CN107805627B - 特异性示踪内皮细胞分化的hESC指示细胞系的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种特异性示踪内皮细胞分化的hESC指示细胞系的构建方法，该方法包括如下步骤：(1)构建质粒CD144N‑GFP；(2)构建质粒TALENs，所述质粒TALENs包括质粒CD144N‑L2和质粒CD144N‑R2；(3)将质粒CD144N‑GFP和质粒TALENs同时核转ESCs，经过G418筛选，挑取单克隆之后，利用跨5’同源臂引物F1/R1及跨3’同源臂引物F2/R2进行PCR初步鉴定，鉴定双侧阳性者进行Southern blot鉴定，利用Kpn I酶切，长同源臂上探针进行杂交鉴定，阳性者即为特异性示踪内皮细胞分化的hESC指示细胞系。

Description

特异性示踪内皮细胞分化的hESC指示细胞系的构建方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及特异性示踪内皮细胞分化的hESC指示细胞系的构建方法。

背景技术

人胚胎干细胞(ESCs)和诱导多能干细胞(iPSCs)为疾病建模，药物筛选和许多其他体外或体内应用提供了前所未有的优势。鉴于其独特的治疗潜力，许多研究已经制定了有效分化ESC到不同谱系细胞的方案，以避免移植未分化的ESC形成畸胎瘤。因此，建立谱系特异性报告ES/iPS细胞系对于更好地了解ES/iPS细胞的不同发育阶段，分化方案的有效优化和体内监测移植细胞存活、细胞迁移将是必不可少的。

位点特异性基因打靶是构建定点整合报告基因细胞系的有效途径。该策略依赖于目标基因组编辑和同源重组(HR)介导将外源报告基因表达框引入适当的基因组位点。这使得报告基因在内源或外源启动子的控制下永久地定点整合至基因组特定位点，而不会产生与随机整合相关联的任何不利影响。然而，ESCs中HR的低效率使得在人类ESC中的基因打靶较为困难。幸运的是，位点特异性核酸酶的出现可以帮助实现有效和特异性的基因编辑。转录激活子样效应核酸酶(TALENs)不仅可以设计和构建简单，而且具有较少的脱靶效应。因此，在本文中，我们借助TALENs来构建人类ESCs指示细胞系。

由细胞功能障碍或细胞数量减少引起的内皮细胞功能障碍导致许多疾病，如心血管疾病，肾脏疾病，血友病A等。这些疾病可以通过移植功能性内皮细胞来治疗。有许多研究使用功能性内皮细胞治疗心血管疾病和血友病A。特别是作为X连锁隐性先天性出血性疾病的血友病A被确定为基因治疗最有吸引力的候选者之一。使用经基因修正的内皮细胞是血友病A的理想治疗方法。然而，这种治疗受到人类内皮细胞来源不足和自我更新能力差的阻碍。胚胎干细胞(ESCs)因其具有自我更新能力和多谱系分化潜能可以有效解除这一限制。因此，构建可以特异性示踪内皮细胞分化的指示ESC细胞系将会发挥巨大的效用。

如上所述，目前还没有可以用来特异性示踪hESCs向内皮细胞分化的定点整合指示 ESC细胞系。如果把范围扩大的话，目前构建可以指示内皮细胞的研究倒是有不少，都是使用的随机整合策略。这种策略是一种比较粗放的方式，就是使用一个外源性克隆的内皮细胞特异性启动子加外源报告基因质粒来转染细胞，这个质粒包含了内皮细胞启动子的整个编码序列以及一个报告基因序列。整个表达框有一定几率整合到基因组中，从而表达报告基因发挥作用。其缺点有：

a.此种策略较于原位启动子处直接靶入报告基因无疑增加了质粒的大小，一般来说质粒越大，构建也越麻烦，整合效率也会降低。

而我们的策略最终整合的片段只有外源报告基因序列，减小了载体大小，技术上非常容易实现；

b.如果基因随机整合到基因组中，基因的表达可能会受到位置效应的影响，有可能表达效率低，甚至不能表达。

我们的策略是原位定点添加报告基因，就是在CD144原位启动子下游也就是起始密码子处插入报告基因编码序列，这样可以在基因原有的启动子以及调控元件下，完全指示细胞本身的实际表达情况；

c.如果质粒整合到其他内源性基因则有可能破坏内源性基因或者激活原来不表达的有害基因，从而导致不好的后果。

原位靶入报告基因策略导入的序列是精确的定点导入，不存在这种不确定性，相对安全。

d.如果随机整合或是病毒介导的混合细胞则表达不稳定，并且不利于后续实验的结果分析。

另外，目前有通过慢病毒将外源克隆的CD144启动子加EGFP序列转入hESC中构建细胞系，但是具体有以下几个缺点：

①慢病毒介导存在病毒整合、免疫原性等安全性问题；

②慢病毒感染未获得定点整合克隆，是混合细胞，不利于后续实验解释说明问题；

③因为是随机整合，所以会存在表达不稳定，或者位置效应等问题；

④外源性CD144启动子可能未包含其临近的调控元件，这会影响基因表达。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种特异性示踪内皮细胞分化的hESC指示细胞系的构建方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述特异性示踪内皮细胞分化的hESC指示细胞系的构建方法包括如下步骤：

(1)构建质粒CD144N-GFP，所述质粒CD144N-GFP的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)构建质粒TALENs，所述质粒TALENs包括质粒CD144N-L2和质粒CD144N-R2，所述质粒CD144N-L2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述质粒CD144N-R2的核苷酸序列如SEQID NO.3所示；

(3)将质粒CD144N-GFP和质粒TALENs同时核转ESCs，经过G418筛选，挑取单克隆之后，利用跨5’同源臂引物F1/R1及跨3’同源臂引物F2/R2进行PCR初步鉴定，鉴定双侧阳性者进行Southern blot鉴定，利用Kpn I酶切，长同源臂上探针进行杂交鉴定，阳性者即为特异性示踪内皮细胞分化的hESC指示细胞系；其中，所述跨5’同源臂引物 F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述跨5’同源臂引物R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5 所示，所述跨3’同源臂引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述跨3’同源臂引物R2的核苷酸序列如SEQID NO.7所示；所述长同源臂上探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.8 所示。

下面对本发明作进一步说明：

具有组织特异性报告基因的胚胎干细胞(ESC)指示细胞系有助于体外优化分化条件以及体内监测移植细胞。为了特异性优化和监测内皮细胞(EC)分化，我们在人类胚胎干细胞(H9)中使用TALENs，在内皮特异性标志基因CD144的5'UTR和外显子2的连接处靶入增强的绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因生成一个EGFP-CD144ESC指示细胞系。细胞在 EC分化过程中越来越明显地表达EGFP和CD144，而未见任何负效应。利用此种特异性示踪hESCs向内皮细胞分化的定点整合指示ESC细胞系，我们进行了内皮细胞分化方法的优化，这个指示细胞系显示出在临床前动物模型中诸如示踪基因和细胞命运等的潜力。

