CN114774469B - 一种adcc功能增强的nk细胞的制作方法、nk细胞及其组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞技术领域，具体涉及一种ADCC功能增强的NK细胞的制作方法、NK细胞及其组合物。通过至少一种质粒载体将编码后的CD16基因序列导入iPSC并最终分化为NK细胞，所获得的NK细胞具有增强的细胞表型及ADCC效果。

Description

一种ADCC功能增强的NK细胞的制作方法、NK细胞及其组合物

技术领域

本发明属于细胞技术领域，具体涉及到一种ADCC功能增强的NK细胞的制作方法、NK细胞及其组合物。

背景技术

NK细胞是一种具有肿瘤细胞杀伤能力的天然免疫细胞类型，在肿瘤免疫细胞治疗领域有着重要的应用。按照来源分类，目前肿瘤免疫细胞治疗领域使用的NK细胞绝大多数是通过在捐献者或者患者身上提取外周血细胞（PBMC），然后通过体外分离、改造、扩增，获得最后的NK 细胞产品。但是在工业界，药企和生物制药公司必须要考虑到产品的生产成本和原材料来源。外周血来源于患者或者捐献者，而NK细胞在外周血中的占比只有5-10%，这很大程度上限制了稳定的供应来源。并且通过PBMC获取的NK细胞其标志物表达及杀伤效果都不是很理想。因此我们引进iPSC细胞，iPSC可以在体外无限增殖并分化为功能性NK细胞，因此iPSC技术为获得大批量质量稳定的免疫细胞提供了有潜力的解决方案。

在实际应用方面，iPSC细胞的获得方法相对简单和稳定，不需要使用卵细胞或者胚胎，这在技术上和伦理上都比其他方法更有优势。iPSC来源的NK细胞的建立进一步拉近了干细胞和临床疾病治疗的距离。

但是存在一个现实问题，即未经基因修饰的iPSC细胞分化为NK细胞，它们在其细胞表面的CD16表达偏低，无法通过抗体依赖性细胞毒性效应即ADCC 机制裂解靶细胞。

发明内容

本申请提供一种CD16高表达、ADCC功能增强的NK细胞的制作方法、NK细胞及其组合物，本方案的优点在于：基于两种质粒系统均可实现将编码后的CD16基因导入到iPSC细胞基因组中。并成功分化为NK细胞，获得CD16-NK细胞系，实现CD16表达稳定，ADCC功能增强，NK细胞纯度高等优点。具体详细说明如下：

为实现上述技术目的，本申请采取的技术方案为：一种ADCC功能增强的NK细胞的制作方法，包括如下步骤：

步骤一：通过电转将表达CD16的质粒导入到iPSC中，得到CD16高表达的iPSC细胞株；

步骤二：将上述步骤中得到的CD16高表达的iPSC细胞株分化为NK细胞；

其中，步骤一中能够表达CD16的质粒至少有一种。

进一步改进在于，表达CD16的质粒可以是基于转座子插入系统的Piggybac质粒或是基于同源重组的模板质粒。

进一步改进在于，表达的CD16 为具有抗体Fc 段高亲和力且不可切割的突变体。

进一步改进在于，CD16基因序列的突变位点为F158V和位点S197P。

进一步改进在于，CD16基因序列为SEQ ID NO:1。

进一步改进在于，表达CD16的基于转座子插入系统的Piggybac质粒需要与PBase质粒共转染，最终获得CD16-PiggyBac质粒。

进一步改进在于，PiggyBac质粒的构建方式为编码CD16的序列前为Ef1a启动子，编码CD16的序列后为PuroR抗性筛选标记；其中，Ef1a启动子序列为SEQ ID NO:2，抗性筛选标记的序列为SEQ ID NO:3。

进一步改进在于，表达CD16的基于转座子插入系统的PiggyBac质粒，将其命名为CD16-PiggyBac质粒，序列为SEQ ID NO:4。

进一步改进在于，其中表达CD16的基于同源重组的模板质粒需要与靶向AAVS1位点的CRISPR-sgRNA质粒共转染；表达CD16的基于同源重组的模板质粒，将其命名为AAVS1-CD16- Puc57质粒。

进一步改进在于，其中， 靶向AAVS1的sgRNA序列为：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。

进一步改进在于，其中表达CD16的基于同源重组的模板质粒的构建方式为编码CD16的序列前为Ef1a启动子，编码CD16的序列后为PuroR抗性筛选标记，Ef1a启动子之前为AAVS1左侧同源臂序列，PuroR抗性筛选标记之后为AAVS1右侧同源臂序列；其中，Ef1a启动子序列为SEQ ID NO:2，抗性筛选标记序列为SEQ ID NO:3；左、右同源臂序列可设置为两组，组1中的左侧同源臂长度为400bp，右侧同源臂长度为600bp，左侧同源臂序列为SEQ IDNO:11，右侧同源臂序列为SEQ ID NO:12，；组2中的左侧同源臂长度为500bp，右侧同源臂长度为500bp，左侧同源臂序列为SEQ ID NO:14，右侧同源臂序列为SEQ ID NO:15。

进一步改进在于，所述表达CD16的基于同源重组的模板质粒，即AAVS1-CD16-Puc57质粒的序列为SEQ ID NO:13。

进一步改进在于，所述CD16高表达的iPSC细胞株通过抗生素筛选和一次的克隆挑选即可获得，所得的iPSC细胞株中CD16的表达不低于85%。其中，抗生素优选为嘌呤霉素，即puromycin。

本发明还公开一种ADCC功能增强的NK细胞，通过上述步骤获得的NK细胞，其CD16的表达不低于80%。

本发明还公开一种组合物，包括ADCC功能增强的NK细胞，所述ADCC功能增强的NK细胞是通过上述方法制作获得。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

（1）本发明可将编码CD16的基因序列通过PiggyBac质粒系统或同源重组的模板质粒成功导入到iPSC基因组中；通过电转的方式成功获得CD16-iPSC稳定表达的细胞株。

（2）稳定表达的iPSC细胞株能够成功分化为NK细胞，其获得的NK细胞的CD16+表达大于等于80%，且表达稳定；采用本方法的基因修饰及分化，成功构建了CD16-NK细胞系。

（3）基于进一步验证，本方案获得的NK细胞的ADCC杀伤率可达60%以上，是未经基因修饰后分化获得的NK细胞ADCC杀伤率的2.8倍左右；可证实通过本方案最终获得的 NK细胞的ADCC功能增强，提高了NK细胞的自然杀伤效果。能够用于制备预防或治疗免疫缺陷、以及治疗肿瘤的药物。

