CN114164114B - 弓形虫核酮糖-5-磷酸异构酶TgRPI基因编辑虫株及其应用 - Google Patents

Abstract

弓形虫核酮糖‑5‑磷酸异构酶TgRPI基因编辑虫株及其应用。本发明公开了一个有潜力的疫苗和药物设计靶点和一种预防弓形虫感染的基因敲除虫株。所述疫苗和药物设计靶点为弓形虫核酮糖‑5‑磷酸异构酶TgRPI基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。所述基因敲除虫株敲除了TgRPI基因，该基因敲除虫株在体外生长速度减缓，但是可以传代培养，在动物体内具有毒力小、繁殖少等特性，能提高动物对弓形虫的免疫能力。由于TgRPI对弓形虫体内外生长有重要作用，故有成为疫苗和药物靶点的潜力，且该基因敲除虫株有成为抗弓形虫基因工程疫苗的潜力。

Description

弓形虫核酮糖-5-磷酸异构酶TgRPI基因编辑虫株及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其涉及一种预防弓形虫感染的基因缺失疫苗、制备方法及其应用。

背景技术

弓形虫是从属于顶复门的一种专性细胞内寄生原虫，能够感染包括人在内的几乎所有温血动物，入侵所有的有核细胞，是非常重要的人畜共患病原体。弓形虫感染孕妇或者孕畜可导致流产、产死胎或畸形胎等；感染艾滋病和器官移植患者等免疫力低下或受损的人群可导致急性呼吸衰竭、局限性肺炎、视网膜脉络丛炎等，严重时可以致死。尽管弓形虫病防治需求迫切，但是目前尚无理想的药物或者疫苗，因此，筛选潜在的疫苗和药物设计靶点、研制候选的弓形虫疫苗显得至关重要。

高温灭活弓形虫速殖子或提取弓形虫可溶性、分泌性天然蛋白，免疫接种动物，不能引起免疫保护或者免疫保护效果非常有限。构建重组蛋白或基于载体的亚单位疫苗，虽能在一定程度延长动物的存活时间，但是仍不能提供足够的免疫保护力，保护效果不理想。

构建良好的减毒或弱毒活疫苗被认为是预防弓形虫病最有希望的策略。当前市场上唯一的商品化弓形虫疫苗

是通过在实验室传统传代致弱获得的，其仅在绵羊中使用且存在毒力返强的风险，并不适用于我国畜牧养殖业。尽管利用遗传学的手段进行了弓形虫减毒虫株的构建，但是，目前具备潜力的弓形虫减毒候选活疫苗数量仍非常有限，仍需筛选更多潜在的疫苗设计靶点，研制更多候选的弓形虫疫苗虫株。

虫体中重要的代谢途径可以成为潜在的药物和疫苗设计靶点。磷酸戊糖途径(PPP)是葡萄糖代谢的重要途径，产生核酮糖-5-磷酸、果糖-6-磷酸(F6P)、核糖-5-磷酸(R5P)和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)等中间产物，与糖酵解、氨基酸和脂肪酸等代谢途径形成碳代谢网络。弓形虫PPP途径非氧化反应阶段核酮糖-5-磷酸异构酶(TgRPI)催化核酮糖-5-磷酸(Ru5P)生成核糖-5-磷酸(R5P)，而R5P是核苷酸代谢的重要底物。本发明聚焦TgRPI在弓形虫体外生长、体内繁殖与毒力的作用。我们利用CRISPR/Cas9遗传改造技术构建了TgRPI敲除虫株，该虫株在体外可以传代培养，但是缺失TgRPI基因减缓虫体体外生长，并显著降低体内繁殖，降低体内毒力，表明：弓形虫TgRPI是一个有潜力的疫苗和药物设计靶点。TgRPI敲除虫株具有良好免疫原性和免疫保护力，其是减毒弓形虫候选疫苗虫株，其应用对于人类健康和畜牧养殖业的健康发展均具有重要价值和意义。

发明内容

针对弓形虫病目前尚无理想的药物或者疫苗，本发明的目的在于提供一种弓形虫基因编辑虫株及其构建方法和应用。

为实现上述发明目的，本发明提供了一种弓形虫基因编辑虫株，该虫株缺失核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的弓形虫核酮糖-5-磷酸异构酶TgRPI基因，接着分析了敲除虫株的特性，并研究了敲除虫株的应用，具体内容如下：

(1)空斑实验结果表明：缺失TgRPI基因减缓虫体体外生长。

(2)荷虫量实验结果表明：缺失TgRPI基因显著降低体内繁殖。

(3)毒力试验结果表明：敲除TgRPI基因显著降低虫体对小鼠的毒力。

(4)免疫保护力试验结果表明：免疫接种TgRPI基因敲除虫株对小鼠抵抗野生型虫株感染具有良好的保护力，有成为基因工程疫苗的潜力。

本发明进一步提供了一种所述弓形虫基因编辑虫株的构建方法，该方法包括以下步骤：

(1)以商业化的pSAG1-Cas9-TgU6-ccdb-sgMIC3质粒为模板，设计TgRPI基因的打靶位点，根据打靶位点设计引物进行定点突变，将上述模板质粒中的sgMIC3替换为TgRPI基因靶点特异的gRNA，构建pSAG1-Cas9-TgU6-sgTgRPI质粒；

(2)提取弓形虫RNA并反转录成cDNA，以cDNA为模板扩增TgRPI基因；以pTub::Loxp::GO::Loxp::YFP::Ter::DHFR*质粒为模板，设计引物扩增含有Tub启动子、YFP荧光报告基因、Ter终止子、乙胺嘧啶药物筛选基因、Cre蛋白识别的Loxp特征性序列的质粒骨架；将TgRPI基因片段和质粒骨架分别回收后进行连接，转化到大肠杆菌DH5α中，经氨苄青霉素筛选获得同源重组质粒并进行扩增，得到含有TgRPI-CDS的同源重组模板；

(3)将步骤(1)构建的pSAG1-Cas9-TgU6-sgTgRPI质粒和步骤(3)扩增得到的同源重组模板共电转至出发虫株，经药物筛选、PCR鉴定获得弓形虫TgRPI基因编辑虫株。

其中，所述TgRPI基因的打靶位点序列如SEQ ID No.7所示。

其中，所述pSAG1-Cas9-TgU6-sgTgRPI质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

