagcctgt cttccaccgt gacccttgaa
cactcttcac tccctcctgg 1441 ggtccacatt tcttacgaat cccagtgtga gggtcctgag
aagagggagg gtaaggctga 1501 ggatcgagga cagtgcaacc acgtccgaat caaccagacg
gtgactttct gggtttctct 1561 ccaagccacc cactgcctcc cagagcccca tctcctgagg
ctccgggccc ttggcttctc 1621 agaggagctg attgtggagt tgcacacgct gtgtgactgt
aattgcagtg acacccagcc 1681 ccaggctccc cactgcagtg atggccaggg acacctacaa
tgtggtgtat gcagctgtgc 1741 ccctggccgc ctaggtcggc tctgtgagtg ctctgtggca
gagctgtcct ccccagacct 1801 ggaatctggg tgccgggctc ccaatggcac agggcccctg
tgcagtggaa agggtcactg 1861 tcaatgtgga cgctgcagct gcagtggaca gagctctggg
catctgtgcg agtgtgacga 1921 tgccagctgt gagcgacatg agggcatcct ctgcggaggc
tttggtcgct gccaatgtgg 1981 agtatgtcac tgtcatgcca accgcacggg cagagcatgc
gaatgcagtg gggacatgga 2041 cagttgcatc agtcccgagg gagggctctg cagtgggcat
- 98 039192
ggacgctgca aatgcaaccg 2101 ctgccagtgc ttggacggct actatggtgc tctatgcgac caatgcccag gctgcaagac 2161 accatgcgag agacaccggg actgtgcaga gtgtggggcc ttcaggactg gcccactggc 2221 caccaactgc agtacagctt gtgcccatac caatgtgacc ctggccttgg cccctatctt 2281 ggatgatggc tggtgcaaag agcggaccct ggacaaccag ctgttcttct tcttggtgga 2341 ggatgacgcc agaggcacgg tcgtgctcag agtgagaccc caagaaaagg gagcagacca 2401 cacgcaggcc attgtgctgg gctgcgtagg gggcatcgtg gcagtggggc tggggctggt 2461 cctggcttac cggctctcgg tggaaatcta tgaccgccgg gaatacagtc gctttgagaa 2521 ggagcagcaa caactcaact ggaagcagga cagtaatcct ctctacaaaa gtgccatcac 2581 gaccaccatc aatcctcgct ttcaagaggc agacagtccc actctctgaa ggagggaggg 2641 acacttaccc aaggctcttc tccttggagg acagtgggaa ctggagggtg agaggaaggg 2701 tgggtctgta agaccttggt aggggactaa ttcactggcg aggtgcggcc accaccctac 2761 ttcattttca gagtgacacc caagagggct gcttcccatg cctgcaacct tgcatccatc 2821 tgggctaccc cacccaagta tacaataaag tcttacctca gaccacaaaa aaaaaaaa
27 NP_000876. 3 Типовая последоват ельность аминокисло т для предшестве нника 1 mawearrepg prraavretv mlllclgvpt grpynvdtes allyqgphnt Ifgysvvlhs 61 hganrwllvg aptanwlana svinpgaiyr crigknpgqt ceqlqlgspn gepcgktcle 121 erdnqwlgvt Isrqpgengs ivtcghrwkn ifyiknenkl ptggcygvpp dlrtelskri 181 apcyqdyvkk fgenfascqa gissfytkdl ivmgapgssy wtgslfvyni ttnkykafld 241 kqnqvkfgsy Igysvgaghf rsqhttevvg gapqheqigk
- 99 039192
человеческ ого α4 ayifsideke Inilhemkgk 301 klgsyfgasv cavdlnadgf sdllvgapmq stireegrvf vyinsgsgav mnametnlvg 361 sdkyaarfge sivnlgdidn dgfedvaiga pqeddlqgai yiyngradgi sstfsqrieg 421 Iqiskslsmf gqsisgqida dnngyvdvav gafrsdsavl Irtrpvvivd aslshpesvn 481 rtkfdcveng wpsvcidltl cfsykgkevp gyivlfynms Idvnrkaesp prfyfssngt 541 sdvitgsiqv ssreancrth qafmrkdvrd iltpiqieaa yhlgphvisk rsteefpplq 601 pilqqkkekd imkktinfar fcahencsad Iqvsakigfl kphenktyla vgsmktlmln 661 vslfnagdda yettlhvklp vglyfikile leekqincev tdnsgvvqld csigyiyvdh 721 Isridisfll dvsslsraee dlsitvhatc eneeemdnlk hsrvtvaipl kyevkltvhg 781 fvnptsfvyg sndenepetc mvekmnltfh vintgnsmap nvsveimvpn sfspqtdklf 841 nildvqtttg echfenyqrv caleqqksam qtlkgivrfl sktdkrllyc ikadphclnf 901 Icnfgkmesg keasvhiqle grpsilemde tsalkfeira tgfpepnprv ielnkdenva 961 hvlleglhhq rpkryftivi issslllgli vlllisyvmw kagffkrqyk silqeenrrd 1021 swsyinsksn dd
28 ΝΡ_000880, 1 Типовая последоват ельность аминокисло т для предшестве нника человеческ 1 mvalpmvlvl llvlsrgese Idakipstgd atewrnphls mlgscqpaps cqkcilshps 61 cawckqlnft asgeaearrc arreellarg cpleeleepr gqqevlqdqp Isqgargega 121 tqlapqrvrv tlrpgepqql qvrflraegy pvdlyylmdl sysmkddler vrqlghallv 181 rlqevthsvr igfgsfvdkt vlpfvstvps klrhpcptrl ercqspfsfh hvlsltgdaq 241 aferevgrqs vsgnldspeg gfdailqaal cqeqigwrnv srllvftsdd tfhtagdgkl
- 100 039192
ого β7 301 ggifmpsdgh chldsnglys rstefdypsv gqvaqalsaa niqpifavts aalpvyqels 361 klipksavge Isedssnvvq limdaynsls stvtlehssl ppgvhisyes qcegpekreg 421 kaedrgqcnh vrinqtvtfw vslqathclp ephllrlral gfseelivel htlcdcncsd 481 tqpqaphcsd gqghlqcgvc scapgrlgrl cecsvaelss pdlesgcrap ngtgplcsqk 541 ghcqcgrcsc sgqssghlce cddascerhe gilcggfgrc qcgvchchan rtgracecsg 601 dmdscispeg glcsghgrck cnrcqcldqy ygalcdqcpg cktpcerhrd caecgafrtg 661 platncstac ahtnvtlala pilddgwcke rtldnqlfff Iveddargtv vlrvrpqekg 721 adhtqaivlg cvggivavgl glvlayrlsv eiydrreysr fekeqqqlnw kqdsnplyks 781 aitttinprf qeadsptl
29 ΝΜ_016602. 2 Типовая последоват ельность нуклеиновы х кислот, кодирующая человеческ ий CCR10 1 agagatgggg acggaggcca cagagcagqt ttcctggggc cattactctg gggatgaaqa 61 ggacgcatac tcggctgagc cactgccgqa gctttgctac aaggccgatg tccaggcctt 121 cagccgggcc ttccaaccca gtgtctccct gaccgtggct gcgctgggtc tggccggcaa 181 tggcctggtc ctggccaccc acctggcaqc ccgacgcgca gcgcgctcqc ccacctctqc 241 ccacctgctc cagctggccc tggccgacct cttgctggcc ctgactctqc ccttcgcgqc 301 agcaggggct cttcagggct ggagtctgqg aagtgccacc tgccgcacca tctctggcct 361 ctactcggcc tccttccacg ccggcttcct cttcctggcc tgtatcagcg ccgaccgcta 421 cgtggccatc gcgcgagcgc tcccagccqg gccgcggccc tccactcccg gccgcgcaca 481 cttggtctcc gtcatcgtgt ggctgctgtc actgctcctg gcgctgcctg cgctgctctt 541 cagccaggat gggcagcggg aaggccaacg acgctgtcgc
- 101 039192
ctcatcttcc ccgagggcct 601 cacgcagacg gtgaaggggg cgagcgccgt ggcgcaggtg gccctgggct tcgcgctgcc 661 gctgggcgtc atggtagcct gctacgcgct tctgggccgc acgctgctgg ccgccagggg 721 gcccgagcgc cggcgtgcgc tgcgcgtcgt ggtggctctg gtggcggcct tcgtggtgct 781 gcagctgccc tacagcctcg ccctgctgct ggatactgcc gatctactgg ctgcgcgcga 841 gcggagctgc cctgccagca aacgcaagga tgtcgcactg ctggtgacca gcggcttggc 901 cctcgcccgc tgtggcctca atcccgttct ctacgccttc ctgggcctgc gcttccgcca 961 ggacctgcgg aggctgctac ggggtgggag ctgcccctca gggcctcaac cccgccgcgg 1021 ctgcccccgc cggccccgcc tttcttcctg ctcagctccc acggagaccc acagtctctc 1081 ctgggacaac tagggctgcg aatctagagg agggggcagg ctgagggtcg tgggaaaggg 1141 gagtaggtgg gggaacactg agaaagaggc agggacctaa agggactacc tctgtgcctt 1201 gccacattaa attgataaca tggaaatgag atgcaaccca acaa
30 AF215981.1 Типовая последоват ельность нуклеиновы х кислот, кодирующая человеческ ий CCR10 1 agagatgggg acggaggcca cagagcaggt ttcctggggc cattactctg gggatgaaga 61 ggacgcatac tcggctgagc cactgccgga gctttgctac aaggccgatg tccaggcctt 121 cagccgggcc ttccaaccca gtgtctccct gaccgtggct gcgctgggtc tggccggcaa 181 tggcctggtc ctggccaccc acctggcagc ccgacgcgca gcgcgctcgc ccacctctgc 241 ccacctgctc cagctggccc tggccgacct cttgctggcc ctgactctgc ccttcgcggc 301 agcaggggct cttcagggct ggagtctggg aagtgccacc tgccgcacca tctctggcct 361 ctactcggcc tccttccacg ccggcttcct cttcctggcc tgtatcagcg ccgaccgcta
- 102 039192
421 cgtggccatc gcgcgagcgc tcccagccgg gccgcggccc
tccactcccg gccgcgcaca 481 cttggtctcc gtcatcgtgt ggctgctgtc actgctcctg
gcgctgcctg cgctgctctt 541 cagccaggat gggcagcggg aaggccaacg acgctgtcgc
ctcatcttcc ccgagggcct 601 cacgcagacg gtgaaggggg cgagcgccgt ggcgcaggtg
gccctgggct tcgcgctgcc 661 gctgggcgtc atggtagcct gctacgcgct tctgggccgc
acgctgctgg ccgccagggg 721 gcccgagcgc cggcgtgcgc tgcgcgtcgt ggtggctctg
gtggcggcct tcgtggtgct 781 gcagctgccc tacagcctcg ccctgctgct ggatactgcc
gatctactgg ctgcgcgcga 841 gcggagctgc cctgccagca aacgcaagga tgtcgcactg
ctggtgacca gcggcttggc 901 cctcgcccgc tgtggcctca atcccgttct ctacgccttc
ctgggcctgc gcttccgcca 961 ggacctgcgg aggctgctac ggggtgggag ctcgccctca
gggcctcaac cccgccgcgg 1021 ctgcccccgc cggccccgcc tttcttcctg ctcagctccc
acggagaccc acagtctctc 1081 ctgggacaac tagggctgcg aatctagagg agggggcagg
ctgagggtcg tgggaaaggg 1141 gagtaggtgg gggaacactg agaaagaggc agggacctaa
agggactacc tctgtgcctt
1201 gccacattaa attgataaca tggaaatgaa aaaaaaaaaa aaaa
31 NP 057686. 1 mgteateqvs wghysgdeed aysaeplpel cykadvqafs
2 Типовая rafqpsvslt vaalglagng 61 Ivlathlaar raarsptsah llqlaladll laltlpfaaa
последоват ельность galqgwslgs atcrtisgly 121 sasfhagflf lacisadryv aiaralpagp rpstpgrahl
аминокисло т для vsvivwllsl llalpallfs 181 qdgqregqrr crlifpeglt qtvkgasava qvalgfalpl
предшестве нника gvmvacyall grtllaarqp 241 errralrvvv alvaafvvlq Ipyslallld tadllaarer
- 103 039192
человеческ ого CCR10 scpaskrkdv allvtsglal 301 arcglnpvly aflglrfrqd Irrllrggsc psgpqprrgc prrprlsscs aptethslsw 361 dn
32 Р46092.3 Типовая последоват ельность аминокисло т для предшестве нника человеческ ого CCR10 1 mgteateqvs wghysgdeed aysaeplpel cykadvqafs rafqpsvslt vaalglagng 61 Ivlathlaar raarsptsah llqlaladll laltlpfaaa galqgwslgs atcrtisgly 121 sasfhagflf lacisadryv aiaralpagp rpstpgrahl vsvivwllsl llalpallfs 181 qdgqregqrr crlifpeglt qtvkgasava qvalgfalpl gvmvacyall grtllaargp 241 errralrvvv alvaafvvlq Ipyslallld tadllaarer scpaskrkdv allvtsglal 301 arcglnpvly aflglrfrqd Irrllrggsc psgpqprrgc prrprlsscs aptethslsw 361 dn
33 NM_005201. 3 Типовая последоват ельность нуклеиновы х кислот, кодирующая человеческ ий CCR8 1 tttgtagtgg gaggatacct ccagagaggc tgctgctcat tgagctgcac tcacatgagg 61 atacagactt tgtgaagaag gaattggcaa cactgaaacc tccagaacaa aggctgtcac 121 taaggtcccg ctgccttgat ggattataca cttgacctca gtgtgacaac agtgaccgac 181 tactactacc ctgatatctt ctcaagcccc tgtgatgcgg aacttattca gacaaatggc 241 aagttgctcc ttgctgtctt ttattgcctc ctgtttgtat tcagtcttct gggaaacagc 301 ctggtcatcc tggtccttgt ggtctgcaag aagctgagga gcatcacaga tgtatacctc 361 ttgaacctgg ccctgtctga cctgcttttt gtcttctcct tcccctttca gacctactat 421 ctgctggacc agtgggtgtt tgggactgta atgtgcaaag tggtgtctgg cttttattac 481 attggcttct acagcagcat gtttttcatc accctcatga gtgtggacag gtacctggct 541 gttgtccatg ccgtgtatgc cctaaaggtg aggacgatca
- 104 039192
ggatgggcac aacgctgtgc 601 ctggcagtat ggctaaccgc cattatggct accatcccat tgctagtgtt ttaccaagtg 661 gcctctgaag atggtgttct acagtgttat tcattttaca atcaacagac tttgaagtgg 721 aagatcttca ccaacttcaa aatgaacatt ttaggcttgt tgatcccatt caccatcttt 781 atgttctgct acattaaaat cctgcaccag ctgaagaggt gtcaaaacca caacaagacc 841 aaggccatca ggttggtgct cattgtggtc attgcatctt tacttttctg ggtcccattc 901 aacgtggttc ttttcctcac ttccttgcac agtatgcaca tcttggatgg atgtagcata 961 agccaacagc tgacttatgc cacccatgtc acagaaatca tttcctttac tcactgctgt 1021 gtgaaccctg ttatctatgc ttttgttggg gagaagttca agaaacacct ctcagaaata 1081 tttcagaaaa gttgcagcca aatcttcaac tacctaggaa gacaaatgcc tagggagagc 1141 tgtgaaaagt catcatcctg ccagcagcac tcctcccgtt cctccagcgt agactacatt 1201 ttgtgaggat caatgaagac taaatataaa aaacattttc ttgaatggca tgctagtagc 1261 agtgagcaaa ggtgtgggtg tgaaaggttt ccaaaaaaag ttcagcatga aggatgccat 1321 atatgttgtt gccaacactt ggaacacaat gactaaagac atagttgtgc atgcctggca 1381 caacatcaag cctgtgattg tgtttattga tgatgttgaa caagtggtaa ctttaaagga 1441 ttctgtatgc caagtgaaaa aaaaagatgt ctgacctcct tacatat
34 BC107159.1 Типовая последоват ельность нуклеиновы х кислот, 1 ctttgtgaag aaggaattgg caacactgaa acctccagaa caaaggctgt cactaaggtc 61 ccgctgcctt gatggattat acacttgacc tcagtgtgac aacagtgacc gactactact 121 accctgatat cttctcaagc ccctgtgatg cggaacttat tcagacaaat ggcaagttgc
- 105 039192
кодирующая 181 tccttgctgt cttttattgc ctcctgtttg tattcagtct
человеческ ий CCR8 tctgggaaac agcctggtca 241 tcctggtcct tgtggtctgc aagaagctga ggagcatcac
agatgtatac ctcttgaacc 301 tggccctgtc tgacctgctt tttgtcttct ccttcccctt
tcagacctac tatctgctgg 361 accagtgggt gtttgggact gtaatgtgca aagtggtgtc
tggcttttat tacattggct 421 tctacagcag catgtttttc atcaccctca tgagtgtgga
caggtacctg gctgttgtcc 481 atgccgtgta tgccctaaag gtgaggacga tcaggatggg
cacaacgctg tgcctggcag 541 tatggctaac cgccattatg gctaccatcc cattgctagt