（4）将表达CD16的两种质粒导入到iPSC中后仅通过一次单克隆的挑取即可得到CD16+高表达的CD16-iPSC的细胞株；步骤简单，效果明确。

（5）通过本方案获得的NK细胞，其CD56+表达高，说明本方案获得的NK细胞的纯度较高。

附图说明

图1为CD16-PiggyBac质粒图谱；

图2为靶向AAVS1位点的CD16同源重组模板质粒（AAVS1-CD16-Puc57质粒）图谱；

图3为基于PiggyBac质粒将CD16导入iPSC获得的iPSC细胞株1中CD16流式检测图；

图4为基于PiggyBac 质粒将CD16导入iPSC获得的iPSC细胞株2中CD16流式检测图；

图5为基于PiggyBac 质粒将CD16导入iPSC获得的iPSC细胞株3中CD16流式检测图；

图6为基于同源重组的模板质粒将CD16导入iPSC获得的iPSC细胞株4中CD16流式检测图；

图7为基于同源重组的模板质粒将CD16导入iPSC获得的iPSC细胞株5中CD16流式检测图；

图8为基于同源重组的模板质粒将CD16导入iPSC获得的iPSC细胞株6中CD16流式检测图；

图9为基于PiggyBac 质粒基因修饰后的iPSC细胞株1分化获得NK细胞的CD16流式检测图；

图10为基于PiggyBac 质粒基因修饰后的iPSC细胞株2分化获得NK细胞的CD16流式检测图；

图11为基于PiggyBac 质粒基因修饰后的iPSC细胞株3分化获得NK细胞的CD16流式检测图；

图12为基于同源重组的模板质粒基因修饰后的iPSC细胞株4分化获得的NK细胞CD16流式检测图；

图13为基于同源重组的模板质粒基因修饰后的iPSC细胞株5分化获得的NK细胞CD16流式检测图；

图14为基于同源重组的模板质粒基因修饰后的iPSC细胞株6分化获得的NK细胞CD16流式检测图；

图15为无基因修饰的iPSC，即对照1，分化NK细胞的CD16流式检测图；

图16为无基因修饰的iPSC，即对照2，分化NK细胞的CD16流式检测图；

图17为基于PiggyBac质粒基因修饰后获得的iPSC最终分化为NK细胞的ADCC杀伤效果图；

图18为基于同源重组的模板质粒基因修饰后获得的iPSC最终分化为NK细胞的ADCC杀伤效果图；

图19为未经基因修饰的iPSC分化为NK细胞的ADCC杀伤效果图；

图20为PBMC中来源的NK细胞的ADCC杀伤效果图；

图21为野生型CD16基于PiggyBac 质粒基因修饰后的iPSC最终分化获得NK细胞的CD16流式检测图；

图22为野生型CD16基于同源重组的模板质粒基因修饰后的iPSC最终分化获得NK细胞的CD16流式检测图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

定义

PBMC：外周血单个核细胞。

APC CD16抗体：APC anti-human CD16 Antibody。

1% FBS的1640培养基：RPMI1640+1%FBS。

10% FBS的1640培养基：RPMI1640+10%FBS。

PBase 质粒：pCMV-hyPBase，是现有的转座酶。

Fc受体：是指通过结合到称为Fc区的抗体的一部分而有助于免疫细胞的保护功能的某些细胞(例如天然杀伤细胞)的表面上发现的蛋白质。抗体的Fc区与细胞的Fc受体(FcR)的结合通过抗体介导的吞噬作用或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)刺激细胞的吞噬或细胞毒性活性。

F158V：CD16的基因序列上的158F变为158V；即第158位由苯丙氨酸（F）变成了缬氨酸（V）。

S197P：CD16的基因序列上的197S变为197P；即第197位由丝氨酸（S）变成了脯氨酸（P）。

AAVS1：iPSC基因组中的基因位点。

CD16-NK细胞：经本方法基因修饰后的iPSC细胞株分化为NK细胞。

野生型CD16：现有技术，未通过基因突变。

本文中除了提到的野生型CD16，其余单独提到的CD16是本方案中提到的F158V与S197P突变后的基因序列。

转基因表达

本发明中涉及到的基因编辑的流程包括如下环节：基因选择，设计序列，PiggyBac质粒，同源重组的模板质粒的构建，PiggyBac质粒和同源重组模板载体向细胞内的导入及细胞分化。可以通过本领域技术人员已知的任何机制将目的基因（例如CD16）工程化到表达质粒中。

可以使用本领域已知的任何瞬时转染方法将转基因引入iPSC细胞，包括例如电转染、脂质转染、核转染、或是“基因枪”，本方案中优选使用电转法。

可以使用任何数量的载体表达CD16。在一些实施方式中，可以使用的质粒载体包括PiggyBac转座子插入系统质粒、同源重组的模板质粒。

在一些实施例中，Fc受体是CD16，将CD16的基因序列突变位点为F158V和位点S197P，最终获得CD16的序列参考SEQ ID NO:1。表达CD16的质粒可以基于PiggyBac转座子插入系统的质粒或是同源重组CRISPR的模板质粒。其中，表达CD16同源重组模板载体的选择：是选择获取自Addgene的Puc57载体作为骨架。最终获得CD16-PiggyBac质粒与AAVS1-CD16-Puc57质粒。

PiggyBac质粒的构建方式为编码CD16的序列前为Ef1a启动子，编码CD16的序列后为PuroR抗性筛选标记；其中，Ef1a启动子序列为SEQ ID NO:2，抗性筛选标记的序列为SEQID NO:3，获得的CD16-PiggyBac质粒序列为SEQ ID NO:4。

其中表达CD16的基于同源重组的模板质粒需要与靶向AAVS1位点的CRISPR-sgRNA质粒共转染；可以将表达CD16的基于同源重组的模板质粒，将其命名为AAVS1-CD16-Puc57质粒，其质粒图谱为附图2，序列为：SEQ ID NO:13。

具体如下：靶向AAVS1的sgRNA序列为：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。其中表达CD16的基于同源重组的模板质粒的构建方式为编码CD16的序列前为Ef1a启动子，编码CD16的序列后为PuroR抗性筛选标记，Ef1a启动子之前为AAVS1左侧同源臂序列，PuroR抗性筛选标记之后为AAVS1右侧同源臂序列；其中，Ef1a启动子序列如SEQ ID NO:2（与PiggyBac质粒中用到的Ef1a启动子序列相同），抗性筛选标记序列为SEQ ID NO:3 （与PiggyBac质粒中用到的抗性筛选标记序列相同）；其中，左、右同源臂序列设置为两组，组1中左侧同源臂长度为400bp，右侧同源臂长度为600bp，左侧同源臂序列为SEQ ID NO:11，右侧同源臂序列为SEQ ID NO:12，组2中左侧同源臂长度为500bp，右侧同源臂长度为500bp，左侧同源臂序列为SEQ ID NO:14，右侧同源臂序列为SEQ ID NO:15。

电转染后进行单克隆挑选，并进行阳性克隆验证，通过流式细胞术检测CD16-iPSC细胞株中CD16+表达。经过基因修饰后的iPSC呈现CD16高水平表达，平均表达在93%±0.46，最低表达为86.29%，最高可达到98.88%。

通过流式细胞术检测NK细胞的CD16+表达。通过对比经本方法基因修饰后的iPSC细胞株分化为NK细胞（CD16-NK细胞）和未经过修饰的iPSC细胞分化获得的NK细胞流式细胞分析显示：与未修饰的iPSC细胞分化的NK细胞相比，经基因修饰后获得的CD16-NK细胞呈现高的多的CD16表达，平均水平达到85%以上，最高表达95.20%。而未经过修饰的iPSC细胞分化获得的NK细胞的CD16+流式检测仅为43.59%与30.13%。

通过流式细胞术检测ADCC的杀伤率。经本方法基因修饰后获得的CD16-NK细胞与未经过修饰的iPSC细胞分化获得的NK细胞、及PBMC来源的NK细胞三者通过流式细胞术数据分析显示：与未经修饰的获得的NK细胞、PBMC中来源的NK细胞相比，通过本案中的基因修饰方法获得的CD16-NK细胞呈现较高的ADCC杀伤率。与PBMC中来源的NK细胞相比，CD16-NK细胞的ADCC杀伤率是它的1.9倍左右；与未修饰的NK细胞相比，CD16-NK细胞的ADCC杀伤率是它的2.8倍左右。

通过流式细胞术检测CD16-NK细胞与未经过修饰的iPSC分化获得的NK细胞的NKG2D+表达，通过本案中的基因修饰方法获得的CD16-NK细胞高表达NKG2D受体，其中最高可达97.04% ，而未经修饰的iPSC分化获得的NK细胞的NKG2D+表达仅为59.07%，可达到它的1.7倍左右。进而说明通过本方案产生NK细胞高表达NKG2D受体，具有更强的细胞因子分泌能力和肿瘤杀伤能力。

总之，这些结果表明，将编码CD16的序列引入至iPSC基因组能够高表达、且稳定表达形成CD16-iPSC细胞株，建模成功；并且通过仅一次的单克隆挑选可获取CD16高表达iPSC细胞株。并经基因修饰后最终获得的NK细胞CD16表达水平较高，同时也增强了NK细胞的ADCC功能。也需要强调的是，分化的NK细胞有高表达的CD56与NKG2D受体，说明分化的NK细胞纯度高且具有更强的细胞因子分泌能力和肿瘤杀伤能力。