其中，所述Loxp特征性序列如SEQ ID No.4所示。

其中，所述同源重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

其中，所述同源重组质粒扩增的引物是：

本发明所提供的弓形虫基因编辑虫株在制备弓形虫疫苗中的应用，所述弓形虫基因编辑虫株的体外生长和体内繁殖能力下降，是一种毒力致弱株，且该虫株对动物具有良好免疫原性和免疫保护力。

更加详尽的技术方案参考具体实施方式。

序列表说明：

SEQ ID No.1：pSAG1-Cas9-TgU6-sgTgRPI质粒的核苷酸序列；

SEQ ID No.2：弓形虫核酮糖-5-磷酸异构酶TgRPI基因的核苷酸序列；

SEQ ID No.3：含有Tub启动子、YFP荧光报告基因、Ter终止子、乙胺嘧啶药物筛选基因、Cre蛋白识别的Loxp特征性序列，以及TgRPI-CDS的同源重组质粒(pUC19::Tub::Loxp::TgRPI::Loxp::YFP::Ter::DHFR*)序列；

SEQ ID No.4：Cre蛋白识别的Loxp特征性序列；

SEQ ID No.5：Dicre-TgRPI-5H-F引物序列，用于扩增同源重组模板；

SEQ ID No.6：Dicre-TgRPI-3H-R引物序列，用于扩增同源重组模板；

SEQ ID No.7：TgRPI基因的打靶位点序列。

附图说明

图1为本发明具体实施例中rpi-Dicre转基因虫株构建示意图；

图2为本发明具体实施例中rpi-Dicre单克隆虫株的PCRs鉴定；

图3为本发明具体实施例中间接免疫荧光染色检测TgRPI缺失；

图4为本发明具体实施例中Δrpi单克隆虫株的PCR鉴定；

图5为本发明具体实施例中Δrpi单克隆虫株的空斑实验；

图6为本发明具体实施例中Δrpi体内荷虫量实验；

图7为本发明具体实施例中Δrpi虫株在小鼠中的毒力试验；

图8为本发明具体实施例中免疫保护试验。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明：

实施例1基因敲除虫株的构建

1.CRISPR/Cas9质粒的构建

利用gRNA在线设计网站(http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html)对目标基因TgRPI打靶位点进行设计，根据所设计的靶点序列(GAAGAGACAAGAGAACTAAC，SEQ ID No.7)设计gRNA上下游引物(如表1)。以pSAG1-Cas9-TgU6-sgMIC3质粒为模板，按照NEB公司Q5点突变试剂盒(

Site-Directed MutagenesisKit)说明书进行操作，将上述模板质粒中sgMIC3替换为TgRPI基因靶点特异的gRNA，构建pSAG1-Cas9-TgU6-sgTgRPI质粒(序列SEQ ID NO：1所示，其中第539-558碱基为TgRPI基因的gRNA打靶序列，其余碱基为从模板质粒pSAG1-Cas9-TgU6-sgMIC3扩增出的质粒骨架序列)，具体方法如下：

表1.构建CRISPR/Cas9质粒所使用的引物

步骤一：

将上述液体混匀后，置于PCR仪中反应，反应程序如下：

反应后的产物加入1μL Dpn1，置于PCR仪中37℃消化45min。

进行步骤二：

将上述液体混匀后，25℃反应15min后转化至DH5α大肠杆菌中，并将菌种涂布在Amp⁺LB平板上，倒置于37℃培养10-12h后，挑取单克隆菌落，于6ml LB/Amp⁺液体培养基中，37℃/180rpm振荡培养8-10h，然后送生物公司进行测序确定。测序引物为通用M13反向引物，若测序结果显示原始的sgMIC3靶点序列已完全被替换成TgRPI的gRNA序列，则该质粒构建成功。

2.同源重组质粒的构建

①弓形虫RNA的提取与cDNA的制备

将纯化收集的弓形虫虫体5000r/min离心6min，弃上清，加入1mL Trizol重悬沉淀，吹打混匀10次后将样品转入2mL无RNAse的EP管中，涡旋3min，使虫体充分裂解，放置10min；

加入200μL氯仿，振荡15s，冰上静置5min，12000r/min，4℃，离心10min；

用无RNAse的枪头吸取上层水相置于新的2mL无RNAse的EP管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀后，置于-20℃沉淀1h；

12000r/min，4℃，离心10min，弃去上清，留管底白色RNA沉淀，加入1mL用DEPC水配成的75％乙醇，洗涤沉淀；

8000r/min，4℃，离心5min，弃上清，在超净台中风干，加入50μL无RNAse DEPC水，溶解RNA沉淀；

使用Nanodrop 2000紫外分光光度计测定总RNA浓度和纯度，并对所提取的总RNA质量用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定；

取1μg总RNA用于反转录，操作步骤如下：

步骤一：去除gDNA

在PCR仪中42℃反应2min，室温30min，冰上冷却。

步骤二：反转录为cDNA

在PCR仪中37℃15min，85℃5s，产物-80℃储存待用。

②PCR扩增目的片段

以上述制备的弓形虫cDNA和模板质粒pTub::Loxp::GO::Loxp::YFP::Ter::DHFR*(Tub为启动子，Loxp为Cre蛋白识别的特征性序列，GO为待替换成TgRPI的区域，YFP为荧光报告基因，Ter为终止子，DHFR*为乙胺嘧啶药物筛选基因)为模板，利用如下表2设计合成的引物分别PCR扩增相应目的片段。

表2.构建同源重组质粒所使用的引物

PCR反应体系：

PCR反应条件：

③目的片段回收

DNA电泳，将TgRPI基因CDS和质粒骨架的目的条带片段分别进行切胶，放入2mL EP管中，使用DNA回收试剂盒对目的片段回收。

④多片段连接

按照诺唯赞多片段克隆试剂盒说明书进行操作，反应体系配制如下：

每片段最适使用量＝[0.02x片段碱基对数]ng，将上述液体混匀后，PCR仪中37℃反应45min，冰浴5min后，转化至DH5α大肠杆菌中，经氨苄青霉素(Amp)筛选、PCR鉴定和DNA测序，获得正确的同源重组质粒pUC19::Tub::Loxp::TgRPI::Loxp::YFP::Ter::DHFR*(序列如SEQ ID NO：3所示，其中952-1728所示碱基为TgRPI基因的CDS区，其余碱基为从模板质粒pUC19::Tub::Loxp::GO::Loxp::YFP::Ter::DHFR*扩增出的质粒骨架序列))。