因此，我们打算构建可以指示内皮细胞分化的ES指示细胞系。为了在内皮细胞中实现特异性报告基因表达，我们需要选择一种内皮细胞特异性启动子。值得注意的是，编码血管内皮钙黏着蛋白(VEcad)的人基因CDH5(也称为CD144)在内皮细胞中是独特且组成型表达的。因此，CDH5是实现内皮特异性报告基因靶向的良好候选位点。

在本发明中，我们设计了一种基于TALEN的策略，以产生内皮特异性报告细胞系。即针对一个内皮特异性表达的膜蛋白标志CD144基因位点靶入目的基因，在CD144基因起始密码子处设计对应的TALENs，定点靶入编码绿色荧光蛋白的EGFP基因，从而构建一个整合EGFP基因的ES细胞系，在其定向分化为内皮细胞时，CD144原位启动子启动EGFP基因，稳定表达EGFP绿色荧光。利用我们构建的这株指示细胞系可以直接观察到内皮细胞分化的效率，实现干细胞向内皮细胞分化过程的“可视化”，方便为进行干细胞向内皮细胞分化方法优化，同时也可以在体内示踪移植细胞的存活、分布等。这个指示细胞系显示出在临床前研究中如动物模型中诸如示踪基因和细胞命运等的潜力。

至今还没有特异性示踪人ESCs定向分化为内皮细胞的定点整合ESC指示细胞系。我们使用的策略不仅能获得定点整合的ESC指示细胞系，并且对基因组的改动小，联合TALENs能获得很高的效率。我们获得的可以用来特异性示踪hESCs向内皮细胞分化的定点整合指示ESC细胞系可以稳定特异性表达报告基因，且不会影响CD144表达。此细胞系可以用来优化内皮细胞分化方法或者在体内示踪内皮细胞分布、存活等。

附图说明

图1为质粒CD144N-GFP示意图及鉴定结果；图1中：图A为质粒CD144N-GFP结构示意图；

图B为EcoR I酶切鉴定结果，可以切出1946bp、2342bp及2997bp条带；图C为CD144N-GFP各元件测序比对结果；

图2为CD144N TALEN左右臂构建完成之后测序鉴定结果；

图3为通过测序检测TALENs活性；WT示原始序列，下划线部分为TALENs识别序列，中间为间隔序列，虚线示缺失的部分，浅灰色色标识碱基为碱基突变，△为插入或缺失突变碱基数，+为碱基突变数；

图4为CD144N-GFP打靶ESCs示意图；CD144locus为CD144原位位点结构示意图，Target vector为打靶载体结构示意图，Integrated CD144为打靶之后基因定点整合示意图；

图5为CD144N-GFP打靶ESCs后同源重组鉴定图；图中：图A为跨5’同源臂引物进行PCR 鉴定结果，阳性克隆条带大小为1673bp，marker为DL 2000；图B为跨3’同源臂引物进行PCR鉴定结果，阳性克隆条带大小为1115bp，N为未进行打靶的H9，作为阴性对照， marker为DL 2000plus；图C为Southern blot鉴定定点整合结果，marker为λ-HindIII，泳道1-9为样本，N为阴性对照，阳性定点整合片段大小为7570bp，阴性片段大小为 4658bp，此基因为双拷贝，阳性者均为CD144N-GFP整合至CD144位点一个拷贝中，从而不影响正常CD144本身的表达，泳道1、2、3、5、7、9为整合至一个拷贝的阳性克隆，4、 6、8为阴性克隆，N为阴性对照(未打靶H9)；

图6为定点整合克隆测序结果图；对Southern blot鉴定为阳性的克隆进行跨5’同源臂及跨3’同源臂测序，打靶之后未见indels产生；

图7为细胞核型分析图；经历了基因打靶后的克隆的核型，均未见明显的突变发生；

图8为基因打靶之后的克隆干细胞表面标志物染色；打靶获得的克隆能够表达干细胞标志性蛋白Oct4、Nanog、SSEA-4，不能表达SSEA-1，符合干细胞的基因表达特征；

图9为打靶ESCs与OP9共培养定向内皮细胞分化第7天；左图为分化第7天细胞形态图，右图为对应的荧光显微镜下观察EGFP荧光图；

图10为免疫荧光检测CD31和EGFP的结果，DAPI染核，显示表达EGFP的细胞同时也表达 CD31

图11为打靶ESCs利用OP9分化条件培养基定向内皮细胞分化第7天；左图为分化第7天细胞形态图，右图为对应的荧光显微镜下观察EGFP荧光图；

图12为免疫荧光鉴定结果图；从左至右分别为CD31、GFP、DAPI及Merge之后的图；

图13为qRT-PCR检测CD144与GFP基因表达；左图为内皮细胞分化不同阶段CD144表达检测，右图为对应分化时间段GFP表达情况，显示从分化第7天到第11天两者的表达逐步上升，符合内皮分化特点；

图14为分化细胞流式检测；检测GFP与CD31双阳性细胞比例，为29.87％。

具体实施方式

实施例1实验过程

需用到的引物和探针如表1：

表1

(1)CD144N-GFP载体构建

①扩增5′和3′同源臂，使用H9的gDNA作为模板：

PCR体系如下：

热循环条件为：

5′同源臂使用引物为CD144N5F2+CD144N5Rovr，产物为831bp。

3′同源臂使用引物为CD144N3F+CD144N3R1，产物为568bp。

②从pEGFP-N1上扩增GFP的orf+pa，并在上下游分别加上Xba 1和Nhe 1的酶切位点，PCR体系如下：

热循环条件为：

以CD144N-GFP-ovF+CD144N-GFP-R为引物，产物大小为961bp

③Overlap PCR连接5′同源臂、GFP的orf+pa两部分

PCR体系如下：

热循环条件如下：

注意：5′同源臂PCR产物与GFP PCR产物用量根据前两步PCR产物电泳结果以1:1加入；热循环中前面10个循环只加入体系中前19μL反应物，待前10个循环进行完毕之后，再加入1.0μL引物CD144N-gfp-R进行后续20个循环反应。

④Overlap产物与3′同源臂产物进行琼脂糖电泳，根据目的片段大小进行胶回收，回收产物加入16μL ddH₂O，取2μL测OD，产物下一步加A尾。

⑤上述胶回收产物加A尾

体系如下：

⑥加A尾后酒精纯化，即加入2倍体积预冷无水乙醇-20℃30min静置， 13000rpm×4℃×10min，弃上清，加入30μL预冷的75％无水乙醇，13000rpm×4℃×5min 离心，弃上清，点离，吸干液体，超净工作台内风干，加入3μLddH₂O溶解

⑦连接

⑧转化与单克隆挑取

a.取-75℃超低温冰箱冻存的DH5α感受态细胞，加入转化的T连产物10μl (50-200ng)，用中Tip轻轻混匀；

b.静置于冰上30min，同时将循环水浴箱预热至42℃；

c.将冰浴中EP管置于42℃循环水浴中热激90s后，立即放回冰上2min；

d.于无菌操作台内加入500μL未添加抗生素的LB液体培养基；

e.37℃空气摇床180rpm摇菌45min；

f.4500rpm，离心5min，弃去部分上清，留取约100μL的菌液吹打混匀；

g.用玻璃棒将菌液均匀的涂布于含对应抗生素的固体LB培养皿上；(接种菌液前2h 在固体LB培养皿上加5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷X-gal和异丙基硫代-β-D- 半乳糖苷IPTG混匀后均匀涂布于固体LB培养皿进行蓝白筛选)

h.倒置于37℃恒温培养箱培养12～16h。

i.挑取单个菌落至500μL含氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃摇床220rpm生长4～6h 后进行菌液PCR。

