CN108138201A - 包含2a肽的重组载体 - Google Patents

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A·H·林
A·霍法克雷
D·J·霍根
D·G·奥斯特塔格
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Abstract

本公开提供了经修饰的重组逆转录病毒，其包含与异源多核苷酸可操作地连接的2A肽或2A肽样编码序列。本公开还涉及表达或包含这种载体的细胞和载体以及使用这种经修饰的载体治疗疾病和病症的方法。

Description

包含2A肽的重组载体
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年9月4日提交的序列号为62/214,884的美国临时申请的优先权，其公开内容通过引用被并入本文。
对序列表的引用
本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表作为标题为序列表_ST25.txt的文件提供，该文件创建于2016年9月1日，大小为245,703字节(239Kb)。序列表的以电子格式的信息通过引用被整体并入本文。
技术领域
本公开涉及具有复制能力的逆转录病毒载体。本公开还涉及这种具有复制能力的逆转录病毒载体在细胞中递送和表达异源核酸的用途。
背景技术
将基因和异源核酸递送至细胞和受试者的有效方法一直是研究人员针对科学发展以及疾病和病症的可行性治疗的目标。
发明内容
本公开提供了一种具有重组复制能力的逆转录病毒，其包含：逆转录病毒GAG蛋白；逆转录病毒POL蛋白；逆转录病毒包膜；逆转录病毒多核苷酸，所述逆转录病毒多核苷酸包含在逆转录病毒多核苷酸序列的3'末端的长末端重复(LTR)序列、在所述逆转录病毒多核苷酸的5'末端的启动子序列、gag核酸结构域、pol核酸结构域和env核酸结构域，所述启动子适于在哺乳动物细胞中表达；包含可操作地连接至异源多核苷酸的2A肽或2A肽样编码序列的盒，其中所述盒定位成5'连至所述3'LTR并可操作地连接，以及3'连至编码所述逆转录病毒包膜的env核酸结构域；以及在靶细胞中逆转录、封装和整合中所需的顺式作用序列。在一个实施方式中，包膜选自兼嗜性、多变性、异嗜性、10A1、GALV、狒狒内源性病毒、RD114、弹状、甲病毒、麻疹或流感病毒包膜中的一个。在另一个实施方式中，逆转录病毒多核苷酸序列源于选自由以下所组成的组中的病毒：鼠白血病病毒(MLV)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、猫白血病病毒(FeLV)、狒狒内源性逆转录病毒(BEV)、猪内源性病毒(PERV)、猫源性逆转录病毒RD114、松鼠猴逆转录病毒、异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(XMRV)、禽网状内皮组织增生病毒(REV)或长臂猿白血病病毒(GALV)。在又一个实施方式中，逆转录病毒是γ逆转录病毒。在另一个实施方式中，靶细胞是哺乳动物细胞。在又一个实施方式中，2A肽或2A肽样编码序列编码含有SEQ ID NO：1的序列的肽。在又一个实施方式中，2A肽或2A肽样编码序列编码如SEQ ID NO：55-125中任一个所述的肽。在另一个实施方式中，2A肽或2A肽样编码序列包含如SEQ ID NO：8-19所述的序列。在任何前述实施方式的又一个实施方式中，异源多核苷酸的长度为>500bp、>1000bp、>1100bp、>1200bp、>1300bp、>1400bp或>1500bp。在另一个实施方式中，异源多核苷酸包含至少2个编码序列。在又一个实施方式中，逆转录病毒还包含第二盒，其在所述盒的下游包含2A肽或2A肽样编码序列。在又一个实施方式中，所述逆转录病毒还包含在所述盒下游的第二盒，其中所述第二盒包含与第二异源多核苷酸可操作地连接的内部核糖体进入位点(IRES)或微启动子或polIII启动子。
本公开还提供了一种具有重组复制能力的逆转录病毒，其包含：逆转录病毒GAG蛋白；逆转录病毒POL蛋白；逆转录病毒包膜；逆转录病毒多核苷酸，所述逆转录病毒多核苷酸包含在逆转录病毒多核苷酸序列的3'末端的长末端重复(LTR)序列、在所述逆转录病毒多核苷酸的5'末端的启动子序列、gag核酸结构域、pol核酸结构域和env核酸结构域，所述启动子适于在哺乳动物细胞中表达；包含可操作地连接至第一异源多核苷酸的调控结构域的盒，所述第一异源多核苷酸可操作地连接至至少一个2A盒，所述2A盒包含可操作地连接至第二异源多核苷酸的2A肽或2A肽样编码序列，其中所述盒定位成5'连至所述3'LTR，以及3'连至编码所述逆转录病毒包膜的env核酸结构域，并且其中所述2A盒在下游并且可操作地连接至第一异源多核苷酸；以及在靶细胞中逆转录、封装和整合中所需的顺式作用序列。在一个实施方式中，包膜选自兼嗜性、多变性、异嗜性、10A1、GALV、狒狒内源性病毒、RD114、弹状、甲病毒、麻疹或流感病毒包膜中的一个。在另一个实施方式中，逆转录病毒多核苷酸序列源于选自由以下所组成的组中的病毒：鼠白血病病毒(MLV)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、猫白血病病毒(FeLV)、狒狒内源性逆转录病毒(BEV)、猪内源性病毒(PERV)、猫源性逆转录病毒RD114、松鼠猴逆转录病毒、异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(XMRV)、禽网状内皮组织增生病毒(REV)或长臂猿白血病病毒(GALV)。