⑤同源重组片段的扩增

利用如下表3设计合成的引物，使用高保真酶KD Plus对鉴定正确的同源重组质粒进行目的片段的PCR扩增，电泳、切胶回收，测定浓度、备用。

表3.同源重组片段的扩增所使用的引物

3.TgRPI基因编辑虫株的构建及鉴定

野生型Dicre虫株是具有核酮糖-5-磷酸异构酶(TgRPI)基因的球虫目弓形虫科弓形虫属的I型虫株，所述核酮糖-5-磷酸异构酶(TgRPI)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

体外培养弓形虫Dicre速殖子，待有30％左右的虫体逸出细胞时，弃掉原培养基并加入5mL新鲜的含2％FBS的DMEM。用一次性细胞刮将细胞刮下，使用5mL注射器反复吹打悬液10-12次，用3μm无菌的滤膜过滤纯化虫体，室温3000rpm离心6min，弃上清，用5mLcytomix重选洗涤虫体，1800rpm离心6min，弃上清，最终用300μL cytomix重悬虫体沉淀；

依据同源重组原理(如图1)，取250μL上述步骤中的虫体悬液加入4mm电转杯中，再加入1500ng同源片段和7500ng CRISPR质粒，混匀，按照1550v，25μF，50Ω，4mm条件电击2次，电转后的虫体在人源成纤维HFF细胞中正常培养，设置未经电转处理的虫体作为对照组；

在含2％FBS的DMEM中正常培养24h后，对实验组和对照组进行换液，加入含有乙胺嘧啶(1μM)的培养基，药物筛选3代以上，直至空白对照的虫体全部死亡；

利用限制稀释法(1个虫体/孔)在长满HFF细胞的96孔板中进行单克隆筛选，37℃、5％CO₂条件下培养7d，将筛选获得的单克隆接种到长满HFF细胞的24孔板中扩大培养，利用PCR1、PCR2、PCR3对所有单克隆进行鉴定。鉴定正确的单克隆敲除株转接到T25细胞瓶中扩大培养，进行第二次鉴定，获得重组正确的单克隆敲除株rpi-Dicre(如图2)。

PCR1、PCR2、PCR3鉴定引物如表4所述：

表4.PCR鉴定单克隆敲除株rpi-Dicre所使用的引物

PCR1、2、3反应体系如下：

PCR1、2、3反应程序如下：

培养经PCR鉴定正确的单克隆rpi-Dicre速殖子，加入50nM雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)24h后，在倒置荧光显微镜下观察YFP荧光基因的表达情况，YFP阳性(YFP⁺)(图3)的速殖子再在长满HFF细胞的96孔板中进行单克隆筛选，37℃、5％CO₂条件下培养10d，将筛选获得的单克隆接种到长满HFF细胞的24孔板中扩大培养，利用PCR(鉴定引物如表5所述，反应体系和反应程序如上)对所有单克隆进行鉴定。鉴定正确的单克隆敲除株转接到T25细胞瓶中扩大培养，进行第二次鉴定，获得基因敲除虫株Δrpi(图4)。

表5.PCR鉴定Δrpi单克隆敲除株所使用的引物

实施例2基因敲除虫株的功能验证

(1)空斑实验

使用人源成纤维HFF细胞体外培养弓形虫rpi-Dicre、Δrpi速殖子，待有30％左右虫体逸出时，用一次性细胞刮将细胞刮下，5mL注射器反复吹打悬液8-10次，使纳虫泡破裂，虫体逸出，对新鲜溢出的弓形虫速殖子用灭菌的3μm滤膜过滤、纯化、稀释，用细胞计数板对虫体进行计数；向长满HFF细胞的6孔板中接种虫体及加入2％FBS DMEM培养基(100Tg/每孔，每组做3个平行)，接种后的6孔板在37℃、5％CO₂培养箱中培养7天，7天后首先在显微镜下观察，发现rpi-Dicre可形成明显的噬斑，Δrpi可在HFF细胞中生长，可形成纳虫泡，但未形成噬斑。然后，用PBS对6孔板洗1-2次，再用4％多聚甲醛37℃固定6孔板细胞20min，PBS洗1-2次，最后用0.1％结晶紫对细胞染色20min，经PBS洗后，6孔板置于室温晾干，空斑结果用扫描仪进行观察。结果表明：缺失TgRPI基因，没有形成可视化的噬斑，说明敲除TgRPI基因减缓弓形虫生长(图5)。

(2)小鼠体内荷虫量实验

分别向7周龄雌性ICR小鼠腹腔接种敲除虫株Δrpi或rpi-Dicre(1×10⁴个速殖子/小鼠，每组5只小鼠)；感染5d后对小鼠进行安乐死，并腹腔注射5mL生理盐水，混匀，抽取混匀液后3500r/min常温离心5min，弃去部分上清定容到2mL，重悬混匀，分别取200μL重悬液提取gDNA，基因组提取方法参照gDNA提取试剂盒操作说明进行。将2mL生理盐水注入空白小鼠，混匀后抽取，形成阴性对照液，将0、10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷个弓形虫野生型速殖子分别混匀于2mL阴性对照液，分别取200μL混匀液提取gDNA，用于制作标准曲线，最后使用实时定量PCR(qPCR)进行荷虫量检测。

荧光定量PCR(qPCR)实验：

在Hard-shell-PCR-Plates 96孔板中配制如下qPCR反应体系，引物见表6：

表6.qPCR反应所使用的引物

PCR反应程序：

Roche

480检测系统进行CT值检测，记录荧光定量PCR每个样品扩增Ct值，将样品Ct值代入标准曲线中，计算每只小鼠的腹水荷虫量，根据数据结果绘制柱状图，结果表明：缺失TgRPI显著降低弓形虫在体内的繁殖(图6)。

(3)Δrpi虫株的小鼠毒力实验

使用人源成纤维HFF细胞体外培养弓形虫Δrpi和rpi-Dicre速殖子，待有30％左右虫体逸出HFF细胞，弃掉原培养基，用PBS洗去已逸出的虫体和残留的培养基，重复清洗1次，加入5mL新鲜不含FBS的DMEM培养基；

用一次性细胞刮将细胞刮下，5mL注射器反复吹打悬液8-10次，使纳虫泡破裂，虫体逸出，用3μm无菌的滤膜过滤、纯化，对纯化的Δrpi、rpi-Dicre虫体悬液用无血清的DMEM溶液进行稀释，用细胞计数板进行计数；