⑨菌液PCR鉴定

5′同源臂PCR产物与GFP PCR产物overlap转化产物鉴定

PCR体系如下：

热循环条件如下：

阳性者片段大小为1792bp，阴性者有831bp与961bp条带

3′同源臂菌液PCR鉴定：

体系如下：

PCR体系如下：

热循环条件为：

阳性产物为568bp

鉴定阳性菌液取200μL送铂尚测序。

⑩测序结果正确者进行小抽质粒(利用

Spin Miniprep Kit)：

a.以1:500将阳性菌液接种至5mL有氨苄抗性的液体LB中，摇菌12h；

b.3000rpm×5min RT离心，弃上清

c.加入250μL含有RNase的Solution I，吹打混匀，重悬细菌

d.加入250μLSolution II，轻轻颠混约2min

e.加入350μLSolution III后，用力颠倒混匀

f.13000rpm×10min RT离心，吸取上清加至DNA吸附柱内，13000rpm×1min RT 离心

g.弃下清，加入500μL Buffer HB，13000rpm×1min RT离心

h.弃下清，加入700μL加有无水乙醇的DNA Wash Buffer，13000rpm×1min RT 离心

i.弃下清，13000rpm×2min RT离心

j.将吸附柱置于1.5mL EP管，加入适量ddH₂O，13000rpm×1min RT，取2μL测 OD。

11利用Pst I及Nhe I对5′同源臂与GFP overlap质粒及3′同源臂质粒进行双酶切，酶切体系如下：

37℃酶切5h,酶切产物电泳，overlap产物回收大片段骨架，3′同源臂产物回收568bp片段，回收之后加6μL ddH₂O溶解产物，进行连接。

12连接

16℃水浴，5h连接，之后进行转化、挑取单个菌落、摇菌、小抽质粒；转化、挑菌落步骤同2.2.2.⑧、⑨。

13小抽质粒进行酶切鉴定，酶切体系如下：利用快酶进行酶切

37℃酶切15min,酶切产物电泳，若5′同源臂产物、GFP、3′同源臂产物连接成功，则利用Nhe I酶切会产生约5.4kb条带，EcoR I酶切产生约2.4kb与3kb条带。阳性者送菌液或者质粒进行测序鉴定。

14测序鉴定正确的质粒及F8-22-PGK-Neo均以Nhe I酶切，酶切体系如下：

37℃酶切15min，酶切产物电泳，同源臂加GFP酶切片段及F8-22-PGK-Neo酶切后产生的约2kb的Neo片段进行胶回收，回收之后加20μL ddH₂O溶解产物。

15同源臂加GFP酶切回收片段进行CIAP去磷酸化处理，体系如下：

37℃,30minPCR仪内进行。之后进行酒精纯化：加入2倍体积预冷无水乙醇-20℃30min静置，13000rpm×4℃×10min，弃上清，加入30μL预冷的75％无水乙醇， 13000rpm×4℃×5min离心，弃上清，点离，吸干液体，超净工作台内风干，加入3μL ddH₂O溶解。

16连接：将CIAP去磷酸化处理的同源臂加GFP片段与胶回收的Neo片段连接，连接体系如下：

16℃水浴，过夜连接，之后进行转化、挑取单个菌落、摇菌、菌液PCR初步鉴定；转化、挑菌落步骤同2.2.2.⑧、⑨。

17菌液PCR初步鉴定

PCR体系如下：

热循环条件为：

阳性产物为1034bp，菌液PCR初步鉴定阳性者进行质粒小抽，质粒小抽步骤同2.2.2. ⑩。

18质粒进行酶切鉴定，酶切体系见下：

37℃酶切15min,酶切产物电泳，若5′同源臂产物、GFP、3′同源臂产物与Neo基因连接成功，则利用EcoR I酶切产生三条条带：1946bp、2342bp、2997bp，阳性者送菌液或者质粒进行整个载体测序鉴定。测序测通均正确者摇菌进行大抽质粒待用。

(2)TALEN表达质粒构建

①使用美国哈佛医学院Keith Joung实验室建立的“REAL Assembly TALEN Kit”体系构建TALEN。该体系包含32个TALE单体质粒，4个TALEN表达质粒，且每个TALEN表达质粒上还有一个半TALE模块。使用ZiFiT软件设计好TALEN后就使用该体系逐级构建。构建的流程就是通过体系里携带单体的质粒构建成二联体，再从二联体构建成四连体，以此递进最终构建成大概16联体左右的中间质粒；

②要完成每一步的连接，需将待连接的两个质粒先行酶切。两个质粒(按连接后上下游顺序)可使用的内切酶组合进行酶切，分别为上游质粒：BsaI+BamHI，下游质粒： BbsI+BamHI(连接后使用上游质粒作为骨架)。

由于酶切上游质粒时BsaI和BamHI的识别序列距离较近，所以分两步酶切，首先配制如下体系：

37℃酶切过夜后再加入0.2μl BamHI继续酶切4h，酶切体系置PCR仪上 65℃×20min终止酶切备用。

下游酶切可以在一个体系里同时双酶切：

37℃酶切过夜后置PCR仪上65℃×20min终止酶切备用。

③连接。由于在构建多条TALENs时往往会同时做数十个连接，而且对于前几步连接，酶切掉的片段都很小(每个TALE模块只有约100bp)所以如果每个酶切产物都要切胶回收的话工作量是非常大的而且难以操作。所以我们设计了一个折衷的方案。以第一步单体连接成二联体为例，上游只切成了骨架和一个12bp的小片段，下游切成了骨架和一个约100bp的TALE片段，每个片段两端的粘性末端都不同，均不存在自连。我们的做法是直接将上下游的酶切产物混合后使用一个PCR纯化柱进行纯化。在上述4条酶切产生的片段里，PCR纯化柱理论上可以弃去12bp的小片段，只剩下上下游骨架和下游质粒产生的TALE片段。上下游骨架都是可能和游离的TALE片段连接成完整的环状质粒，其机会理论上是均等的，而我们要的是前者。如上面酶切体系，我们上下游质粒酶切的量分别为100ng和30ng，这样理论上产生的两种环状质粒的比例应为10:3，可以保证一半以上都是我们要的质粒，我们每个连接挑取3个菌落进行鉴定，基本上可以保证能够获得连接成功的菌落。事实证明我们的设计是可行的。

