CN110079529A - 用于靶向敲除人NKG2A/KLRC1基因的sgRNA、表达载体、试剂盒及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于靶向敲除人NKG2A/KLRC1基因的sgRNA，属于基因工程技术领域，所述sgRNA具有如SEQ ID NO.1‑56中的任一种核苷酸序列，本发明还公开了用于靶向敲除人NKG2A/KLRC1基因的sgRNA组合物、表达载体、CRISPR/Cas9系统、试剂盒及其在制备治疗肿瘤疾病的免疫细胞药物中的用途；利用本发明制备的特异性靶向人NKG2A/KLRC1基因能够精确的靶向人NKG2A/KLRC1基因并实现有效的敲除，同时，所得的人NKG2A/KLRC1基因敲除免疫细胞适用于多种肿瘤细胞模型；该制备方法步骤简单、sgRNA靶向特异性好，CRISPR/Cas9系统的敲除效率高。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及用于靶向敲除人NKG2A/KLRC1基因的sgRNA、表达载体、试剂盒及其用途。
背景技术
CRISPR/Cas系统是从细菌和古生菌对抗外来病毒或质粒的适应性免疫系统发展而来，CRISPR序列和其相关基因(Cas基因)共同作用，因其特有的RNA介导的核酸内切酶活性得到生物学界的广泛关注。其中，来源于Streptococcus Pyogenes为代表的II型DNA内切酶Cas9因其只有一个亚基，结构最为简单，所以应用最为广泛。CRISPR/Cas9系统通过识别特定序列的small-guide RNA(sgRNA)序列定位靶向基因，引导Cas9切割靶向序列，造成双链DNA断裂(Double-strand breaks,DSB)，在没有模板的条件下，发生非同源重组的末端连接(Non-Homologous End Joining,NHEJ)DNA修复方式产生碱基的插入或缺失，从而造成移码突变达到基因敲除的目的。
与ZFN(Zinc Finger Nucleas)和TALEN(Transcription Activator-likeEffector Nucleas)需要研究者根据目的基因设计和植被一对特异性的核酸酶相比，CRISPR/Cas9技术能够快速高效的靶向任意一个或多个基因，并且具有操作简便，可以高通量制备以及成本低等优势。因此，这一技术在免疫细胞改造和基因临床治疗中具有很高的应用前景和价值。
CRISPR/Cas9系统中，Cas9靶向切割是依靠sgRNA识别靶序列实现的。虽然靶序列只有20个核苷酸，设计十分简便，但是非特异性结合(脱靶)的几率也相对较大。脱靶会造成出目的基因以外的基因突变，给人体带来不可预估的影响。脱靶效率对基因治疗等临床应用是不可忽视的安全隐患，也是限制该技术发展和应用的主要原因。因此，sgRNA对目的基因的特异性和靶向准确性是目的基因特异性敲除的先决条件。因此，具有高度特异性和准确性sgRNA的设计和制备是CRISPR/Cas9基因敲除的关键。
现今，在肿瘤临床治疗中，使用阻断免疫细胞表面的免疫检查点抗体进行的免疫治疗是常用的治疗手段。免疫检查点(Immune Checkpoints)是调节系统性免疫稳态与耐受的信号通路。诸多研究表明，肿瘤细胞表面高表达免疫检查点配体，通过结合免疫细胞的免疫检查点达到抑制肿瘤免疫的效果。这一效果在肿瘤抗原特异性的效应T细胞和自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)的肿瘤抑制中尤为突出。特定的免疫检查点的阻断，比如PD-1，能够增强抗肿瘤免疫反应。2018年，刊登在国际著名杂志Cell的最新研究表明，利用抗体阻断免疫检查点NKG2A能够促进NK细胞和效应T细胞对肿瘤的查杀能力，并且通过联合用药在临床实验中取得了很好的疗效。因此，NKG2A是继CTLA-4、PD-1/L1和IDO2之后最具有临床应用价值的肿瘤治疗靶点。
但是，利用免疫检查点抗体的治疗并非对所有癌症均有效果。PD-1抗体对黑色素瘤虽然有较好的疗效，但是仅对部分肾癌和肺癌具有效果。其他免疫检查点抗体药物也还处于临床试验阶段，比如NKG2A，目前，已经有很多采用NKG2A抗体进行肿瘤治疗的报道。但是还存在抗体药物作用的短效性、免疫检查点的多样性、药物研发时间过长、抗体价格昂贵等诸多不利因素。
相比之下，CRISPR/Cas9技术的优点不言而喻。利用CRISPR/Cas9技术对免疫细胞进行改造，敲除表面免疫检查点相关基因，为实现肿瘤免疫治疗提供了一种新的策略。但是，如上述所讲，设计和制备出精确性和特异性靶向免疫检查点基因的sgRNA是CRISPR/Cas9特异性基因敲除的关键所在。
发明内容
本发明的目的之一，就在于提供一种用于靶向敲除人NKG2A/KLRC1基因的sgRNA，以解决上述问题。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：一种用于靶向敲除人NKG2A/KLRC1基因的sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-56中的任一种所示。
本发明的目的之二，在于提供一种用于靶向敲除人NKG2A/KLRC1基因的表达载体，采用的技术方案为：所述表达载体表达上述的sgRNA。
本发明的目的之三，在于提供一种用于靶向敲除人NKG2A/KLRC1基因的CRISPR/Cas9系统，采用的技术方案为，所述CRISPR/Cas9系统包括上述的sgRNA和Cas9蛋白。
本发明的目的之四，在于提供一种用于靶向敲除人NKG2A/KLRC1基因的试剂盒，采用的技术方案为，所述试剂盒包括表达Cas9蛋白和上述的sgRNA的载体。
本发明的目的之五，在于提供一种用于靶向敲除人NKG2A/KLRC1基因的sgRNA组合物，采用的技术方案为，所述组合物包括至少两种上述的sgRNA。
本发明的目的之六，在于提供一种上述的sgRNA在制备用于治疗肿瘤疾病的免疫细胞药物中的用途。
本发明的目的之六，在于提供一种上述的sgRNA组合物在制备用于治疗肿瘤疾病的免疫细胞药物中的用途。
本发明是通过下述方法实现的：
1.靶向NKG2A/KLRC1基因的sgRNA序列的设计和选择：
(a)通过NCBI数据库找到NKG2A/KLRC1基因序列；
(b)选择NKG2A/KLRC1基因上的不同的各种剪切形式的共有外显子；
(c)在第一个起始密码子ATG之后的共有外显子中找出5’-GGN(19)GG-3’、5’-GN(20)GG-3’或5’-N(21)GG-3’的序列位点；
(d)选择不能离起始密码子ATG太近的位点，防止转录后下游另一个ATG开始而出现一个被截短的基因形式，不能保证基因完全失活，同时应当位于整个基因前半段的单个或者相隔一定距离(0-200bp)的成对位点；
(e)使用在线数据库NCBI的BLAST或者UCSC的BLAT确定sgRNA的靶序列是否唯一；
2.构建sgRNA的寡聚核苷酸双链：
(a)在选择的sgRNA序列的5’加上适当的限制性内切酶粘性末端，连接至Bsa I切割位点的sgRNA序列添加ACCG，连接至Bbs I切割位点的sgRNA序列添加CACC，得到正向寡核苷酸(Forward oligo)；
(如果sgRNA序列在5’端不是以G开始，则在5’端添加一个G后再添加内切酶粘性末端)；
(b)根据选择的sgRNA序列，获得其对应DNA的互补链，并且在其5’端加上AAAC得到反向寡核苷酸(Reverse oligo)；
(c)分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸；
(d)将合成的正反向sgRNA寡聚核苷酸成对的进行变性、退火，使其碱基配对形成可接入线性U6真核表达的pGL3-2U6-sgRNA体的双链结构；
双链结构如下：
3.sgRNA寡聚核苷酸质粒的构建：
(a)线性化pGL3-2U6-sgRNA载体(结构如图1所示，序列如SEQ ID NO.77所示)；
(b)将退火的sgRNA寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-2U6-sgRNA载体连接获得pGL3-2U6-NKG2A/KLRC1-sg质粒；
(c)转化并涂Amp+平板(100μg/ml)；
(d)挑取单克隆，在LB培养液中37℃摇床摇菌过夜；
(e)取部分菌液，利用SEQ ID NO.71的测序用特异性引物，通过测序的方法检测是否正确插入载体；剩余菌液用EndoFree Plasmid Kits(QIAGEN)抽提质粒；
4.转染免疫细胞获得NKG2A/KLRC1基因敲除免疫细胞：
按照Human T Cell Nucleofector Kit(Lonza)的操作手册，将载有sgRNA寡聚核苷酸的质粒与序列为SEQ ID NO.76的Cas9质粒(结构如图2所示)混匀，共转染细胞。
5.用T7EN1酶切检测和流式细胞术检测确认NKG2A/KLRC1基因已经被敲除。