也需要说明的是，经基因改造过的iPSC能够继续维持其多能性，以及向其它免疫细胞分化的潜能。

电转及分化

通过电转将CD16导入iPSC，培养基为Stemflex，每天更换培养基，培养6-8天左右，挑克隆并接种于24孔板中，每孔加入300-500ul的Stemflex，继续培养6-8天左右，在培养过程中添加终浓度为0.3-1.5 ug/ml的puromycin，进行阳性克隆验证。

将iPSC细胞株分化为NK细胞，包括如下步骤，步骤一：采用人诱导多能干细胞分化形成具有KDR+CD73+表达的内皮祖细胞；步骤二：将具有KDR+CD73+表达的内皮祖细胞经内皮-血液转化，形成具有CD34-CD45+表达的NK祖细胞；步骤三：将具有CD34-CD45+表达的NK祖细胞进一步分化为具有CD56+CD3-表达的NK细胞。

步骤一用到的分化培养基I， 所述分化培养基I包括细胞因子组合A与细胞因子组合B；所述细胞因子组合A为VEGF，bFGF，Activin-A中的至少两种的组合；所述细胞因子组合B为BMP-4，SCF，IL-3，IL-6，TPO，FLT3L中的至少一种或多种的组合；

分化培养基I的用量VEGF 1-100ng/ml，bFGF 0.25-50ng/ml，Activin-A 0.1-20ng/ml，BMP-4 0.3-60ng/ml，SCF 1-200ng/ml，IL-3 0.1-20ng/ml，IL-6 0.1-20ng/ml，TPO 0.1-100ng/ml，FLT3L 0.1-30ng/ml。

所述培养基分化培养基 I 还含有基础培养基I；所述基础培养基I为AIM-V，X-Vivo-10，X-Vivo-15，Optimizer，PRIME-XV，KBM581中的一种或多种按照任意比例的混合。

步骤二用到的分化培养基II，所述分化培养基II包括细胞因子组合C与细胞因子组合D；所述细胞因子组合C包含SCF、TPO、FLT3L、IL3或IL6中的一种或多种的组合；所述细胞因子组合D包含IL7、IL15、IL12、IL18、IL21中的一种或多种的组合；

分化培养基II的用量为SCF 1-200ng/ml，TPO 1-100ng/ml，FLT3L 1-200ng/ml，IL3 1-200ng/ml，IL6 1-100ng/ml，IL7 1-100ng/ml，IL15 1-100ng/ml，IL12 1-100ng/ml，IL18 1-100ng/ml，IL21 1-100ng/ml。

所述分化培养基II还包括基础培养基II；所述基础培养基II为AIM-V，X-Vivo-10，X-Vivo-15，Optimizer，PRIME-XV和KBM581中的一种或多种按照不同比例的混合。

步骤三用到的分化培养基III，所述分化培养基III包括SCF，TPO，FLT3L，IL3，IL6，IL7，IL11，IL12，IL18，IL15，IL21中的一种或多种的组合；

所述分化培养基III中的用量SCF 1-200ng/ml，TPO 1-100ng/ml，FLT3L 1-200ng/ml，IL3 1-200ng/ml，IL6 1-100ng/ml，IL7 1-100ng/ml，IL11 1-100ng/ml，IL12 1-100ng/ml，IL18 1-100ng/ml，IL15 1-100ng/ml，IL21 1-100ng/ml。

所述分化培养基III的成份还包括基础培养基III；所述基础培养基III包括AIM-V，X-Vivo-10，X-Vivo-15，Optimizer，PRIME-XV和KBM581中的一种或多种按照任意质量比例的混合。

本文中的iPSC分化为NK细胞的具体方法，将我司已经公开的专利文本全部引入此次文本，其中引入文本的公开号为CN113801846A，名称为“一种从人诱导多能干细胞分化为自然杀伤细胞的方法”。

可知，通过本方案的基因修饰方法获取的NK细胞，其经过本方案中的基因修饰后最终获取的NK细胞的CD16 表达更稳定，核实基因修饰后最终获取的NK 细胞中CD16的表达仅导致 14%±0.08的下调。

实施例1: 目的基因与质粒构建

目的基因为CD16，突变位点是F158V和位点S197P，新获得的CD16为具有抗体Fc 段高亲和力且不可切割的突变体，CD16序列表为SEQ ID NO:1，序列如下所示，并突变位点对应的碱基序列已标出下划线：

Atgtggcagctgctcctcccaactgctctgctacttctagtttcagctggcatgcggactgaagatctcccaaaggctgtggtgttcctggagcctcaatggtacagggtgctcgagaaggacagtgtgactctgaagtgccagggagcctactcccctgaggacaattccacacagtggtttcacaatgagagcctcatctcaagccaggcctcgagctacttcattgacgctgccacagtcgacgacagtggagagtacaggtgccagacaaacctctccaccctcagtgacccggtgcagctagaagtccatatcggctggctgttgctccaggcccctcggtgggtgttcaaggaggaagaccctattcacctgaggtgtcacagctggaagaacactgctctgcataaggtcacatatttacagaatggcaaaggcaggaagtattttcatcataattctgacttctacattccaaaagccacactcaaagacagcggctcctacttctgcagggggcttgttgggagtaaaaatgtgtcttcagagactgtgaacatcaccatcactcaaggtttggcagtgccaaccatctcatcattctttccacctgggtaccaagtctctttctgcttggtgatggtactcctttttgcagtggacacaggactatatttctctgtgaagacaaacattcgaagctcaacaagagactggaaggaccataaatttaaatggagaaaggaccctcaagacaaatga

本发明分别验证了两种质粒载体将CD16导入到iPSC中，分别是基于PiggyBac 的质粒和同源重组的模板质粒。

1）CD16-PiggyBac 质粒的构建：

表达CD16的PiggyBac质粒需要与PBase 质粒共转染。PiggyBac质粒的构建方式为编码CD16的序列前为Ef1a启动子，编码CD16的序列后为PuroR抗性筛选标记；其中，Ef1a启动子序列为SEQ ID NO:2，抗性筛选标记的序列为SEQ ID NO:3，获取的CD16-PiggyBac质粒序列为SEQ ID NO:4，图谱如附图1。

2）AAVS1-CD16- Puc57质粒的构建：

AAVS1是iPSC基因组中的基因位点。

CD16同源重组模板载体的选择：选择获取自Addgene的pUC57载体作为骨架。

其中表达CD16的基于同源重组的模板质粒需要与靶向AAVS1位点的CRISPR-sgRNA质粒共转染；将表达CD16的基于同源重组的模板质粒，将其命名为AAVS1-CD16-Puc57质粒，其质粒图谱为附图2，序列为：SEQ ID NO:13。

具体如下：靶向AAVS1的sgRNA序列为：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。

其中表达CD16的基于同源重组的模板质粒的构建方式为编码CD16的序列前为Ef1a启动子，编码CD16的序列后为PuroR抗性筛选标记，Ef1a启动子之前为AAVS1左侧同源臂序列，PuroR抗性筛选标记之后为AAVS1右侧同源臂序列；其中，Ef1a启动子序列与上同为SEQ ID NO:2，抗性筛选标记序列与上同为SEQ ID NO:3，其中， 左、右同源臂序列可设置为两组；组1中左侧同源臂长度为400bp，右侧同源臂长度为600bp，左侧同源臂序列为SEQ IDNO:11，右侧同源臂序列为SEQ ID NO:12；组2中，左侧同源臂长度为500bp，右侧同源臂长度为500bp，左侧同源臂序列为SEQ ID NO:14，右侧同源臂序列为SEQ ID NO:15。见表1-1。

左、右同源臂如下：

组	L左侧同源臂长度/bp	R右侧同源臂长度/bp	序列
				1	400	600	SEQ ID NO:11与12
2	500	500	SEQ ID NO:14与15

表1-1

基于PiggyBac质粒CD16基于是随机插入至iPSC细胞基因组中；而AAVS1-CD16-Puc57质粒是定点插入至iPSC细胞的AAVS1的基因位点处，靶向AAVS1的sgRNA的插入位点是在CRISPR质粒的BbsI(245)与BbsI(267)之间。