两部分混合后以PCR纯化，用17.5μl ddH2O溶解纯化产物，配制连接体系：

16℃水浴连接2h后取5-10μl转化感受态细胞；

④培养过夜后挑取菌落，每个菌落在EP管中以500μl液体LB以280rpm×37℃×2h，之后取1μl做菌液PCR，剩余继续摇菌，PCR体系如下：

热循环条件为：

PCR完成后取5μl产物琼脂糖凝胶电泳分析，理论上连接成功的二联体的产物大小应比300bp稍大，而单体的PCR产物应比200bp稍大，连接成功的菌液移至15ml离心管中以3-5m液体LB继续培养，晚上可提取质粒并在晚上10-11点左右继续进行酶切过夜，以备第二天进行二联体连接四联体使用；

⑤每一步PCR鉴定正确的菌落都应送测序确定正确，测序使用引物TAL-Modu-F。由于在这个酶切连接过程中出现错误的几率极小，并且构建TALEN要进行至少5轮酶切，因此可以PCR鉴定正确后直接进行下一步的连接，同时送测序，不必等测序出结果后才进行下一步；

⑥以此类推再由二联体连接到四联体，最终连接到十六联体左右，后面由于连接的模块较多，测序的时候需双向引物才能测通，使用测序引物为TAL-Modu-F和TAL-Modu-R；

⑦将最终的串联的TALE序列连接到TALEN表达质粒上。

酶切最终串联TALE的中间质粒，配制酶切体系如下：

37℃酶切6-8h。

酶切TALEN表达质粒(JSD70、JSD71、JSD74、JSD78)，配制酶切体系如下，使用Frementas的BsmBI进行单酶双酶切位点的酶切：

37℃酶切6-8h。

将上述两部分酶切产物琼脂糖凝胶电泳，切胶回收片段，TALE模块质粒回收约2kb的模块片段以10μl ddH₂O溶解，TALEN表达质粒回收线性化质粒以22μl ddH₂O溶解并测浓度。

连接上述两个片段，配制连接体系：

16℃水浴连接2h后取5-10μl转化感受态细胞；

⑧培养过夜后挑取菌落，每个菌落在EP管中以500μl液体LB以280rpm×37℃×2h，之后取1μl做菌液PCR，剩余继续摇菌，PCR体系如下：

热循环条件为：

⑨PCR完成后取5μl产物琼脂糖凝胶电泳分析，理论上连接成功的TALEN对应的的产物大小应接近2kb，视总的TALE模块数而稍有不同。连接成功的菌液移至15ml离心管中以3-5ml液体LB继续培养，送测序使用引物TALEN-F和TALEN-R，测序正确后即可大量提取质粒备用。

(3)TALEN切割活性检测(利用测序方法检测)

利用Lipo2000转染HEK293T细胞，瞬时表达TALENs，在其发挥切割作用产生DSB的时候促使细胞通过NHEJ的机制修复，产生indels，检测含有indels的目的基因所占的比例即能反映该对TALEN的切割活性。

①转染前一天，六孔板接种85万HEK293T/孔，约22-24h转染；

②转染前两小时，进行完全培养基换液；

③取两个EP管用于准备转染试剂，在其中一个EP管加250μL OPTI-MEM，10μLlipofectamine 2000并混匀，另一个EP管加250μL OPTI-MEM，约500ng质粒 (CD144N-TALENs加至EP管中)并混匀，室温静置5min；

④将两个EP管内液体混匀至一个管内，室温静置20min；

⑤弃去孔板内培养基，轻柔的加入1.5mL完全培养基，将上一步液体一一对应分别均匀滴加至孔板内，做好标记，轻轻摇匀，约12h后换新鲜完全培养基；

⑥48h时，将各组细胞对应消化下来，抽提gDNA，使用其作为模板，PCR扩增切割位点附近的序列，体系如下：

热循环条件为：

阳性目的条带大小为440bp，PCR产物进行电泳，胶回收目的片段，回收产物进行T连，连接体系如下：

16℃水浴连接过夜后取10μL转化，且进行蓝白筛选，转化后细菌生长约14h左右，挑取白色的菌落至加有氨苄的液体LB中，摇菌3h左右进行菌液PCR鉴定：PCR体系如下：

热循环条件为：

阳性目的条带大小为440bp，PCR产物进行电泳，电泳阳性条带存在者取200μL菌液送测序，利用DNA star序列比对软件进行序列比对，切割位点附近出现indels者计为切开者，计算TALENs切割效率。

(4)转染质粒酶切线性化及纯化

利用Ahd I进行酶切，使CD144N-GFP质粒线性化，以利于进行打靶，酶切体系如下：

37℃酶切过夜，取5μL利用1％琼脂糖凝胶180V电泳45min鉴定是否酶切完全。若酶切完全，其余部分进行酒精纯化，纯化完毕用75％无水乙醇洗完之后，在超净工作台内弃去上清，洗干净液体，在无菌室内进行风干，加ddH₂O溶解，溶解后取2μL测OD，待打靶用。

(5)MEFs的制备

MEFs来源于13.5天的胎鼠，取自CF-1小鼠的MEFs效果较好。

①前一天准备足够的灭菌好的手术器械以分离MEFs，在超净工作台内进行组织分离：颈椎脱臼法处死孕鼠，用70％无水乙醇充分消毒孕鼠腹部后将其腹部朝上置于超净工作台内。用止血钳从腹部下方白线处提起皮肤后用大剪刀将表皮连同腹壁剪一个开口。从开口向两侧、向上剪开腹壁以暴露子宫；

②用一个新的灭菌的止血钳夹住两个子宫中间的部分，边提起边用剪刀分离剪开多余的系带，最终将含有多个胎鼠的子宫两端分离，将子宫取出后置含双抗的DPBS中标记子宫数量后移至无菌室内；

③将分离的子宫用DPBS漂洗2次后分离胎鼠。用弯口眼科剪刺入子宫，一次性刺破子宫和胎膜，将胎鼠分离出来并移至另一干净的DPBS皿中；

④使用弯口镊子和弯口眼科剪尽量去除干净胎鼠的头部以及红色的内脏团。将其余组织在新鲜的DPBS中漂洗数次以尽量去除血液及组织液，洗至DPBS基本无血色且无胶体样物时将组织块移至一个50mL离心管的管口。用大tip吸掉多余的液体，将离心管稍向下倾斜，使组织块聚集于管口。用弯口眼科剪剪碎组织，大概需连续剪5min左右。剪完后加10mL预温的0.05％trypsin/EDTA重悬组织块后置于37℃培养箱消化，每5min取出来轻晃摇匀，并在中途再补充5mL 0.05％Trypsin/EDTA，总消化时间不超过25min；

⑤用30mL MEF培养基终止消化，1500rpm×10min，小心吸弃上清(不能丢弃中间悬浮的组织团)，再加30mL MEF培养基重悬细胞和组织块，1500rpm×10min。按照分离时计数的子宫数接种，约每6个胚胎的细胞接种至一个T225的培养瓶中；

⑥待细胞长至接近汇合时冻存细胞或传代，一般在第2天或第3天会汇合。此时记为P0，每T225瓶可冻存3-4管(以后复苏时每管接种至一个T225的培养瓶中)。如传代可以1:3或1:4传代，如此传代至P3时用10μg/mL丝裂霉素C处理细胞2.5h后消化细胞，计数并分装冻存；