更进一步的，同时利用一对相邻(在人NKG2A/KLRC1基因上的靶向起始位点相距0-200bp)的sgRNA可以显著提高敲除效率。在靶向人NKG2A/KLRC1基因的sgRNA寡核苷酸设计、选择和合成之后，将一对靶向人NKG2A/KLRC1基因的sgRNA寡聚核苷酸与线性化pGL3-2U6-sgRNA载体连接获得包含一对靶向人NKG2A/KLRC1基因的sgRNA寡聚核苷酸的载体pGL3-2U6-NKG2A/KLRC1-sg1-sg2质粒。在此之后进行细胞转染。
本发明为利用CRISPR/Cas9技术特异性敲除细胞中人NKG2A/KLRC1基因设计、合成了一组正向和反向特异性靶向此基因的sgRNA，并将该sgRNA与经过改造能够装载2条sgRNA的线性pGL3-2U6-sgRNA载体连接成质粒。将上述载体与Cas9质粒同时成功转染细胞即可实现人NKG2A/KLRC1基因的敲除。
本发明提供了一种利用CRISPR/Cas9技术结合特异性靶向人NKG2A/KLRC1基因的sgRNA快速、高效、低成本、特异性敲除人NKG2A/KLRC1基因的策略；有效的解决了现有的NKG2A抗体治疗存在的问题，实现永久抑制免疫检查点NKG2A的效果；不仅可以针对人NKG2A/KLRC1基因的多个编码序列进行同时敲除，也可以针对多个靶基因进行同时敲除；而且，制备本发明提供的高效的sgRNA只需要小量合成就能大量生产；同时，敲除人NKG2A/KLRC1基因的免疫细胞在肿瘤细胞治疗领域具有很大的应用前景。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1.相对于现有技术NKG2A抗体的暂时性封闭作用，本发明直接敲除NKG2A/KLRC1基因，可以实现永久的效果；
2.抗体药物目前还无法同时封闭多种抑制性受体，本发明既可以针对NKG2A的多个编码序列进行敲除，也可以针对多个靶基因进行敲除；
3.现有的有效NKG2A抗体数量极少，并且研发困难度较大，本发明提供了针对人NKG2A/KLRC1基因的一组高效的sgRNA；
4.抗体药物作用只能针对细胞外靶点，本发明既可以针对胞外，也能针对胞内靶点；
5.相对开发抗体药物费时、费力、费钱导致抗体药物昂贵，利用sgRNA只需要小量合成多核苷酸片断，就能大批量生产；
6.通过利用一对sgRNA组合物进行基因敲除，大大减少脱靶效率，提高临床使用的可行性，降低安全风险。
附图说明
图1为线性化pGL3-2U6-sgRNA载体结构图；
图2为Cas9质粒结构图；
图3为T7EN1酶切图；
图4为流式细胞术检测结果图。
具体实施方式
在下文中，将参照实施例详细描述本发明。然而本发明的这些实施例在本文中仅出于说明的目的来描述，并且本发明的权利范围不受限于这些实施例。
实施例1
CRISPR/Cas9特异性敲除人NKG2A/KLRC1基因中用于特异性靶向人NKG2A/KLRC1基因的sgRNA的设计与合成：
1.靶向人NKG2A/KLRC1基因的sgRNA的设计：
(a)在人NKG2A/KLRC1基因上选择5’-GGN(19)GG-3’、5’-GN(20)GG-3’或5’-N(21)GG-3’的序列；
(b)选取靶向位点位于人NKG2A/KLRC1基因外显子上的序列，保证更容易引起基因完全失活；
(c)sgRNA在人NKG2A/KLRC1基因上的靶向位点位于不同剪切形式的共有外显子上；
(d)使用在线数据库NCBI的BLAST或者UCSC的BLAT确定sgRNA的靶序列是否唯一；
根据上述方法，共设计了56个靶向人NKG2A/KLRC1基因的sgRNA，序列分别如序列表SEQ ID NO.1-56所示；
2.靶向人NKG2A/KLRC1基因的sgRNA的选择：
(a)sgRNA序列不与第一个ATG起始密码子相隔太近；
(b)sgRNA在人NKG2A/KLRC1基因上的靶向位点位于整个基因的前部；
(c)在人NKG2A/KLRC1基因上选择相隔一定距离(0-200bp)成对的位点；
根据上述方法，在56个靶向sgRNA中(序列分别如序列表SEQ ID NO.1-56所示)符合的序列有43个(分别如序列SEQ ID NO.1、2、4、5、6、8、9、12、13、15、16、18、20-27、29、32-53所示)；
为实验验证，从中选择了7个(分别如序列SEQ ID NO.2,6,8,20,21,22,26所示的序列进行后续试验。
3.靶向人NKG2A/KLRC1基因的sgRNA寡聚核苷酸的合成和构建：
根据前述步骤选择的7个(分别如序列SEQ ID NO.2,6,8,20,21,22,26所示)sgRNA序列，在5’端加上ACCG或者CACC得到正向寡核苷酸(Forward oligo)，如果序列本身在5’端不是以G开始，则在5’端添加一个G后再添加ACCG或者CACC。根据选择的sgRNA，获得互补链，并在5’端加上AAAC得到反向寡核苷酸(Reverse oligo)。分别合成上述寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸的Forward oligo和Reverse oligo成对变性、退火形成带有粘性末端的双链sgRNA，模式如下：
变性、退火体系为：
5μl Forward oligo(100μM)
5μl Reverse oligo(100μM)
在PCR仪中按照以下touch down程序运行：95℃，2min；95–25℃at-1℃/min；4℃保持。
所得的SEQ ID NO.2正向寡核苷酸和反向寡核苷酸序列分别如SEQ ID NO.57、58所示；
所得的SEQ ID NO.6正向寡核苷酸和反向寡核苷酸序列分别如SEQ ID NO.59、60所示；
所得的SEQ ID NO.8正向寡核苷酸和反向寡核苷酸序列分别如SEQ ID NO.61、62所示；
所得的SEQ ID NO.20正向寡核苷酸和反向寡核苷酸序列分别如SEQ ID NO.63、64所示；
所得的SEQ ID NO.21正向寡核苷酸和反向寡核苷酸序列分别如SEQ ID NO.65、66所示；
所得的SEQ ID NO.22正向寡核苷酸和反向寡核苷酸序列分别如SEQ ID NO.67、68所示；
所得的SEQ ID NO.26正向寡核苷酸和反向寡核苷酸序列分别如SEQ ID NO.69、70所示。
实施例2
利用CRISPR/Cas9特异性敲除人NKG2A/KLRC1基因(本实施例用于靶向人NKG2A/KLRC1基因的一对sgRNA分别如序列SEQ ID NO.2,6,8,20,21,22,26所示的序列)
包括以下步骤：
1.线性化序列如序列SEQ ID NO.77的pGL3-2U6-sgRNA载体。
酶切体系和条件如下：
2μg pGL3-2U6-sgRNA
5μl CutSmart Buffer
1μl BsaI(NEB)
补水至50μl，PCR 37℃反应1小时。
酶切完成后进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用EndoFree Plasmid Kits(QIAGEN)回收pGL3-2U6-sgRNA载体；
2.将变性、退火之后获得的可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA(2),sgRNA(8),sgRNA(21),sgRNA(22)(分别如序列SEQ ID NO.2,8,21,22所示)寡聚核苷酸与线性化的pGL3-2U6-sgRNA载体相连获得pGL3-2U6-NKG2A/KLRC1-sg(2)，pGL3-2U6-NKG2A/KLRC1-sg(8)，pGL3-2U6-NKG2A/KLRC1-sg(21)，pGL3-2U6-NKG2A/KLRC1-sg(22)质粒。
连接体系如下：
3μl 50μM退火产物(双链sgRNA寡聚核苷酸，正向寡核苷酸如序列SEQ ID NO.57、61、65、67所示，反向寡核苷酸如序列SEQ ID NO.58、62、66、68所示)
1μl线性化的pGL3-2U6-sgRNA载体(25ng/μl)
1μl T4 ligation Buffer
0.5μl T4 ligase(NEB)
4.5μl灭菌水
16℃孵育2小时
3.将上述步骤获得的连接产物转化100μl DH5α感受态细胞(TransGen Biotech)并涂Amp+平板(100μg/ml)，并挑取单克隆于LB培养基中37℃摇床培养6h；
4.取部分摇床培养的菌液送交测序(利用SEQ ID NO.71的测序用特异性引物)，检测是否正确插入载体。另取部分菌液加入LB培养基中摇床过夜培养，并用EndoFreePlasmid Kits(QIAGEN)抽提质粒，获得pGL3-2U6-NKG2A/KLRC1-sg(2)，pGL3-2U6-NKG2A/KLRC1-sg(8)，pGL3-2U6-NKG2A/KLRC1-sg(21)，pGL3-2U6-NKG2A/KLRC1-sg(22)质粒；