在又一个实施方式中，逆转录病毒是γ逆转录病毒。在又一个实施方式中，靶细胞是哺乳动物细胞。在另一个实施方式中，2A肽或2A肽样编码序列编码含有SEQ ID NO：1的序列的肽。在另一个实施方式中，2A肽或2A肽样编码序列编码SEQ ID NO：55-125中任一个所述的肽。在又一个实施方式中，2A肽或2A肽样编码序列包含如SEQ ID NO：8-19中任一个所述的序列。在任何前述实施方式中，靶细胞选自由肺癌细胞、结肠-直肠癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、尿道癌细胞、子宫癌细胞、脑癌细胞、头颈癌细胞、胰腺癌细胞、黑素瘤细胞、胃癌细胞和卵巢癌细胞所组成的组。在又任何前述实施方式中，启动子序列与生长调节基因相关。在任何前述实施方式的又一个实施方式中，启动子序列包含组织特异性启动子序列。在另一个实施方式中，组织特异性启动子序列包含至少一个雄激素应答元件(ARE)。在任何前述的另一个实施方式中，启动子包含具有如SEQ ID NO：2所示的从核苷酸1到约核苷酸582的序列的CMV启动子，可包括对一个或多个核酸碱基的修饰，并且其能够引导和启动转录。在任何前述的另一个实施方式中，启动子包含CMV-R-U5结构域多核苷酸。在另一个实施方式中，CMV-R-U5结构域包含与MLV R-U5区连接的来自人巨细胞病毒的立即早期启动子。在又一个实施方式中，CMV-R-U5结构域多核苷酸包含如SEQ ID NO：2所示的从约核苷酸1至约核苷酸1202的序列或与如SEQ ID NO：2所示的从核苷酸1至约核苷酸1202的序列至少95％相同的序列，其中所述多核苷酸促进与其可操作地连接的核酸分子的转录。在任何前述的另一个实施方式中，gag多核苷酸源于γ逆转录病毒。在另一个实施方式中，gag核酸结构域包含SEQ ID NO：2的从约核苷酸编号1203至约核苷酸2819的序列或与其具有至少95％、98％、99％或99.8％同一性的序列。在任何前述的另一个实施方式中，多核苷酸的pol结构域源于γ逆转录病毒。在另一个实施方式中，pol结构域包含SEQ ID NO：2的从约核苷酸编号2820至约核苷酸6358的序列或与其具有至少95％、98％、99％或99.9％同一性的序列。在任何前述的另一个实施方式中，env结构域包含SEQ ID NO：2的从约核苷酸编号6359至约核苷酸8323的序列或与其具有至少95％、98％、99％或99.8％同一性的序列。在任何前述的另一个实施方式中，3'LTR源于γ逆转录病毒。在另一个实施方式中，3'LTR包含U3-R-U5结构域。在又一个实施方式中，3'LTR包含如SEQID NO：2所述的从约核苷酸9111至约11654的序列或与其具有至少95％、98％或99.5％同一性的序列。在任何前述的另一个实施方式中，异源核酸序列编码生物反应调节剂或免疫增强细胞因子。在另一个实施方式中，免疫增强细胞因子选自由白介素1至38、干扰素、肿瘤坏死因子(TNF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)所组成的组。在另一个实施方式中，免疫增强细胞因子是干扰素γ。在任何前述的另一个实施方式中，异源核酸编码将无毒前药转化为毒性药物的多肽。在另一个实施方式中，将无毒前药转化为毒性药物的多肽是胸苷激酶、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)或胞嘧啶脱氨酶。在任何前述的另一个实施方式中，异源核酸序列编码受体结构域、抗体或抗体片段。在一个实施方式中，第二盒包含抑制性多核苷酸。在另一个实施方式中，抑制性多核苷酸包含miRNA、RNAi或siRNA序列。
本公开还提供了一种用于产生如上述任何实施方式中所述的逆转录病毒的重组逆转录病毒多核苷酸基因组。在一个实施方式中，多核苷酸包含与具有或不具有GSG连接子编码序列的2A肽或2A肽样编码序列读框符合的MLV 4070A包膜蛋白基因，和与所述2A肽或2A肽样编码序列读框符合的第二基因。在另一个实施方式中，多核苷酸包含与具有或不具有GSG连接子编码序列的2A肽或2A肽样编码序列读框符合的MLV 10A1包膜蛋白基因，和与所述2A肽或2A肽样编码序列读框符合的第二基因。在另一个实施方式中，所述多核苷酸包含与具有或不具有GSG连接子编码序列的2A肽或2A肽样编码序列读框符合的XMRV包膜蛋白基因，和与所述2A肽或2A肽样编码序列读框符合的第二基因。在另一个实施方式中，多核苷酸包含与具有或不具有GSG连接子编码序列的2A肽或2A肽样编码序列读框符合的非友性MLV包膜蛋白基因，和与所述2A肽或2A肽样编码序列读框符合的第二基因。在任何前述的另一个实施方式中，异源多核苷酸是分泌型、膜型、细胞质型、细胞核型或细胞区室特异性蛋白。
在任何前述实施方式中，重组逆转录病毒和/或异源多核苷酸被工程化以去除对人APOBEC超突变敏感的色氨酸密码子。在一个实施方式中，异源多核苷酸编码具有胞嘧啶脱氨酶活性的多肽。在另一个实施方式中，具有胞嘧啶脱氨酶活性的多肽编码SEQ ID NO：29的多肽，其中X是除色氨酸以外的任何氨基酸。