gttttaccaa gtggcctctg 601 aagatggtgt tctacagtgt tattcatttt acaatcaaca
gactttgaag tggaagatct 661 tcaccaactt caaaatgaac attttaggct tgttgatccc
attcaccatc tttatgttct 721 gctacattaa aatcctgcac cagctgaaga ggtgtcaaaa
ccacaacaag accaaggcca 781 tcaggttggt gctcattgtg gtcattgcat ctttactttt
ctgggtccca ttcaacgtgg 841 ttcttttcct cacttccttg cacagtatgc acatcttgga
tggatgtagc ataagccaac 901 agctgactta tgccacccat gtcacagaaa tcatttcctt
tactcactgc tgtgtgaacc 961 ctgttatcta tgcttttgtt ggggagaagt tcaagaaaca
cctctcagaa atatttcaga 1021 aaagttgcag ccaaatcttc aactacctag gaagacaaat
gcctagggag agctgtgaaa 1081 agtcatcatc ctgccagcag cactcctccc gttcctccag
cgtagactac attttgtgag 1141 gatcaatgaa gactaaatat aaaaaacatt ttcttgaatg
gcatgctagt agcagtgagc 1201 aaaggtgtgg gtgtgaaagg tttccaaaaa aagttcagca
tgaaggatgc cgtgtgtgtt 1261 gttgccaaca cttggaacac gatgactggg gacgtggttg
- 106 039192
tgcatgcctg gcacaacatc 1321 aagcctgtga ttgtgtttat tgatgatgtt gaacaagtgg tggctttgga ggattctgta 1381 tgccaagtga aaggggagat gtctgacctc cttcatatag
35 NP_005192. 1 Типовая последоват ельность аминокисло т для предшестве нника человеческ ого CCR8 1 mdytldlsvt tvtdyyypdi fsspcdaeli qtngklllav fycllfvfsl Ignslvilvl 61 vvckklrsit dvyllnlals dllfvfsfpf qtyylldqwv fgtvmckvvs gfyyigfyss 121 mffitlmsvd rylavvhavy alkvrtirmg ttlclavwlt aimatipllv fyqvasedgv 181 Iqcysfynqq tlkwkiftnf kmnilgllip ftifmfcyik ilhqlkrcqn hnktkairlv 241 livviasllf wvpfnvvlfl tslhsmhild gcsisqqlty athvteiisf thccvnpviy 301 afvgekfkkh Iseifqkscs qifnylgrqm presceksss cqqhssrsss vdyil
36 ΑΆΙ07160,1 Типовая последоват ельность аминокисло т для предшестве нника человеческ ого CCR8 1 mdytldlsvt tvtdyyypdi fsspcdaeli qtngklllav fycllfvfsl Ignslvilvl 61 vvckklrsit dvyllnlals dllfvfsfpf qtyylldqwv fgtvmckvvs gfyyigfyss 121 mffitlmsvd rylavvhavy alkvrtirmg ttlclavwlt aimatipllv fyqvasedgv 181 Iqcysfynqq tlkwkiftnf kmnilqllip ftifmfcyik ilhqlkrcqn hnktkairlv 241 livviasllf wvpfnvvlfl tslhsmhild gcsisqqlty athvteiisf thccvnpviy 301 afvgekfkkh Iseifqkscs qifnylgrqm presceksss cqqhssrsss vdyil
37 NM_005508. 4 Типовая последоват ельность нуклеиновы х кислот, 1 gctcacaqga agccacqcac ccttgaaagg caccgggtcc ttcttagcat cgtgcttcct 61 gagcaagcct ggcattqcct cacagacctt cctcagagcc gctttcagaa aagcaagctg 121 cttctggttg ggcccagacc tgccttgagg agcctgtaga gttaaaaaat gaaccccacg 181 gatatagcag acaccaccct cgatgaaagc atatacagca
- 107 039192
кодирующая человеческ ий CCR4 attactatct gtatgaaagt 241 atccccaagc cttgcaccaa agaaggcatc aaggcatttg gggagctctt cctgccccca 301 ctgtattcct tggtttttgt atttggtctg cttggaaatt ctgtggtggt tctggtcctg 361 ttcaaataca agcggctcag gtccatgact gatgtgtacc tgctcaacct tgccatctcg 421 gatctgctct tcgtgttttc cctccctttt tggggctact atgcagcaga ccagtgggtt 481 tttgggctag gtctgtgcaa gatgatttcc tggatgtact tggtgggctt ttacagtggc 541 atattctttg tcatgctcat gagcattgat agatacctgg caattgtgca cgcggtgttt 601 tccttgaggg caaggacctt gacttatggg gtcatcacca gtttggctac atggtcagtg 661 gctgtgttcg cctcccttcc tggctttctg ttcagcactt gttatactga gcgcaaccat 721 acctactgca aaaccaagta ctctctcaac tccacgacgt ggaaggttct cagctccctg 781 gaaatcaaca ttctcggatt ggtgatcccc ttagggatca tgctgttttg ctactccatg 841 atcatcagga ccttgcagca ttgtaaaaat gagaagaaga acaaggcggt gaagatgatc 901 tttgccgtgg tggtcctctt ccttgggttc tggacacctt acaacatagt gctcttccta 961 gagaccctgg tggagctaga agtccttcag gactgcacct ttgaaagata cttggactat 1021 gccatccagg ccacagaaac tctggctttt gttcactgct gccttaatcc catcatctac 1081 ttttttctgg gggagaaatt tcgcaagtac atcctacagc tcttcaaaac ctgcaggggc 1141 ctttttgtgc tctgccaata ctgtgggctc ctccaaattt actctgctga cacccccagc 1201 tcatcttaca cgcagtccac catggatcat gatctccatg atgctctgta gaaaaatgaa 1261 atggtgaaat gcagagtcaa tgaactttcc acattcagag cttacttaaa attgtatttt
- 108 039192
1321 agtaagagat tcctgagcca gtgtcaggag gaaggcttac
acccacagtg gaaagacagc 1381 ttctcatcct gcaggcagct ttttctctcc cactagacaa
gtccagcctg gcaagggttc 1441 acctgggctg aggcatcctt cctcacacca ggcttgcctg
caggcatgag tcagtctgat 1501 gagaactctg agcagtgctt gaatgaagtt gtaggtaata
ttgcaaggca aagactattc 1561 ccttctaacc tgaactgatg ggtttctcca gagggaattg
cagagtactg gctgatggag 1621 taaatcgcta ccttttgctg tggcaaatgg gccctct
38 P51679.1 1 mnptdiadtt Idesiysnyy lyesipkpct kegikafgel
Типовая последоват flpplyslvf vfgllgnsvv 61 vlvlfkykrl rsmtdvylln laisdllfvf slpfwgyyaa
ельность аминокисло dqwvfglglc kmiswmylvg 121 fysgiffvml msidrylaiv havfslrart Itygvitsla
т для предшестве twsvavfasl pgflfstcyt 181 ernhtycktk yslnsttwkv Issleinilg Iviplgimlf
нника человеческ cysmiirtlq hcknekknka 241 vkmifavvvl flgfwtpyni vlfletlvel evlqdctfer
ого CCR4 yldyaiqate tlafvhccln 301 piiyfflgek frkyilqlfk dtpsssytqs tmdhdlhdal tcrglfvlcq ycgllqiysa
39 NM_0012066 1 aatcatccga gaaccttgga gggtggacag tgcccctttt
09.1 Типовая acagatgaga aaactgaggc 61 ttgaagggga gaagcagctg cctctggcgg catggcttct
последоват ельность ggctgcagga tgcccatgga 121 gttcgtggtg accctaggcc tgtgtctcgg cttcctttgc
нуклеиновы х кислот, tgaacttgaa caggaagatg 181 gcagtggggg ccagtggtct agaaggagat aagatggctg
кодирующая человеческ gtgccatgcc tctgcaactc 241 ctcctgttgc tgatcctact gggccctggc aacagcttgc
ий CLA agctgtggga cacctgggca 301 gatgaagccg agaaagcctt accggagaca ggccaccgaa 361 tatgagtacc tagattatga gggtcccctg tttcctgcca cttgcccggg gaaacggagc
- 109 039192 ctccagaaat gctgaggaac
421 agcactgaca ccactcctct gactgggcct ggaacccctg
agtctaccac tgtggagcct 481 gctgcaaggc gttctactgg cctggatgca ggaggggcag
tcacagagct gaccacggag 541 ctggccaaca tggggaacct gtccacggat tcagcagcta
tggagataca gaccactcaa 601 ccagcagcca cggaggcaca gaccactcaa ccagtgccca
cggaggcaca gaccactcca 661 ctggcagcca cagaggcaca gacaactcga ctgacggcca
cggaggcaca gaccactcca 721 ctggcagcca cagaggcaca gaccactcca ccagcagcca
cggaagcaca gaccactcaa 781 cccacaggcc tggaggcaca gaccactgca ccagcagcca
tggaggcaca gaccactgca 841 ccagcagcca tggaagcaca gaccactcca ccagcagcca
tggaggcaca gaccactcaa 901 accacagcca tggaggcaca gaccactgca ccagaagcca
cggaggcaca gaccactcaa 961 cccacagcca cggaggcaca gaccactcca ctggcagcca
tggaggccct gtccacagaa 1021 cccagtgcca cagaggccct gtccatggaa cctactacca
aaagaggtct gttcataccc 1081 ttttctgtgt cctctgttac tcacaagggc attcccatgg
cagccagcaa tttgtccgtc 1141 aactacccag tgggggcccc agaccacatc tctgtgaagc
agtgcctgct ggccatccta 1201 atcttggcgc tggtggccac tatcttcttc gtgtgcactg
tggtgctggc ggtccgcctc 1261 tcccgcaagg gccacatgta ccccgtgcgt aattactccc
ccaccgagat ggtctgcatc 1321 tcatccctgt tgcctgatgg gggtgagggg ccctctgcca
cagccaatgg gggcctgtcc 1381 aaggccaaga gcccgggcct gacgccagag cccagggagg
accgtgaggg ggatgacctc 1441 accctgcaca gcttcctccc ttagctcact ctgccatctg
ttttggcaag accccacctc
- 110 039192
1501 cacgggctct cctgggccac ccctgagtgc ccagacccca
ttccacagct ctgggcttcc 1561 tcggagaccc ctggggatgg ggatcttcag ggaaggaact
ctggccaccc aaacaggaca 1621 agagcagcct ggggccaagc agacgggcaa gtggagccac
ctctttcctc cctccgcgga 1681 tgaagcccag ccacatttca gccgaggtcc aaggcaggag
gccatttact tgagacagat 1741 tctctccttt ttcctgtccc ccatcttctc tgggtccctc
taacatctcc catggctctc 1801 cccgcttctc ctggtcactg gagtctcctc cccatgtacc
caaggaagat ggagctcccc 1861 catcccacac gcactgcact gccattgtct tttggttgcc
atggtcacca aacaggaagt 1921 ggacattcta agggaggagt actgaagagt gacggacttc
tgaggctgtt tcctgctgct 1981 cctctgactt ggggcagctt gggtcttctt gggcacctct
ctgggaaaac ccagggtgag 2041 gttcagcctg tgagggctgg gatgggtttc gtgggcccaa
gggcagacct ttctttggga 2101 ctgtgtggac caaggagctt ccatctagtg acaagtgacc
cccagctatc gcctcttgcc 2161 ttcccctgtg gccactttcc agggtggact ctgtcttgtt
cactgcagta tcccaactgc 2221 aggtccagtg caggcaataa atatgtgatg gacaaacgat
agcggaatcc ttcaaggttt 2281 caaggctgtc tccttcaggc agccttcccg gaattctcca
tccctcagtg caggatgggg 2341 gctggtcctc agctgtctgc cctcagcccc tggcccccca
ggaagcctct ttcatgggct 2401 gttaggttga cttcagtttt gcctcttgga caacaggggg
tcttgtacat ccttgggtga 2461 ccaggaaaag ttcaggctat ggggggccaa agggagggct
gccccttccc caccagtgac 2521 cactttattc cacttcctcc attacccagt tttggcccac
agagtttggt cccccccaaa 2581 cctcggacca atatccctct aaacatcaat ctatcctcct
- 111 039192
gttaaagaaa аааааааа
40 NM_003006. 4 Типовая последоват ельность нуклеиновы X кислот, кодирующая человеческ ий CLA 1 acacacagcc attgggggtt gctcggatcc gggactgccg cagggggtgc cacagcagtg 61 cctggcagcg tgggctggga ccttgtcact aaagcagaga agccacttct tctgggccca 121 cgaggcagct gtcccatgct ctgctgagca cggtggtgcc atgcctctgc aactcctcct 181 gttgctgatc ctactgggcc ctggcaacag cttgcagctg tgggacacct gggcagatga 241 agccgagaaa gccttgggtc ccctgcttgc ccgggaccgg agacaggcca ccgaatatga 301 gtacctagat tatgatttcc tgccagaaac ggagcctcca gaaatgctga ggaacagcac 361 tgacaccact cctctgactg ggcctggaac ccctgagtct accactgtgg agcctgctgc 421 aaggcgttct actggcctgg atgcaggagg ggcagtcaca gagctgacca cggagctggc 481 caacatgggg aacctgtcca cggattcagc agctatggag atacagacca ctcaaccagc 541 agccacggag gcacagacca ctcaaccagt gcccacggag gcacagacca ctccactggc 601 agccacagag gcacagacaa ctcgactgac ggccacggag gcacagacca ctccactggc 661 agccacagag gcacagacca ctccaccagc agccacggaa gcacagacca ctcaacccac 721 aggcctggag gcacagacca ctgcaccagc agccatggag gcacagacca ctgcaccagc 781 agccatggaa gcacagacca ctccaccagc agccatggag gcacagacca ctcaaaccac 841 agccatggag gcacagacca ctgcaccaga agccacggag gcacagacca ctcaacccac 901 agccacggag gcacagacca ctccactggc agccatggag gccctgtcca cagaacccag 961 tgccacagag gccctgtcca tggaacctac taccaaaaga ggtctgttca tacccttttc 1021 tgtgtcctct gttactcaca agggcattcc catggcagcc
- 112 039192 agcaatttgt ccgtcaacta
1081 cccagtgggg gccccagacc acatctctgt gaagcagtgc
ctgctggcca tcctaatctt 1141 ggcgctggtg gccactatct tcttcgtgtg cactgtggtg
ctggcggtcc gcctctcccg 1201 caagggccac atgtaccccg tgcgtaatta ctcccccacc
gagatggtct gcatctcatc 1261 cctgttgcct gatgggggtg aggggccctc tgccacagcc
aatgggggcc tgtccaaggc 1321 caagagcccg ggcctgacgc cagagcccag ggaggaccgt
gagggggatg acctcaccct 1381 gcacagcttc ctcccttagc tcactctgcc atctgttttg
gcaagacccc acctccacgg 1441 gctctcctgg gccacccctg agtgcccaga ccccattcca
cagctctggg cttcctcgga 1501 gacccctggg gatggggatc ttcagggaag gaactctggc
cacccaaaca ggacaagagc 1561 agcctggggc caagcagacg ggcaagtgga gccacctctt
tcctccctcc gcggatgaag 1621 cccagccaca tttcagccga ggtccaaggc aggaggccat
ttacttgaga cagattctct 1681 cctttttcct gtcccccatc ttctctgggt ccctctaaca
tctcccatgg ctctccccgc 1741 ttctcctggt cactggagtc tcctccccat gtacccaagg
aagatggagc tcccccatcc 1801 cacacgcact gcactgccat tgtcttttgg ttgccatggt
caccaaacag gaagtggaca 1861 ttctaaggga ggagtactga agagtgacgg acttctgagg
ctgtttcctg ctgctcctct 1921 gacttggggc agcttgggtc ttcttgggca cctctctggg
aaaacccagg gtgaggttca 1981 gcctgtgagg gctgggatgg gtttcgtggg cccaagggca
gacctttctt tgggactgtg 2041 tggaccaagg agcttccatc tagtgacaag tgacccccag
ctatcgcctc ttgccttccc 2101 ctgtggccac tttccagggt ggactctgtc ttgttcactg
cagtatccca actgcaggtc
- 113 039192
2161 cagtgcaggc aataaatatg tgatggacaa acgatagcgg
aatccttcaa ggtttcaagg 2221 ctgtctcctt caggcagcct tcccggaatt ctccatccct
cagtgcagga tgggggctgg 2281 tcctcagctg tctgccctca gcccctggcc ccccaggaag
cctctttcat gggctgttag 2341 gttgacttca gttttgcctc ttggacaaca gggggtcttg
tacatccttg ggtgaccagg 2401 aaaagttcag gctatggggg gccaaaggga gggctgcccc
ttccccacca gtgaccactt 2461 tattccactt cctccattac ccagttttgg cccacagagt