5.线性化pGL3-2U6-NKG2A/KLRC1-sg(2)，pGL3-2U6-NKG2A/KLRC1-sg(8)，pGL3-2U6-NKG2A/KLRC1-sg(21)，pGL3-2U6-NKG2A/KLRC1-sg(22)质粒。
2μg质粒
5μl CutSmart Buffer
1μl BbsI(NEB)
补水至50μl，PCR 37℃反应1小时。
酶切完成后进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用EndoFree Plasmid Kits(QIAGEN)回收pGL3-2U6-NKG2A/KLRC1-sg(2)，pGL3-2U6-NKG2A/KLRC1-sg(8)，pGL3-2U6-NKG2A/KLRC1-sg(21)，pGL3-2U6-NKG2A/KLRC1-sg(22)质粒；
6.将变性、退火之后获得的可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA(6),sgRNA(20),sgRNA(26)(分别如序列SEQ ID NO.6、20、26所示)寡聚核苷酸与线性化的pGL3-2U6-NKG2A/KLRC1-sg(2)，pGL3-2U6-NKG2A/KLRC1-sg(8)，pGL3-2U6-NKG2A/KLRC1-sg(21)，pGL3-2U6-NKG2A/KLRC1-sg(22)相连获得pGL3-2U6-NKG2A/KLRC1-sg(2)-sg(6)，pGL3-2U6-NKG2A/KLRC1-sg(8)-sg(6)，pGL3-2U6-NKG2A/KLRC1-sg(21)-sg(26)，pGL3-2U6-NKG2A/KLRC1-sg(22)-sg(20)质粒。
连接体系如下：
3μl 50μM退火产物(双链sgRNA寡聚核苷酸，正向寡核苷酸如序列表SEQ IDNO.59、63、69所示，反向寡核苷酸如序列表SEQ ID NO.60、64、70所示)
1μl线性化的质粒(25ng/μl)
1μl T4 ligation Buffer
0.5μl T4 ligase(NEB)
4.5μl灭菌水
16℃孵育2小时
7.将上述步骤获得的连接产物转化100μl DH5α感受态细胞(TransGen Biotech)并涂Amp+平板(100μg/ml)，并挑取单克隆于LB培养基中37℃摇床培养6h；
8.取部分摇床培养的菌液送交测序(利用SEQ ID NO.71的测序用特异性引物)，检测是否正确插入载体。另取部分菌液加入LB培养基中摇床过夜培养，并用EndoFreePlasmid Kits(QIAGEN)抽提质粒，获得pGL3-2U6-NKG2A/KLRC1-sg(2)-sg(6)，pGL3-2U6-NKG2A/KLRC1-sg(8)-sg(6)，pGL3-2U6-NKG2A/KLRC1-sg(21)-sg(26)，pGL3-2U6-NKG2A/KLRC1-sg(22)-sg(20)质粒。
9.细胞培养与转染
(a)人免疫细胞细胞接种培养于RPMI-1640培养液中，其中含10％自体血清，青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)；
(b)在转染前分至6孔板中，待70％～80％密度时进行转染；
(c)按照Human T Cell Nucleofector Kit(Lonza)的操作手册，将5μg pGL3-2U6-NKG2A/KLRC1-sg(2)-sg(6)，pGL3-2U6-NKG2A/KLRC1-sg(8)-sg(6)，pGL3-2U6-NKG2A/KLRC1-sg(21)-sg(26)；pGL3-2U6-NKG2A/KLRC1-sg(22)-sg(20)质粒与10μg的Cas9质粒混匀，共转染至每孔细胞中，6-8小时后换液，48小时后收取细胞。
10.T7EN1酶切检测
(a)将收集的细胞采用Tissue DNA Kit(OMEGA)提取基因组DNA；
(b)使用序列如SEQ ID NO.72，73或SEQ ID NO.74,75的成对的引物进行PCR扩增，用Cycle-Pure Kit(OMEGA)纯化获得PCR回收产物；
(c)取5μl PCR产物，1.1μl NEB Buffer 2，4.4μl ddH2O进行变性、退火；
(d)在上述体系中加入T7EN1 0.5μl，PCR仪中37℃酶切30分钟后，加入2μl 6×Loading Buffer，用2.5％的琼脂糖胶电泳检测，其结果如图3所示。
11.流式细胞术检测
(a)取1×106的转染并培养后的细胞，通过离心的方式，使用PBS清洗两次细胞；
(b)用100μl PBS重新悬浮细胞后，加入BSA在室温孵育5分钟；
(c)加入PE-anti-human NKG2A抗体，在暗处4度孵育30分钟；
(d)使用PBS清洗细胞一次；
(e)利用流式细胞仪检测细胞表面NKG2A的表达，结果如图4所示。
实验结果表明，淋巴细胞表面NKG2A的表达降低率(即敲除率)为14.1-47.4％,证明基因敲除成功。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 成都美杰赛尔生物科技有限公司
<120> 用于靶向敲除人NKG2AKLRC1基因的sgRNA、表达载体、试剂盒及其用途
<130> 201902
<160> 77
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ttgaaggttt aattccgcat 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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ggtctgagta gattactcct 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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ctccatttta gcaactgaac 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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tgaacaggaa ataacctatg 20
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cgttgctgcc tctttgggtt 20
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aggcagcaac gaaaacctaa 20
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<213> Artificial Sequence
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ggttttcgtt gctgcctctt 20
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ttcctgttca gttgctaaaa 20
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atctgccccc aaacccaaag 20
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gttttcgttg ctgcctcttt 20
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aagcttctca ggattttcaa 20
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ttgctgcctc tttgggtttg 20
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ttgggtttgg gggcagattc 20
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aatcctgaga agctttttga 20
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gttgctgcct ctttgggttt 20
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tgctgcctct ttgggtttgg 20
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aaagcttctc aggattttca 20