本公开还提供了一种具有重组复制能力的逆转录病毒，其通过将在逆转录病毒多核苷酸中的对APOBEC超突变敏感的密码子工程化为非敏感密码子而抵抗被人APOBEC的失活。在一个实施方式中，对APOBEC超突变敏感的密码子编码色氨酸氨基酸。在又一个实施方式中，重组逆转录病毒包含IRES盒、启动子盒和/或在所述env基因下游的2A肽盒。
本公开还提供了一种治疗细胞增殖性病症的方法，所述方法包括在所述异源多核苷酸被表达的情况下使受试者接触前述实施方式中任一个所述的逆转录病毒，并且其中所述异源多核苷酸编码将前药转化为细胞毒性药物的蛋白。
在附图和下面的描述中阐述了本公开的一个或多个实施方式的细节。其它特征、目的和优点将从说明书和附图以及权利要求中显而易见。
附图说明
图1示出了口蹄疫病毒(F2A)、马鼻炎A病毒(E2A)、明脉扁刺蛾β四体病毒(T2A)和猪捷申病毒-1(P2A)的2A区的氨基酸序列的序列比对(SEQ ID NO：55至58)。
图2示出了存在于不同种类的病毒中的2A肽序列的序列比对(SEQ ID NO：59至125)。
图3示出了pAC3-(x)2A-GFPm和pAC3-(x)2A-yCD2载体组的克隆方案。黑框表示Gibbson组装克隆中使用的重叠序列；(x)表示来自马鼻炎A(E)、口蹄疫病毒(F)、猪捷申病毒-1(P)或明脉扁刺蛾β四体病毒(T)的2A肽。
图4示出了由瞬时转染的HEK293T细胞产生的RRV-2A-GFPm和RRV-GSG-2A-GFPm载体在U87-MG细胞中的复制动力学。
图5示出了RRV-2A-GFPm和RRV-GSG-2A-GFPm载体在U87-MG细胞中的GFP表达水平，以平均荧光强度(MFI)表示。所示的百分比是相对于RRV-IRES-GFP的MFI。
图6示出了RRV-2A-GFPm和RRV-GSG-2A-GFPm载体在U87-MG细胞中的载体稳定性。
图7示出了由最高感染的U87-MG细胞产生的RRV-2A-GFPm和RRV-GSG-2A-GFPm载体的效价。所呈现的效价值来自2个独立实验。
图8示出了在最低感染的U87-MG细胞中产生然后在原始U87-MG细胞中随后进行感染循环的RRV-2A-GFPm和RRV-GSG-2A-GFPm载体的复制动力学。
图9示出了在来自第二感染周期的最高感染的U87-MG细胞中的RRV-2A-GFPm和RRV-GSG-2A-GFPm载体的GFPm表达的MFI。所示的百分比是相对于RRV-IRES-GFP的MFI。
图10示出了来自经RRV-2A-GFPm和RRV-GSG-2A-GFPm感染的U87-MG细胞的细胞裂解物的抗GFP免疫印迹。在～120KDa处检测到的蛋白条带代表病毒包膜-GFPm融合多蛋白。在～27KDa处检测到的蛋白条带代表从Env-GFPm融合多蛋白分离的天然GFP或2A-GFPm蛋白。
图11示出了来自RRV-2A-GFPm和RRV-GSG-2A-GFPm感染的U87-MG细胞的细胞裂解物的抗gp70免疫印迹。在～120KDa处检测到的蛋白条带代表病毒包膜-GFPm融合多蛋白。在～75KDa处检测到的蛋白条带代表从融合多蛋白分离的Pr85/gp70病毒包膜蛋白。
图12示出了分别通过抗-gp70和抗-TM抗体检测的含有gp70和p15E亚基的与多羟病毒(viron)相关的、适当处理的病毒包膜蛋白的免疫印迹。抗-p15E抗体检测前体TM亚基p15E和R-肽切割的TM亚基p12E。
图13示出了由最高感染的U87-MG细胞产生的RRV-P2A-yCD2载体、RRV-T2A-yCD2载体、RRV-GSG-P2A-yCD2载体和RRV-GSG-T2A-yCD2载体的效价。
图14示出了来自经RRV-P2A-yCD2、RRV-T2A-yCD2、RRV-GSG-P2A-yCD2和RRV-GSG-T2A-yCD2感染的U87-MG细胞的细胞裂解物的抗-yCD2免疫印迹。在～110KDa处检测到的蛋白条带代表病毒包膜-GFPm融合多蛋白。在～15KDa处检测到的蛋白条带代表从Env-yCD2融合多蛋白分离的yCD2或2A-yCD2蛋白。
图15示出了来自经RRV-P2A-yCD2、RRV-T2A-yCD2、RRV-GSG-P2A-yCD2和RRV-GSG-T2A-yCD2感染的U87-MG细胞的细胞裂解物的抗-gp70免疫印迹。在～110KDa处检测到的蛋白条带代表病毒包膜-yCD2融合多蛋白。在～75KDa处检测到的蛋白条带代表从融合多蛋白分离的Pr85/gp70病毒包膜蛋白。
图16示出了在16个感染周期内的RRV-P2A-yCD2和RRV-T2A-yCD2、RRV-GSG-P2A-yCD2和RRV-GSG-T2A-yCD2载体在U87-MG细胞中的长期载体稳定性。pDNA是包含作为阳性对照的pAC3-P2A-yCD2和pAC3-T2A-yCD2、pAC3-GSG-P2A-yCD2和pAC3-GSG-T2A-yCD2的质粒DNA。
图17示出了分别通过抗-gp70和抗-TM抗体检测的含有gp70和p15E亚基的与多羟病毒相关的、适当处理的病毒包膜蛋白的免疫印迹。抗-p15E抗体检测前体TM亚基p15E和R-肽切割的TM亚基p12E。
图18示出了对经RRV-IRES-GFP、RRV-P2A-yCD2和RRV-T2A-yCD2、RRV-GSG-P2A-yCD2和RRV-GSG-T2A-yCD2感染的U87-MG细胞进行5-FC处理后第7天时5-FC介导的杀伤。相对于未经5-FC处理但被RRV感染的细胞计算细胞存活百分比。包括原始U87-MG细胞作为对照以测定5-FC的非5-FU介导的细胞毒性作用的浓度。