ttggtccccc ccaaacctcg 2521 gaccaatatc cctctaaaca tcaatctatc ctcctgttaa
agaaaaaaaa aaa
NP_0011935 1 mavgasgleg dkmagamplq lllllillgp gnslqlwdtw
38.1 Типовая adeaekalgp llardrrqat 61 eyeyldydfl peteppemlr nstdttpltg pgtpesttve
последоват ельность paarrstgld aggavteltt 121 elanmgnlst dsaameiqtt qpaateaqtt qpvpteaqtt
аминокисло т для plaateaqtt rltateaqtt 181 plaateaqtt ppaateaqtt qptgleaqtt apaameaqtt
предшестве нника apaameaqtt ppaameaqtt 241 qttameaqtt apeateaqtt qptateaqtt plaamealst
человеческ ого CLA epsatealsm epttkrglfi 301 pfsvssvthk gipmaasnls vnypvgapdh isvkqcllai
lilalvatif fvctvvlavr 361 Isrkghmypv rnysptemvc skakspgltp epredregdd 421 Itlhsflp issllpdgge gpsatanggl
42 NP_002997. 1 mplqllllli llgpgnslql wdtwadeaek algpllardr
2 rqateyeyld ydflpetepp
Типовая 61 emlrnstdtt pltgpgtpes ttvepaarrs tgldaggavt
последоват elttelanmg nlstdsaame
ельность 121 iqttqpaate aqttqpvpte aqttplaate aqttrltate
аминокисло aqttplaate aqttppaate
т для 181 aqttqptgle aqttapaame aqttapaame aqttppaame
предшестве aqttqttame aqttapeate
нника человеческ 241 aqttqptate aqttplaame glfipfsvss vthkgipmaa alstepsate alsmepttkr
ого CLA 301 snlsvnypvg apdhisvkqc lavrlsrkgh mypvrnyspt llaililalv atiffvctvv
361 emvcissllp dggegpsata egddltlhsf Ip ngglskaksp gltpepredr
5.3.6. Полинуклеотид для генерации CAR и/или хоминг-рецептора.
В настоящем изобретении описаны полинуклеотидные последовательности (т.е. последовательности нуклеиновых кислот), которые кодируют химерные рецепторы и хоминг-рецепторы. Полинуклеотиды могут содержаться в пределах любого полинуклеотидного вектора, подходящего для трансформации иммуноцитов, например, NK-клеток. Например, NK-клетки могут быть трансформированы с применением синтетических векторов, лентивирусных или ретровирусных векторов, автономно реплицирующихся плазмид, вируса (например, ретровируса, лентивируса, аденовируса или вируса герпеса) и т.п., содержащих полинуклеотиды, кодирующие первый и второй полипептиды (например, химерные рецепторы). Лентивирусные векторы, подходящие для трансформации NK-клеток, включают, но не ограничены указанным, например, лентивирусные векторы, описанные в патентах США № 5994136; 6165782; 6428953; 7083981 и 7250299, раскрытия которых включены в настоящее описание посредством ссылки во всей их полноте. Векторы ВИЧ, подходящие для трансформации NK-клеток, включают, но не ограничены ука- 114 039192 занным, например векторы, описанные в патенте США № 5665577, изобретение которого включено в настоящее описание посредством ссылки во всей его полноте.
Нуклеиновые кислоты, пригодные для продуцирования полипептидов, описанных в настоящем раскрытии, например, в пределах NK-клетки включают ДНК, РНК или аналоги нуклеиновых кислот. Аналоги нуклеиновых кислот могут быть модифицированы в основном компоненте, сахарном компоненте или фосфатном остове и могут содержать замену дезоксиуридина на дезокситимидин, 5-метил-2'дезоксицитидин или замену 5-бромо-2'-дезоксицитидина на дезоксицитидин. Модификации сахарного компонента могут включать в себя модификацию 2'-гидроксила сахара рибозы с формированием 2'-О-метил или 2'-O-аллил сахаров. Дезоксирибозный фосфатный остов может быть модифицирован с целью получения морфолино нуклеиновых кислот, в которых каждый основной компонент соединен с 6-членным морфолино-кольцом, или пептидных нуклеиновых кислот, в которых дезоксифосфатный остов заменен на псевдопептидный остов, и четыре основания сохраняются. См., например, Summerton and Weller (1997), Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7:187-195; и Hyrup и соавт. (1996), Bioorgan. Med. Chain. 4:5-23. Кроме того, дезоксифосфатный остов может быть заменен, например, на тиофосфатный или дитиофосфатный остов, фосфороамидатный или алкил-фосфотриэфирный остов.
Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, описанный в настоящем раскрытии, может быть введена в клетки-хозяева как часть вектора, такого как, например, экспрессионный вектор. Кроме того, полипептид, описанный в настоящем раскрытии, может быть продуцирован посредством трансфицирования клетки-хозяина нуклеиновой кислотой, кодирующей такой полипептид, и такая нуклеиновая кислота может являться частью вектора. В конкретном варианте осуществления вектор представляет собой экспрессионный вектор, который способен направлять экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, описанный в настоящем раскрытии. Неограничивающие примеры экспрессионных векторов включают в себя, но не ограничены указанным, плазмиды и вирусные векторы, такие как дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы, адено-ассоциированные вирусы, вирус псевдочумы, вирус коровьей оспы и бакуловирусы. Стандартные методики молекулярной биологии могут применяться для введения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, описанный в настоящем раскрытии, в экспрессионный вектор.
Экспрессионный вектор содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, описанный в настоящем раскрытии, в форме, подходящей для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине или не являющемся человеком субъекте. В конкретном варианте осуществления экспрессионный вектор содержит одну или более регуляторных последовательностей, выбранных на основе клеток-хозяев, которые будут использоваться для экспрессии, которые являются функционально связанными с нуклеиновой кислотой, которая должна быть экспрессирована. В пределах описания экспрессионного вектора предполагается, что термин функционально связанный означает, что интересующая нуклеиновая кислота связана с регуляторной(ыми) последовательностью(ями) таким образом, который позволяет осуществлять экспрессию нуклеиновой кислоты (например, в системе транскрипции/трансляции in vitro или в клеткехозяине, когда вектор вводится в клетку-хозяина). Регуляторные последовательности включают в себя промоторы, энхансеры и другие управляющие экспрессией элементы (например, сигналы полиаденилирования). Регуляторные последовательности включают последовательности, которые направляют конститутивную экспрессию нуклеиновой кислоты во многих типах клеток-хозяев, последовательности, которые направляют экспрессию нуклеиновой кислоты только в определенных клетках-хозяевах (например, тканеспецифичные регуляторные последовательности), и последовательности, которые направляют экспрессию нуклеиновой кислоты после стимуляции конкретным средством (например, индуцибельные регуляторные последовательности). Специалистам в данной области техники будет понятно, что конструкция экспрессионного вектора может зависеть от таких факторов, как, например, выбор клеткихозяина, которая будет подвергнута трансформации, уровень экспрессии требуемого белка и т.д.
Экспрессионный вектор может быть введен в клетки-хозяева через обычные методики трансформации или трансфекции. Такие методики включают в себя, но не ограничены указанным, соосаждение фосфатом кальция или хлоридом кальция, трансфекцию, опосредованную DEAE-декстраном, липофекцию и электропорацию.
Соответствующие способы для трансформирования или трасфекции клеток-хозяев можно найти в Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, New York и в других лабораторных справочниках. В определенных вариантах осуществления клетка-хозяин подвергается транзиентной трансфекции экспрессионным вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, описанный в настоящем раскрытии. В других вариантах осуществления клетка-хозяин подвергается стабильной трансфекции экспрессионным вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, описанный в настоящем раскрытии.
Клетки, содержащие любой полинуклеотид, могут быть выбраны с использованием одного или более селектируемых маркеров.
5.4. Способы лечения гематологических нарушений или солидных опухолей.
В настоящем изобретении представлены способы лечения гематологического нарушения или солидной опухоли с применением NK-клеток или генетически модифицированных NK-клеток (например,
- 115 039192
NK-клеток, содержащих CAR и/или хоминг-рецептор), в соответствии с описанным выше.
5.4.1. Комбинированная терапия NK.
В одном из аспектов, представленных в настоящем раскрытии, способы лечения гематологического нарушения или солидной опухоли у нуждающегося в этом субъекта включают в себя:
(a) введение указанному субъекту изолированной популяции естественных клеток-киллеров (NK) или фармацевтической композиции с ней или изолированной популяции генетически модифицированных NK-клеток (например, NK-клеток, содержащих CAR и/или хоминг-рецептор) или фармацевтической композиции с ней; и (b) введение указанному субъекту второго средства или фармацевтической композиции с ним. Второе средство может представлять собой любое фармацевтически приемлемое средство, которое может применяться для лечения гематологического нарушения или солидной опухоли, и включает, но не ограничено указанным, антитело (например, моноклональное антитело), биспецифичный активатор клетоккиллеров (BiKE), противовоспалительное средство, иммуномодулирующее средство (например, иммуномодулирующее соединение в соответствии с описанным в разделе 5.2.7.1), цитотоксическое средство, вакцину против рака, химиотерапевтическое средство, ингибитор HDAC или миРНК.
5.4.1.1. Комбинации NK с антителами.
В определенных вариантах осуществления второе средство представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
При использовании в настоящем изобретении термины антитело, и иммуноглобулин, и Ig являются терминами данной области техники и могут использоваться взаимозаменяемо в настоящем изобретении и относятся к молекуле с сайтом связывания антигена, который специфично связывает антиген.
Антитела могут включать, например, моноклональные антитела, рекомбинантно продуцированные антитела, моноспецифичные антитела, мультиспецифичные антитела (включая биспецифичные антитела), человеческие антитела, гуманизированные антитела, такие как композитные человеческие антитела или деиммунизированные антитела, мышиные антитела (например, антитела мыши или крысы), химерные антитела, синтетические антитела и тетрамерные антитела, содержащие две молекулы тяжелых цепи и две молекулы легкой цепи. В конкретных вариантах осуществления антитела могут включать в себя, но не ограничены указанным, мономер легкой цепи антитела, мономер тяжелой цепи антитела, димер легкой цепи антитела, димер тяжелой цепи антитела, пару легкой цепи антитела и тяжелой цепи антитела, внутриклеточные антитела, гетероконъюгатные антитела, однодоменные антитела и моновалентные антитела. В конкретном варианте осуществления антитела могут включать в себя антигенсвязывающие фрагменты или эпитопсвязывающие фрагменты, такие как, но не ограниченные указанным, одноцепочечные антитела или одноцепочечные Fv (scFv) (например, включая моноспецифичные, биспецифичные и т.д.), камелизированные антитела, аффитела, фрагменты Fab, фрагменты F(ab'), фрагменты F ab')2 и дисульфид-связанные Fv (sdFv). В конкретных вариантах осуществления антитела, описанные в настоящем раскрытии, относятся к моноклональным антителам.