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aaaccttcaa aaagcttctc 20
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atggagcttt tattgccttt 20
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aacaactatc gttaccacag 20
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gctccagaga agctcattgt 20
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gaagctcatt gttgggatcc 20
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aagctcattg ttgggatcct 20
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atcccaacaa tgagcttctc 20
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ctccagagaa gctcattgtt 20
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agataagaca gataattccc 20
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atgagcttct ctggagctga 20
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aattatctgt cttatcttaa 20
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tcttatctta atggcctctg 20
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tttctgagtt cttgtattca 20
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ctttctgagt tcttgtattc 20
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actggagttc ttcgaagtac 20
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tccaacagtt gttactacat 20
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attatctata gaaagcagac 20
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aacttgggaa gagagtttgc 20
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cagttgttac tacattggta 20
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taatccactc ctcaggacaa 20
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tcattgtggc cattgtcctg 20
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gtggccattg tcctgaggag 20
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accaatgtag taacaactgt 20
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tggtaaggaa agaagaactt 20
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gaatatgtaa tccactcctc 20
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ttggtaagga aagaagaact 20
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ccatcatttc accatcctca 20
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<212> DNA
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ccatgaggat ggtgaaatga 20
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catccatggg tgacaatgaa 20
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atgggtgaca atgaatggtt 20
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atttcaccat cctcatggat 20
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aaaccattca ttgtcaccca 20
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acgaaacaca ccaatccatg 20
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gtaacagcag tcatcatcca 20
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taacagcagt catcatccat 20
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aacacaccaa tccatgagga 20
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tattattgaa gatccacact 20
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cgacttaaat cagcccagtg 20
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atattattga agatccacac 20
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<400> 57
accgggtctg agtagattac tcct 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 58
aaacaggagt aatctactca gacc 24
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caccgaggca gcaacgaaaa cctaa 25
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aaacttaggt tttcgttgct gcctc 25
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accggttcct gttcagttgc taaaa 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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aaacttttag caactgaaca ggaac 25
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<213> Artificial Sequence
<400> 63
caccgaacaa ctatcgttac cacag 25
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<213> Artificial Sequence