实施例2:电转染及挑克隆

2.1.质粒的配置：CD16-PiggyBac质粒与AAVS1-CD16-Puc57质粒；分别用DEPC水将CD16-PiggyBac质粒、PBase 质粒、AAVS1-CD16-Puc57质粒浓度调整为0.5-1.5 ug/ul，本方案中优选使用1ug/ul，设计可以是0.6ug/ul、0.7ug/ul、0.8 ug/ul、0.9 ug/ul、1.0 ug/ul、1.1 ug/ul、1.2 ug/ul、1.3 ug/ul、1.4 ug/ul或任意两个数字之间的任何范围，包括端点。-20℃存储备用。

2.2.将生长至90%左右汇合率的iPSC取出放于生物安全柜中，吸弃上清，加入TrypLE，放于37℃细胞培养箱中静置孵育；消化细胞，离心并计数。

2.3. 细胞计数后，吸取1×10⁶个细胞，低速离心，取出离心管至生物安全柜中，拧开管盖，吸弃上清。其中，低速离心为转速为8000 r/min以下，相对离心力为10000×g以下的离心。

2.4. 在生物安全柜中取出洁净1.5 ml EP管，吸取100 μl 预先配制好的电转Buffer于EP管中。将上述三种质粒分别吸取1μl -3μl，加入电转缓冲液buffer中。本方案中上述三种质粒优选为2μl，其设计可以是1.1μl、1ul、1.1ul、1.2ul、1.3ul、1.4ul、1.5ul、1.6ul、1.7ul、1.8ul、1.9ul、2ul 、2.1ul、2.2ul、2.3ul、2.4ul、2.5ul、2.6ul、2.7ul、2.8ul、2.9ul，或任意两个数字之间的任何范围，包括端点。

2.5.用100 μl移液枪吹打8-10次混匀后，将全部液体吸出后加入细胞沉淀中； 将电转杯取出并放入电转仪的转染室中进行电转，电转程序为B016。电转结束后取出电转杯放进生物安全柜中。

2.6. 取出6孔板放于生物安全柜中，并在其中1孔加入2 ml Stemflex培养基,十字交叉混匀，静置培养。

2.7. 每天更换2ml Stemflex培养基，培养两天后，将细胞消化、计数，并接种5000个细胞于10cm皿中（预先铺好Matrigel，并加入10ml Stemflex培养基）；同时进行取适量细胞，染APC CD16抗体，进行流式检测， CD16阳性率是37.96%；

2.8. 培养7天左右，在层流工作台中进行单克隆的挑取，克隆挑取并接种于孔板（预先铺好Matrigel，每孔加入500ul Stemflex培养基）。继续培养7天左右，培养过程中添加试剂puromycin，终浓度为0.3-1.5ug/ml。本方案中优选为1ug/ml，进行阳性克隆的验证。puromycin的设计可以是0.4ug/ml、0.5ug/ml、0.6ug/ml、0.7ug/ml、0.8ug/ml、0.9ug/ml、1.0ug/ml、1.1ug/ml、1.2ug/ml、1.3ug/ml、1.4ug/ml，或任意两个数字之间的任何范围，包括端点。

实施例3：流式验证

基于本方案中的转座子系统质粒、同源重组的模板质粒分别将CD16电转导入iPSC基因组中获得iPSC细胞株。基于转座子系统质粒基因修饰后获得iPSC细胞株，随机挑取3株克隆进行阳性验证，分别是Clone-1, Clone-2, Clone-3，流式结果分别如附图3-5。

其次，基于同源重组的模板质粒基因修饰后获得iPSC细胞株。随机挑取3株克隆进行阳性验证，分别是Clone-4, Clone-5, Clone-6, 流式结果分别如附图6-8。

表1:通过两种质粒基因修饰获得的iPSC细胞株中CD16阳性表达

随机6株iPSC细胞株	CD16+表达	基于质粒
			Clone-1	91.81%	PiggyBac质粒
Clone-2	98.88%	PiggyBac质粒
			Clone-3	94.43%	PiggyBac质粒
Clone-4	86.29%	同源重组的模板质粒
			Clone-5	96.76%	同源重组的模板质粒
Clone-6	92.56%	同源重组的模板质粒

表1

实施例4：NK细胞分化及其验证

对将上述经过基因修饰后的iPSC、与未经过基因编辑的iPSC在连续培养三代后进行NK分化实验，具体分化操作步骤引入本公司之前申请专利。即将公开号为CN113801846A，专利名称为“一种从人诱导多能干细胞分化为自然杀伤细胞的方法”全部引入本次文本。

表2：经过本方案基因修饰后获得的iPSC细胞株分化为NK细胞（实验组）、与未经过基因修饰获得的iPSC分化为NK细胞（设对照组1和对照组2）、电转实验中，经过相同方法将野生型CD16转入到iPSC，分别基于PiggyBac质粒与同源重组的模板质粒将野生型CD16导入iPSC分化为NK细胞，（分别设为对照组3和对照组4），进行NK细胞表面标志物验证：

细胞来源	CD16+	CD56+
			基因修饰后iPSC分化的NK细胞	86.28%	97.59%
基因修饰后iPSC分化的NK细胞	88.16%	99.12%
			基因修饰后iPSC分化的NK细胞	92.48%	99.85%
基因修饰后iPSC分化的NK细胞	81.12%	98.72%
			基因修饰后iPSC分化的NK细胞	95.20%	90.12%
基因修饰后iPSC分化的NK细胞	84.50%	91.57%
			对照组1分化的NK细胞	43.59%	86.03%
对照组2分化的NK细胞	30.13%	80.28%
			对照组3分化的NK细胞	22.64%	81.30%
对照组4分化的NK细胞	32.24%	83.48%

表2

基于PiggyBac 质粒基因修饰后获得的iPSC分化为NK细胞，CD16+表达流式结果如附图9、附图10与附图11；

基于同源重组的模板质粒，即AAVS1-CD16-Puc57质粒基因修饰后获得的iPSC分化为NK细胞流式结果如图12、图13与图14。

未经过基因修饰获得的iPSC分化为NK细胞，NK细胞CD16+表达流式结果如图15和图16。

经过本方案中相应的电转及实验方法，将野生型CD16转入iPSC分化获得的NK细胞，NK细胞CD16+表达流式结果如图21和图22。

结合表2与附图10-16，图21和22可知，经过基因修饰后的iPSC细胞株分化获得的NK细胞，其CD16阳性表达均达到80%以上，最高值达到95%以上，对照组1和2的NK细胞的CD16阳性表达分别为30.13%与45.59%，对照组3和4的NK细胞的CD16阳性表达分别为22.64%与32.24%。实验组即经本方案改造后的iPSC获得的NK细胞，对照组即未经本方案改造的iPSC获得的NK细胞，实验组CD16的表达量均明显高于对照组。

通过本方案的基因修饰分化得到的NK细胞各标志物的表达较高且稳定，由此说明本实验通过电转化法转入的CD16基因在NK细胞中成功表达，这可能会增强NK细胞的ADCC功能。为了进一步确定ADCC的功能是否增强，本方案进一步进行验证。

实施例5：ADCC验证

5.1. 靶细胞悬液配置：取1M靶细胞，靶细胞为Raji，300g，5min离心，去上清；用含1% FBS的1640培养基重悬，得到1M/mL的细胞悬液；

5.2.将靶细胞按每孔50ul加至96孔板内；用10% FBS的1640培养基将抗体（anti-CD20 Rituximab单抗）稀释为 25ug/ml - 40ug/ml，本方案中优先使用30ug/ml。抗体的设计可以是26ug/ml、27ug/ml、28ug/ml、29ug/ml、30ug/ml、31ug/ml、32ug/ml、33ug/ml、34ug/ml、35ug/ml、36ug/ml、37ug/ml、38ug/ml、39ug/ml，或任意两个数字之间的任何范围，包括端点。