Антитела могут иметь любой тип (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA или IgY), любой класс (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 или IgA2) или любой подкласс (например, IgG2a или IgG2b) молекулы иммуноглобулина. В определенных вариантах осуществления антитела, описанные в настоящем раскрытии, являются антителами IgG или их классом (например, человеческий IgG1, IgG2 или IgG4) или подклассом. В определенных вариантах осуществления антитела, описанные в настоящем раскрытии, являются антителами IgG2 (например, человеческими IgG2) или их подклассом (например, человеческими IgG2a, или человеческими IgG2b, или их смесью). В определенных вариантах осуществления антитела, описанные в настоящем раскрытии, являются антителами IgG1 (например, человеческими IgG1) или их подклассом. В определенных вариантах осуществления антитела IgG1, описанные в настоящем раскрытии, содержат одну или более аминокислотных замен и/или делеций в константной области.
При использовании в настоящем изобретении термин моноклональное антитело является термином, хорошо известным в технике, который относится к антителу, полученному из популяции гомогенных или по существу гомогенных антител. Термин моноклональное не ограничен каким-либо конкретным способом создания антитела. Обычно популяция моноклональных антител может генерироваться клетками, популяциями клеток или клеточной линией. В конкретных вариантах осуществления моноклональное антитело при использовании в настоящем изобретении является антителом, продуцированным единственной клеткой или клеточной линией, при этом антитело иммуноспецифично связывается с эпитопом, что определяют, например, посредством ELISA или другой реакции связывания антигена или конкурентно-связывающим анализом, известным в технике. В конкретных вариантах осуществления моноклональное антитело может являться химерным антителом или гуманизированным антителом. В определенных вариантах осуществления моноклональное антитело является моновалентным антителом или поливалентным (например, бивалентным) антителом.
В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфично связывается с ассоциированным с опухолью антигеном (ТАА), который описывается в разделе 5.3.2. В дальнейшем конкретном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с CS-1. В более конкретном варианте осуществления антитело или его антигенсвязы- 116 039192 вающий фрагмент представляет собой элотузумаб или его антигенсвязывающий фрагмент. В дальнейшем конкретном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с CD20.
В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфично связывается с ассоциированным с микроокружением опухоли антигеном (ТМАА), который описывается в разделе 5.3.2.
В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфично связывается и противодействует активности белка иммунной контрольной точки. В более конкретных вариантах осуществления белок иммунной контрольной точки представляет собой CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2 или LAG-3. В более конкретных вариантах относящийся к иммунной контрольной точке белок представляет собой BTLA, KIR, TIM-3, A2aR, B7-H3 или В7-Н4. В других конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфично связывается и противодействует активности костимулирующего сигнального белка. В более конкретных вариантах осуществления костимулирующий сигнальный белок представляет собой ICOS, CD28, 4-1ВВ, ОХ40, CD27 или CD40.
5.4.1.2. Комбинации NK с биспецифичными активаторами клеток-киллеров.
В определенных вариантах осуществления второе средство представляет собой биспецифичный активатор клеток-киллеров (BiKE).
BiKE представляют собой реагенты, которые содержат два одноцепочечных вариабельных фрагмента (scFv) и специфично активируют как клетки-мишени (например, опухолевые клетки или инфицированные клетки), так и NK-клетки, с тем чтобы опосредовать уничтожение клеток-мишеней. Они применяются для локализации клеток-мишеней (например, опухолевых клеток или инфицированных клеток) с NK-клетками и, таким образом, запуска опосредованной NK-клетками антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC). BiKE могут генерироваться любым способом, известным в технике, например, в соответствии с описанным в Gleanson, M.K., et al., Mol Cancer Ther, 11:2674-2684 (2012); Vallera, D.A., et al., Cancer Biother Radiopharm, 28:274-282 (2013); Wiernik, А., et al., Clin Cancer Res, 19:3844-3855 (2013); Reiners, K.S., et al., Mol. Ther., 21:895-903 (2013); Singer, H., et al., J. Immunother., 33:599-608 (2010); or Gleason, M.K., et al., Blood, 123:3016-3026 (2014). Один scFv BiKE специфично связывается с антигеном на поверхности клеток-мишеней (например, опухолевых клеток или инфицированных клеток), и другой scFv специфично связывается с рецептором (например, Fc-рецептором, таким как CD16) на клетках NK.
В конкретных вариантах осуществления BiKE содержит первый scFv, который специфично связывается с ТАА, который описывается в разделе 5.3.2. В дальнейших конкретных вариантах осуществления BiKE содержит второй scFv, который специфично связывается с CD16.
5.4.1.3. Комбинации NK с другими противораковыми средствами.
Другие противораковые средства, которые могут быть применены в качестве второго средства, известны в технике и включают в себя противовоспалительные средства, иммуномодулирующие средства, цитотоксические средства, вакцины против рака, химиотерапевтические средства, ингибиторы HDAC и миРНК. Конкретные противораковые средства, которые могут быть введены индивиду, имеющему рак, например индивиду, имеющему опухолевые клетки, в дополнение к клеткам NK, продуцированным с применением способов, описанных в настоящем раскрытии, и, необязательно, перфузату, клеткам перфузата, естественным клеткам-киллерам, отличным от NK-клеток, продуцированных с применением способов, описанных в настоящем раскрытии, включают в себя, но не ограничены указанным, ацивицин; акларубицин; акодазола гидрохлорид; акронин; адозелезин; алдеслейкин; альтретамин; амбомицин; аметантрона ацетат; амсакрин; анастрозол; антрамицин; аспарагиназу (например, из Erwinia chrysan; Erwinaze); асперлин; авастин (бевацизумаб); азацитидин; азетепа; азотомицин; батимастат; бензодепу; бикалутамид; бисантрена гидрохлорид; биснафида димезилат; бизелизин; блеомицина сульфат; бреквинар натрия; бропиримин; бусульфан; кактиномицин; калустерон; карацемид; карбетимера; целекоксиб (ингибитор СОХ-2); СС 122; СС 486 (оральный азацитидин); церубидин; хлорамбуфил; циролемицин; цисплатин; кладрибин; кризнатола мезилат; циклофосфамид; цитарабин; дакарбазин; дактиномицин; даунорубицина гидрохлорид; децитабин; дексормаплатин; дезагуанин; дезагуанина мезилат; дизиквон; доцетаксел; доксорубицин; доксорубицина гидрохлорид; дролоксифен; дролоксифена цитрат; дромостанолона пропионат; дуазомицин; эдатрексат; эфлорнитина гидрохлорида; элсамитруцин; элспар; энлоплатин; энпромат; эпипропидин; эпирубицина гидрохлорид; эрбулозол; эзорубицина гидрохлорид; эстрамустин; эстрамустина фосфата натрия; этанидазол; этопозид; этопозид фосфат; этропофос; этоприн; фадрозола гидрохлорид; фазарабин; фенретинид; флоксуридин; флударабина фосфат; фторурацил; флуроцитабин; фосвидон; фостриецин натрия; гемцитабин; гемцитабина гидрохлорид; гидроксимочевину; идамицин; идарубицина гидрохлорид; ифосфамид; илмофозин; ипроплатин; иринотекан; иринотекана гидрохлорид; ланреотида ацетат; летрозол; лейпролида ацетат; лиарозола гидрохлорид; лометрексол натрия; ломустин; лозоксантрона гидрохлорид; мазопрокол; майтанзин; мехлоретамина гидрохлорид; мегестрола ацетат; меленгестрола ацетат; мелфалан; меногарил; меркаптопурин; метотрексат; метотрексат натрия; метоприн; метуредеп; митиндомид; митокарцин; митокромин; митогиллин; митомалцин; митомицин;
- 117 039192 митоспер; митотан; митоксантрона гидрохлорид; микофенольную кислоту; нокодазол; ногаламицин; ормаплатин; оксисуран; паклитаксел; пегаспаргаза; пелиомицин; пентамустин; пепломицина сульфат; перфосфамид; пипоброман; пипосульфан; пироксантрона гидрохлорид; пликамицин; пломестан; порфимер натрия; порфиромицин; преднимустин; прокарбазин гидрохлорида; пролейкин; пуринетол; пуромицин; пуромицина гидрохлорид; пиразофурин; ревматрекс; рибоприн; сафингол; сафингола гидрохлорид; семустин; симтразен; спарфосат натрия; спарсомицин; спирогермания гидрохлорид; спиромустин; спироплатин; стрептонигрин; стрептозоцин; сулофенур; таблоид; тализомицин; текогалан натрия; таксотер; тегафур; телоксантрона гидрохлорид; темопорфин; тенипозид; тероксирон; тестолактон; тиамиприн; тиогуанин; тиотепу; тиазофурин; тирапазамин; топозар; торемифена цитрат; трестолона ацетат; трексол; трицирибина фосфат; триметрексат; триметрексата глюкуронат; трипторелина, тубулозола гидрохлорид; урамустин; уредепу; вапреотид; вертепорфин; винбластина сульфат; винкристина сульфат; виндезин; виндезина сульфат; винепидина сульфат; винглицината сульфат; винлеурозина сульфат; винорелбина тартрат; винрозидина сульфат; винзолидина сульфат; ворозол; зениплатин; зиностатин; зорубицина гидрохлорид.
Другие препараты против рака включают в себя, но не ограничены указанным, 20-эпи-1,25дигидроксивитамин D3; 5-этинилурацил; абиратерон; акларубицин; ациофульвен; адеципенол; адозелезин; альдеслейкин, антагонисты ALL-TK; альтретамин; амбамустин; амидокс; амифостин; аминолевулиновая кислота; амрубицин; амсакрин; анагрелид; анастрозол; андрографолид; ингибиторы ангиогенеза; антагонист D; антагонист G; антареликс; анти-дорсалинизирующий морфогенетический белок-1; антиандроген для карциномы простаты; антиэстроген; антинеопластон; антисмысловые олигонуклеотиды; афидиколина глицинат; модуляторы генов апоптоза; регуляторы апоптоза; апуриновую кислоту; ара-CDP-DL-PTBA; деаминазу аргинина; асулакрин; атаместан; атримустин; аксинастатин 1; аксинастатин 2; аксинастатин 3; азасетрон; азатоксин; азатирозин; производные баккатина; баланол; батимастат; антагонисты BCR/ABL; бензохлорины; бензоилстауроспорин; производные беталактама; бета-алетин; бетакламицин В; бетулиновую кислоту; ингибитор bFGF; бикалутамид; бисантрен; бисазиридинилспермин; биснафид; бистратен А; бизелизин; брефлат; бропиримин; будотитан; бутионина сульфоксимин; кальципотриол; кальфостин С; камптозар (также называемый кампто; иринотекан); производные камптотецина; капецитабин; карбоксамидаминотриазол; карбоксиамидотриазол; CaRest М3; CARN 700, ингибитор, полученный из хряща; карзелизин; ингибиторы казеинкиназы (ICOS); кастаноспермин; цекропин В; цетрореликс; хлорины; хлорквиноксалина сульфонамид; цикапрост; цис-порфирин; кладрибин; аналоги кломифена; клотримазол; коллисмицин А; коллисмицин В; комбрестатин А4; аналог комбрестатина; конагенин; крамбесцидин 816; кризнатол; криптофицин 8; производные криптофицина А; курацин А; циклопентантраквиноны; циклоплатам; ципемицин; цитарабина окфосфат; цитолитический фактор; цитостатин; дакликсимаб; децитабин; дегидродидемнин В; деслорелин; дексаметазон; дексифосфамид; декстразоксан; дексверапамил; диазиквон; дидемнин В; дидокс; диэтилнорспермин; дигидро-5-азацитидин; дигидротаксола, 9-; диоксамицин; дифенилспиромустин; доцетаксел; докозанол; долазетрон; доксифлуридин; доксорубицин; дролоксифен; дронабинол; дуокармицин SA; эбзелен; экомустин; эдельфозин; эдреколомаб; эфлорнитин; элемен; эмитефур; эпирубицин; эпристерид; аналог эстрамустин; агонисты эстрогена; антагонисты эстрогена; этанидазол; этопозида фосфат; экземестан; фадрозол; фазарабин; фенретинид; филграстим; финастерид; флавопиртдол; флезеластин; флуастерон; флударабин; фтордаунорубицина гидрохлорид; форфенимекс; форместан; фостриецин; фотемустин; гадолиния тексафирин; галлия нитрат; галоцитабин; ганиреликс; ингибиторы желатиназы; гемцитабин; ингибиторы глутатиона; гепсульфам; герегулин; гексаметилена бисацетамид; гиперицин; ибандроновая кислота; идарубицин; идоксифен; идрамантон; илмофозин; иломастат; иматиниб (например, гливек®); имиквимод; иммуностимулирующие пептиды; ингибитор инсулиноподобного рецептора фактора роста-1; агонисты интерферона; интерфероны; интерлейкины; йобенгуан; йододоксорубицин; ипомеанол, 4-ипролакт; ирсогладин; изобенгазол; изогомогаликондрин В; итазетрон; ясплакинолид; кагалалид F; ламелларина-N триацетат; ланреотид; лейнамицин; ленограстим; лентинана сульфата, лептолстатин; летрозол; ингибирующий фактор лейкемии; альфаинтерферона лейкоцит; лейпролид+эстроген+прогестерон; лейпрорелин; левамизол; лиарозол; аналог линейного полиамина; липофильный дисахаридный пептид; липофильные соединения платины; лиссоклинамид 7; лобаплатин; ломбрицин; лометрексол; лонидамин; лозоксантрон; локсорибин; луртотекан; лутетия тексафирин; лизофиллин; литические пептиды; майтанзин; манностатин А; маримастат; мазопрокол; маспин; ингибиторы матрилизина; ингибиторы матрицы металлопротеиназы; меногарил; мербарон; метерелин; метиониназа; метоклопрамид; ингибитор MIF; мифепристон; милтефозин; миримостим; митоквазон; митолактол; аналоги митомицина; митонафид; фактор роста митотоксина фибробласта-сапорин; митоксантрон; мофаротен; молграмостим; антитело против EGFR (например, эрбитукс(цетуксимаб)); антитело против CD19; антитело против CD20 (например, ритуксимаб); антитело против дизиалоганглиозида (GD2); антитело (например, моноклональное антитело, 3F8 или ch14>18); антитело против ErbB2 (например, герцептин); хорионический гонадотропин человека; монофосфорил липид А+миобактериальная клеточная стенка sk; мопидамол; горчичное противораковое средство; микапероксид В; экстракт стенки микобактериальной клетки; мириапорон; N-ацетилдиналин; N-замещенные бензамиды; нафарелин; нагрестип; налоксон+пентазоцин; напавин; нафтерпин; нартограстим; недапла
- 118 039192 тин; неморубицин; неридроновую кислоту; нилутамид; нихамицин; модуляторы оксида азота; антиоксидант нитроксида; нитруллин; облимерсен (дженасенс®); O6-бензилгуанин; октреотид; окиценон; олигонуклеотиды; онапристон; онданзетрон; онданзетрон; орацин; пероральный индуктор цитокинов; ормаплатин; озатерон; оксалиплатин (например, флоксатин); оксауномицин; паклитаксел; аналоги паклитаксела; производные паклитаксела; палауамин, пальмитоилризоксин; памидроновую кислоту; панакситриол; паномифен; парабактин; пазеллиптин; пегаспаргаза; пелдезин; пентозана полисульфат натрия; пентостатин; пентрозол; перфлуброн; перфосфамид; периллиловый спирт; феназиномицин; фенилацетат; ингибиторы фосфатазы; пицибанил; пилокарпина гидрохлорид; пирарубицин; пиритрексим; плацетин А; плацетин В; ингибитор активатора плазминогена; комплекс платины; соединения платины; комплекс платинатриамин; порфимер натрия; порфиромицин; преднизон; бис-акридона пропил; простагландин J2; ингибиторы протеасомы; иммунный модулятор на основе протеина А; ингибитор протеинкиназы С; ингибиторы протеинкиназы С; микроводоросли; ингибиторы протеинтирозинфосфатазы; ингибиторы пуриннуклеозидфосфорилазы; пурпурины; пиразолоакридин; конъюгат пиридоксилированного гемоглобина и полиоксиэтилена; антагонисты raf; ралтитрексед; рамозетрон; ингибиторы ras фарнезилпротеинтрансферазы; ингибиторы ras; ингибитор ras-GAP; деметилированный ретеллиптин; этидронат рения Re 186; ризоксин; рибозимы; RII ретинамид; рохитукин; ромуртид; роквинимекс; рубигинон В1; рубоксил; сафингол; саинтопин; SarCNU; саркофитол А; сарграмостим; миметики Sdi 1; семустин; ингибитор 1, полученный при старении; смысловые олигонуклеотиды; ингибиторы трансдукции сигналов; сизофиран; собузоксан; борокаптат натрия; фенилацетат натрия; солверол; белок связывания соматомедина; сонермин; спарфозиновую кислоту; спикамицин D; спиромустин; спленопентин; спонгистатин 1; скваламин; стипиамид; ингибиторы стромелизина; сульфинозин; антагонист суперактивного вазоактивного кишечного пептида; сурадисту; сурамин; свайнзонин; таллимустин; тамоксифена метиодид; тауромустин; тазаротен; текогалан натрия; тегафур; теллурапирилий; ингибиторы теломеразы; темопорфин; тенипозид; тетрахлордекаоксид; тетразомин; талибластин; тиокоралин; тромбопоэтин; миметики тромбопоэтина; тималфазин; агонист рецептора тимопоэтина; тимотринан; гормон, стимулирующий щитовидную железу; этиопурпурин этила олова; тирапазамин; титаноцена бихлорид; топсентин; торемифен; ингибиторы трансляции; третиноин; триацетилуридин; трицирибин; триметрексат; трипторелин; тропизетрон; туростерид; ингибиторы тирозинкиназы; тирфостины; ингибиторы UBC; убенимекс; ингибирующий фактор роста, полученный из урогенитальной системы; антагонисты рецепторов урокиназы; вапреотид; вариолин В; вектибикс(панитумумаб); веларезол; верамин; вердины; вертепорфин; винорелбин; винксалтин; витаксин; ворозол; велковорин (лейковорин); кселоду (капецитабин); занотерон; зениплатин; зиласкорб и зиностатина стималамер.