⑦丝裂霉素C处理过的MEF需检测无支原体污染且确定细胞密度后才能用于iPSCs及ESCs的培养。

(6)CD144N-GFP联合TALENs共转染ESCs

①待打靶的ESCs在MEF上生长至需传代时，接种至matrigel上，利用mTeSR1培养；

②约生长3-4天时进行打靶，基因打靶前3h换一次新鲜培养基并加终浓度为10μM的Y27632至培养基中继续培养；

③使用Lonza公司的核转染试剂Human Stem Cell

Kit 2进行转染。按照试剂盒说明书进行操作，先取试剂盒中的82μl Solution II以及18μl的supplement I混合后置于室温平衡温度；

④用TrypLE SELECT消化干细胞，需37℃消化3-5min，置培养箱中消化，不时拿出来观察，待摇晃时细胞团有一半会剥落时取出，用ES培养基终止消化后立即将细胞吹打下来。这一步动作一定要快，因为一旦终止消化，细胞会以极快的速度重新贴壁至无法吹打下来。吹打力度不能太大，一般由于细胞重贴壁速度太快以及细胞团中间往往消化不彻底，从而不可能把细胞完全吹打下来，剩余的少量细胞舍弃，不要反复吹打以免对细胞造成比较严重的损伤；

⑤细胞计数，取样在血细胞计数板上计数。这一步可以检查细胞状态，正常情况下细胞应为圆形且光滑的，如果细胞边缘发毛则可能是由于消化过度或吹打过猛所致。根据计数的浓度取适量细胞悬液1000rpm室温离心5min，一般取300-500万细胞进行一次核转；

⑥离心完成后弃上清，吸净残液。用上述100μl核转液重悬细胞并移入电击杯中，再加入AhdI线性化的打靶载体以及两侧的TALENs，三个质粒用量均为5μg。置核转仪上使用程序B016核转，之后立即加400μl ES培养基，室温静置5min；

⑦将准备的pMEF-NL培养基换成ES培养基，将核转产物用专用吸管吸至pMEF-NL上并加终浓度为10μM的Y27632至培养基中，十字摇匀后于培养箱中培养；

⑧从第二天开始每天换液，待细胞密度近50％时加G418至终浓度50μg/ml进行筛选。一般加药后第二天无变化，最早从隔天开始死亡，逐渐大量死亡。约打靶后10天左右可见确定的抗性克隆，14天左右抗性克隆可达一个10倍物镜的视野，即可挑取克隆。克隆最好接种至matrigel上用mTesR在24孔板上进行培养，这样有助于贴壁；

⑨贴壁克隆细胞量增殖较多时可用0.5mM EDTA消化传代至24孔板的两个孔里，两孔细胞量比值为2:8。多的那一份大概传代后2-3天后可提gDNA用于PCR鉴定。PCR阳性的克隆对应的保种细胞扩大培养用于提gDNA用于Southern blot检测并冻存，阴性细胞可丢弃。

(7)CD144N-GFP打靶的PCR鉴定

分别利用5′及3′跨同源臂引物进行定点整合初步鉴定

①CD144N打靶5′同源重组检测PCR体系如下：

热循环条件为：

②CD144N打靶3′同源重组检测PCR体系如下：

热循环条件为：

PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶进行电泳，未打靶的阴性细胞或打靶未整合细胞无条带；阳性克隆的5′跨同源臂PCR产物为1673bp大小条带；3′跨同源臂PCR产物大小为1115bp。

(8)CD144N-GFP打靶的Southern blot鉴定定点整合

通过PCR鉴定阳性的克隆扩增培养，抽提细胞DNA后进行酶切，Southern blot检测。

①CD144N PCR双侧均阳性克隆Southern鉴定酶切体系如下：

37℃酶切过夜，取部分进行琼脂糖凝胶电泳确定酶切完全，之后进行酒精纯化，加入2倍体积预冷无水乙醇-20℃30min静置，13000rpm×4℃×10min，弃上清，加入 500μL预冷的75％无水乙醇，13000rpm×4℃×5min离心，弃上清，点离，吸干液体，超净工作台内风干，加入22μL ddH₂O溶解，取2μL测OD，置4℃冰箱保存待用。

②探针标记，体系如下：

在ABI热循环仪上按以下条件扩增：

标记之后进行琼脂糖凝胶电泳，以确定标记效率及特异性，从而决定杂交用量。

③Southern blot分析

a.利用0.8％琼脂糖凝胶150V，90min电泳之前酶切好的DNA样本；

b.ddH₂O漂洗一次胶与膜；

c.TS变性液15min×2洗膜及胶；

d.利用虹吸转膜法进行转膜，约12-14h；

e.2×SSC漂洗膜两次，同时利用EB染液染胶，确定转膜是否完全；

f.120℃，30min烤膜，使DNA紧密结合于尼龙膜上；

g.预杂交液10mL 42℃预杂交约30min；

h.以2μL/mL比例将标记探针加入6.5mL杂交液中，42℃杂交过夜；

i.2×SSC/0.1％SDS 66℃5min洗3次；

j.0.1×SSC/0.1％SDS 66℃15min洗2次

k.Washing buffer 5min×1次，室温；

l.Blocking buffer 30min×1次，室温；

m.Antibody-Blocking buffer 30min×1次，室温；

n.Washing buffer 15min×2次，室温；

o.Detection buffer 5min×1次，室温；

p.加显影液，置暗盒中5min，压X片不同时间在显影仪内显影，根据条带深浅调整压片时间。

Southern blot鉴定阳性克隆后续利用PCR鉴定引物(跨同源臂)测序确定接头处是否存在indels，阳性克隆可进一步进行核型鉴定，核型无突变的克隆可用于后续试验。

(9)定点整合的ESCs向内皮细胞的定向分化

通过OP9细胞共培养的方式进行定向分化

①OP9细胞的培养及传代。OP9细胞需培养在预铺0.1％gelatin的培养皿上，每2-3天用胰酶以1:5左右的比例传代，一定要在细胞汇合前进行传代，因为密度过高的情况下细胞会自发分化成脂肪细胞；

②准备用于内皮分化的OP9细胞。将OP9以正常传代的方式接种到预铺gelatin的10cm dish中以10ml OP9培养基进行常规培养。在第4天进行半量换液，之后一直不换液直到第8天备用；

③准备好的OP9细胞会形成致密生长的单层，不会形成多层细胞。细胞表面可以看到一层光滑致密的胶状基质层。准备好的细胞在第8-12天(中途无需换液)均可用于干细胞向ECs的分化；

④消化ES细胞前从培养箱中取出准备用于分化的OP9细胞，换10ml新鲜的OP9分化培养基，继续置培养箱中。用1mg/ml dispase消化ES细胞10min左右，吸弃dispase 并洗掉残留的酶。用tip吹打下细胞团，在离心管中自然沉降后吸弃上清。用十二孔板的一个孔的细胞接种一个10cm dish用于分化，用1ml OP9分化培养基重悬细胞团并轻轻吹打成小细胞团后接种于准备好的10cm dish中，十字摇匀置于培养箱中培养，这一天记为第0天；