按照每孔50ul加入对应孔内，轻轻吹打几次混匀；放入37度培养箱中孵育30min。

5.3.效应细胞悬液配制：收集效应细胞，400g，5min离心，去上清，使用10% FBS的1640培养基重悬并计数；将效应细胞按每孔100ul加至96孔，靶细胞按每孔100ul加至与效应细胞共孵育的孔。其中，效应细胞分别为：经过本方案基因修饰后iPSC分化的NK细胞、无基因修饰的iPSC分化的NK细胞、PBMC扩增的NK细胞。

5.4. 孵育、检测，混匀转移至对应EP管。每个样品均加入终浓度为5nM的SYTOX染色液，混匀，4℃避光孵育15min，上机检测。

表3：通过本方案基因修饰iPSC获得的NK细胞、无基因修饰获得NK细胞、及其PBMC扩增来源的NK细胞的ADCC验证：

NK细胞来源	ADCC杀伤率
		基于PiggyBac质粒基因修饰后最终获得的NK细胞	60.18%
基于同源重组的模板质粒基因修饰后最终获得的NK细胞	66.80%
		无基因修饰的iPSC分化获得的NK细胞	23.86%
PBMC来源的NK细胞	34.44%

表3

通过本方案基因修饰后获得的iPSC分化为NK细胞、无基因修饰的iPSC分化为NK、以及从PBMC中来源的NK细胞，分别获得ADCC进行杀伤效果的比较，实验结果分别如图17-20。

通过表3与附图17-20可知，基于本方案基因修饰最终获得的CD16-NK细胞的ADCC杀伤能力明显优于无基因修饰iPSC分化的NK细胞和PBMC来源的NK细胞的ADCC能力。因此可以证明通过本方案基因修饰后获得的NK细胞，其抗体依赖性细胞毒性作用显著增强。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 南京艾尔普再生医学科技有限公司

<120> 一种ADCC功能增强的NK细胞的制作方法、NK细胞及其组合物

<130> 1

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 765

<212> DNA

<213> 人工序列(CD16)

<400> 1

atgtggcagc tgctcctccc aactgctctg ctacttctag tttcagctgg catgcggact 60

gaagatctcc caaaggctgt ggtgttcctg gagcctcaat ggtacagggt gctcgagaag 120

gacagtgtga ctctgaagtg ccagggagcc tactcccctg aggacaattc cacacagtgg 180

tttcacaatg agagcctcat ctcaagccag gcctcgagct acttcattga cgctgccaca 240

gtcgacgaca gtggagagta caggtgccag acaaacctct ccaccctcag tgacccggtg 300

cagctagaag tccatatcgg ctggctgttg ctccaggccc ctcggtgggt gttcaaggag 360

gaagacccta ttcacctgag gtgtcacagc tggaagaaca ctgctctgca taaggtcaca 420

tatttacaga atggcaaagg caggaagtat tttcatcata attctgactt ctacattcca 480

aaagccacac tcaaagacag cggctcctac ttctgcaggg ggcttgttgg gagtaaaaat 540

gtgtcttcag agactgtgaa catcaccatc actcaaggtt tggcagtgcc aaccatctca 600

tcattctttc cacctgggta ccaagtctct ttctgcttgg tgatggtact cctttttgca 660

gtggacacag gactatattt ctctgtgaag acaaacattc gaagctcaac aagagactgg 720

aaggaccata aatttaaatg gagaaaggac cctcaagaca aatga 765

<210> 2

<211> 1192

<212> DNA

<213> 人工序列( Ef1a启动子)

<400> 2

ctagcttcgt gaggctccgg tgcccgtcag tgggcagagc gcacatcgcc cacagtcccc 60

gagaagttgg ggggaggggt cggcaattga accggtgcct agagaaggtg gcgcggggta 120

aactgggaaa gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc ccgagggtgg gggagaaccg 180

tatataagtg cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca 240

caggtaagtg ccgtgtgtgg ttcccgcggg cctggcctct ttacgggtta tggcccttgc 300

gtgccttgaa ttacttccac ctggctccag tacgtgattc ttgatcccga gctggagcca 360

ggggcgggcc ttgcgcttta ggagcccctt cgcctcgtgc ttgagttgag gcctggcctg 420

ggcgctgggg ccgccgcgtg cgaatctggt ggcaccttcg cgcctgtctc gctgctttcg 480

ataagtctct agccatttaa aatttttgat gacctgctgc gacgcttttt ttctggcaag 540

atagtcttgt aaatgcgggc caggatctgc acactggtat ttcggttttt gggcccgcgg 600

ccggcgacgg ggcccgtgcg tcccagcgca catgttcggc gaggcggggc ctgcgagcgc 660

ggccaccgag aatcggacgg gggtagtctc aagctggccg gcctgctctg gtgcctggcc 720

tcgcgccgcc gtgtatcgcc ccgccctggg cggcaaggct ggcccggtcg gcaccagttg 780

cgtgagcgga aagatggccg cttcccggcc ctgctccagg gggctcaaaa tggaggacgc 840

ggcgctcggg agagcgggcg ggtgagtcac ccacacaaag gaaaagggcc tttccgtcct 900

cagccgtcgc ttcatgtgac tccacggagt accgggcgcc gtccaggcac ctcgattagt 960

tctggagctt ttggagtacg tcgtctttag gttgggggga ggggttttat gcgatggagt 1020

ttccccacac tgagtgggtg gagactgaag ttaggccagc ttggcacttg atgtaattct 1080

cgttggaatt tgcccttttt gagtttggat cttggttcat tctcaagcct cagacagtgg 1140

ttcaaagttt ttttcttcca tttcaggtgt cgtgaacacg tggtcgcggc ca 1192

<210> 3

<211> 600

<212> DNA

<213> 人工序列(抗性筛选标记)

<400> 3

atgaccgagt acaagcccac ggtgcgcctc gccacccgcg acgacgtccc cagggccgta 60

cgcaccctcg ccgccgcgtt cgccgactac cccgccacgc gccacaccgt cgatccggac 120

cgccacatcg agcgggtcac cgagctgcaa gaactcttcc tcacgcgcgt cgggctcgac 180

atcggcaagg tgtgggtcgc ggacgacggc gccgcggtgg cggtctggac cacgccggag 240

agcgtcgaag cgggggcggt gttcgccgag atcggcccgc gcatggccga gttgagcggt 300

tcccggctgg ccgcgcagca acagatggaa ggcctcctgg cgccgcaccg gcccaaggag 360

cccgcgtggt tcctggccac cgtcggcgtc tcgcccgacc accagggcaa gggtctgggc 420

agcgccgtcg tgctccccgg agtggaggcg gccgagcgcg ccggggtgcc cgccttcctg 480

gagacctccg cgccccgcaa cctccccttc tacgagcggc tcggcttcac cgtcaccgcc 540

gacgtcgagg tgcccgaagg accgcgcacc tggtgcatga cccgcaagcc cggtgcctga 600

<210> 4

<211> 7598

<212> DNA

<213> 人工序列(CD16-PiggyBac)