<400> 64
aaacctgtgg taacgatagt tgttc 25
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accggctcca gagaagctca ttgt 24
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<213> Artificial Sequence
<400> 66
aaacacaatg agcttctctg gagc 24
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<213> Artificial Sequence
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caccgaacaa ctatcgttac cacag 25
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<400> 68
aaacctgtgg taacgatagt tgttc 25
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<400> 69
caccgagata agacagataa ttccc 25
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aaacgggaat tatctgtctt atctc 25
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tgaacggatc tcgacggt 18
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<213> Artificial Sequence
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ataagaaacg tgtttaggct tg 22
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aaccctcatc tcccattgta 20
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ggaaagagaa gggagtgctc 20
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tacgattgca tcagaagcg 19
<210> 76
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 76
tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg 60
gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc 120
ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc 180
tcggcatgga cgagctgtac aagtaagttt aaacccgctg atcagcctcg actgtgcctt 240
ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg 300
ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt 360
gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca 420
atagcaggca tgctggggat gcggtgggct ctatggcttc tgaggcggaa agaaccagct 480
ggggctctag ggggtatccc cattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac 540
ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt 600
gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga 660
gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca 720
ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg 780
ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt 840
cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc 900
ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct 960
tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc 1020
gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta 1080
tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca 1140
gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag 1200
tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag 1260
ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt 1320
agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 1380
gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg 1440
attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga 1500
agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta 1560
atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc 1620
cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg 1680
ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga 1740
agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt 1800
tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt 1860
gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc 1920
caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc 1980
ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca 2040
gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag 2100
tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg 2160
tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa 2220
cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa 2280
cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga 2340
gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga 2400
atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg 2460
agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt 2520