⑤第1天取出培养皿，吸弃培养基后加20ml预温的新鲜OP9分化培养基继续培养，此时细胞已经贴壁，ES细胞在OP9细胞上贴壁很好，基本上看不到未贴壁的细胞。随着培养的继续贴壁细胞开始展开并迅速增殖；

⑥在第4天和第6天时半量换液，培养过程中可看到干细胞团快速增大并多数变为上皮样细胞形态，但是细胞团与OP9细胞之间的边界一直保持清晰；

⑦在第7-9天可观察到带有绿色荧光的细胞出现，将这些克隆团挑取接种至铺有基质胶的爬片上，进行内皮细胞表面标志物免疫荧光鉴定。

(10)利用定点整合的报告ES细胞系进行内皮细胞分化方法优化

我们构建的这个可以特异性指示内皮细胞分化的ES细胞系可以用来优化内皮细胞分化方法。因为现在所用的OP9共培养分化方法是将人的细胞与鼠源OP9共培养来诱导分化为内皮细胞的，后续即使经过分选仍然有可能混杂有鼠源的细胞，这对于最终进行临床应用是一个很大的限制，因此有必要对目前使用的这一分化方法进行改进。

①将OP9细胞在OP9培养基中按照普通密度培养4-5天，将培养基换成OP9分化培养基，每24h收集一次OP9分化条件培养基，0.45μm针式滤器过滤后使用，每一盘OP9细胞可以连续收集7天左右，收集的OP9条件分化培养基可以冻存至-20℃备用。

②将ESCs传代接种至铺有matrigel的十二孔板上，mTeSR1培养3-4天，汇合度达到70％-80％时换成内皮细胞OP9分化条件培养基培养，1ml/12孔板孔，隔天换液或每天换液均可，培养5天-7天左右即可观察到鹅卵石样细胞，并在荧光倒置显微镜下观察到GFP 绿色荧光；然后进行内皮细胞表面标志物免疫荧光检测，并利用流式细胞仪检测阳性细胞比例。

(11)内皮细胞免疫荧光鉴定

①将上述分化好的内皮细胞传代接种至12孔板或24孔板铺有matrigel爬片上，继续分化培养基培养2-3天时，进行免疫荧光鉴定

②将培养基吸干净，弃去，DPBS漂洗2次，4％多聚甲醛固定15min；

③PBST透化处理15min；

④DPBS漂洗2次-3次，之后5％BSA封闭30min，注意：一般5％BSA封闭液要现用现配；

⑤用封闭液以1:75稀释GFP一抗(兔来源)，1:200稀释CD31一抗(鼠来源)，一抗室温孵育1h；

⑥DPBS漂洗2次-3次，DPBS洗3×10min；再次5％BSA封闭30min；

⑦用封闭液以1:600稀释二抗(羊抗兔二抗，488标记；羊抗鼠二抗，cy3标记)，室温避光孵育1h；

⑧DPBS漂洗2次-3次，DPBS洗6×5min；

⑨1μg/mL DAPI染核6min，DPBS漂洗2次-3次，DPBS洗6×5min；

⑩超纯水漂洗一次，Fluoromount-G封片，指甲油封边，尽早confocal拍照。

(12)RT-PCR检测CD144与EGFP的表达

①将利用改进的分化方法分化的ECs于分化不同时期利用Trizol法提取总RNA；

②纯化RNA,将抽提的RNA用DNaseI,RNase-free酶进行处理，体系如下：

在EP管中配制，放入水浴中37℃反应30分钟，之后加入3倍体积预冷的无水乙醇，将其中RNA析出，12000g，4℃离心10min，弃上清，加入75％无水乙醇洗涤一次，12000g，4℃离心5min，弃上清，风干，加10μlNuclease-Free H₂O溶解RNA。

③定量逆转录PCR

本实验采用诺唯赞公司一部分qRT-PCR试剂盒(

II One Step qRT-PCR

Green Kit),将经过纯化的RNA模板稀释至30ng/μl,分别检测分化不同时期CD144与 EGFP的表达，HPRT作为内参基因。

在96孔qPCR板中配制如下体系：

在Bio-Rad qPCR仪上进行反应：

在Bio-Rad CFX manager 3.0软件分析结果。

实施例2实验结果及分析

(1)质粒CD144N-GFP的构建(结果见图1)

利用引物CD144N5F2与CD144N5Rovr扩增出831bp的5′同源臂LHA；引物CD144N3F与CD144N3R1扩增出568bp的3′同源臂SHA；由引物CD144N-GFP-ovF与CD144N-GFP-R 扩增出GFP片段。利用重叠引物延伸法将LHA与GFP相连构成LHA-GFP，将SHA与LHA-GFP 分别经PstⅠ与NheⅠ酶切并连接构成中间载体，将中间载体与F8-22-PGK-Neo分别用Nhe Ⅰ酶切，将PGK-Neo连入中间载体中构成最终打靶载体CD144N-GFP。

(2)质粒TALEN的构建(结果见图2)

针对CD144基因N端的TALENs即CD144N-L2与CD144N-R2利用美国哈佛医学院KeithJoung实验室建立的“REAL Assembly TALEN Kit”体系构建，构建好之后使用引物 TALEN-F和TALEN-R进行测序鉴定。

(3)TALENs切割活性检测(结果见图3)

通过Lipo 2000将CD144N-L2R2瞬时转染HEK293T细胞，48h后抽提gDNA，使用引物CD144N-exon1-F2+CD144N-exon1-R2扩增切割位点片段。将PCR产物连接到T-easy载体上，转化蓝白筛选后挑取白色菌落35个送测序。结果显示有30个连接测序成功，其中5个产生了indels，大多为小片段缺失，突变率(切割活性)为16.67％。

(4)TALENs促进CD144N-GFP基因在ESCs中定点整合

使用CD144N-GFP联合TALENs核转ESCs(H9)，经过G418筛选，挑取单克隆之后，利用跨5’同源臂引物F1/R1及跨3’同源臂引物F2/R2进行PCR初步鉴定，鉴定双侧阳性者进行Southern blot鉴定，利用Kpn I酶切，长同源臂上探针进行杂交鉴定。由于 CD144位点为双拷贝基因，故CD144N-GFP整合至CD144位点一个拷贝者，能够表达靶入的 CD144N-GFP，同时不会影响正常CD144基因的表达，是较为理想的结果，鉴定之后进行测序，未见indels产生。且核型分析显示打靶之后未见突变产生。通过免疫荧光检测，提示打靶获得的克隆能够表达干细胞标志性蛋白Oct4、Nanog、SSEA-4，不能表达SSEA-1，符合干细胞的基因表达特征。(见图4、图5、图6、图7、图8)