<400> 4

actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata 60

catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa 120

agtgccacct aaattgtaag cgttaatatt ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa 180

atcagctcat tttttaacca ataggccgaa atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa 240

tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca gtttggaaca agagtccact attaaagaac 300

gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa 360

ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct 420

aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa 480

gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc 540

gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg ccgctacagg gcgcgtccca ttcgccattc 600

aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg 660

gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca 720

cgacgttgta aaacgacggc cagtgagcgc gcctcgttca ttcacgtttt tgaacccgtg 780

gaggacgggc agactcgcgg tgcaaatgtg ttttacagcg tgatggagca gatgaagatg 840

ctcgacacgc tgcagaacac gcagctagat taaccctaga aagataatca tattgtgacg 900

tacgttaaag ataatcatgc gtaaaattga cgcatgtgtt ttatcggtct gtatatcgag 960

gtttatttat taatttgaat agatattaag ttttattata tttacactta catactaata 1020

ataaattcaa caaacaattt atttatgttt atttatttat taaaaaaaaa caaaaactca 1080

aaatttcttc tataaagtaa caaaactttt atgagggaca gccccccccc aaagccccca 1140

gggatgtaat tacgtccctc ccccgctagg gggcagcagc gagccgcccg gggctccgct 1200

ccggtccggc gctccccccg catccccgag ccggcagcgt gcggggacag cccgggcacg 1260

gggaaggtgg cacgggatcg ctttcctctg aacgcttctc gctgctcttt gagcctgcag 1320

acacctgggg ggatacgggg aaaaggcctc caaggcctac tagtattatg cccagtacat 1380

gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat 1440

gctagcttcg tgaggctccg gtgcccgtca gtgggcagag cgcacatcgc ccacagtccc 1500

cgagaagttg gggggagggg tcggcaattg aaccggtgcc tagagaaggt ggcgcggggt 1560

aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc 1620

gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg ccgccagaac 1680

acaggtaagt gccgtgtgtg gttcccgcgg gcctggcctc tttacgggtt atggcccttg 1740

cgtgccttga attacttcca cctggctcca gtacgtgatt cttgatcccg agctggagcc 1800

aggggcgggc cttgcgcttt aggagcccct tcgcctcgtg cttgagttga ggcctggcct 1860

gggcgctggg gccgccgcgt gcgaatctgg tggcaccttc gcgcctgtct cgctgctttc 1920

gataagtctc tagccattta aaatttttga tgacctgctg cgacgctttt tttctggcaa 1980

gatagtcttg taaatgcggg ccaggatctg cacactggta tttcggtttt tgggcccgcg 2040

gccggcgacg gggcccgtgc gtcccagcgc acatgttcgg cgaggcgggg cctgcgagcg 2100

cggccaccga gaatcggacg ggggtagtct caagctggcc ggcctgctct ggtgcctggc 2160

ctcgcgccgc cgtgtatcgc cccgccctgg gcggcaaggc tggcccggtc ggcaccagtt 2220

gcgtgagcgg aaagatggcc gcttcccggc cctgctccag ggggctcaaa atggaggacg 2280

cggcgctcgg gagagcgggc gggtgagtca cccacacaaa ggaaaagggc ctttccgtcc 2340

tcagccgtcg cttcatgtga ctccacggag taccgggcgc cgtccaggca cctcgattag 2400

ttctggagct tttggagtac gtcgtcttta ggttgggggg aggggtttta tgcgatggag 2460

tttccccaca ctgagtgggt ggagactgaa gttaggccag cttggcactt gatgtaattc 2520

tcgttggaat ttgccctttt tgagtttgga tcttggttca ttctcaagcc tcagacagtg 2580

gttcaaagtt tttttcttcc atttcaggtg tcgtgaacac gtggtcgcgg ccatctagag 2640

ccaccatgtg gcagctgctc ctcccaactg ctctgctact tctagtttca gctggcatgc 2700

ggactgaaga tctcccaaag gctgtggtgt tcctggagcc tcaatggtac agggtgctcg 2760

agaaggacag tgtgactctg aagtgccagg gagcctactc ccctgaggac aattccacac 2820

agtggtttca caatgagagc ctcatctcaa gccaggcctc gagctacttc attgacgctg 2880

ccacagtcga cgacagtgga gagtacaggt gccagacaaa cctctccacc ctcagtgacc 2940

cggtgcagct agaagtccat atcggctggc tgttgctcca ggcccctcgg tgggtgttca 3000

aggaggaaga ccctattcac ctgaggtgtc acagctggaa gaacactgct ctgcataagg 3060

tcacatattt acagaatggc aaaggcagga agtattttca tcataattct gacttctaca 3120

ttccaaaagc cacactcaaa gacagcggct cctacttctg cagggggctt gttgggagta 3180

aaaatgtgtc ttcagagact gtgaacatca ccatcactca aggtttggca gtgccaacca 3240

tctcatcatt ctttccacct gggtaccaag tctctttctg cttggtgatg gtactccttt 3300

ttgcagtgga cacaggacta tatttctctg tgaagacaaa cattcgaagc tcaacaagag 3360

actggaagga ccataaattt aaatggagaa aggaccctca agacaaagag ggcagaggaa 3420

gtcttctaac atgcggtgac gtggaggaga atcccggccc tatgaccgag tacaagccca 3480

cggtgcgcct cgccacccgc gacgacgtcc ccagggccgt acgcaccctc gccgccgcgt 3540

tcgccgacta ccccgccacg cgccacaccg tcgatccgga ccgccacatc gagcgggtca 3600

ccgagctgca agaactcttc ctcacgcgcg tcgggctcga catcggcaag gtgtgggtcg 3660

cggacgacgg cgccgcggtg gcggtctgga ccacgccgga gagcgtcgaa gcgggggcgg 3720

tgttcgccga gatcggcccg cgcatggccg agttgagcgg ttcccggctg gccgcgcagc 3780

aacagatgga aggcctcctg gcgccgcacc ggcccaagga gcccgcgtgg ttcctggcca 3840

ccgtcggcgt ctcgcccgac caccagggca agggtctggg cagcgccgtc gtgctccccg 3900

gagtggaggc ggccgagcgc gccggggtgc ccgccttcct ggagacctcc gcgccccgca 3960

acctcccctt ctacgagcgg ctcggcttca ccgtcaccgc cgacgtcgag gtgcccgaag 4020

gaccgcgcac ctggtgcatg acccgcaagc ccggtgcctg aaatcaacct ctggattaca 4080

aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc tccttttacg ctatgtggat 4140

acgctgcttt aatgcctttg tatcagttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa 4200

ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg 4260

tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg aattgactca aatgatgtca 4320

attagtctat cagaagctat ctggtctccc ttccggggga caagacatcc ctgtttaata 4380

tttaaacagc agtgttccca aactgggttc ttatatccct tgctctggtc aaccaggttg 4440

cagggtttcc tgtcctcaca ggaacgaagt ccctaaagaa acagtggcag ccaggtttag 4500

ccccggaatt gactggattc cttttttagg gcccattggt atggcttttt ccccgtatcc 4560

ccccaggtgt ctgcaggctc aaagagcagc gagaagcgtt cagaggaaag cgatcccgtg 4620

ccaccttccc cgtgcccggg ctgtccccgc acgctgccgg ctcggggatg cggggggagc 4680

gccggaccgg agcggagccc cgggcggctc gctgctgccc cctagcgggg gagggacgta 4740

attacatccc tgggggcttt gggggggggc tgtccctgat atctataaca agaaaatata 4800

tatataataa gttatcacgt aagtagaaca tgaaataaca atataattat cgtatgagtt 4860

aaatcttaaa agtcacgtaa aagataatca tgcgtcattt tgactcacgc ggtcgttata 4920

gttcaaaatc agtgacactt accgcattga caagcacgcc tcacgggagc tccaagcggc 4980

gactgagatg tcctaaatgc acagcgacgg attcgcgcta tttagaaaga gagagcaata 5040

tttcaagaat gcatgcgtca attttacgca gactatcttt ctagggttaa tctagctgca 5100

tcaggatcat atcgtcgggt cttttttccg gctcagtcat cgcccaagct ggcgctatct 5160

gggcatcggg gaggaagaag cccgtgcctt ttcccgcgag gttgaagcgg catggaaaga 5220

gtttgccgag gatgactgct gctgcattga cgttgagcga aaacgcacgt ttaccatgat 5280

gattcgggaa ggtgtggcca tgcacgcctt taacggtgaa ctgttcgttc aggccacctg 5340

ggataccagt tcgtcgcggc ttttccggac acagttccgg atggtcagcc cgaagcgcat 5400

cagcaacccg aacaataccg gcgacagccg gaactgccgt gccggtgtgc agattaatga 5460

cagcggtgcg gcgctgggat attacgtcag cgaggacggg tatcctggct ggatgccgca 5520

gaaatggaca tggatacccc gtgagttacc cggcgggcgc gcttggcgta atcatggtca 5580

tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga 5640

agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg 5700

cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc 5760

caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac 5820

tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata 5880

cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa 5940

aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct 6000

gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa 6060

agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg 6120

cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca 6180

cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa 6240

ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg 6300

gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg 6360

tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg 6420

acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc 6480

tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag 6540

attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac 6600

gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc 6660

ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag 6720

taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt 6780

ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag 6840

ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca 6900

gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact 6960

ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca 7020

gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg 7080

tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc 7140

atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg 7200

gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca 7260

tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt 7320

atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc 7380

agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc 7440

ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca 7500

tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa 7560

aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcat 7598

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(sgRNA-1)