按照所需要的虫体量进行稀释，通过腹腔注射，向每只ICR小鼠接种100个虫体，每组10只ICR小鼠；

每天观察并记录小鼠的精神状态、存活情况，30d后尾静脉血采血、离心、收集血清，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测感染，排除未感染小鼠，死亡率被绘制成图，并使用prism 5软件分析。结果如图7所示，接种Δrpi虫株的小鼠30天内存活率为40％，而接种野生型rpi-Dicre的小鼠在第9d全部死亡。表明：缺失TgRPI可以显著降低弓形虫毒力(图7)。

(4)TgRPI基因敲除虫株的免疫保护力实验

以100个TgRPI基因敲除虫株速殖子每只小鼠的感染量接种雌性7周龄的ICR小鼠。30天后对免疫过的小鼠及未经免疫的对照组ICR小鼠接种1×10³个野生型虫体，观察、记录小鼠死亡情况，使用prism 5软件统计分析小鼠30天内的死亡率。如图8所示，未经免疫的对照组小鼠在12天内全部死亡，经TgRPI基因敲除虫株免疫过的小鼠在30天仍没有死亡，免疫保护力为100％(图8)。结果表明：免疫接种TgRPI基因敲除虫株对小鼠抵抗野生型虫株感染具有良好的保护力，有成为基因工程疫苗的潜力。

<110> 华南农业大学

<120> 弓形虫核酮糖-5-磷酸异构酶TgRPI基因编辑虫株及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9674

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

caagtaagca gaagcacgct gtatttccgg gagggtgcga cgagacaaag tgcgcgagtt 60

gaaatcgtcg tggggacgat tgcaccgcgg ccacatgttg gagacactga ggacacacgg 120

gaaacgcgaa agatttcaaa ttaacgtacc caagcgcgaa agcttgcgca gcatacactc 180

gaagcgaaca tcccgaacca tcgagaggcg gagagcgata agtctttcac gctgcgaagt 240

gttgcgacgg ctgcgccgct gcactgtgaa ttgggcgcca atattgcatc ctaggcctga 300

cgcgcctcct gcagaacgcg agacactggg atatgtagag ccaaggggga aaccttcgaa 360

ctctcgaatg tcttctctga caagaatcat atttccatca gttctgtcag attttcaaat 420

ggcgacctgc agaggcctgc ttcctccctg tgcgctcttc gaaggggctt tctgtcgcgc 480

agggtcacct cgtccccgaa gggggtgttt gccttctggt aaatggggat gtcaagttga 540

agagacaaga gaactaacgt tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg 600

ttatcaactt gaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttg agctccagct tttgttccct 660

ttagtgaggg ttaatttcga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa 720

ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg 780

gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca 840

gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg 900

tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 960

gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 1020

ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 1080

ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 1140

acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 1200

tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 1260

ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc 1320

ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 1380

ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 1440

actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 1500

gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc 1560

tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 1620

caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 1680

atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 1740

acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 1800

ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta 1860

ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt 1920

tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag 1980

tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca 2040

gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc 2100

tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt 2160

tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag 2220

ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt 2280

tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat 2340

ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt 2400

gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc 2460

ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat 2520

cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag 2580

ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt 2640

ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg 2700

gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta 2760

ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc 2820

gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctaa attgtaagcg ttaatatttt gttaaaattc 2880

gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc 2940

ccttataaat caaaagaata gaccgagata gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag 3000

agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt ctatcagggc 3060

gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa tcaagttttt tggggtcgag gtgccgtaaa 3120

gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg aaagccggcg 3180

aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt 3240

gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc 3300

gcgtcccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct 3360

tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg 3420

ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgagcgcgc gtaatacgac 3480

tcactatagg gcgaattggg taccgggccc cccctcgagg tcgacggtat cgataagctt 3540

ttacatccgt tgccttttcc acggtccgtg atttcatgtg cgtgcagctt caaagactgg 3600

tcgttgcgac taataagact gcagtgacag gtcgaatggt gggcaccttg ctgatgacta 3660

tctactgcaa agtctgagac aacgaacgaa acttcccaca cgaggcattt gaaactgacg 3720

gtgtctaggt aatatgcact gcaagacacg gtactggggc ctcgctgaat taggggccga 3780

tctcgttgcc ctatcagtgc tcacagtgcc gcaacgtaac accagggcag gttcttgaca 3840

gtggcaacaa tgtgcgacgg gcgtgtgaac gtttcgtagt catagcgcta gcacgtacct 3900

agccacatgg tcgtgaggag ctttaccatg cgtctagaag gtggatgcgg gacacgcctt 3960

cctggccttt ggctcccgag acgcgtgttc taaccacaaa ccttgagacg cgtgttccaa 4020

ccacgcaccc tgacacgcgt gttccaacca cgcaccctga gacgcgtgtt ctaaccacgc 4080

accctgagac gcgtgttcta accacgcacc ctgagacgcg tgttctgccg cacaatgtgc 4140

acctgtagga agctgtagtc actgctgatt ctcactgttc tcggcaaggg ccgacgaccg 4200

gagtacagtt tttgtgggca gagccgttgt gcagctttcc gttcttctcg gttgtgtcac 4260

atgtgtcatt gtcgtgtaaa cacacggttg tatgtcggtt tcgctgcacc acttcattat 4320

ttcttctggt tttttgacga gtatgcatct agacaaaatg gacaagaagt acagcatcgg 4380

cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc accgacgagt acaaggtgcc 4440

cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac agcatcaaga agaacctgat 4500

cggcgccctg ctgttcgaca gcggagaaac agccgaggcc acccggctga agagaaccgc 4560

cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat ctgcaagaga tcttcagcaa 4620

cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg gaagagtcct tcctggtgga 4680

agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac atcgtggacg aggtggccta 4740

ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa ctggtggaca gcaccgacaa 4800

ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg atcaagttcc ggggccactt 4860

cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg gacaagctgt tcatccagct 4920

ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc aacgccagcg gcgtggacgc 4980

caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg ctggaaaatc tgatcgccca 5040

gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggcaacctg attgccctga gcctgggcct 5100

gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat gccaaactgc agctgagcaa 5160

ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag atcggcgacc agtacgccga 5220

cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg ctgagcgaca tcctgagagt 5280

gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg atcaagagat acgacgagca 5340

ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag cagctgcctg agaagtacaa 5400

agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc tacatcgatg gcggagccag 5460

ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa aagatggacg gcaccgagga 5520

actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag cagcggacct tcgacaacgg 5580

cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc attctgcggc ggcaggaaga 5640

tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag aagatcctga ccttccgcat 5700

cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga ttcgcctgga tgaccagaaa 5760

gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg gtggacaagg gcgccagcgc 5820

ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac ctgcccaacg agaaggtgct 5880

gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtac aacgagctga ccaaagtgaa 5940

atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc ggcgagcaga aaaaagccat 6000

cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg aagcagctga aagaggacta 6060

cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc ggcgtggaag atcggttcaa 6120

cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc aaggacaagg acttcctgga 6180

caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg accctgacac tgtttgagga 6240

cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac ctgttcgacg acaaagtgat 6300

gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg ctgagccgga agctgatcaa 6360

cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat ttcctgaagt ccgacggctt 6420

cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc ctgaccttta aagaggacat 6480

ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac gagcacattg ccaatctggc 6540

cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg aaggtggtgg acgagctcgt 6600

gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc gaaatggcca gagagaacca 6660

gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg aagcggatcg aagagggcat 6720

caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg gaaaacaccc agctgcagaa 6780

cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat atgtacgtgg accaggaact 6840

ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc gtgcctcaga gctttctgaa 6900

ggacgactcc atcgataaca aagtgctgac tcggagcgac aagaaccggg gcaagagcga 6960

caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac tactggcgcc agctgctgaa 7020

tgccaagctg attacccaga ggaagttcga caatctgacc aaggccgaga gaggcggcct 7080

gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg gtggaaaccc ggcagatcac 7140

aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact aagtacgacg agaacgacaa 7200

actgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag ctggtgtccg atttccggaa 7260

ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac caccacgccc acgacgccta 7320

cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac cctaagctgg aaagcgagtt 7380

cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg atcgccaaga gcgagcagga 7440

aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac atcatgaact ttttcaagac 7500

cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct ctgatcgaga caaacggcga 7560

aacaggcgag atcgtgtggg ataagggccg ggactttgcc accgtgcgga aagtgctgtc 7620

tatgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag acaggcggct tcagcaaaga 7680

gtctatcctg cccaagagga acagcgacaa gctgatcgcc agaaagaagg actgggaccc 7740

taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat tctgtgctgg tggtggccaa 7800

agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa gagctgctgg ggatcaccat 7860

catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt ctggaagcca agggctacaa 7920

agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac tccctgttcg agctggaaaa 7980

cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag aagggaaacg aactggccct 8040

gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac tatgagaagc tgaagggctc 8100

ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag cacaaacact acctggacga 8160

gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc ctggccgacg ctaatctgga 8220

caaggtgctg agcgcctaca acaagcacag agacaagcct atcagagagc aggccgagaa 8280

tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct gccgccttca agtactttga 8340

caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag gtgctggacg ccaccctgat 8400

ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac ctgtctcagc tgggaggcga 8460

cgcctatccc tatgacgtgc ccgattatgc cagcctgggc agcggctccc ccaagaaaaa 8520

acgcaaggtg gaagatccta agaaaaagcg gaaagtggac ggcattggta gtgggagcaa 8580

cggcagcagc ggatccgtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct 8640

ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgcgcggcg agggcgaggg 8700

cgatgccacc aacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca agctgcccgt 8760

gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc 8820

cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga 8880

gcgcaccatc tccttcaagg acgacggcac ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga 8940

gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa 9000

catcctgggg cacaagctgg agtacaactt caacagccac aacgtctata tcacggccga 9060

caagcagaag aacggcatca aggcgaactt caagatccgc cacaacgtcg aggacggcag 9120

cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct 9180

gcccgacaac cactacctga gcacccagtc caagctgagc aaagacccca acgagaagcg 9240

cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg gcatggacga 9300

gctgtacaag tagttaatta atcaccgttg tgctcacttc tcaaatcgac aaaggaaaca 9360

cacttcgtgc agcatgtgcc ccattataaa gaaactgagt tgttccgttg tggcttgcag 9420

gtgtcacatc cacaaaaacc ggccgactct aaataggagt gtttcgcagc aagcagcgaa 9480

agtttatgac tgggtccgaa tctctgaacg gatgtgtggc ggacctggct gatgttgatc 9540

gccgtcgaca cacgcgccac atgggtcaat acacaagaca gctatcagtt gttttagtcg 9600

aaccggttaa cacaattctt gcccccccga gggggatcca ctagttctag agcggccgcc 9660

accgcggtgg agct 9674

<210> 2

<211> 3278

<212> DNA

<213> 弓形虫（Toxoplasma gondii）

<400> 2

atgaatcctc aggacaaagc aaagcaagcc gtggtaagcc ttttgagcat ctgtgctctc 60

tccggaaagc aaggagttga gtcaggcaag caaaacgcat tcttggaagg cggtggccac 120

cccgccaaac tggactcgat ggagacaaca cggaagccag agggtggggg agatcatgca 180

gagaagagaa aacgaaggag agaatgccaa agcgaaatca gcagagaaaa ctcaagaaca 240

caacgtacac aaaagaatgc gacttgacgg agtgtaggcg gtatatcagc gcttgtttca 300

agatcccagg agacgaagca acgaaatttt actggctaca gcggagctaa cagagacgga 360

ataaaatgaa aaacggagaa gaaacatgcc tttctcaaag gaggggtttc agccagccag 420

gaaacatagt tccttaccaa agcgaggacg cgagaaactc cgaggcctcg ccgtctacgt 480

aatttctttg cattgcgtgt atgacaccac tctaaactat ggagagaaac acaacactgc 540

attctagaac agaactctgt ttaaatttct tgccaatgga aacctttcga ttcccacggg 600

tctcttgtct gcgcatgtgc cgttctgttc gcaaaacaag gtttttcttt gacctcactt 660

ccctggtgtc tctttctctc ccttcaagtt cccctctatc tccatttcgc ctgttcactt 720

tttctatctc ctccccgttt gccccaatcg ccgaaagagc gaaagcgaaa acacagtgcg 780

ggaaaggaca aggtcgagaa gaaatagtgt tgctactttt tcttttgctt ttcgcagggc 840

tacttcgctg tcgatactta tgtacgaagc ggcatgaagg tcggtctcgg gaccggaacg 900

acagcgaagt tcgttgtcga gagaatcggc caacgcatgc aggaagggtc tttgaaggat 960

ctgctctgcg tcccgactag cgaggccact cgcaaacagg taacctctca tttctcgtct 1020

ttttgtatcc ccattcaaac ctgcatgtgc tacaccttct cttctgtatt gcatgcgtac 1080

tttaagacaa acctgccgcg cctctggccg ccaaagttcc gagagcatgg acgcgctcct 1140

ctgagaataa cgcgtgacta gcaggcaaaa tgctacgttt tggtgactgc tcacaaccac 1200

aaatatccac ctatgtagat gtgcctgtaa aaaatgagtg cacatttatc tctgtctatc 1260

tagcgattaa tatttacacc acgtgcattt ctctatggag atctgtgtgc atctgtgctg 1320

gtacgcatcc acacatgtct acatatatat atatatatat acatatatat atgtatatat 1380

atatatatat atatgtatat atatatatgc atatatgcgt ctttatgttt tcggagattc 1440

acatgtttca gcacatgcgt gtacatatgg agatgcccgt aaacgtggat gcatctgtgc 1500

atctgcgagt agcaggcgtc agttggtttg cttgcttttc gccgcgttgc actgtcagca 1560

atctggagac ccctaggacc cgcgagtctc ccgttcccgt tctcgacgtt caacccactg 1620

cttctttgtc tactttttgt gtttttgtgt ctttcttcgt gtacatgtcg cgtgagtgtc 1680

gacgcgttaa aggcgctgtg gggacatgac caaccggact ccagcgtcgt ttctgtgttt 1740

ttaggcagag agtttgggaa ttcctctgac aactctcgac ggcattgcag actgtctcga 1800

tgtagccatc gacggagctg acgaaattct tccgccaacc cttggactcg tgaaaggacg 1860

gggtggcgcc ctgctgcgcg aaaaaatgat cgctgcagct gccaagacat tcatcgtggt 1920

agggagagcg acacagtgaa gagcgacaga gaaaaaagag aaagaggggc aaaacacaag 1980

ggacccgaga cgcgtcttcc taataacgaa aaagaaagcg tagtgcagag cacgaagatc 2040

aggatgagaa tgtgcaaaag atacaagcaa acaaaaaaaa caaacgagac agagaatcgt 2100

tgaaaggatc tcgcagcgtc acggacttcc cgtcgttttt tctgtcgttt ctcgcgtttg 2160

tcgagcctgt ctccttttgg gtcgtttcgg tcgctcatgc gcctttctgt tcgttctctc 2220

tcgcgccgat tcgtctgcat gttttttgcg gccttcagac gcctgttagt tctcttgtct 2280

cttcgcggcg ttcgtctcct tcaggctgcg gatgaaacga aactcgtctc caacggcata 2340

ggctccacgg gagctcttcc tgttgaagta gtcgtctttt ccagctccca cacaaagcgc 2400

ttgctttccg cgttgccttc ggtgaaacgc catggcggtc gggcggagtt tcgcaagaga 2460

gctggcgccg cgaccggaga aaagaacggt ggccaggaag atatcccgga agaagaccga 2520

tttgtgacag acaacggaaa ctacatcgtc gacctctact tcacagagac tgtgcccgat 2580

cttcatgaaa tggacaaaga actcaaaagc gtaagcacaa cagacgctaa ccacaacgac 2640

caacacttcc cgtctattcc gatgcggtcg cggctacctt tccactgccc ggatttagac 2700

gtacatgctt gaatttatat atttatttat atatatatat atacaaatgt agggccaagc 2760

tagagagacg agaagagagg cgaaagccta cgcagaccag gtgtatgcgg taccagtatc 2820

acaatgcttc ggttagtgcg aataggcttc cgtcatgaat tttgctccgt gtgtcatgtg 2880

cctattttct tttctcctcg ctggtcctgt tgtccgtgct aattctcttt tcgttgctga 2940

tgataaatcc tctcgtgttg gtcgcctaca cacttgaatc gattcaggtg ctcttccgag 3000

tcatttgatc ctttgcgctg acccttgcgg tggttgtctg tgtcgaaaga tcgtctggaa 3060

tgcatgcata acgcctttct ttgcgttttt acagtattcc atgtgcgtct ttcccttccg 3120

tttcacgcgc gctcatgcgt gtttccgttt atctgtctac aattcctttc cagatccctg 3180

gcgttgtcga gaccggcttt tttctcgacc tggcctccgt gtgcctgatc ggcaaggccg 3240

acggctctgt cgcaacattg actgcagagc gcaaatga 3278

<210> 3

<211> 8826

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accacgacgg ccagtcttaa gctcgggccc caaataatga ttttattttg actgatagtg 240