图19示出了病毒体组装和成熟过程中的MLV病毒包膜蛋白处理。通常，天然MLV包膜蛋白的处理包括将前体蛋白Pr85切割成在感染的宿主细胞中出现的gp70(SU)和p15E(TM)亚基。在从宿主细胞出芽期间，需要切割Pr85以有效地将病毒包膜蛋白掺入到病毒体内。当病毒体从宿主细胞膜中出芽时，病毒体经历成熟过程从而变得具有感染性。MLV病毒体成熟过程之一涉及通过病毒蛋白酶去除位于包膜蛋白TM亚基的C末端的R肽。取决于2A肽的序列，2A肽被框内表达到R肽的C末端，使得R肽的长度从16个氨基酸增加到至少32个氨基酸。尽管通过添加2A肽序列增加了R肽的长度，但是将随着R肽的切割同时去除2A肽，从而产生功能性包膜蛋白。
图20A-图20B示出了在最高感染的Tu-2449细胞中RRV-P2A-yCD2、RRV-GSG-P2A-yCD2、RRV-T2A-yCD2和RRV-GSG-YCD2的(A)yCD2蛋白表达和(B)5-FC敏感性。
图21示出了相比于用RRV-IRES-yCD2+5-FC处理的肿瘤，用RRV-GSG-T2A-yCD2+5-FC处理的肿瘤的肿瘤生长延迟。
图22A-图22B示出了(A)来自经RRV-GSG-T2A-GMCSF-GSG-P2A-yCD2和RRV-GSG-T2A-yCD2-GSG-P2A-GMCSF瞬时转染的HEK293T细胞的细胞裂解物的抗-yCD2免疫印迹。在～110KDa处检测到的蛋白条带代表病毒包膜-GFPm融合多蛋白。在～15KDa处检测到的蛋白条带代表从融合多蛋白分离的yCD2或2A-yCD2蛋白。(B)从经RRV-GSG-T2A-GMCSF-GSG-P2A-yCD2和RRV-GSG-T2A-yCD2-GSG-P2A-GMCSF瞬时转染的HEK293T细胞分泌到培养基中的GMCSF。
图23示出了由最高感染的U87-MG细胞产生的RRV-P2A-TKO、RRV-T2A-TKO、RRV-GSG-P2A-TKO和RRV-GSG-T2A-TKO载体的效价。
图24示出了来自经RRV-P2A-TKO、RRV-T2A-TKO、RRV-GSG-P2A-TKO和RRV-GSG-T2A-TKO感染的U87-MG细胞的细胞裂解物的抗HSV-tk免疫印迹。
图25示出了在16个感染周期内，RRV-P2A-TKO、RRV-T2A-TKO、RRV-GSG-P2A-TKO和RRV-GSG-T2A-TKO载体在U87-MG细胞中的载体稳定性。使用pAC3-P2A-TKO质粒DNA作为阳性对照。
图26A-图26B示出了在不同剂量下，经RRV-P2A-TKO、RRV-T2A-TKO、RRV-GSG-P2A-TKO和RRV-GSG-T2A-TKO感染的U87-MG细胞的GCV敏感性。
图27A-图27B示出了在瞬时转染的293T细胞中的PDL1scFv和PDL1scFvFc蛋白表达以及Env-scFv和Env-ScFvFc多蛋白的分离效率。(A)来自用pAC3-GSG-T2A-PDL1scFv、pAC3-GSG-T2A-PDL1scFvFc、pAC3-GSG-T2A-PDL1scFv-标签、pAC3-GSG-T2A-PDL1scFvFc-标签瞬时转染的HEK293T细胞的scFv-标签(～30KDa)和scFvFc-标签(～55Kd)蛋白表达。(B)来自瞬时转染的293T细胞的细胞裂解物的抗-2A免疫印迹。在110KDa以上检测到的蛋白条带代表Env-scFv融合多蛋白和Env-ScFvFc融合多蛋白。在～85KDa处检测到的蛋白条带代表从融合多蛋白分离的Pr85病毒包膜蛋白，在～15KDa处检测到的蛋白条带代表从Pr85病毒包膜蛋白处理的p15E-2A蛋白。
图28示出了取自血液和肿瘤的20位患者样品的RRV(Toca 511，Tocagen Inc.)点突变的元分析。对每个样品在检测频率至少为1％下统计所有通过质量过滤器的点突变，并计算各个可能的成对点突变的总数并转化为相对频率。该图示出了根据样品类型分组的不同点突变的相对频率：血液＝来自患者的血液样品，肿瘤＝IV给药Toca511后切除的肿瘤，再肿瘤＝来自在初步切除时经Toca511治疗的患者的再切除肿瘤。
具体实施方式
如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数个提及物，除非上下文另外明确指出。因此，例如，对“一个细胞”的提及包括多个这种细胞，并且对“该载体”的提及包括对一个或多个载体的提及，等等。
另外，除非另有说明，“或”的使用意指“和/或”。类似地，“包含”、“包括”是可互换的，而并非意在是限制性的。
还应理解，在多个实施方式的描述使用术语“包括”的情况下，本领域技术人员将理解，在一些特定情况下，可以使用语言“基本上由…组成”或“由….组成。”
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语与本公开所属领域的普通技术人员所通常理解的具有相同的含义。尽管与本文所述相似或等同的方法和材料都可以用于所公开的方法和组合物的实施中，但是本文描述了示例性方法、装置和材料。