В конкретном варианте осуществления противораковым средством, которое вводят в качестве второго средства, является талидомид, леналидомид, помалидомид, СС-122, азацитидин, децитабин или СС-486 (пероральный азацидидин). В более конкретном варианте осуществления противораковым средством, которое вводят в качестве второго средства, является леналидомид или помалидомид. В конкретном варианте осуществления противораковым средством, которое вводят в качестве второго средства, является иммуномодулирующее соединение (например, иммуномодулирующее соединение в соответствии с описанным в разделе 5.2.7.1). В конкретном варианте осуществления противораковым средством, которое вводят в качестве второго средства, является ромидепсин.
5.4.2. Лечение с применением генетически модифицированных NK-клеток.
В другом аспекте в настоящем изобретении представлены способы лечения гематологического нарушения или солидной опухоли у нуждающегося в этом субъекта, включающие в себя введение указанному субъекту изолированной популяции NK-клеток или фармацевтической композиции с ней, при этом NK-клетки являются генетически модифицированными (например, содержат химерный антигенный рецептор (CAR) и/или хоминг-рецептор, при этом указанный CAR содержит внеклеточный домен, трансмембранный домен, внутриклеточный стимулирующий домен и, необязательно, костимулирующий домен).
Генетически модифицированные NK-клетки (например, NK-клетки, содержащие CAR и/или хоминг-рецептор) описаны в разделе 5.3.
5.4.3. Гематологические нарушения и солидные опухоли.
В конкретных вариантах осуществления гематологическое нарушение представляет собой гематологическое гиперпролиферативное нарушение. В конкретных вариантах осуществления гематологическое нарушение представляет собой гематологический рак, например лейкемию или лимфому. В более конкретных вариантах осуществления гематологический рак представляет собой острый лейкоз, например острый Т-клеточный лейкоз, острый миелогенный лейкоз (AML), острый промиелоцитарный лейкоз, острый миелобластный лейкоз, острый мегакариобластический лейкоз, острый лимфобластный лейкоз В-предшественников, острый лимфобластный лейкоз Т-предшественников, лейкоз Беркитта (лимфома Беркитта) или острый бифенотипический лейкоз; хронический лейкоз, например хроническая миелоидная лимфома, хронический миелогенный лейкоз (CML), хронический моноцитарный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL)/лимфома из малых лимфоцитов или В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз; волосатоклеточная лимфома; Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз или лимфома, напри
- 119 039192 мер гистиоцитарная лимфома, лимфоплазмоцитарная лимфома (например, макроглобулинемия Вальденстрема), лимфома маргинальной зоны селезенки, неоплазия плазматических клеток (например, миеломная болезнь плазматических клеток, плазмоцитома, болезнь депонирования моноклонального иммуноглобулина или болезнь тяжелых цепей), экстранодальная В-клеточная лимфома из клеток маргинальной зоны (лимфома MALT), нодальная В-клеточная лимфома из клеток маргинальной зоны (NMZL), фолликулярная лимфома, лимфома из клеток мантии, диффузная В-крупноклеточная лимфома, средостенная (тимусная) В-крупноклеточная лимфома, внутрисосудистая В-крупноклеточная лимфома, первичная выпотная лимфома, Т-клеточный лейкоз из больших гранулированных лимфоцитов, агрессивный NKклеточный лейкоз, Т-клеточный лейкоз/лимфома взрослых, экстранодальная NK/T-клеточная лимфома, носовой тип, Т-клеточный лейкоз энтеропатического типа, Т-клеточная лимфома печени и селезенки, бластическая NK-клеточная лимфома, фунгоидный микоз (синдром Сезари), первичное CD30-положительное кожное Т-клеточное лимфопролиферативное нарушение (например, первичная кожная анапластическая крупноклеточная лимфома или лимфоматоидный папулез), ангиоиммунобластическая Т-клеточная лимфома, периферическая Т-клеточная лимфома, неопределенная, анапластическая крупноклеточная лимфома, лимфома Ходжкина или нодулярная с лимфоидным преобладанием лимфома Ходжкина. В другом конкретном варианте осуществления гематологический рак представляет собой острый миелогенный лейкоз (AML).
В другом конкретном варианте осуществления гематологический рак представляет собой хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL). В другом конкретном варианте осуществления гематологический рак представляет собой множественную миелому или миелодиспластический синдром.
Солидная опухоль может представлять собой, но не ограничена указанным, например, карциному, такую как аденокарцинома, адренокортикальная карцинома, аденокарцинома толстой кишки, колоректальная аденокарцинома, колоректальная карцинома, карцинома дуктальных клеток, карцинома легкого, карцинома щитовидной железы, носоглоточная карцинома, меланома (например, злокачественная меланома), не являющаяся меланомой карцинома кожи или неопределенная карцинома; десмоидная опухоль; десмопластическая мелкокруглоклеточная опухоль; эндокринная опухоль; саркома Юинга; эмбрионально-клеточная опухоль (например, тестикулярный рак, овариальный рак, хориокарцинома, опухоль эндодермального синуса, герминома и т.д.); гепатобластома; гепатоцеллюлярная карцинома; нейробластома; не являющаяся рабдомиосаркомой саркома мягкой ткани; остеогенная саркома; ретинобластома; рабдомиосаркома; или опухоль Вильмса.
В другом варианте осуществления солидная опухоль представляет собой рак поджелудочной железы или рак молочной железы. В других вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой акустическую невриному; астроцитому (например, пилоидная астроцитома I степени, слабовыраженная астроцитома II степени; анапластическая астроцитома III степени или мультиформная глиобластома IV степени); хордому; краниофарингиому; глиому (например, глиома ствола мозга; эпендимома; смешанная глиома; глиома зрительного нерва или подэпендимома); глиобластому; медуллобластому; менингиому; метастатическую опухоль головного мозга; олигодендроглиому; пинеобластому; гипофизарную опухоль; примитивную нейроэктодермальную опухоль или шванному. В другом варианте осуществления солидная опухоль представляет собой рак простаты.
В определенных вариантах осуществления индивид, имеющий гематологический рак или солидную опухоль, например индивид, имеющий недостаток естественных клеток-киллеров, является индивидом, который подвергался трансплантации костного мозга до указанного введения. В определенных вариантах осуществления трансплантат костного мозга подвергался лечению указанного гематологического рака или указанной солидной опухоли. В определенных других вариантах осуществления трансплантат костного мозга подвергался лечению состояния, отличного от указанного гематологического рака или указанной солидной опухоли. В определенных вариантах осуществления индивид получал иммунодепрессант в дополнение к указанному трансплантату костного мозга. В определенных вариантах осуществления индивид, который подвергался трансплантации костного мозга, демонстрирует один или более симптомов реакции трансплантант против хозяина (GVHD) во время указанного введения. В определенных других вариантах осуществления индивиду, который подвергался трансплантации костного мозга, вводят указанные клетки до того, как проявился симптом реакции трансплантант против хозяина (GVHD).
В определенных конкретных вариантах осуществления индивид, имеющий гематологический рак или солидную опухоль, получил по меньшей мере одну дозу ингибитора TNFa, например этанерцепта® (Enbrel), до указанного введения. В конкретных вариантах осуществления указанный индивид получал указанную дозу ингибитора TNFa в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев после диагностирования указанного гематологического рака или указанной солидной опухоли. В конкретном варианте осуществления индивид, который получил дозу ингибитора TNFa, демонстрирует острый миелоидный лейкоз. В более конкретном варианте осуществления индивид, который получил дозу ингибитора TNFa и демонстрирует острый миелоидный лейкоз, также имеет делецию длинного плеча хромосомы 5 в клетках крови. В другом варианте осуществления индивид, имеющий гематологический рак или солид- 120 039192 ную опухоль, например рак крови, имеет филадельфийскую хромосому.
В определенных других вариантах осуществления гематологический рак или солидная опухоль у указанного индивида являются невосприимчивыми к одному или более лекарственным препаратам против рака. В конкретном варианте осуществления гематологический рак или солидная опухоль являются невосприимчивыми к гливеку® (иматиниба мезилат).
В определенных вариантах осуществления гематологический рак или солидная опухоль у указанного индивида отвечает по меньшей мере на один лекарственный препарат против рака; в этом варианте осуществления плацентарный перфузат, изолированные клетки плацентарного перфузата, изолированные естественные клетки-киллеры, например плацентарные естественные клетки-киллеры, например полученные из плаценты промежуточные естественные клетки-киллеры, изолированные объединенные естественные клетки-киллеры или активированные NK- или TSPNK-клетки, описанные в настоящем раскрытии, и/или комбинации указанного и, необязательно, иммуномодулирующее соединение (например, иммуномодулирующее соединение в соответствии с описанным в разделе 5.2.7.1) добавляют в качестве вспомогательной терапии или в качестве комбинированной терапии с указанным лекарственным препаратом против рака. В определенных других вариантах осуществления индивид, имеющий гематологический рак или солидную опухоль, подвергался лечению по меньшей мере одним лекарственным препаратом и имел рецидив до указанного введения. В определенных вариантах осуществления индивид, который будет подвергаться лечению, имеет невосприимчивый рак. В одном из вариантов осуществления способ лечения рака с применением клеток, описанных в настоящем раскрытии, защищает (например, предотвращает или задерживает) от рецидива рака. В одном из вариантов осуществления способ лечения рака, описанный в настоящем раскрытии, приводит к ремиссии рака в течение 1 месяца или более, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев или более, 1 года или более, 2 лет или более, 3 лет или более или 4 лет или более.
В определенных вариантах осуществления NK-клетки изолируют из опухолевого очага, например представляют собой проникающие в опухоль лимфоциты; такие NK-клетки, как ожидают, будут являться специфичными для ассоциированного с опухолью антигена (ТАА) или ассоциированного с микроокружением опухоли антигена (ТМАА).
В одном из вариантов осуществления, представленном в настоящем раскрытии, способ лечения индивида, имеющего множественную миелому, включает в себя введение индивиду (1) леналидомида или помалидомида и (2) CAR NK-клеток, при этом указанные CAR NK-клетки являются эффективными для лечения множественной миеломы у указанного индивида. В конкретном варианте осуществления указанные CAR NK-клетки представляют собой NK-клетки пуповинной крови или NK-клетки, продуцированные из гематопоэтических клеток пуповинной крови, например, стволовых гематопоэтических клеток. В другом варианте осуществления указанные CAR NK-клетки были продуцированы посредством двух- или трехэтапного способа, описанного в настоящем изобретении для продуцирования NK-клеток. В другом варианте осуществления указанные леналидомид или помалидомид и CAR NK-клетки вводят отдельно друг от друга. В определенных конкретных вариантах осуществления способа лечения индивида с множественной миеломой указанные CAR NK-клетки содержат внеклеточный домен CAR, и этот внеклеточный домен представляет собой связывающий CS-1 домен. В конкретных вариантах осуществления связывающий CS-1 домен содержит scFv или антигенсвязывающий фрагмент антитела, которое связывает CS-1. В определенных конкретных вариантах осуществления связывающий CS-1 домен содержит одноцепочечную версию элотузумаба и/или антигенсвязывающего фрагмента элотузумаба.