<400> 5

agagctagca cagactagag 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(sgRNA-2)

<400> 6

ctggacaccc cgttctcctg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(sgRNA-3)

<400> 7

tgctgtcctg aagtggacat 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(sgRNA-4)

<400> 8

tgtccctagt ggccccactg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(sgRNA-5)

<400> 9

gggaacccag cgagtgaaga 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(sgRNA-6)

<400> 10

gatgatgcag gcctacaaga 20

<210> 11

<211> 400

<212> DNA

<213> 人工序列(左侧同源臂-1)

<400> 11

caccgttttt ctggacaacc ccaaagtacc ccgtctccct ggctttagcc acctctccat 60

cctcttgctt tctttgcctg gacaccccgt tctcctgtgg attcgggtca cctctcactc 120

ctttcatttg ggcagctccc ctacccccct tacctctcta gtctgtgcta gctcttccag 180

ccccctgtca tggcatcttc caggggtccg agagctcagc tagtcttctt cctccaaccc 240

gggcccctat gtccacttca ggacagcatg tttgctgcct ccagggatcc tgtgtccccg 300

agctgggacc accttatatt cccagggccg gttaatgtgg ctctggttct gggtactttt 360

atctgtcccc tccaccccac agtggggcca ctagggacag 400

<210> 12

<211> 600

<212> DNA

<213> 人工序列(右侧同源臂-1)

<400> 12

gattggtgac agaaaagccc catccttagg cctcctcctt cctagtctcc tgatattggg 60

tctaaccccc acctcctgtt aggcagattc cttatctggt gacacacccc catttcctgg 120

agccatctct ctccttgcca gaacctctaa ggtttgctta cgatggagcc agagaggatc 180

ctgggaggga gagcttggca gggggtggga gggaaggggg ggatgcgtga cctgcccggt 240

tctcagtggc caccctgcgc taccctctcc cagaacctga gctgctctga cgcggccgtc 300

tggtgcgttt cactgatcct ggtgctgcag cttccttaca cttcccaaga ggagaagcag 360

tttggaaaaa caaaatcaga ataagttggt cctgagttct aactttggct cttcaccttt 420

ctagtcccca atttatattg ttcctccgtg cgtcagtttt acctgtgaga taaggccagt 480

agccagcccc gtcctggcag ggctgtggtg aggagggggg tgtccgtgtg gaaaactccc 540

tttgtgagaa tggtgcgtcc taggtgttca ccaggtcgtg gccgcctcta ctccctttct 600

<210> 13

<211> 7396

<212> DNA

<213> 人工序列(AAVS1-CD16-Puc57)

<400> 13

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt ccattctctc ccctgggcct 420

gtgccgcttt ctgtctgcag cttgtggcct gggtcacctc tacggctggc ccagatcctt 480

ccctgccgcc tccttcaggt tccgtcttcc tccactccct cttccccttg ctctctgctg 540

tgttgctgcc caaggatgct ctttccggag cacttccttc tcggcgctgc accacgtgat 600

gtcctctgag cggatcctcc ccgtgtctgg gtcctctccg ggcatctctc ctccctcacc 660

caaccccatg ccgtcttcac tcgctgggtt cccttttcct tctccttctg gggcctgtgc 720

catctctcgt ttcttaggat ggccttctcc gacggatgtc tcccttgcgt cccgcctccc 780

cttcttgtag gcctgcatca tcaccgtttt tctggacaac cccaaagtac cccgtctccc 840

tggctttagc cacctctcca tcctcttgct ttctttgcct ggacaccccg ttctcctgtg 900

gattcgggtc acctctcact cctttcattt gggcagctcc cctacccccc ttacctctct 960

agtctgtgct agctcttcca gccccctgtc atggcatctt ccaggggtcc gagagctcag 1020

ctagtcttct tcctccaacc cgggccccta tgtccacttc aggacagcat gtttgctgcc 1080

tccagggatc ctgtgtcccc gagctgggac caccttatat tcccagggcc ggttaatgtg 1140

gctctggttc tgggtacttt tatctgtccc ctccacccca cagtggggcc actagggaca 1200

gcaagcttct gacctcttct cttcctccca cagggcctcg agagatctgg cagcggagag 1260

ggcagaggaa gtcttctaac atgcggtgac gtggaggaga atcccggccc taggctcgag 1320

atgaccgagt acaagcccac ggtgcgcctc gccacccgcg acgacgtccc cagggccgta 1380

cgcaccctcg ccgccgcgtt cgccgactac cccgccacgc gccacaccgt cgatccggac 1440

cgccacatcg agcgggtcac cgagctgcaa gaactcttcc tcacgcgcgt cgggctcgac 1500

atcggcaagg tgtgggtcgc ggacgacggc gccgcggtgg cggtctggac cacgccggag 1560

agcgtcgaag cgggggcggt gttcgccgag atcggcccgc gcatggccga gttgagcggt 1620

tcccggctgg ccgcgcagca acagatggaa ggcctcctgg cgccgcaccg gcccaaggag 1680

cccgcgtggt tcctggccac cgtcggcgtc tcgcccgacc accagggcaa gggtctgggc 1740

agcgccgtcg tgctccccgg agtggaggcg gccgagcgcg ccggggtgcc cgccttcctg 1800

gagacctccg cgccccgcaa cctccccttc tacgagcggc tcggcttcac cgtcaccgcc 1860

gacgtcgagg tgcccgaagg accgcgcacc tggtgcatga cccgcaagcc cggtgcctga 1920

ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 1980

tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 2040

tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 2100

gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggctagc ttcgtgaggc 2160

tccggtgccc gtcagtgggc agagcgcaca tcgcccacag tccccgagaa gttgggggga 2220

ggggtcggca attgaaccgg tgcctagaga aggtggcgcg gggtaaactg ggaaagtgat 2280

gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag ggtgggggag aaccgtatat aagtgcagta 2340