描述可用于本文的分子生物学技术(包括载体、启动子的用途和许多其它相关主题)的一般文章包括：Berger和Kimmel,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology Volume 152,(Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.)("Berger")；Sambrook等,Molecular Cloning--A Laboratory Manual,2d ed.,Vol.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989("Sambrook")；Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等人编辑,Current Protocols,Greene Publishing Associates,Inc.和John Wiley&Sons,Inc.,之间的合资企业(补充至1999年)(“Ausubel”)；以及S.Carson,H.B.Miller&D.S.Witherow和Molecular BiologyTechniques:A Classroom Laboratory Manual,Third Edition,Elsevier,San Diego(2012)。足以引导技术人员通过体外扩增方法(包括聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、Qβ-复制酶扩增和其它RNA聚合酶介导的技术(例如NASBA))而制造本公开的同源核酸的方案实例，可以在Berger,Sambrook和Ausubel以及Mullis等(1987)美国专利号4,683,202；Innis等,eds.(1990)PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Academic Press Inc.San Diego,Calif.)("Innis")；Arnheim&Levinson(Oct.1,1990)C&EN 36-47；The Journal Of NIH Research(1991)3:81-94；Kwoh等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173；Guatelli等(1990)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 87:1874；Lomell等(1989)J.Clin.Chem 35:1826；Landegren等(1988)Science 241:1077-1080；Van Brunt(1990)Biotechnology 8:291-294；Wu and Wallace(1989)Gene 4:560；Barringer等(1990)Gene 89:117；以及Sooknanan和Malek(1995)Biotechnology 13:563-564中找到。在Wallace等的美国专利号5,426,039中公开了用于在体外扩增的核酸中克隆的改进方法。在Cheng等(1994)Nature 369：684-685和其中引用的参考文献中总结了通过PCR扩增大核酸的改进方法，其中生成了高达40kb的PCR扩增子。技术人员将会理解，基本上任何RNA都可以转化为适于限制性消化、PCR扩增和使用逆转录酶和聚合酶的测序的双链DNA。参见例如Ausubel、Sambrook和Berger，全部同上。
全文讨论的出版物仅仅是针对它们在本申请的申请日之前的公开内容而提供。本文中任何内容都不应被解释为承认发明人由于先前公开而无权先于这种公开。
本公开提供了用于将基因或蛋白质递送至细胞或受试者的方法和组合物。这种方法和组合物可以用于治疗受试者的多种疾病和病症，包括癌症和其它细胞增殖性疾病和病症。本公开提供了用于将基因递送至细胞的具有复制能力的逆转录病毒载体。
术语“载体”、“载体构建体”和“表达载体”意指可以将DNA或RNA序列(例如外源基因)引入宿主细胞中从而转化宿主并促进所引入的序列的表达(例如转录和翻译)的载体。载体通常包括DNA或RNA，其通过限制酶技术使编码蛋白的外源DNA插入其中。普通类型的载体是“质粒”，其通常是双链DNA的自含式分子，其可以容易地接受另外(外源)DNA并且可以被容易地引入合适的宿主细胞中。已经描述了大量的载体，包括质粒和真菌载体，用于在各种真核宿主和原核宿主中复制和/或表达。使用本文公开或引用的方法或相关领域技术人员已知的方法，非限制性实例包括pKK质粒(Clonetech)、pUC质粒、pET质粒(Novagen,Inc.,Madison,Wis.)、pRSET或pREP质粒(Invitrogen,San Diego,Calif.)或pMAL质粒(NewEngland Biolabs,Beverly,Mass.)，和许多合适的宿主细胞。重组克隆载体通常包括一个或多个用于克隆或表达的复制体系、用于在宿主中选择的一个或多个标记物，例如抗生素抗性和一个或多个表达盒。
具有重组复制能力的逆转录病毒载体或逆转录病毒复制载体(RRV)是指基于逆转录病毒科病毒成员的载体。如下面更充分描述的那样，逆转录病毒的结构被充分表征。可以使用重组遗传技术对这种载体进行工程化，以通过插入异源基因或序列将亲本病毒修饰为非天然存在的RRV。这种修饰可以为载体提供使其递送对体外或体内宿主细胞表达的基因的属性。