В одном из вариантов осуществления, представленном в настоящем раскрытии, способ лечения индивида, имеющего множественную миелому, включает в себя введение индивиду (1)леналидомида или помалидомида; (2) элотузумаба и (3) CAR NK-клеток, при этом указанные CAR NK-клетки являются эффективными для лечения множественной миеломы у указанного индивида. В конкретном варианте осуществления указанные CAR NK-клетки представляют собой NK-клетки пуповинной крови или NK-клетки, продуцированные из гематопоэтических клеток пуповинной крови, например стволовые гематопоэтические клетки. В другом варианте осуществления указанные CAR NK-клетки были продуцированы посредством двух- или трехэтапного способа, описанного в настоящем изобретении для продуцирования NK-клеток. В другом варианте осуществления указанные леналидомид или помалидомид, элотузумаб и/или CAR NK-клетки вводят отдельно друг от друга. В определенных конкретных вариантах осуществления способа лечения индивида с множественной миеломой указанные CAR NK-клетки содержат внеклеточный домен CAR, и этот внеклеточный домен представляет собой связывающий CS-1 домен. В конкретных вариантах осуществления связывающий CS-1 домен содержит scFv или антигенсвязывающий фрагмент антитела, которое связывает CS-1.
В другом варианте осуществления, представленном в настоящем раскрытии, способ лечения индивида, имеющего рак крови (например, лимфому Беркитта), включает в себя введение индивиду (1) ромидепсина и (2) CAR NK-клеток, при этом указанные CAR NK-клетки являются эффективными для лечения рака крови (например, лимфомы Беркитта) у указанного индивида. В определенных конкретных вариантах осуществления способа лечения индивида с раком крови (например, лимфомой Беркитта) указанные CAR NK-клетки содержат внеклеточный домен CAR, и этот внеклеточный представляет собой
- 121 039192 связывающий CD20 домен. В конкретных вариантах осуществления связывающий CD20 домен содержит scFv или антигенсвязывающий фрагмент антитела, которое связывает CD20.5.5. Способы лечения инфекционных заболеваний В настоящем изобретении представлены способы лечения инфекционных заболеваний с применением NK-клеток или генетически модифицированных NK-клеток (например,
NK-клеток, содержащих CAR и/или хоминг-рецептор), в соответствии с описанным выше.
5.5.1. Лечение инфекционных заболеваний с применением комбинированной NK-терапии.
В другом аспекте, представленном в настоящем раскрытии, способы лечения инфекционного заболевания у нуждающегося в этом субъекта включают в себя (а) введение указанному субъекту изолированной популяции естественных клеток-киллеров (NK) или фармацевтической композиции с ней или изолированной популяции генетически модифицированных NK-клеток (например, NK-клеток, содержащие CAR и/или хоминг-рецептор) или фармацевтической композиции с ней и (b) введение указанному субъекту второго средства или фармацевтической композиции с ним. Второе средство может представлять собой любое фармацевтически приемлемое средство, которое может применяться для лечения инфекционного заболевания, и включает, но не ограничено указанным, антитело (например, моноклональное антитело), биспецифичный активатор клеток-киллеров (BiKE) или противовирусное средство.
5.5.1.1. Антитела, которые связываются с белком иммунной контрольной точки.
В определенных вариантах осуществления второе средство представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (см. раздел 5.4.1.1 в отношении описания антител). В конкретных вариантах осуществления антитело специфично связывается и противодействует активности белка иммунной контрольной точки, связанного с иммунной контрольной точкой белка или костимулирующего сигнального белка, в соответствии с описанным в разделе 5.4.1.1.
5.5.1.2. Активатор биспецифичных клеток-киллеров.
В определенных вариантах осуществления второе средство представляет собой BiKE в соответствии с описанным в разделе 5.4.1.2.
5.5.1.3. Противовирусное средство.
В определенных вариантах осуществления второе средство представляет собой противовирусное средство, которое включает, но не ограничено указанным, имиквимод, подофилокс, подофиллин, альфаинтерферон (IFNa), ретиколос, ноноксинол-9, ацикловир, фамцикловир, валацикловир, ганцикловир, цидофовир; амантадин, римантадин; рибавирин; занамавир и осельтамивир; ингибиторы протеаз, такие как индинавир, нелфинавир, ритонавир или саквинавир; нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы, такие как диданозин, ламивудин, ставудин, залцитабин или зидовудин; или ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы, такие как невирапин или эфавиренц.
5.5.2. Лечение инфекционных заболеваний с применением генетически модифицированных NK-клеток.
В другом аспекте в настоящем изобретении представлены способы лечения инфекционного заболевания у нуждающегося в этом субъекта, включающие в себя введение указанному субъекту изолированной популяции NK-клеток или фармацевтической композиции с ней, при этом NK-клетки являются генетически модифицированными (например, содержат химерный антигенный рецептор (CAR) и/или хоминг-рецептор, содержат химерный антигенный рецептор (CAR), при этом указанный CAR содержит внеклеточный домен, трансмембранный домен, внутриклеточный стимулирующий домен и, необязательно, костимулирующий домен).
Генетически модифицированные NK-клетки (например, NK-клетки, содержащие CAR и/или хоминг-рецептор), описаны в разделе 5.3.
5.5.3. Инфекционное заболевание.
В определенных вариантах осуществления инфекционное заболевание представляет собой инфекцию, вызванную вирусом, бактерией, грибом или гельминтом. В конкретных вариантах осуществления инфекционное заболевание представляет собой вирусную инфекцию.
В конкретных вариантах осуществления вирусная инфекция представляет собой инфекцию, вызываемую вирусом семейства Adenoviridae, Picornaviridae, Herpesviridae, Hepadnaviridae, Flaviviridae, Retroviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Papilommaviridae, Rhabdoviridae или Togaviridae. В более конкретных вариантах осуществления указанный вирус представляет собой вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вирус Коксаки, вирус гепатита A (HAV), полиовирус, вирус Эпштейна-Барр (EBV), вирус герпеса простого типа 1 (HSV1), вирус герпеса простого типа 2 (HSV2), человеческий цитомегаловирус (CMV), человеческий вирус герпеса типа 8 (HHV8), вирус герпес зостер (вирус ветряной оспы (VZV) или вирус опоясывающего лишая), вирус гепатита В (HBV), вирус гепатита С (HCV), вирус гепатита D (HDV), вирус гепатита Е (HEV), вирус гриппа (например, вирус гриппа А, вирус гриппа В, вирус гриппа С или тоготовирус - thogotovirus), вирус кори, вирус свинки, вирус парагриппа, папилломавирус, вирус бешенства или вирус краснухи.
В других более конкретных вариантах осуществления указанный вирус представляет собой аденовирус вида А, серотип 12, 18 или 31; аденовирус вида В, серотип 3, 7, 11, 14, 16, 34, 35 или 50; аденовирус вида С, серотип 1, 2, 5 или 6; вида D, серотип 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 36, 37, 38, 39, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 4 9 или 51; вида Е, серотип 4; или вида F, серотип 40
- 122 039192 или 41.
В определенных других более конкретных вариантах осуществления вирус представляет собой вирус Апои (APOIV), вирус Ароа (AROAV), вирус Багаза (BAGV), вирус Банци (BANV), вирус Бубуи (BOUV), вирус Каципакоре (CPCV), вирус Карей-Айленд (CIV), вирус Cowbone Ridge (CRV), вирус денге (DENV), вирус Edge Hill (EHV), вирус Gadgets Gully (GGYV), вирус Ильеус (ILHV), вирус менингоэнцефаломиелита индюков в Израиле (ITV), вирус японского энцефалита (JEV), вирус Югра (JUGV), вирус Ютиапа (JUTV), вирус кадам (KADV), вирус Кедугу (KEDV), вирус Кокобера (KOKV), вирус Кутанго (KOUV), вирус Кьяссанурской лесной болезни, (KFDV), вирус Лангата (LGTV), вирус Мибан (MEAV), вирус Модок (MODV), вирус лейкоэнцефалита ночниц Монтаны (MMLV), вирус энцефалита долины Муррея (MVEV), вирус Нтайя (NTAV), вирус омской геморрагической лихорадки (OHFV), вирус Повассан (POWV), вирус Рио-браво-дель-Норте (RBV), вирус Royal Farm (RFV), вирус Saboya (SABV), вирус энцефалита Сент-Луиса (SLEV), вирус Sal Vieja (SW), вирус San Perlita (SPV), вирус Saumarez Reef (SREV), вирус Сепик (SEPV), вирус Тембусу (TMUV), вирус клещевого энцефалита (TBEV), вирус Тюлений (TYUV), вирус Уганды S (UGSV), вирус Усуту (USUV), вирус вессельсбронской болезни (WESSV), вирус лихорадки Западного Нила (WNV), вирус Яунде (YAOV), вирус желтой лихорадки (YFV), вирус Юкосе (YOKV) или вирус Зика (ZIKV).
В других вариантах осуществления NK-клетки вводят субъекту, имеющему вирусную инфекцию, как часть курса противовирусного лечения, который включает в себя один или более других противовирусных средств. Конкретные противовирусные средства, которые могут быть введены индивиду, имеющему вирусную инфекцию, включают, но не ограничены указанным, имиквимод, подофилокс, подофиллин, альфа-интерферон (IFNa), ретиколос, ноноксинол-9, ацикловир, фамцикловир, валацикловир, ганцикловир, цидофовир; амантадин, римантадин; рибавирин; занамавир и осельтамивир; ингибиторы протеаз, такие как индинавир, нелфинавир, ритонавир или саквинавир; нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы, такие как диданозин, ламивудин, ставудин, залцитабин или зидовудин; или ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы, такие как невирапин или эфавиренц.
5.6. Введение.
NK-клетки, генетически модифицированные NK-клетки или второе средство в соответствии с описанным в настоящем изобретении могут быть введены индивиду, например индивиду, имеющему опухолевые клетки или инфицированные клетки, через любой приемлемый с медицинской точки зрения маршрут, известный в технике, подходящий для введения живых клеток или второго средства. В различных вариантах осуществления клетки могут быть имплантированы хирургически, инъецированы, влиты, например, посредством катетера или шприца, или введены другим способом прямо или косвенно в место, в которое имеется необходимость их ввести. В различных вариантах осуществления второе средство может быть инъецировано, влито, например, посредством катетера или шприца или введено другим способом прямо или косвенно в место, в которое имеется необходимость его ввести. В одном из вариантов осуществления клетки или второе средство вводят индивиду внутривенно. В другом варианте осуществления клетки или второе средство вводят индивиду в месте расположения опухоли, например солидной опухоли или инфекции. В конкретном варианте осуществления, в котором индивид имеет опухоль или инфекцию более чем в одном местоположении, клетки или второе средство вводят по меньшей мере в два или во все местоположения опухоли/инфекции. В определенных других вариантах осуществления клетки, или второе средство, или композиции указанного вводят перорально, через нос, внутриартериально, парентерально, внутриглазно, внутримышечно, подкожно, интраперитонеально, внутрицеребрально, внутрижелудочково, интрацеребровентрикулярно, интратекально, интрацистернально, интраспинально и/или периспинально. В конкретных вариантах осуществления клетки, или второе средство, или композиции указанного, вводят посредством инъекции, вливания, внутривенного (IV) введения, внутрибедренного введения или внутриопухолевого введения. В определенных конкретных вариантах осуществления клетки или второе средство доставляются через внутричерепные или внутрипозвоночные иглы и/или катетеры с помощью насосных устройств или без них.
В конкретных вариантах осуществления этап введения указанному субъекту изолированной популяции NK-клеток или фармацевтической композиции с ней выполняют посредством инъекции. В конкретных вариантах осуществления инъекция NK-клеток представляет собой местную инъекцию. В более конкретных вариантах осуществления местную инъекцию выполняют непосредственно в солидную опухоль (например, саркому). В конкретных вариантах осуществления введение NK-клеток выполняют посредством инъекции шприцем. В конкретных вариантах осуществления введению NK-клеток посредством инъекции способствуют лапароскопией, эндоскопией, ультразвуком, компьютерной томографией, магнитным резонансом или рентгенологией.
NK-клетки, генетически модифицированные NK-клетки или второе средство могут быть введены индивиду в композиции, например матрице, гидрогеле, скаффолде и т.п.
В одном из вариантов осуществления клетки высевают на естественную матрицу, например плацентарный биоматериал, такой как амниотический мембранный материал. Такой амниотический мембранный материал может представлять собой, например, амниотическую мембрану, иссеченную непосредственно из плаценты млекопитающего; фиксированную или термически обработанную амниотиче- 123 039192 скую мембрану, по существу сухую (т.е. <20% Н2О) амниотическую мембрану, хориальную мембрану, по существу сухую хориальную мембрану, по существу сухую амниотическую и хориальную мембрану и т.п. Предпочтительные плацентарные биоматериалы, на которые могут быть высеяны плацентарные стволовые клетки, описаны в Харири, публикация заявки на патент США № 2004/0048796, изобретение которой включено в настоящее описание посредством ссылки во всей его полноте.
В другом варианте осуществления клетки суспендируют в растворе гидрогеля, подходящем, например, для инъекции. Подходящие гидрогели для таких композиций включают самособирающиеся пептиды, такие как RAD16. В одном из вариантов осуществления раствор гидрогеля, содержащий клетки, может затвердевать, например, в шаблоне с формированием матрицы, в которой клетки диспергированы для имплантации. Клетки в такой матрице могут также культивироваться, с тем чтобы клетки стали митотически расширенными до имплантации. Гидрогель может являться, например, органическим полимером (естественным или синтетическим), который является поперечно сшитым через ковалентные, ионные или водородные связи, с тем чтобы создать трехмерную структуру открытой решетки, которая удерживает молекулы воды и формирует гель. Формирующие гидрогель материалы включают полисахариды, такие как альгинат и его соли, пептиды, полифосфазены и полиакрилаты, которые поперечно сшиваются ионно, или блочные полимеры, такие как блочные сополимеры полиэтиленоксидаполипропиленгликоля, которые поперечно сшиваются посредством температуры или рН соответственно. В некоторых вариантах осуществления гидрогель или матрица являются биоразлагаемыми.
В некоторых вариантах осуществления рецептура, применяемая в настоящем изобретении, содержит полимеризующийся на месте гель (см., например, публикацию заявки на патент США 2002/0022676; Anseth et al., J. Control Release, 78(1-3):199-209 (2002); Wang et al., Biomaterials, 24(22):3969-80 (2003).
В некоторых вариантах осуществления полимеры являются по меньшей мере частично растворимыми в водных растворах, таких как вода, буферизованные солевые растворы или водные спиртовые растворы, которые имеют заряженные боковые группы или их моновалентную ионную соль. Примерами полимеров, имеющих кислотные боковые группы, которые могут реагировать с катионами, являются поли(фосфазены), поли(акриловые кислоты), поли(метакриловые кислоты), сополимеры акриловой кислоты и метакриловой кислоты, поли(винилацетат) и сульфированные полимеры, такие как сульфированный полистирол. Сополимеры, имеющие кислотные боковые группы, сформированные посредством реакции акриловой или метакриловой кислоты и мономеров или полимеров винилового простого эфира, также могут использоваться. Примерами кислотных групп являются группы карбоновой кислоты, группы сульфокислоты, галоидированные (предпочтительно фторированные) спиртовые группы, фенольные группы ОН и кислотные группы ОН.