gtcgccgtga acgttctttt tcgcaacggg tttgccgcca gaacacaggt aagtgccgtg 2400

tgtggttccc gcgggcctgg cctctttacg ggttatggcc cttgcgtgcc ttgaattact 2460

tccacctggc tccagtacgt gattcttgat cccgagctgg agccaggggc gggccttgcg 2520

ctttaggagc cccttcgcct cgtgcttgag ttgaggcctg gcctgggcgc tggggccgcc 2580

gcgtgcgaat ctggtggcac cttcgcgcct gtctcgctgc tttcgataag tctctagcca 2640

tttaaaattt ttgatgacct gctgcgacgc tttttttctg gcaagatagt cttgtaaatg 2700

cgggccagga tctgcacact ggtatttcgg tttttgggcc cgcggccggc gacggggccc 2760

gtgcgtccca gcgcacatgt tcggcgaggc ggggcctgcg agcgcggcca ccgagaatcg 2820

gacgggggta gtctcaagct ggccggcctg ctctggtgcc tggcctcgcg ccgccgtgta 2880

tcgccccgcc ctgggcggca aggctggccc ggtcggcacc agttgcgtga gcggaaagat 2940

ggccgcttcc cggccctgct ccagggggct caaaatggag gacgcggcgc tcgggagagc 3000

gggcgggtga gtcacccaca caaaggaaaa gggcctttcc gtcctcagcc gtcgcttcat 3060

gtgactccac ggagtaccgg gcgccgtcca ggcacctcga ttagttctgg agcttttgga 3120

gtacgtcgtc tttaggttgg ggggaggggt tttatgcgat ggagtttccc cacactgagt 3180

gggtggagac tgaagttagg ccagcttggc acttgatgta attctcgttg gaatttgccc 3240

tttttgagtt tggatcttgg ttcattctca agcctcagac agtggttcaa agtttttttc 3300

ttccatttca ggtgtcgtga acacgtggtc gcggccatct agagccacca tgtggcagct 3360

gctcctccca actgctctgc tacttctagt ttcagctggc atgcggactg aagatctccc 3420

aaaggctgtg gtgttcctgg agcctcaatg gtacagggtg ctcgagaagg acagtgtgac 3480

tctgaagtgc cagggagcct actcccctga ggacaattcc acacagtggt ttcacaatga 3540

gagcctcatc tcaagccagg cctcgagcta cttcattgac gctgccacag tcgacgacag 3600

tggagagtac aggtgccaga caaacctctc caccctcagt gacccggtgc agctagaagt 3660

ccatatcggc tggctgttgc tccaggcccc tcggtgggtg ttcaaggagg aagaccctat 3720

tcacctgagg tgtcacagct ggaagaacac tgctctgcat aaggtcacat atttacagaa 3780

tggcaaaggc aggaagtatt ttcatcataa ttctgacttc tacattccaa aagccacact 3840

caaagacagc ggctcctact tctgcagggg gcttgttggg agtaaaaatg tgtcttcaga 3900

gactgtgaac atcaccatca ctcaaggttt ggcagtgcca accatctcat cattctttcc 3960

acctgggtac caagtctctt tctgcttggt gatggtactc ctttttgcag tggacacagg 4020

actatatttc tctgtgaaga caaacattcg aagctcaaca agagactgga aggaccataa 4080

atttaaatgg agaaaggacc ctcaagacaa atgataagat acattgatga gtttggacaa 4140

accacaacta gaatgcagtg aaaaaaatgc tttatttgtg aaatttgtga tgctattgct 4200

ttatttgtaa ccattataag ctgcaataaa caagttaaca acaacaattg cattcatttt 4260

atgtttcagg ttcaggggga ggtgtgggag gttttttaaa gcaagtaaaa cctctacaaa 4320

tgtggtatgg ctgattatga tccggctgcc tcgcgcgatt ggtgacagaa aagccccatc 4380

cttaggcctc ctccttccta gtctcctgat attgggtcta acccccacct cctgttaggc 4440

agattcctta tctggtgaca cacccccatt tcctggagcc atctctctcc ttgccagaac 4500

ctctaaggtt tgcttacgat ggagccagag aggatcctgg gagggagagc ttggcagggg 4560

gtgggaggga agggggggat gcgtgacctg cccggttctc agtggccacc ctgcgctacc 4620

ctctcccaga acctgagctg ctctgacgcg gccgtctggt gcgtttcact gatcctggtg 4680

ctgcagcttc cttacacttc ccaagaggag aagcagtttg gaaaaacaaa atcagaataa 4740

gttggtcctg agttctaact ttggctcttc acctttctag tccccaattt atattgttcc 4800

tccgtgcgtc agttttacct gtgagataag gccagtagcc agccccgtcc tggcagggct 4860

gtggtgagga ggggggtgtc cgtgtggaaa actccctttg tgagaatggt gcgtcctagg 4920

tgttcaccag gtcgtggccg cctctactcc ctttctcttt ctccatcctt ctttccttaa 4980

agagtcccca gtgctatctg ggacatattc ctccgcccag agcagggtcc cgcttcccta 5040

aggccctgct ctgggcttct gggtttgagt ccttggcaag cccaggagag gcgctcaggc 5100

ttccctgtcc cccttcctcg tccaccatct catgcccctg gctctcctgc cccttcaagc 5160

ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca 5220

cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa 5280

ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag 5340

ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc 5400

gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 5460

cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 5520

tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 5580

cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 5640

aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 5700

cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 5760

gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 5820

ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 5880

cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 5940

aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 6000

tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 6060

ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 6120

tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 6180

ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 6240

agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 6300

atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 6360

cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 6420

ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgaggc 6480

ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc 6540

agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct 6600

agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc 6660

gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg 6720

cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc 6780

gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat 6840

tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag 6900

tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat 6960

aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg 7020

cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca 7080

cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga 7140

aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc 7200

ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata 7260

tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 7320

ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc 7380

acgaggccct ttcgtc 7396

<210> 14

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列(左侧同源臂-2)

<400> 14

ctccttctgg ggcctgtgcc atctctcgtt tcttaggatg gccttctccg acggatgtct 60

cccttgcgtc ccgcctcccc ttcttgtagg cctgcatcat caccgttttt ctggacaacc 120

ccaaagtacc ccgtctccct ggctttagcc acctctccat cctcttgctt tctttgcctg 180

gacaccccgt tctcctgtgg attcgggtca cctctcactc ctttcatttg ggcagctccc 240

ctacccccct tacctctcta gtctgtgcta gctcttccag ccccctgtca tggcatcttc 300

caggggtccg agagctcagc tagtcttctt cctccaaccc gggcccctat gtccacttca 360

ggacagcatg tttgctgcct ccagggatcc tgtgtccccg agctgggacc accttatatt 420

cccagggccg gttaatgtgg ctctggttct gggtactttt atctgtcccc tccaccccac 480

agtggggcca ctagggacag 500

<210> 15

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列(右侧同源臂-2)

<400> 15

gattggtgac agaaaagccc catccttagg cctcctcctt cctagtctcc tgatattggg 60

tctaaccccc acctcctgtt aggcagattc cttatctggt gacacacccc catttcctgg 120

agccatctct ctccttgcca gaacctctaa ggtttgctta cgatggagcc agagaggatc 180

ctgggaggga gagcttggca gggggtggga gggaaggggg ggatgcgtga cctgcccggt 240

tctcagtggc caccctgcgc taccctctcc cagaacctga gctgctctga cgcggccgtc 300

tggtgcgttt cactgatcct ggtgctgcag cttccttaca cttcccaaga ggagaagcag 360

tttggaaaaa caaaatcaga ataagttggt cctgagttct aactttggct cttcaccttt 420

ctagtcccca atttatattg ttcctccgtg cgtcagtttt acctgtgaga taaggccagt 480

agccagcccc gtcctggcag 500

Claims (5)

1.一种ADCC功能增强的NK细胞的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：

Ⅰ、通过电转将表达CD16的质粒导入到iPSC中，得到CD16高表达的iPSC细胞株；

Ⅱ、将步骤Ⅰ中得到的CD16高表达的iPSC细胞株分化为NK细胞；

其中，能够表达CD16的质粒是基于转座子插入系统的PiggyBac质粒；

CD16的基因序列突变位点为F158V和位点S197P，突变后的碱基序列分别是gtt和cca；

表达CD16的基于转座子插入系统的Piggybac质粒需要与PBase 质粒共转染；

PiggyBac质粒的构建方式为编码CD16的序列前为Ef1a启动子，编码CD16的序列后为PuroR抗性筛选标记， Ef1a启动子序列为SEQ ID NO:2，抗性筛选标记的序列为SEQ ID NO:3；

表达CD16的基于转座子插入系统PiggyBac质粒的序列为SEQ ID NO:4；

所述CD16高表达的iPSC细胞株通过抗生素筛选和一次的克隆挑选获得。

2.如权利要求1所述的一种ADCC功能增强的NK细胞的制作方法，其特征在于，表达的CD16 为具有抗体Fc 段高亲和力且不可切割的突变体。

3.如权利要求1所述的一种ADCC功能增强的NK细胞的制作方法，其特征在于，CD16的基因序列为SEQ ID NO:1。

4.如权利要求1所述的一种ADCC功能增强的NK细胞的制作方法，其特征在于，通过所述方法最终获得NK细胞，其NK细胞的CD16表达不低于80%。

5.如权利要求1所述的一种ADCC功能增强的NK细胞的制作方法，其特征在于，通过所述方法获取一种组合物，所述组合物中包含ADCC增强型的NK细胞。

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