已经以多种方式对逆转录病毒进行了分类，但是在过去十年中该命名已经被标准化(参见ICTVdB-万维网(www)上的通用病毒数据库，第4版，网址为ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTVdB/和教材“Retroviruses”Eds Coffin,Hughs和Varmus,Cold Spring HarborPress 1997；其公开内容通过引用并入本文)。在一个实施方式中，有复制能力的逆转录病毒载体可以包括正交逆转录病毒或更典型的γ逆转录病毒载体。
逆转录病毒通过它们复制其遗传物质的方式来定义。在复制期间，RNA被转化成DNA。在细胞感染后，通过被称为反转录分子过程从病毒颗粒中携带的两个RNA分子产生DNA的双链分子。DNA形式作为前病毒共价整合到宿主细胞基因组中，借助于细胞因子和/或病毒因子表达病毒RNA。表达的病毒RNA被包装成颗粒并作为感染性病毒体被释放。
逆转录病毒颗粒由两个相同的RNA分子组成。每个野生型基因组具有正义单链RNA分子，其在5'末端被封闭并且在3'末端被聚腺苷酸化。二倍体病毒颗粒包含与gag蛋白复合的两条RNA链、病毒酶(pol基因产物)和gag蛋白“核”结构内的宿主tRNA分子。围绕和保护这种衣壳的是脂质双分子层，其来自宿主细胞膜并含有病毒包膜(env)蛋白。env蛋白与病毒的细胞受体结合，并且颗粒通常通过受体介导的胞吞和/或膜融合进入宿主细胞。
在病毒颗粒释放到靶细胞中后，外包膜脱落，病毒RNA通过逆转录被复制到DNA中。这被由pol区编码的逆转录酶催化，并使用被包入病毒体的宿主细胞tRNA作为DNA合成的引物。以这种方式，RNA基因组被转化成更复杂的DNA基因组。
通过逆转录产生的双链线性DNA可以必须或不必在核内环化。原病毒此时在任一端具有两个相同的重复序列，称为长末端重复序列(LTR)。两个LTR序列的末端产生由pol产物-整合酶蛋白(催化整合)识别的位点，使得原病毒总是连接到宿主DNA的两个碱基对(bp)。在两个LTR的末端看到细胞序列的重复，令人联想到可转座遗传因子的整合模式。逆转录病毒可以将它们的DNA整合到宿主DNA中的许多位点，但不同的逆转录病毒具有不同的整合位点偏好。HIV-1和猴免疫缺陷病毒DNA优先整合到表达基因中，鼠白血病病毒(MLV)DNA优先整合近转录起始位点(TSS)，而禽肉瘤白血病病毒(ASLV)和人T细胞白血病病毒(HTLV)DNA几乎随机地整合，表明对基因的少许偏好(Derse D等(2007),J Virol 81:6731–6741；Lewinski MK,et al.(2006),PLoS Pathog 2:e601)。
整合病毒DNA的转录、RNA剪接和翻译是由宿主细胞蛋白介导的。生成多种剪接的转录本。在人类逆转录病毒的情况下，HIV-1/2和HTLV-I/II病毒蛋白也用于调节基因表达。细胞因子和病毒因子之间的相互作用是控制病毒潜伏期和表达病毒基因的时间顺序的因素。
逆转录病毒可以水平和垂直传播。逆转录病毒的有效感染性传播需要在特异性识别病毒包膜蛋白的受体的靶细胞上表达，但是病毒可以低效率使用非受体依赖性、非特异性进入途径。通常地，由于进而导致对二重感染的抗性的受体掩蔽或下调，病毒感染导致每个细胞中病毒基因组的一个或几个拷贝(Ch3 p104 in“Retroviruses”,JM Coffin,SHHughes,&HE Varmus 1997 Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring HarborNY；Fan等,J.Virol 28:802,1978)。通过操纵组织培养的情况，可以得到一定程度的多重感染，但通常小于5个拷贝/二倍体基因组。另外，目标细胞类型必须能够在病毒结合并穿透后支持复制周期的所有阶段。当病毒基因组整合到宿主的种系中时发生垂直传播。然后，病毒将像细胞基因一样代代相传。因此，内源性原病毒确定为：通常是潜伏的，但当宿主暴露于适当的药剂时会被激活。
术语“慢病毒”以其常规含义用于描述包含逆转录酶的病毒属。慢病毒包括“免疫缺陷病毒”，其包括人免疫缺陷病毒(HIV)1型和2型(HIV-1和HIV-2)和猴免疫缺陷病毒(SIV)。
如在病毒成熟过程中电子显微镜下所见，基于颗粒形态，历来将致癌病毒进一步细分为A组、B组、C组和D组。A型颗粒代表在感染细胞的细胞质中看到的B型病毒和D型病毒的不成熟颗粒。这些颗粒不具有感染性。B型颗粒通过包膜胞质内A型颗粒而从质膜出芽成为成熟病毒体。在膜上它们具有75nm的环形核心，长的糖蛋白纤突从该环形核心突出。出芽后，B型颗粒包含偏心定位的电子致密核心。原型B型病毒是小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)。在被C型病毒感染的细胞中不能观察到胞质内颗粒。相反，成熟颗粒通过月牙形“C”形凝结直接从细胞表面出芽，然后自身闭合并被质膜包围。包膜糖蛋白纤突连同均匀的电子致密核心可以是可见的。出芽可能发生于表面质膜或直接进入胞内液泡内。C型病毒被最通常地研究，包括许多禽白血病病毒和鼠白血病病毒(MLV)。牛白血病病毒(BLV)和人T细胞白血病病毒I型和II型(HTLV-I/II)由于它们从细胞表面出芽的形态而同样被分类为C型颗粒。然而，它们也具有正六边形形态和比原型C型病毒例如鼠白血病病毒(MLV)更复杂的基因组结构。D型颗粒与B型颗粒相似，因为它们在受感染细胞的细胞质中显示为环状结构，其从细胞表面发芽，但病毒体包含短的表面糖蛋白纤突。电子致密芯也偏心地位于颗粒内。梅森辉瑞猴病毒(MPMV)是原型D型病毒。