Клетки могут быть высеяны на трехмерную решетку или скаффолд и имплантированы in vivo. Такая решетка может быть имплантирована в комбинации с любыми одним или более факторами роста, клетками, лекарственными препаратами или другими компонентами, которые стимулируют формирование ткани или другим способом усиливают или улучшают практическое применение способов, описанных в настоящем раскрытии.
Примеры скаффолдов, которые могут применяться в настоящем изобретении, включают нетканые маты, поропласты или самособирающиеся пептиды. Нетканые маты могут быть сформированы с использованием волокон, содержащих синтетический абсорбируемый сополимер гликолевой и молочной кислот (например, PGA/PLA) (VICRYL, Ethicon, Inc., Сомервилл, Нью-Джерси). Поропласты, состоящие, например, из сополимера поли(ε-капролактоновой)/поли(гликолевой кислоты) (PCL/PGA), сформированного посредством таких процессов, как сублимационная сушка или лиофилизация (см., например, патент США № 6355699), могут также использоваться в качестве скаффолдов.
Клетки также могут быть высеяны на или могут входить в контакт с физиологически приемлемым керамическим материалом, включая, но не ограничиваясь указанным, моно-, ди-три-, альфа-три, бетатри- и тетракальцийфосфат, гидроксиапатит, фторапатиты, сульфаты кальция, фториды кальция, окиси кальция, карбонаты кальция, магний-кальций-фосфат, биологически активные стекла, такие как BIOGLASS®, и смеси указанного. Пористые биологически совместимые керамические материалы, коммерчески доступные в настоящий момент, включают SURGIBONE® (CanMedica Corp., Канада), ENDOBON® (Merck Biomaterial France, Франция), CEROS® (Mathys, AG, Bettlach, Швейцария) и минерализованные коллагеновые продукты костной пластики, такие как HEALOS™ (DePuy, Inc., Рэйнхэм, Массачусетс) и VITOSS®, RHAKOSS™ и CORTOSS® (Orthovita, Малверн, Пенсильвания). Решетка может представлять собой смесь, комбинацию или композит из естественных и/или синтетических материалов.
В другом варианте осуществления клетки могут быть высеяны на или могут входить в контакт с волокном, которое может, например, состоять из мультифиламентных нитей, сделанных из биопоглощаемого материала, такого как PGA, PLA, сополимеры или комбинации PCL или гиалуроновая кислота.
Клетки в другом варианте осуществления могут быть высеяны на поропластные скаффолды, которые могут представлять собой композитные структуры. Такие поропластные скаффолды могут формоваться в необходимую форму, такую как форма части конкретной структуры в теле, которая будет вос- 124 039192 станавливаться, заменяться или расширяться. В некоторых вариантах осуществления решетку обрабатывают, например, 0,1 М уксусной кислотой, после чего выполняется инкубация в полилизине, PBS и/или коллагене, до инокуляции клеток, описанных в настоящем раскрытии, с тем чтобы улучшить прикрепление клеток. Внешние поверхности матрицы могут быть модифицированы в целях улучшения прикрепления или роста клеток и дифференцировки ткани, например, посредством плазменного покрытия матрицы или добавления одного или более белков (например, коллагены, эластичные волокна, ретикулярные волокна), гликопротеинов, гликозаминогликанов (например, сульфат гепарина, хондроитин-4-сульфат, хондроитин-6-сульфат, дерматансульфат, кератинсульфат и т.д.), клеточной матрицы и/или других материалов, таких как, но не ограничиваясь указанным, желатин, альгинаты, агар, агароза и растительные смолы и т.п.
В некоторых вариантах осуществления скаффолд содержит или обрабатывается материалами, которые делают его нетромбообразующим. Такие обработки и материалы могут также способствовать и поддерживать рост эндотелия, миграцию и накопление внеклеточного матрикса. Примеры таких материалов и обработок включают, но не ограничены указанным, природные материалы, такие как белки базальной мембраны, такие как ламинин и коллаген IV типа, синтетические материалы, такие как EPTFE и сегментированные полиуретанмочевинные силиконы, такие как PURSPAN™ (Polymer Technology Group, Inc., Беркли, Калифорния). Скаффолд может также содержать антитромбические средства, такие как гепарин; скаффолды могут также обрабатывать в целях изменения поверхностного заряда (например, покрывать плазмой) до высевания плацентарных стволовых клеток.
В конкретных вариантах осуществления NK-клетки, генетически модифицированные NK-клетки или второе средство вводят с фармацевтическим носителем. Фармацевтический носитель может быть любым известным в технике. В конкретных вариантах осуществления NK-клетки или генетически модифицированные NK-клетки являются фукозилированными на поверхности клеток.
Определение количества NK-клеток или генетически модифицированных NK-клеток (например, NK-клеток, содержащих CAR и/или хоминг-рецептор) или количества второго средства может быть выполнено независимо. Такое определение может быть основано на состоянии субъекта и может быть сделано врачом.
В определенных вариантах осуществления, NK-клетки, генетически модифицированные NK-клетки или второе средство применяют, например вводят индивиду, в любом объеме или количестве, которое приводит к детектируемому терапевтическому эффекту для индивида, например, в эффективном количестве, при этом индивид имеет вирусную инфекцию, рак или опухолевые клетки, например индивид имеет опухолевые клетки, солидную опухоль или рак крови, например, является больным раком пациентом. Клетки могут быть введены такому индивиду по абсолютному количеству клеток, например, указанному индивиду могут вводить около, по меньшей мере около или самое большее около 1x105, 5x105, 1x106, 5x106, 1x107, 5x107, 1x108, 5x108, 1x109, 5x109, 1x1010, 5x1010 или 1x1011 клеток. В других вариантах осуществления клетки могут быть введены такому индивиду по относительному количеству клеток, например указанному индивиду может быть введено около, по меньшей мере около или самое большее около 1x105, 5x105, 1x106, 5x106, 1x107, 5x107, 1x108, 5x108, 1x109, 5x109, 1x1010, 5x1010 или 1x1011 клеток. В других вариантах осуществления клетки могут быть введены такому индивиду по относительному количеству клеток, например указанному индивиду может быть введено около, по меньшей мере около или самое большее около 1x105, 5x105, 1x106, 5x106, 1x107, 5x107, 1x108 или 5x108 клеток. Клетки могут быть введены такому индивиду согласно приблизительному соотношению между количеством NK-клеток или генетически модифицированных NK-клеток и, необязательно, клеток плацентарного перфузата и количеством клеток опухоли/инфицированных клеток у указанного индивида (например, оцененное количество). Например, NK-клетки или генетически модифицированные NK-клетки могут быть введены указанному индивиду в отношении около, по меньшей мере около или самое большее около 1:1, 1:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1 или 100:1 к количеству клеток опухоли/инфицированных клеток у индивида. Количество клеток опухоли/инфицированных клеток у такого индивида может быть оценено, например, путем подсчета количества клеток опухоли/инфицированных клеток в образце ткани пациента, например образце крови, биопсии и т.п. В конкретных вариантах осуществления, например, для солидных опухолей, указанный подсчет выполняют в комбинации с визуализацией опухоли или опухолей, с тем чтобы получить приблизительный объем опухоли.
В конкретном варианте осуществления NK-клетки (или генетически модифицированные NK-клетки) дополняют клетками плацентарного перфузата или плацентарным перфузатом. В конкретном варианте осуществления около 1x104, 5x104, 1x105, 5x105, 1x106, 5x106, 1x107, 5x107, 1x108, 5x108 или более NK-клеток (или генетически модифицированных NK-клеток) на 1 мл или 1x104, 5x104, 1x105, 5x105, 1x106, 5x106, 1x107, 5x107, 1x108, 5x108, 1x109, 5x109, 1x1010, 5x1010, 1x1011 или более NK-клеток (или генетически модифицированных NK-клеток) на 1 мл дополняют около или по меньшей мере около 1x104, 5x104, 1x105, 5x105, 1x106, 5x106, 1x107, 5x107, 1x108, 5x108 или более изолированных клеток плацентарного перфузата на 1 мл или 1x104, 5x104, 1x105, 5x105, 1x106, 5x106, 1x107, 5x107, 1x108, 5x108,
- 125 039192
1χ109, 5χ109, 1χ1010, 5χ1010, 1x1011 или более изолированных клеток плацентарного перфузата на 1 мл. В других более конкретных вариантах осуществления около 1χ104, 5χ104, 1χ105, 5x105, 1χ106, 5χ106, 1χ107, 5χ107, 1χ108, 5χ108 или более NK-клеток (или генетически модифицированных NK-клеток) на 1 мл или 1χ104, 5χ104, 1χ105, 5χ105, 1χ106, 5χ106, 1χ107, 5χ107, 1χ108, 5χ108, 1χ109, 5χ109, 1χ1010, 5χ1010, 1χ1011 или более NK-клеток (или генетически модифицированных NK-клеток) на 1 мл дополняют около или по меньшей мере около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 или 1000 мл перфузата или около 1 единицей перфузата.
В другом конкретном варианте осуществления NK-клетки (или генетически модифицированные NK-клетки) дополняют прилипающими плацентарными клетками, например прилипающими плацентарными стволовыми клетками или мультипотентными клетками, например CD34-, CD10+, CD105+, CD200+ прилипающими к пластику плацентарными клетками в культуре ткани. В конкретных вариантах осуществления NK-клетки дополняют около 1χ104, 5χ104, 1χ105, 5χ105, 1χ106, 5χ106, 1χ107, 5χ107, 1χ108, 5χ108 или более прилипающих плацентарных клеток/мл или 1χ104, 5χ104, 1χ105, 5χ105, 1χ106, 5χ106, 1χ107, 5χ107, 1χ108, 5χ108, 1χ109, 5χ109, 1χ1010, 5χ1010, 1χ1011 или более прилипающих плацентарных клеток, например прилипающих плацентарных клеток или мультипотентных клеток.
В другом конкретном варианте осуществления NK-клетки (или генетически модифицированные NK-клетки) дополняют кондиционированной средой, например культуральной средой, кондиционированной CD34-, CD10+, CD105+, CD200+ прилипающими к пластику плацентарными клетками в культуре ткани, например 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 мл кондиционированной стволовыми клетками культуральной среды на единицу перфузата или на 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010 или 1011 NK-клеток (или генетически модифицированных NK-клеток). В определенных вариантах осуществления прилипающие к пластику плацентарные клетки в культуре ткани представляют собой мультипотентные прилипающие плацентарные клетки, описанные в патенте США № 74 68276 и публикации заявки на патент США № 2007/0275362, раскрытия которых включены в настоящее описание посредством ссылки во всей их полноте. В другом конкретном варианте осуществления способ дополнительно включает в себя помещение опухолевых клеток вблизи, или введение индивиду, иммуномодулир ующего соединения (например, иммуномодулирующего соединения в соответствии с описанным в разделе 5.2.7.1) или талидомида.
В другом конкретном варианте осуществления NK-клетки (или генетически модифицированные NK-клетки) дополняют клетками плацентарного перфузата, при этом клетки перфузата помещают вблизи интерлейкина-2 (IL-2) на некоторый период времени до указанного помещения вблизи. В определенных вариантах осуществления указанный период времени составляет около, по меньшей мере или самое большее 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 4 6 или 4 8 ч до указанного помещения вблизи.
NK-клетки, генетически модифицированные NK-клетки или второе средство могут быть введены однократно (т.е. в единственной дозе) индивиду, имеющему вирусную инфекцию, гематологическое нарушение или солидную опухоль, во время курса терапии; или могут быть введены многократно (т.е. во множестве доз), например один раз в каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 ч, или один раз в каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней, или один раз в каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 24, 36 или более недель во время терапии. В вариантах осуществления, в которых используются и NK-клетки (или генетически модифицированные NK-клетки), и второе средство, это второе средство и NK-клетки (или генетически модифицированные NK-клетки) могут быть введены индивиду вместе, например в одной и той же рецептуре; отдельно, например в отдельных рецептурах, приблизительно в одно и то же время; или могут быть введены отдельно, например в различных планах дозирования или в различное время суток. Второе средство может быть введено до, после или одновременно с NK-клетками (или генетически модифицированными NK-клетками). NK-клетки (или генетически модифицированные NK-клетки) или второе средство могут быть введены безотносительно того, вводились ли NK-клетки (или генетически модифицированные NK-клетки) или второе средство индивиду в прошлом.
5.7. Пациенты.
Пациент, упоминаемый в настоящем раскрытии, может являться, но не ограничен указанным, человеком или не являющимся человеком позвоночным, таким как дикое, домашнее или сельскохозяйственное животное. В определенных вариантах осуществления пациент является млекопитающим, например человеком, коровой, собакой, кошкой, козой, лошадью, овцой, свиньей, крысой или мышью. В одном из вариантов осуществления пациентом является пациент-человек.
5.8. Наборы.
В настоящем изобретении предоставлена фармацевтическая упаковка или набор, включающий в себя один или более контейнеров, заполненных композицией, содержащей NK-клетки или генетически модифицированные NK-клетки (например, NK-клетки, содержащие CAR и/или хоминг-рецептор), описанные выше, и один или более контейнеров, заполненных композицией, содержащей второе средство, описанное выше. Также в настоящем изобретении предоставлена фармацевтическая упаковка или набор,
- 126 039192 включающие в себя один или более контейнеров, заполненных композицией, содержащей NK-клетки, содержащие CAR и/или хоминг-рецептор, описанные выше. Необязательно, с таким(и) контейнером(ами) может быть ассоциировано извещение в форме, предписанной правительственным агентством, регулирующим производство, применение или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов, и это извещение отражает одобрение агентством в отношении производства, применения или продажи для введения человеку.
Наборы, охваченные в настоящем раскрытии, могут применяться в соответствии со способами лечения, представленными в настоящем раскрытии, например способами лечения гематологического рака, солидной опухоли или вирусной инфекции.
6. Пример.
6.1. Пример 1. Антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC) с использованием ритуксимаба.
Пример, представленный в настоящем раскрытии, демонстрирует, что совместное введение NK-клеток (в настоящем раскрытии, клеток PiNK) и антитела, специфичного для антигена поверхности клеток (в этом случае, CD20), например ассоциированного с опухолью антигена, повышает NK-антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) NK-клеток.