acctgttcgt tgcaacacat tgatgagcaa tgctttttta taatgccaac tttgtacaaa 300

aaagcaggct aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa 360

aacgacggcc agtgagcgcg cgtaatacga ctcactatag ggcgaattgg gtaccgggcc 420

ccccctcgac ggtatcgata agcttaacca caaaccttga gacgcgtgtt ccaaccacgc 480

accctgacac gcgtgttcca accacgcacc ctgagacgcg tgttctaacc acgcaccctg 540

agacgcgtgt tctaaccacg caccctgaga cgcgtgttca agcttgcctg cattgggtgc 600

ggttggtgat cctggttgga ccggtggaga tgcgcgcgca cgaaggggat gtgtcagaaa 660

cattttgttt gttctctgtg aacttttaga tgtgttaaag gcggcgaata ttagcagaga 720

gtcctccttg ttccattctc tcttgaattt cgccctttcc ttctctttgc gagtgtggta 780

gagaacaagc actcgttcgc cgtccctgac gacgcaaccc gcgcagaaga catccaccaa 840

acggtgttac acaatcacct tgtgtgaagt tcttgcggaa aactactcgt tggcattttt 900

tctataactt cgtatagcat acattatacg aagttataga attccgacaa aatgaatcct 960

caggacaaag caaagcaagc cgtgggctac ttcgctgtcg atacttatgt acgaagcggc 1020

atgaaggtcg gtctcgggac cggaacgaca gcgaagttcg ttgtcgagag aatcggccaa 1080

cgcatgcagg aagggtcttt gaaggatctg ctctgcgtcc cgactagcga ggccactcgc 1140

aaacaggcag agagtttggg aattcctctg acaactctcg acggcattgc agactgtctc 1200

gatgtagcca tcgacggagc tgacgaaatt cttccgccaa cccttggact cgtgaaagga 1260

cggggtggcg ccctgctgcg cgaaaaaatg atcgctgcag ctgccaagac attcatcgtg 1320

gctgcggatg aaacgaaact cgtctccaac ggcataggct ccacgggagc tcttcctgtt 1380

gaagtagtcg tcttttccag ctcccacaca aagcgcttgc tttccgcgtt gccttcggtg 1440

aaacgccatg gcggtcgggc ggagtttcgc aagagagctg gcgccgcgac cggagaaaag 1500

aacggtggcc aggaagatat cccggaagaa gaccgatttg tgacagacaa cggaaactac 1560

atcgtcgacc tctacttcac agagactgtg cccgatcttc atgaaatgga caaagaactc 1620

aaaagcatcc ctggcgttgt cgagaccggc ttttttctcg acctggcctc cgtgtgcctg 1680

atcggcaagg ccgacggctc tgtcgcaaca ttgactgcag agcgcaaaga ggtccacacg 1740

aaccaggacc cgctcgatta acgaggatat gcatagatct taattaataa cttcgtatag 1800

catacattat acgaagttat aaaatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg 1860

tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg 1920

agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca 1980

agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccttcgg ctacggcctg cagtgcttcg 2040

cccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct 2100

acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg 2160

tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg 2220

aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac aacgtctata 2280

tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg 2340

aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc 2400

ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gctaccagtc cgccctgagc aaagacccca 2460

acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg 2520

gcatggacga gctgtacaag taaatgcagc ccacagaagc tgcccgtctc tcgttttcct 2580

ctcttttcgg agggatcagg gagagtgcct cgggtcggag agagctgacg agggggtgcc 2640

agagacccct gtgtccttta tcgaagaaaa gggatgactc ttcatgtggc atttcacaca 2700

gtctcacctc gccttgtttt ctttttgtca atcagaacga aagcgagttg cgggtgacgc 2760

agatgtgcgt gtatccactc ggaatgcgtt atcgttctgt atgccgctag agtgctggac 2820

tgttgctgtc tgcccacgac agcagacaac tttccttcta tgcacttgca ggatggtgca 2880

gcgcaaacga cggagagaaa ggagcaccct ctcagtttcc ctacgatgtg ctgtcagttt 2940

cgactcttca ccgcgaacga ttggcgatac gtctctgttg acttgttagg ctccgaccac 3000

gaagctccct taactagata agccgcgaca cctaagtgta caccatttgc agatcgataa 3060

tctgcgaccg ctgaatccgt ccagatcagt aaaaccgcac cacctaagtg taaaccttgt 3120

ttaggtcgat aaaatgctac caacccccac ccacaatcga gccttgagcg tttctgcgca 3180

cgcgttggcc tacgtgactt gctgatgcct gcctctggcc attcatgcca gtcagtgcgc 3240

ataaaaatgt ggacacagtc ggttgacaag tgttctggca ggctacagtg acaccgcggt 3300

ggagggggat ccactagttc tagactcgag ctgcagcagg ctgtaaatcc cgtgagtcgt 3360

cctcacaaat catcaagcag gtgtcctcag ggagactgcc tgactgagtt atgctaattc 3420

ctttctactt tggcgtggtc acgggggcgc gccggatcct taattaagtc tagcatgtca 3480

ttcgattttc accccccgcg tagttcctgt gtgtcattcg ttgtcgagac aactctgtcc 3540

cgccccggtg ctgttccata tgcgtgactt tcccgcaatt ttttcagact ttcaggaaag 3600

acaggctccg gaacgatctc gtccatgact ggtaaatcca cgacaccgca atggccccca 3660

gcacctctat ctctcgtgcc aggggactaa cgttgtatgc gtctgcgtct tgtctttttg 3720

cattcgcttt ccaaaaaaga gagccatccg ttcccccgca cattcaacgc cgcgagtgcg 3780

gtttttgtct tttttgagtg gtaggacgct tttcatgcgc gaactacgtg gacattaagt 3840

tccattctct ttttcgacag cacgaaacct tgcattcaaa cccgcccgcg gaagatccga 3900

tcttgctgct gttcgcagtc ccagtagcgt cctgtcggcc gcgccgtctc tgttggtggg 3960

cagccgctac acctgttatc tgactgccgt gcgcgaaaat gacgccattt ttgggaaaat 4020

cggggaactt cattctttaa aagtatgcgg aggtttcctt tttcttctgt tcgtttcttt 4080

ttctcgggtt tgataaccgt gttcgatgta agcactttcc gtctctcctc cgtgctttgt 4140

tcgacatcga gaccaggtgt gcagatcctt cgcttgtcga tccggagacg cgtgtctcgt 4200

agaacctttt cattttacca cacggcagtg cggagcactg ctctgagtgc agcagggacg 4260

ggtgaagttt cgctttagta gtgcgtttct gctctacggg gcgttgtcgt gtctgggaag 4320

atgcagaaac cggtgtgtct ggtcgtcgcg atgaccccca agaggggcat cggcatcaac 4380

aacggcctcc cgtggcccca cttgaccaca gatttcaaac actttcgtcg tgtgacaaaa 4440

acgacgcccg aagaagccag tcgcctgaac gggtggcttc ccaggaaatt tgcaaagacg 4500

ggcgactctg gacttccctc tccatcagtc ggcaagagat tcaacgccgt tgtcatggga 4560

cggaaaaact gggaaagcat gcctcgaaag tttagacccc tcgtggacag attgaacatc 4620

gtcgtttcct cttccctcaa agaagaagac attgcggcgg agaagcctca agctgaaggc 4680

cagcagcgcg tccgagtctg tgcttcactc ccagcagctc tcagccttct ggaggaagag 4740

tacaaggatt ctgtcgacca gatttttgtc gtgggaggag cgggactgta cgaggcagcg 4800

ctgtctctgg gcgttgcctc tcacctgtac atcacgcgtg tagcccgcga gtttccgtgc 4860

gacgttttct tccctgcgtt ccccggagat gacattcttt caaacaaatc aactgctgcg 4920

caggctgcag ctcctgccga gtctgtgttc gttccctttt gtccggagct cggaagagag 4980

aaggacaatg aagcgacgta tcgacccatc ttcatttcca agaccttctc agacaacggg 5040

gtaccctacg actccgtggt tctcgagaag agaaggaaga ctgacgacgc agccactgcg 5100

gaaccgagca acgcaatgag ctccttgacg tccacgaggg agacaactcc cgtgcacggg 5160

ttgcaggctc cttcttcggc cgcagccatt gccccggtgt tggcgtggat ggacgaagaa 5220

gaccggaaaa aacgcgagca aaaggaactg attcgggccg ttccgcatgt tcactttaga 5280

ggccatgaag aattccagta ccttgatctc attgccgaca ttattaacaa tggaaggaca 5340

atggatgacc gaacgggcgt tggtgtcatc tccaaattcg gctgcactat gcgctactcg 5400

ctggatcagg cctttccact tctcaccaca aagcgtgtgt tctggaaagg ggtcctcgaa 5460

gagttgctgt ggttcattcg cggcgacacg aacgcaaacc atctttctga gaagggcgtg 5520

aagatctggg acaagaatgt gacacgcgag ttcctcgatt cgcgcaatct cccccaccga 5580

gaggtcggag acatcggccc gggctacggc ttccagtgga gacacttcgg cgcggcatac 5640

aaagacatgc acacagacta cacagggcag ggcgtcgacc agctgaagaa tgtgatccag 5700

atgctgagaa cgaatccaac agatcgtcgc atgctcatga ctgcctggaa tcctgcagcg 5760

ctggacgaaa tggcgctgcc gccttgtcac ttgttgtgcc agttctacgt gaacgaccag 5820

aaggagctgt cgtgcatcat gtatcagcgg tcgtgcgatg tcggcctcgg cgtccccttc 5880

aacatcgctt cctattcgct tttgacgctc atggttgcac acgtctgcaa cctaaaacct 5940

aaggagttca ttcacttcat ggggaacacg catgtctaca cgaaccatgt cgaggcttta 6000

aaagagcagc tgcggagaga accgagaccg ttccccattg tgaacatcct caacaaggaa 6060

cgcatcaagg aaatcgacga tttcaccgcc gaggattttg aggtcgtggg ctacgtcccg 6120

cacggacgaa tccagatgga gatggctgtc tagcggaaat acagaagctg cccgtctctc 6180

gttttcctct cttttcggag ggatcaggga gagtgcctcg ggtcggagag agctgacgag 6240

ggggtgccag agacccctgt gtcctttatc gaagaaaagg gatgactctt catgtggcat 6300

ttcacacagt ctcacctcgc cttgttttct ttttgtcaat cagaacgaaa gcgagttgcg 6360

ggtgacgcag atgtgcgtgt atccactcgt gaatgcgtta tcgttctgta tgccgctaga 6420

gtgctggact gttgctgtct gcccacgaca gcagacaact ttccttctat gcacttgcag 6480

gatgaattcc tacccagctt tcttgtacaa agtggtcgtc tctagttttt ttgacagacc 6540

gctgacggaa tcccggggat cctctagagt cgacctgcag gcatgcaagc ttggcgtaat 6600

catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac 6660

gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa 6720

ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat 6780

gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc 6840

tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg 6900

cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag 6960

gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc 7020

gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag 7080

gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga 7140

ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc 7200

atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg 7260

tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt 7320

ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca 7380

gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca 7440

ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag 7500

ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca 7560

agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg 7620

ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa 7680

aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta 7740

tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag 7800

cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga 7860

tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac 7920

cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc 7980

ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta 8040

gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac 8100

gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat 8160

gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa 8220

gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg 8280

tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag 8340

aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc 8400

cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct 8460

caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat 8520

cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg 8580

ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc 8640

aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta 8700

tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg 8760

tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct 8820

ttcgtc 8826

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 4

ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34

<210> 5

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 5

atttcccctc aatactcccg gtcggatatt tacaagaaaa aacagtcaag acggccagtc 60

ttaagctcgg 70

<210> 6

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 6

tggtgtctcc aaagtgttgt tccctgcgta aagctgtgtt ttacaatctt gattccgtca 60

gcggtctgtc a 71

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 7

gaagagacaa gagaactaac 20

Claims (3)

1.一种弓形虫基因编辑虫株，其特征在于：该虫株是在野生型Dicre虫株中敲除核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的核酮糖-5-磷酸异构酶TgRPI基因而获得的。

2.一种构建权利要求1所述弓形虫基因编辑虫株的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）以pSAG1-Cas9-TgU6-ccdb-sgMIC3质粒为模板，设计TgRPI基因的打靶位点，根据打靶位点设计引物进行定点突变，将上述模板质粒中的sgMIC3替换为TgRPI基因靶点特异的gRNA，构建pSAG1-Cas9-TgU6-sgTgRPI质粒；

（2）提取弓形虫RNA并反转录成cDNA，以cDNA为模板扩增TgRPI基因；以pTub::Loxp::GO:: Loxp::YFP::Ter::DHFR*质粒为模板，设计引物扩增含有Tub启动子、YFP荧光报告基因、Ter终止子、乙胺嘧啶药物筛选基因、Cre蛋白识别的Loxp特征性序列的质粒骨架；将TgRPI基因片段和质粒骨架分别回收后进行连接，转化到大肠杆菌DH5α中，经氨苄青霉素筛选获得同源重组质粒并进行扩增，得到含有TgRPI-CDS的同源重组模板；

（3）将步骤（1）构建的pSAG1-Cas9-TgU6-sgTgRPI质粒和步骤（3）扩增得到的同源重组模板共电转至出发虫株，经药物筛选、PCR鉴定获得弓形虫TgRPI基因编辑虫株，

所述TgRPI基因的打靶位点序列如SEQ ID No.7所示；

所述pSAG1-Cas9-TgU6-sgTgRPI质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述Loxp特征性序列如SEQ ID No.4所示；

所述同源重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述同源重组质粒的扩增引物是：

Dicre-TgRPI-5H-F：SEQ ID No.5；

Dicre-TgRPI-3H-R：SEQ ID No.6。

3.权利要求1所述的弓形虫基因编辑虫株在制备弓形虫疫苗中的应用，所述弓形虫基因编辑虫株的体外生长和体内繁殖能力下降，是一种毒力致弱株，且该虫株对动物具有良好免疫保护力。

Images