在用于治疗性使用具有重组复制能力的逆转录病毒的许多情况下，有利的是具有高水平的转基因表达，该转基因由具有重组复制能力的逆转录病毒编码。例如，对于前体药物活化基因例如胞嘧啶脱氨酶基因，有利的是在细胞中具有较高水平的CD蛋白表达，使得前药5-FC向5-FU的转化更高效。类似地，高水平的siRNA或shRNA表达导致更有效地抑制靶基因表达。对于细胞因子或单链抗体(scAb)，通常有利的是表达高水平的细胞因子或scAb。另外，在载体的一些拷贝中存在使载体或转基因的活性失活或损害的突变的情况下，在靶细胞中具有载体的多个拷贝是有利的，因为这提供了有效表达完整转基因的高可能性。
如上所述，整合的DNA中间体被称为前病毒。先前的基因治疗系统或基因递送系统使用的方法和逆转录病毒需要转录前病毒并同时在合适的辅助病毒存在下组装成感染性病毒，或需要在含有使得能够衣壳化而不会同时产生污染性辅助病毒的合适序列的细胞系中。如下所述，由于在基因组中提供用于衣壳化的序列，所以不需要辅助病毒来产生本公开的重组逆转录病毒，因此提供了用于基因递送或治疗的具有复制能力的逆转录病毒载体。
本公开的逆转录病毒基因组和原病毒DNA具有至少三种基因：gag、pol和env，这些基因可以侧接有一个或两个长末端重复序列(LTR)，或者在原病毒中侧接有两个长末端重复序列(LTR)和含有顺式作用序列例如psi的序列。gag基因编码内部结构(基质、衣壳和核衣壳)蛋白；pol基因编码RNA引导的DNA聚合酶(逆转录酶)、蛋白酶和整合酶；env基因编码病毒包膜糖蛋白。5'和/或3'LTR用于促进病毒体RNA的转录和聚腺苷酸化。LTR包含病毒复制所需的所有其它顺式作用序列。慢病毒具有另外的基因，包括vif、vpr、tat、rev、vpu、nef和vpx(在HIV-1、HIV-2和/或SIV中)。
邻近5'LTR是基因组逆转录(tRNA引物结合位点)和将病毒RNA有效衣壳化成颗粒(Psi位点)所需的序列。如果病毒基因组中缺失衣壳化(或将逆转录病毒RNA封装入感染性病毒体)所需的序列，则造成阻止基因组病毒RNA衣壳化的顺式缺陷。这种类型的修饰载体通常用于先前的基因递送系统(即，缺乏病毒体衣壳化所需的元件的系统)作为提供反式病毒蛋白的“辅助”元件，反式病毒蛋白封装非复制型但可封装的RNA基因组。
术语“表达”是指使得或引起基因或DNA序列中的信息变得明显，例如通过激活参与相应基因或DNA序列的转录和翻译的细胞功能来产生蛋白，或者在抑制剂RNA(RNAi)转录RNAi分子的情况下，使得产生RNAi分子并且能够抑制靶基因的表达。
DNA序列在细胞中或由细胞表达以形成“表达产物”，例如蛋白。表达产物本身例如所得到的蛋白，也可以说是由细胞“表达”的。例如，当多核苷酸或多肽在外源启动子或天然启动子控制下在外源宿主细胞中或在外源启动子控制下在天然宿主细胞中表达或产生时，多核苷酸或多肽被重组表达。
如上所述，在一些情况下，术语“表达”包括产生抑制性RNA分子(RNAi)。这种分子的表达不涉及细胞的翻译机制，而是利用细胞中的机制来修饰宿主细胞的基因表达。在一些实施方式中，可以修饰本公开的重组病毒载体以表达编码序列(例如蛋白)、表达RNAi分子或同时表达编码序列(例如，表达蛋白)和表达RNAi分子。
通常将重组复制病毒载体修饰成包含“盒”，其通常含有可操作地连接至允许有效表达的元件的待表达的异源基因或序列(例如启动子、IRES或允许转录和翻译异源序列的通读元件)。
可以将转基因(例如待表达的异源序列)插入逆转录病毒基因组的多个位置，包括在长末端重复序列(LTR)中插入包膜下游，以及在剪接受体之后，与病毒gag蛋白或pol蛋白、内部IRES序列或包膜编码序列下游的小内部启动子融合。将转基因插入到LTR中并引入额外的剪接受体导致载体基因组的快速不稳定化，而IRES和其它方法已显示出更多的前景。转基因的表达和构成可以至少部分地通过关键序列的合理改变(例如消除隐蔽剪接受体和转基因序列的人源化)而受到影响(参见例如美国专利号8,722,867，其公开内容通过引用并入本文)。转基因的大小也会影响载体稳定性。例如，在某些载体中，随着转基因大小的增加，病毒变得不稳定，并且快速删除至少部分异源基因或序列。这种限制因需要包括能够表达序列例如IRES(通常约600bp，参见例如美国专利号8,722,867)或小启动子(通常约250-300bp，参见例如国际申请公布号WO 2014/066700，其通过引用并入本文)而被加剧，可能在例如MLV中仅留下900-1200bp的异源基因或序列的插入片段。因此，能够最大化可用的转基因大小以包括更多的转基因选择或多个转基因将是非常有用的。
在人细胞中有效复制的逆转录病毒的一些实例包括鼠白血病病毒(MLV)以及长臂猿白血病病毒(GALV)、狒狒内源性病毒和猫病毒RD114的兼嗜性菌株、多变菌株、异嗜性菌株和10A1菌株。同样，已被修饰以包含非亲嗜性包膜基因(例如兼嗜性假型RRV)的MLV的亲嗜性菌株也可以在待治疗的多种物种和细胞类型中有效复制。然而，逆转录病毒包膜也可以被非逆转录病毒包膜如弹状、甲病毒、麻疹或流感病毒包膜所取代。
包括小核糖核酸病毒和脑心肌炎病毒的多种病毒在其基因组中编码2A或2A样肽从而介导来自单个ORF的多个蛋白表达。2A肽通常为约16-18个氨基酸序列并且共享共有基序(D[V/I]EXNPGP(SEQ ID NO：1)，其中X是任何氨基酸)。当2A肽在人工多顺反子mRNA中的ORF之间被编码时，它会导致核糖体在翻译多肽时在2A肽的C末端停止，从而导致来自每个ORF的多肽分离(Doronina等,2008)。分离点在2A的C末端处，其中下游ORF的第一个氨基酸是脯氨酸(参见例如图1)。2A肽的独特特性已经导致其用作用于从单个多顺反子mRNA结构进行多蛋白表达的分子工具。