ccccgaaaag tgccacctga cgtcgacgga tcgggagatc tcccgatccc ctatggtgca 2580
ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gtatctgctc cctgcttgtg 2640
tgttggaggt cgctgagtag tgcgcgagca aaatttaagc tacaacaagg caaggcttga 2700
ccgacaattg catgaagaat ctgcttaggg ttaggcgttt tgcgctgctt cgcgatgtac 2760
gggccagata tacgcgttga cattgattat tgactagtta ttaatagtaa tcaattacgg 2820
ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc 2880
cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca 2940
tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg 3000
cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg 3060
acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac tttcctactt 3120
ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca 3180
tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac cccattgacg 3240
tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact 3300
ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag 3360
ctctctggct aactagagaa cccactgctt actggcttat cgaaattaat acgactcact 3420
atagggagac ccaagctggc tagcaccatg gacaagaaat actctattgg actggatatc 3480
gggacaaact ccgttggctg ggccgtcata accgacgagt ataaggtgcc aagcaagaaa 3540
ttcaaggtgc tgggtaatac tgaccgccat tcaatcaaga agaacctgat cggagcactc 3600
ctcttcgact ccggtgaaac cgctgaagct actcggctga agcggaccgc aaggcggaga 3660
tacacccgcc gcaagaatcg gatatgttat ctgcaagaga tctttagcaa cgaaatggct 3720
aaggtggacg actccttctt tcaccgcctg gaagagagct ttctggtgga ggaggataag 3780
aaacacgaga ggcaccctat attcggaaat atcgtggatg aggtggctta ccatgaaaag 3840
tatcctacaa tctaccatct gaggaagaag ctggtggaca gcaccgataa agcagacctg 3900
aggctcatct atctggccct ggctcatatg ataaagttta gaggacactt tctgatcgag 3960
ggcgacctga atcccgataa ttccgatgtg gataaactct tcattcaact ggtgcagaca 4020
tataaccaac tgttcgagga gaatcccata aacgcttctg gtgtggatgc caaggctatt 4080
ctgtccgctc ggctgtccaa gtcacgcaga ctggagaatc tgattgccca actgccagga 4140
gaaaagaaga acggcctgtt tgggaacctc atcgccctga gcctgggcct gacacctaac 4200
ttcaagtcca attttgatct ggccgaagat gctaaactcc agctctccaa ggacacctat 4260
gacgatgatc tggacaacct gctcgcacag ataggcgacc agtacgccga tctctttctg 4320
gctgctaaga atctctccga cgccattctg ctgagcgaca tactccgggt caacactgag 4380
atcaccaaag cacctctgag cgcctccatg ataaaacgct atgatgaaca ccatcaagac 4440
ctgactctgc tcaaagccct cgtgaggcaa cagctgccag agaagtacaa agagatattc 4500
ttcgaccaga gcaagaatgg atatgccgga tacatcgatg gcggagcatc acaggaagaa 4560
ttttacaagt tcatcaaacc aatcctcgag aagatggacg gtactgaaga gctgctggtg 4620
aagctgaaca gggaggacct gctgaggaag cagaggacct ttgataatgg ctccattcca 4680
catcagatac acctgggaga gctgcatgca atcctccgca ggcaggagga tttctatcct 4740
ttcctgaagg ataaccggga gaagatagag aagatcctga ccttcaggat cccttattac 4800
gtcggccctc tggctagagg caactcccgc ttcgcttgga tgaccaggaa atctgaggag 4860
acaattactc cttggaactt cgaagaggtc gtggataagg gcgcaagcgc ccagtcattc 4920
atcgaacgga tgaccaattt cgataagaac ctgcccaacg agaaggtcct gcccaaacat 4980
tcactcctgt acgagtattt caccgtctat aacgagctga ctaaagtgaa gtacgtgacc 5040
gagggcatga ggaagcctgc cttcctgtcc ggagagcaga agaaggctat cgttgatctg 5100
ctcttcaaga ctaatagaaa ggtgacagtg aagcagctca aggaggatta ctttaagaag 5160
atcgaatgct ttgactcagt ggaaatctct ggcgtggagg accgctttaa tgccagcctg 5220
ggcacttacc atgatctgct gaagataatc aaagacaaag atttcctcga taatgaggag 5280
aacgaggaca tcctggaaga tatcgtgctg accctgactc tgttcgagga tagagagatg 5340
atcgaagagc gcctgaagac ctatgcccat ctgtttgacg ataaagtcat gaaacagctc 5400
aagcggcggc gctacactgg gtggggtaga ctctccagga aactcataaa cggcatccgc 5460
gacaaacaga gcggaaagac catcctggat ttcctgaaat ccgacggatt cgctaacagg 5520
aacttcatgc aactgattca cgatgactct ctgacattta aagaggacat ccagaaggca 5580
caggtgagcg gtcaaggcga cagcctgcac gagcacatcg ccaacctcgc tggatcaccc 5640
gccataaaga agggaatact gcagacagtc aaggtcgtgg acgaactcgt caaagtgatg 5700
ggtcggcaca agccagagaa tatcgttatc gaaatggcaa gggagaacca aaccacccag 5760
aagggccaga agaactctcg ggaacggatg aaaagaatcg aagagggaat taaggagctg 5820