(5)定点整合GFP的H9利用OP9共培养方法向内皮细胞的定向分化

将定点整合的hESCs通过与小鼠骨髓基质细胞系OP9共培养的方式分化成ECs。ESCs 在OP9上贴壁很好，并且从接种两天后开始快速增殖铺展开来，形态逐渐变为以上皮样为主，与OP9细胞的边界保持明显。在分化第7天可以观察到有绿色荧光蛋白表达的细胞，为了鉴定表达EGFP的细胞是否内皮细胞，将共培养第9天的克隆团挑取接种至铺有matrigel的爬片上，使用CD31(血小板-内皮细胞粘附分子，Platelet endothelial celladhesion molecule-1,PECAM-1)抗体与EGFP抗体进行免疫荧光检测，结果显示表达EGFP的细胞均能够表达ECs的标志蛋白CD31，这表明我们构建的利用CD144(Cadherin 5，钙黏蛋白5)内源性启动子直接调控EGFP表达是完全可以特异性示踪分化的内皮细胞的。(见图9、图10)

(6)利用定点整合H9优化ESC向内皮细胞的定向分化方法

我们所用的OP9共培养分化方法是将人的细胞与鼠源OP9共培养来诱导分化为内皮细胞的，后续即使经过分选仍然有可能混杂有鼠源的细胞，这对于最终进行临床应用是一个很大的限制，因此有必要对目前使用的这一分化方法进行改进。我们构建的这个可以特异性指示内皮细胞分化的ES细胞系可以用来优化内皮细胞分化方法。

直接利用收集过滤的OP9分化条件培养基培养接种在基质胶上的ESCs，在培养第7天 -第9天可以观察到表达绿色荧光蛋白的细胞，图11为第7天的分化细胞的形态图与荧光显微镜下观察到的荧光图，然后进行内皮细胞表面标志物免疫荧光检测，显示表达EGFP 者均表达CD31，EGFP可以特异性指示内皮细胞。qRT-PCR检测显示打靶并未影响CD144基 因表达，CD144基因表达与EGFP表达情况一致，说明构建该指示细胞系的策略是安全可靠 的。并利用流式细胞仪检测阳性细胞比例，约为30％。(见图11、图12、图13、图14)。

SEQUENCE LISTING

<110> 中南大学

<120> 特异性示踪内皮细胞分化的hESC指示细胞系的构建方法

<160> 28

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 7284

<212> DNA

<213> 人工

<400> 1

gggcgaattg ggcccgacgt cgcatgctcc cggccgccat ggcggccgcg ggaattcgat 60

tttgggttcc tgtctgagtc ccaccactta ctccaatgtg aacttaacat ctgtgtgcct 120

cagtttcctc atttgaacaa tgaggataac ctgagcaccc aatgcctggg gacttaggag 180

ctgccattgg catcagcctc acaccctctt cctggagacc ttccccacag gccctcctct 240

gggctcccat atcccctgca cttgcttccg tcctagcaca tgtgactcgc aagtagaaat 300

ggtttccacg tctattttca ccctccccag ttcggagttc atcaaggcat gaagggggtc 360

tggttctgct ggtgtcagca gacagtgaag gatgaaggag tgaacagata aagggagtta 420

ggttccctat ggaagctgct cacaccctta ggcagtggcc accatatatg ggcgatcggt 480

cagagtggtg gaagaaattt tagggaaagg acgcaaacct tcttgaaagg tcagaaggtt 540

ttgcatagct tcggggaaga ataagcagaa ggcagctgtt ctaccctgag gcagagggtg 600

aggagtaggt acaaggaagt gtagggaaat ttatcttaaa tgcgcttgtt tactcatgtt 660

gtcctaaaac cgacctttca tccgagtgca tgactgctcc ctgaaagggg gaacaataat 720

gttaattacc cgcagattgt gtttgcccca ggcttttggc attatatcta gctgctctta 780

tgtgaaatac ctgtgtctaa gtactccttt catcgtcact ggccagagtc tgaatgtgtc 840

tcctctttcc ccagatctgt tcctcctggg aagatggtga gcaagggcga ggagctgttc 900

accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc 960

gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc 1020

accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg 1080

cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg 1140

cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc 1200

cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc 1260

gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac 1320

aacgtctata tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc 1380

cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc 1440

ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgccctgagc 1500

aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg 1560

atcactctcg gcatggacga gctgtacaag taaagcggcc gcgactctag atcataatca 1620

gccataccac atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa cctcccacac ctccccctga 1680

acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt gtttattgca gcttataatg 1740

gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt 1800

ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatctgctag cataacttcg tatagcatac 1860

attatacgaa gttatacatg tcacaaaagg aaactcaccc taactgtaaa gtaattgtgt 1920

gttttgagac tataaatatc ccttggagaa aagccttgtt aacgcgcggt gaccctcgag 1980

tactaggatc cattagggaa ttcgtcgacc tcgaaattct accgggtagg ggaggcgctt 2040

ttcccaaggc agtctggagc atgcgcttta gcagccccgc tgggcacttg gcgctacaca 2100

agtggcctct ggcctcgcac acattccaca tccaccggta ggcgccaacc ggctccgttc 2160

tttggtggcc ccttcgcgcc accttctact cctcccctag tcaggaagtt cccccccgcc 2220

ccgcagctcg cgtcgtgcag gacgtgacaa atggaagtag cacgtctcac tagtctcgtg 2280

cagatggaca gcaccgctga gcaatggaag cgggtaggcc tttggggcag cggccaatag 2340

cagctttgct ccttcgcttt ctgggctcag aggctgggaa ggggtgggtc cgggggcggg 2400

ctcaggggcg ggctcagggg cggggcgggc gcccgaaggt cctccggagg cccggcattc 2460

tgcacgcttc aaaagcgcac gtctgccgcg ctgttctcct cttcctcatc tccgggcctt 2520

tcgacctgca tccgccacca tgattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc 2580

ttgggtggag aggctattcg gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc 2640

cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc 2700

cggtgccctg aatgaactgc aggacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg 2760

cgttccttgc gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt 2820

gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc 2880

catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga 2940

ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga 3000

tcaggatgat ctggacgaag agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct 3060

caaggcgcgc atgcccgacg gcgaggatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc 3120

gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt 3180

ggcggaccgc tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg 3240

cgaatgggct gaccgcttcc tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat 3300

cgccttctat cgccttcttg acgagttctt ctgagcggga ctctggggtt cgaaatgacc 3360

gaccaagcga cgcccaacct gccatcacga gatttcgatt ccaccgccgc cttctatgaa 3420

aggttgggct tcggaatcgt tttccgggac gccggctgga tgatcctcca gcgcggggat 3480

ctcatgctgg agttcttcgc ccaccccaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa 3540

taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt 3600

ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctgta taccgtcgac ctctagctag 3660

agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt 3720

ccacacaaca tacgagccgg aagcaataac ttcgtatagc atacattata cgaagttatg 3780

ctagcatgca gaggctcatg atgctcctcg ccacatcggg cgcctgcctg ggcctgctgg 3840

cagtggcagc agtggcagca gcaggtgcta accctgccca acgggacacc cacagcctgc 3900

tgcccaccca ccggcgccaa aagagagatt ggatttggaa ccagatgcac attgatgaag 3960

agaaaaacac ctcacttccc catcatgtag gcaaggtaag gctcaagccc caggacagga 4020

gaagccatca gcagctggcc catagtgaca agtggtggtg gtgatggcga tggtggcaaa 4080

ggtggtaata gatattgtgg tggttgtagg agtggagatg ataagggtga aggtggtagc 4140

aatagtggta gaggtcgtgg tggtagaagt agtggtggta atggtagcaa tggtggtggt 4200

agtgatagtg atggtggtga ggatgggaaa ggccaaggtg gtggtgggag tggtgagaat 4260

ggtggtgatg gtagtgatga taaaggggta ggtggtggtt gtgatggtgg tgatggtggt 4320

ggtggctgta tcactagtga attcgcggcc gcctgcaggt cgaccatatg ggagagctcc 4380

caacgcgttg gatgcatagc ttgagtattc tatagtgtca cctaaatagc ttggcgtaat 4440

catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac 4500

gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa 4560

ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat 4620

gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc 4680

tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg 4740

cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag 4800

gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc 4860

gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag 4920

gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga 4980

ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc 5040

atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg 5100

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<212> DNA

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ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120