В экспериментах, представленных в настоящем раскрытии, используется антитело против CD20, ритуксимаб и клетки Дауди (Cat. No. CCL-213, АТСС), которые имеют высокую экспрессию CD20. Клетки Дауди были собраны и помечены РКН26 (Cat. No. PKH26GL-1KT, Sigma-Aldrich) (Ferlazzo, G. et al., J. Immunol., 172:1455-1462 (2004); Lehmann, D. et al., Stem Cells Dev, 21:2926-2938 (2012)), чей липофильный алифатический остаток вставляется в плазматическую мембрану клетки. Клетки были промыты и культивированы с ритуксимабом (и человеческим IgG в качестве контроля изотипа) в различных концентрациях, как указано на фиг. 1, в течение 1 ч при комнатной температуре. После трехкратного промывания 104 клеток-мишеней были помещены в 96-луночные планшеты для культивирования ткани с U-образным дном и инкубировались с культивированными NK-клетками при различных соотношениях эффектор-мишень (Е:Т) (50:1, 20:1, 10:1 и 2,5:1) в 200 мкл RPMI 1640, дополненном 10% FBS. Культуры инкубировались в течение 4 ч при 37°C в 5% СО2. После инкубации клетки были собраны и TO-PRO-3 (Cat. No. Т3605, Invitrogen), мембранно-непроницаемый ДНК-краситель, был добавлен к культурам до итоговой концентрации 0,25 мкМ, после чего проводился анализ FACS с использованием BD FACSCanto II. Цитотоксичность (% цитотоксичности на фиг. 1) выражена в процентах мертвых клеток (PKH26+TO-PRO-3н) от общего количества целевых опухолевых клеток PKH26+ за вычетом спонтанного некроза клеток.
Культивирование клеток Дауди с ритуксимабом повышает цитотоксичность (PiNK) клеток по сравнению с контролями человеческого IgG, таким образом показывая повышение цитолитической активности клеток PiNK при дополнении совместным введением антитела против CD20 (фиг. 1).
6.2. Пример 2. Цитотоксичность трехэтапных NK-клеток против множественной миеломы.
Исследование фенотипа клеточных линий ММ и первичных образцов ММ.
Первичные клетки множественной миеломы (ММ) (раствор ткани, ID доноров: ММ285, ММ293) или линии опухолевых клеток MM: RPMI8226 (АТсС, Cat. No. CCL-155) и клеток ОРМ2 (DSMZ, Cat. No. АСС-50) (1x106 каждых) использовались в данном анализе. Клетки были окрашены анти-PD-L1 АРС (Biolegend, Cat. No. 329708), анти-CS1 РЕ-Су7 (Biolegend, Cat. No. 331816) и 7-AAD (BD Bioscience, Cat. No. 559925) согласно протоколу производителя. Данные были получены на BD LSRFortessa (BD Bioscience) и проанализированы с использованием программного обеспечения FLOWJO® (Tree Star). Данные были выражены как % положительных клеток, запертых под единичными клетками 7-AAD-. Установка % положительного запирания была выполнена с использованием неокрашенного образца в качестве контроля.
Результаты.
Экспрессия PD-L1 и CS-1 на клеточных линиях ММ показана на фиг. 2. Крайний левый пик в панелях фиг. 2 указывает контроль, тогда как самый правый пик указывает образец. Процент клеток, положительных по PD-L1, был следующим: указывает контроль, тогда как самый правый пик указывает образец. Процент клеток, положительных по PD-L1, был следующим: 71,6% ММ285, 70,7% ММ293, 66,2% ОРМ-2 и 94,4% RPMI8226. Процент клеток, положительных по CS-1 был следующим: 31,8% ММ285, 58,8% ММ293, 93,4% ОРМ-2 и 29,5% RPMI8226.
24-часовая проба на цитотоксичность трехэтапных NK-клеток против клеточных линий ММ и первичных образцов ММ.
Клетки ОРМ2 были маркированы 10 мкМ РКН26 флуоресцентным красителем (Sigma-Aldrich, Cat. No. PKH26-GL) до совместной культивации с трехэтапными NK-клетками от пяти различных доноров при соотношении эффектора и мишени (Е:Т), составляющем 3:1 (3x105 и 1x105 трехэтапных NK и клеток ОРМ2 соответственно) в 1 мл RPMI1640, дополненного 10% FBS и антибиотиками (базальная среда), или в условиях эксперимента: IL-15 (5 нг/мл) (Invitrogen, Cat. No. РНС9153); IL-2 (200 межд.ед./мл) (Invitrogen, Cat. No. РНС0023); анти-PD-L1 (10 нг/мл) (Affymetrix, Cat. No. 16-5983-82);
- 127 039192 анти-IgG (10 нг/мл) (Affymetrix, Cat. No. 16-4714-82); ревлимид® (леналидомид; 1 мкМ) или диметилсульфоксид (0,1%) в 48-луночных планшетах. Клетки-мишени по отдельности были помещены в планшет в качестве контролей. После инкубации в течение 24 ч при 37°C и 5% СО2 клетки были собраны, после чего проводилось окрашивание 1 мкМ TO-PRO-3, чтобы идентифицировать мертвые клетки. Количество жизнеспособных клеток-мишеней (PKH26+TO-PRO-3-) в каждом образце было определено количественно посредством проточной цитометрии с использованием гранул для подсчета в соответствии с протоколом, предоставленным производителем (Invitrogen, Cat. No. С36950). Гранулы для подсчета были введены в данную пробу в целях учета любой потенциальной пролиферации опухолевых клеток во время длительного 24-часового культивирования.
Кратко, количество жизнеспособных клеток-мишеней в каждом образце было вычислено следующим образом: (% PKH26+TO-PRO-3- живых мишеней)/(гранулы для подсчета%)х(присвоенное значение для гранулы из партии гранул для подсчета). Процент выживания (% выживания) в образцах (клеткимишени с совместно культивированными трехэтапными NK-клетками) был вычислен путем деления абсолютного числа жизнеспособных PKH26+ клеток-мишеней, остающихся в совместных культурах с трехэтапными NK-клетками после 24 ч, на абсолютное число жизнеспособных РКН26+ клеток-мишеней, остающихся в культуре только клеток-мишеней. Процент цитотоксичности за 24 ч вычислялся как: 100 - % выживания. Результаты были изображены как среднее значение ± стандартное отклонение среднего значения.
Результаты.
Трехэтапные NK-клетки демонстрировали цитотоксическую активность против различных клеточных линий ММ. Трехэтапные NK-клетки оказывали 20-60% лизирование в отношении четырех образцов первичных ММ при отношении Е:Т, составляющем 3:1 (фиг. 3). Наблюдалось изменение чувствительности мишеней ММ от различных доноров в отношении уничтожения NK-клетками. Кроме того, начальная оценка цитотоксичности трехэтапных NK-клеток против ОРМ2 показала улучшение цитолитической активности путем добавления цитокинов, иммуномодулирующих соединений и моноклональных антител, использованных в этих экспериментах (фиг. 4).
Эквиваленты
Настоящее изобретение не должно быть ограничено в своем объеме конкретными вариантами осуществления, описанными в настоящем раскрытии. Фактически, различные модификации изобретения в дополнение к описанным станут очевидными для специалистов в данной области техники из предшествующего описания и прилагаемых фигур. Такие модификации, как предполагается, будут попадать в пределы объема прилагаемой формулы изобретения.
Вся библиография, процитированная в настоящем раскрытии, включена в настоящее изобретение посредством ссылки во всей ее полноте и для всех целей до той же самой степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или заявка на патент были конкретно и индивидуально указаны как включенные посредством ссылки во всей их полноте для всех целей. Цитирование любой публикации предназначено для его раскрытия до даты подачи и не должно рассматриваться как признание того, что настоящее изобретение не правомочно датировать задним числом такую публикацию посредством предшествующего изобретения.

Claims (16)

1. Способ лечения рака у нуждающегося в этом субъекта, включающий в себя введение указанному субъекту выделенной популяции активированных естественных клеток-киллеров (NK) или фармацевтической композиции с ней, при этом NK-клетки являются генетически сконструированными, экспрессирующими химерный антигенный рецептор (CAR) и хоминг-рецептор, при этом указанный CAR содержит внеклеточный домен, трансмембранный домен, внутриклеточный стимулирующий домен и костимулирующий домен, и где хоминг-рецептор представляет собой VEGFR2 или CCR7.
2. Способ по п.1, в котором внеклеточный домен содержит антигенсвязывающий домен, где антигенсвязывающий домен специфически связывается с ассоциированным с опухолью антигеном (ТАА), который выбран из группы, состоящей из CD123, CLL-1, CD38 и CS-1.
3. Способ по п.1 или 2, в котором костимулирующий домен содержит внутриклеточный домен CD28, 4-1ВВ, PD-1, OX40, CTLA-4, Kp46, Kp44, Kp30, DAP10 или DAP12.
4. Способ по любому из пп.1-3, в котором введение указанному субъекту выделенной популяции активированных NK-клеток или фармацевтической композиции с ней выполняют посредством инъекции, инфузии, внутривенного введения, внутрибедренного введения или внутриопухолевого введения.
5. Способ по любому из пп.1-4, в котором введение указанному субъекту выделенной популяции активированных NK-клеток или фармацевтической композиции с ней выполняют с помощью устройства, матрицы или скаффолда.
6. Способ по любому из пп.1-5, в котором активированные NK-клетки являются фукозилированными на поверхности клеток.
7. Способ по любому из пп.1-6, в котором изолированную популяцию активированных NK-клеток
- 128 039192 или фармацевтическую композицию с ней вводят в однократной дозе.
8. Способ по любому из пп.1-6, в котором выделенную популяцию активированных NK-клеток или фармацевтическую композицию с ней вводят во множестве доз.
9. Способ по любому из пп.1-8, в котором рак представляет собой гематологический рак.
10. Способ по любому из п.1-8, в котором рак представляет собой солидную опухоль.
11. Способ по любому из пп.1-10, дополнительно включающий введение указанному субъекту антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, который специфично связывается и является антагонистом активности белка иммунной контрольной точки.
12. Способ по п.11, в котором антитело представляет собой моноклональное антитело, белок иммунной контрольной точки представляет собой CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2 или LAG-3.
13. Способ по любому из пп.1-12, дополнительно включающий введение указанному субъекту биспецифичного активатора клеток-киллеров (BiKE), где BiKE содержит первый одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), который специфично связывается с ассоциированным с опухолью антигеном (ТАА).
14. Способ по п.13, в котором ТАА представляет собой CD123, CLL-1, CD38, CS-1, CD138, ROR1, FAP, MUC1, PSCA, EGFRvIII, EPHA2 или GD2.
15. Набор для лечения рака у нуждающегося в этом субъекта, включающий в себя:
(а) выделенную популяцию активированных NK-клеток или фармацевтическую композицию с ней, при этом активированные NK-клетки являются генетически сконструированными, экспрессирующими химерный антигенный рецептор (CAR) и хоминг-рецептор, при этом указанный CAR содержит внеклеточный домен, трансмембранный домен, внутриклеточный стимулирующий домен и костимулирующий домен, где хоминг-рецептор представляет собой VEGFR2 или CCR7; и (b) второе средство или фармацевтическую композицию с ним, при этом указанное второе средство применяется для лечения указанного рака.
16. Набор по п.15, в котором второе средство представляет собой противовоспалительное средство, иммуномодулирующее средство, цитотоксическое средство, вакцину против рака, химиотерапевтическое средство, ингибитор HDAC или миРНК.
EA201791442A 2015-03-30 2015-12-30 Способ лечения рака и набор для лечения рака EA039192B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562139952P 2015-03-30 2015-03-30
PCT/US2015/068069 WO2016109668A1 (en) 2014-12-31 2015-12-30 Methods of treating hematological disorders, solid tumors, or infectious diseases using natural killer cells

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201791442A1 EA201791442A1 (ru) 2018-05-31
EA039192B1 true EA039192B1 (ru) 2021-12-16

Family

ID=80632888

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201791442A EA039192B1 (ru) 2015-03-30 2015-12-30 Способ лечения рака и набор для лечения рака

Country Status (1)

Country Link
EA (1) EA039192B1 (ru)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2728361C1 (ru) * 2019-10-16 2020-07-29 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина" Минздрава России) Биомедицинский клеточный продукт с анти-HER2 специфической противоопухолевой активностью

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013123061A1 (en) * 2012-02-13 2013-08-22 Seattle Children's Hospital D/B/A Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof
US20140322183A1 (en) * 2013-03-15 2014-10-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013123061A1 (en) * 2012-02-13 2013-08-22 Seattle Children's Hospital D/B/A Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof
US20140322183A1 (en) * 2013-03-15 2014-10-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BENSON et al. "The PD-1/PD-L1 axis modulates the natural killer cell versus multiple myeloma effect: a therapeutic target for CT-011, a novel monoclonal anti-PD-1 antibody", Blood, 11 May 2010 (11.05.2010), Vol. 116, No. 13, Pgs. 2286-94, entire document *
CANY et al. "Natural killer cells generated from cord blood hematopoietic progenitor cells efficiently target bone marrow-residing human leukemia cells in NOD/SCID/IL2Rg(null) mice", PLoS One, 05 June 2013 (05.06.2013), Vol. 8, No. 6, e64384, Pg. 1-11, entire document *
GLEASON et al. "Bispecific and trispecific killer cell engagers directly activate human NK cells through CD16 signaling and induce cytotoxicity and cytokine production", Mol Cancer Ther. 17 October 2012 (17.10.2012), Vol. 11, No. 12, Pgs. 2674-84, entire document *
SONG et al. "Chimeric NKG2D CAR-expressing T cell-mediated attack of human ovarian cancer is enhanced by histone deacetylase inhibition", Hum Gene Ther. 01 March 2013 (01.03.2013), Vol. 24, No. 3, Pgs. 295-305, entire document *

Also Published As

Publication number Publication date
EA201791442A1 (ru) 2018-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210008109A1 (en) Methods of treating hematological disorders, solid tumors, or infectious diseases using natural killer cells
US20220348875A1 (en) Genetically modified natural killer cells
US9913863B2 (en) Regulatory B cells and their uses
JP2022023148A (ja) ナチュラルキラー細胞およびｉｌｃ３細胞ならびにそれらの使用
KR102534472B1 (ko) 케모카인 리셉터와 세포 접착 분자를 발현하는 cd3 음성 세포의 집단, 및 그 이용 그리고 그 제조 방법
CN105008516A (zh) 自然杀伤细胞及其用途
Shin et al. Ex vivo expansion of canine cytotoxic large granular lymphocytes exhibiting characteristics of natural killer cells
US20230028680A1 (en) Expansion of natural killer cells and ilc3 cells with novel aromatic compounds
KR102256272B1 (ko) 전혈로부터 분리된 자연살상세포의 고효율 대량증식 방법
CN110603320A (zh) 高活性nk细胞及其应用
Ghaedrahmati et al. Targeting immune checkpoints: how to use natural killer cells for fighting against solid tumors
CN113613723A (zh) 包含nk细胞的细胞群体的制造方法
EA039192B1 (ru) Способ лечения рака и набор для лечения рака
US20220000919A1 (en) Placental derived natural killer cells for treatment of coronavirus infections
NZ733149A (en) Methods of treating hematological disorders, solid tumors, or infectious diseases using natural killer cells
CN118813544A (zh) 遗传修饰的自然杀伤细胞