ggatctcaga tactgaagga gcaccctgtg gagaatacac agctccagaa cgagaaactc 5880
tacctgtact acctccagaa cgggcgggac atgtacgttg accaggaact cgacatcaac 5940
cggctgtccg attatgacgt ggaccatatt gttccacagt ccttcctcaa agatgactcc 6000
attgacaaca aggtgctgac cagatccgat aagaatcgcg gtaagtctga caatgttcca 6060
tcagaagagg tggtcaagaa gatgaagaat tactggcggc agctcctcaa cgccaaactg 6120
atcacccagc ggaagtttga caatctgact aaggcagaaa gaggaggtct gagcgaactc 6180
gacaaggccg gctttattaa gaggcaactg gtcgaaacac gccagattac caaacacgtg 6240
gcacaaatcc tcgactctag gatgaacact aagtacgatg agaacgataa gctgatcagg 6300
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ttctacaaag ttcgcgaaat aaacaattac catcatgctc acgatgccta tctcaatgct 6420
gtcgttggca ccgccctgat caagaaatac cctaaactgg agtctgagtt cgtgtacggt 6480
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atcgtgtggg ataaaggcag ggacttcgca actgtgcgga aggtgctgtc catgccacaa 6720
gtcaatatcg tgaagaagac cgaagtgcag accggcggat tctcaaagga gagcatcctg 6780
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ggcggtttcg attcccctac agtggcttat tccgttctgg tcgtggcaaa agtggagaaa 6900
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cggatgctgg cctccgccgg agagctgcag aaaggaaacg agctggctct gccctccaaa 7140
tacgtgaact tcctgtatct ggcctcccac tacgagaaac tcaaaggtag ccctgaagac 7200
aatgagcaga agcaactctt tgttgagcaa cataaacact acctggacga aatcattgaa 7260
cagattagcg agttcagcaa gcgggttatt ctggccgatg caaacctcga taaagtgctg 7320
agcgcatata ataagcacag ggacaagcca attcgcgaac aagcagagaa tattatccac 7380
ctctttactc tgactaatct gggcgctcct gctgccttca agtatttcga tacaactatt 7440
gacaggaagc ggtacacctc taccaaagaa gttctcgatg ccaccctgat acaccagtca 7500
attaccggac tgtacgagac tcgcatcgac ctgtctcagc tcggcggcga cggttctccc 7560
aagaagaaga ggaaagtctc gaccggtgga gctgcaggaa tggtgagcaa gggcgaggag 7620
ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag 7680
ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc 7740
atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac 7800
ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc 7860
gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga cggcaactac 7920
aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag 7980
ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta caactacaac 8040
agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag 8100
atccgccaca aca 8113
<210> 77
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 77
ggtaccgatt agtgaacgga tctcgacggt atcgatcacg agactagcct cgagcggccg 60
cccccttcac cgagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg 120
ctgttagaga gataattgga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata 180
cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa 240
tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct 300
tgtggaaagg acgaaacacc gtgagaccga gagagggtct cagttttaga gctagaaata 360
gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca acttgaaaaa gtggcaccga gtcggtgctt 420
tttttaaaga gggcctattt cccatgattc cttcatattt gcatatacga tacaaggctg 480
ttagagagat aattggaatt aatttgactg taaacacaaa gatattagta caaaatacgt 540
gacgtagaaa gtaataattt cttgggtagt ttgcagtttt aaaattatgt tttaaaatgg 600
actatcatat gcttaccgta acttgaaagt atttcgattt cttggcttta tatatcttgt 660
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agcagagatc cactttggcc gcggctcgag ggggttgggg ttgcgccttt tccaaggcag 1020
ccctgggttt gcgcagggac gcggctgctc tgggcgtggt tccgggaaac gcagcggcgc 1080
cgaccctggg actcgcacat tcttcacgtc cgttcgcagc gtcacccgga tcttcgccgc 1140
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cggctgctca gcagggcgcg ccgagagcag cggccgggaa ggggcggtgc gggaggcggg 1380
gtgtggggcg gtagtgtggg ccctgttcct gcccgcgcgg tgttccgcat tctgcaagcc 1440
tccggagcgc acgtcggcag tcggctccct cgttgaccga atcaccgacc tctctcccca 1500
gggggatcca ccggagctta ccatgaccga gtacaagccc acggtgcgcc tcgccacccg 1560
cgacgacgtc cccagggccg tacgcaccct cgccgccgcg ttcgccgact accccgccac 1620