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aagcctatcc ctaaccctct cctcggtctc gattctacgc gtaccggtca tcatcaccat 3780

caccattgag tttaaacccg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct 3840

gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt 3900

tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg 3960

ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaag acaatagcag gcatgctggg 4020

gatgcggtgg gctctatggc ttctgaggcg gaaagaacca gctggggctc tagggggtat 4080

ccccacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg 4140

accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc 4200

gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg gcatcccttt agggttccga 4260

tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt 4320

gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat 4380

agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat 4440

ttataaggga ttttggggat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa 4500

tttaacgcga attaattctg tggaatgtgt gtcagttagg gtgtggaaag tccccaggct 4560

ccccaggcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac caggtgtgga 4620

aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca 4680

accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat 4740

tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctctgcc 4800

tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag gcctaggctt ttgcaaaaag 4860

ctcccgggag cttgtatatc cattttcgga tctgatcagc acgtgttgac aattaatcat 4920

cggcatagta tatcggcata gtataatacg acaaggtgag gaactaaacc atggccaagc 4980

ctttgtctca agaagaatcc accctcattg aaagagcaac ggctacaatc aacagcatcc 5040

ccatctctga agactacagc gtcgccagcg cagctctctc tagcgacggc cgcatcttca 5100

ctggtgtcaa tgtatatcat tttactgggg gaccttgtgc agaactcgtg gtgctgggca 5160

ctgctgctgc tgcggcagct ggcaacctga cttgtatcgt cgcgatcgga aatgagaaca 5220

ggggcatctt gagcccctgc ggacggtgtc gacaggtgct tctcgatctg catcctggga 5280

tcaaagcgat agtgaaggac agtgatggac agccgacggc agttgggatt cgtgaattgc 5340

tgccctctgg ttatgtgtgg gagggctaag cacttcgtgg ccgaggagca ggactgacac 5400

gtgctacgag atttcgattc caccgccgcc ttctatgaaa ggttgggctt cggaatcgtt 5460

ttccgggacg ccggctggat gatcctccag cgcggggatc tcatgctgga gttcttcgcc 5520

caccccaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat 5580

ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat 5640

gtatcttatc atgtctgtat accgtcgacc tctagctaga gcttggcgta atcatggtca 5700

tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga 5760

agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg 5820

cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc 5880

caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac 5940

tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata 6000

cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa 6060

aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct 6120

gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa 6180

agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg 6240

cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcaatgctca 6300

cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa 6360

ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg 6420

gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg 6480

tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg 6540

acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc 6600

tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag 6660

attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac 6720

gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc 6780

ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag 6840

taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt 6900

ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag 6960

ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca 7020

gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact 7080

ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca 7140

gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg 7200

tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc 7260

atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg 7320

gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca 7380

tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt 7440

atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc 7500

agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc 7560

ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca 7620

tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa 7680

aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat 7740

tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa 7800

aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtc 7854

<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工

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tcagggttaa gacagttgga 20

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gcttgtcggc catgatat 18

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caacatacga gccggaagca 20

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atcgtcagac caccgccta 19

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tcctgtctga gtcccaccac ttactccaat gtgaacttaa catctgtgtg cctcagtttc 60

ctcatttgaa caatgaggat aacctgagca cccaatgcct ggggacttag gagctgccat 120

tggcatcagc ctcacaccct cttcctggag accttcccca caggccctcc tctgggctcc 180

catatcccct gcacttgctt ccgtcctagc acatgtgact cgcaagtaga aatggtttcc 240

acgtctattt tcaccctccc cagttcggag ttcatcaagg catgaagggg gtctggttct 300

gctggtgtca gcagacagtg aaggatgaag gagtgaacag ataaagggag ttaggttccc 360

tatggaagct gctcacaccc ttaggcagtg gccaccatat atgggcgatc ggtcagagtg 420

gtggaagaaa ttttagggaa aggacgcaaa ccttcttgaa aggtcagaag gttttgcata 480

gcttcgggga agaataagca gaaggcagc 509

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ttgggttcct gtctgagtcc 20

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cctcgccctt gctcaccatc ttcccaggag gaacagatc 39

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gctagcatgc agaggctcat gatgct 26

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acagccacca ccaccatc 18

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gatctgttcc tcctgggaag atggtgagca agggcgagg 39

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gctagcagat acattgatga gtttgg 26

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tttgctcctt cgctttctgg g 21

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cgtcgcttgg tcggtcattt c 21

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gtgcatgact gctccctgaa 20

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cagctgctga tggcttctc 19

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ccttctgcga ggatatggc 19

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caggaagatg agcagggtga 20

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tcgtgaccac cctgaccta 19

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gaagatggtg cgctcctg 18

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tcagggttaa gacagttgga 20

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gcttgtcggc catgatat 18

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caacatacga gccggaagca 20

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atcgtcagac caccgccta 19

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tcctgtctga gtcccacc 18

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gctgccttct gcttattctt 20

Claims (1)

1.特异性示踪内皮细胞分化的hESC指示细胞系的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)构建质粒CD144N-GFP，所述质粒CD144N-GFP的核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示；

(2)构建质粒TALENs，所述质粒TALENs包括质粒CD144N-L2和质粒CD144N-R2，所述质粒CD144N-L2的核苷酸序列如SEQ ID NO .2所示，所述质粒CD144N-R2的核苷酸序列如SEQ IDNO .3所示；

(3)将质粒CD144N-GFP和质粒TALENs同时核转ESCs，经过G418筛选，挑取单克隆之后，利用跨5’同源臂引物F1/R1及跨3’同源臂引物F2/R2进行PCR初步鉴定，鉴定双侧阳性者进行Southern blot鉴定，利用Kpn I酶切，长同源臂上探针进行杂交鉴定，阳性者即为特异性示踪内皮细胞分化的hESC指示细胞系；其中，所述跨5’同源臂引物F1的核苷酸序列如SEQIDNO .4所示，所述跨5’同源臂引物R1的核苷酸序列如SEQ ID NO .5所示，所述跨3’同源臂引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO .6所示，所述跨3’同源臂引物R2的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示；

所述步骤（1）构建质粒CD144N-GFP为在CD144起始密码子处插入报告基因编码序列；

所述hESC为H9细胞系。

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