gcgccacacc gtcgatccgg accgccacat cgagcgggtc accgagctgc aagaactctt 1680
cctcacgcgc gtcgggctcg acatcggcaa ggtgtgggtc gcggacgacg gcgccgcggt 1740
ggcggtctgg accacgccgg agagcgtcga agcgggggcg gtgttcgccg agatcggccc 1800
gcgcatggcc gagttgagcg gttcccggct ggccgcgcag caacagatgg aaggcctcct 1860
ggcgccgcac cggcccaagg agcccgcgtg gttcctggcc accgtcggcg tctcgcccga 1920
ccaccagggc aagggtctgg gcagcgccgt cgtgctcccc ggagtggagg cggccgagcg 1980
cgccggggtg cccgccttcc tggaaacctc cgcgccccgc aacctcccct tctacgagcg 2040
gctcggcttc accgtcaccg ccgacgtcga ggtgcccgaa ggaccgcgca cctggtgcat 2100
gacccgcaag cccggtgcct gacgcccgcc ccacgacccg cagcgcccga ccgaaaggag 2160
cgcacgaccc catgcatcgg tacctttaag accaatgact tacaaggcag ctgtagatct 2220
tagccacttt ctagagtcgg ggcggccggc cgcttcgagc agacatgata agatacattg 2280
atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt tgtgaaattt 2340
gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt aacaacaaca 2400
attgcattca ttttatgttt caggttcagg gggaggtgtg ggaggttttt taaagcaagt 2460
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ttcaacccag tcagctcctt ccggtgggcg cggggcatga ctatcgtcgc cgcacttttt 2580
atcatgcaac tcgtaggaca ggtgccggca gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc 2640
gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg 2700
gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa 2760
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ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct 2940
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ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc 3060
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tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac 3240
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ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat 3360
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tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt 3480
cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta 3540
aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct 3600
atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg 3660
cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgggac ccacgctcac cggctccaga 3720
tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt 3780
atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt 3840
taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt 3900
tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat 3960
gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc 4020
cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc 4080
cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat 4140
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gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca 4860
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gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa 4980
caaaatatta acgtttacaa tttcccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg 5040
gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg ccagcccaag ctaccatgat aagtaagtaa 5100
tattaaggta cgggaggtac ttggagcggc cgcaataaaa tatctttatt ttcattacat 5160
ctgtgtgttg gttttttgtg tgaatcgata gtactaacat acgctctcca tcaaaacaaa 5220
acgaaacaaa acaaactagc aaaataggct gtccccagtg caagtgcagg tgccagaaca 5280
tttctctatc gata 5294
Claims (7)
1.一种用于靶向敲除人NKG2A/KLRC1基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-56中的任一种所示。
2.一种用于靶向敲除人NKG2A/KLRC1基因的表达载体，其特征在于，所述表达载体表达权利要求1所述的sgRNA。
3.一种用于靶向敲除人NKG2A/KLRC1基因的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统包括权利要求1所述的sgRNA和Cas9蛋白。
4.一种用于靶向敲除人NKG2A/KLRC1基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括表达Cas9蛋白和权利要求1所述的sgRNA的载体。
5.一种用于靶向敲除人NKG2A/KLRC1基因的sgRNA组合物，其特征在于，所述组合物包括至少两种权利要求1所述的sgRNA。
6.权利要求1所述的sgRNA在制备用于治疗肿瘤疾病的免疫细胞药物中的用途。
7.权利要求5所述的sgRNA组合物在制备用于治疗肿瘤疾病的免疫细胞药物中的用途。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20190802 |