2A肽存在于小核糖核酸病毒科的病毒基因组中，例如口蹄疫病毒和马鼻炎A病毒以及其它病毒例如猪捷申病毒-1和昆虫病毒明脉扁刺蛾β四体病毒(图1)。2A肽在其天然情况下具有接近100％的“分离”效率，而当它们被引入非天然序列时通常具有较低的“分离”效率。在不同种类的病毒中发现的其它2A样序列也显示在非天然序列中实现～85％“分离”效率(Donnelly等,1997)。存在大量2A样序列(图2)，其可以用于本公开的用于表达转基因的方法和组合物中。
尽管已知2A序列存在约20年，但它们在非天然环境中的作用能力已受到质疑。特别地，2A序列在先前翻译的蛋白的C末端上留下约17-22个额外的氨基酸，并将脯氨酸添加到下游蛋白的N末端上，因此可能影响先前蛋白的作用能力。如果蛋白需要在内质网和高尔基体中和/或在病毒体成熟过程中进行翻译后修饰(如在许多病毒包膜蛋白情况下(T.Murakami,Mol Biol Int.2012)，则对于先前蛋白存在进一步功能不足的风险。
图19示出了MLV包膜蛋白的处理，在包膜蛋白的C末端带有2A肽。通常，天然MLV包膜蛋白的处理包括将前体蛋白Pr85切割成在感染的宿主细胞中出现的gp70(SU)和p15E(TM)亚基。在从宿主细胞出芽期间，需要切割Pr85以将病毒包膜蛋白有效地掺入到病毒体内。随着病毒体从宿主细胞膜中出芽，病毒体经历成熟过程从而变得具有感染性。MLV病毒体成熟过程之一涉及通过病毒蛋白酶去除位于包膜蛋白TM亚基的C末端的R肽。在图19所示的情况下，取决于2A肽的序列，2A肽除了最后的氨基酸残基脯氨酸(Pro)之外被表达到R肽的下游，使得R肽的长度从16个氨基酸增加到至少32个氨基酸。尽管通过添加2A肽序列延长了R肽的长度，但是理论上，将随着R肽的切割同时去除2A肽，从而产生功能性包膜蛋白。
因此，如果包膜序列是非功能性的或衰减的，病毒载体很可能不会有用。已经尝试在具有仅感染小鼠的特定包膜(亲嗜性)的逆转录病毒构建体中使用特定2A序列(来自猪捷申病毒-1，“P2A”)(S.Stavrou等,PLoS Pathog 10(5):e1004145,2014；和E.P.Browne,J.Virol.89:155-64,2015)。然而，这些病毒不会感染人细胞，也不会预期解决一般的蛋白处理问题。此外，如此构建的病毒被设计成表达促进体内病毒复制的基因，而不是实现治疗效果。
本公开提供了具有复制能力的病毒载体，其含有编码例如胞嘧啶脱氨酶或其突变体、miRNA或siRNA、细胞因子、抗原结合结构域或编码可被递送给细胞或受试者的序列的组合等的异源多核苷酸。病毒载体可以是腺病毒载体、麻疹载体、疱疹载体、逆转录病毒载体(包括慢病毒载体)、弹状病毒载体例如水泡性口炎病毒载体、呼肠孤病毒载体、塞内卡谷病毒载体、痘病毒载体(包括动物痘或牛痘源性载体)、细小病毒载体(包括AAV载体)、甲病毒载体或本领域技术人员已知的其它病毒载体(也参见例如Concepts in GeneticMedicine,ed.Boro Dropulic and Barrie Carter,Wiley,2008,Hoboken,NJ.；TheDevelopment of Human Gene Therapy,ed.Theodore Friedmann,Cold Springs HarborLaboratory Press,Cold springs Harbor,New York,1999；Gene and Cell Therapy,ed.Nancy Smyth Templeton,Marcel Dekker Inc.,New York,New York,2000and Gene&Cell Therapy:Therapeutic Mechanism and Strategies,3rd.ed.,ed.Nancy SmythTempletone,CRC Press,Boca Raton,FL,2008；其公开内容通过引用并入本文)。
如下所述，本公开的RRV可以源自(即，亲本核苷酸序列得自)MLV、MoMLV、GALV、FELV等并被工程化为含有连接到异源核苷酸序列的2A肽或2A样肽(在本文中有时称为“2A-肽盒”)。
本公开的RRV可以被工程化以修饰它们的稳定性和/或表达。例如，由于在复制逆转录病毒载体时失活或衰减突变频率随着其在肿瘤组织中逐步复制而累积，所以可能发生表达改变。研究表明，最常见事件之一是G至A突变(与来自逆转录步骤中的第一复制步骤的负链单链DNA中的C至T特征性ApoBec介导的突变对应)。这会导致RRV蛋白的氨基酸组成发生改变，并导致TGG(色氨酸)到终止密码子(TAG或TGA)的破坏性改变。在一个实施方式中，通过具有相似化学或结构性质的其它氨基酸(如苯丙氨酸或酪氨酸)的替代密码子避免了这种失活改变。
因此，除了2A-肽盒之外，RRV可以包括多个另外的突变，其改进了构建体在宿主细胞中的表达和/或稳定性。这种突变可以包括对GAG编码序列、POL编码序列和/或ENV编码序列中的一个或多个密码子的修饰，其将色氨酸密码子改变为维持GAG结构域、POL结构域和/或ENV结构域的生物学活性的可允许密码子。本领域已知，色氨酸的密码子是UGG(DNA中的TGG)。此外，本领域已知，“终止密码子”是UAA、UAG或UGA(DNA中的TAA、TAG或TGA)。色氨酸密码子中的单点突变并产生非天然终止密码子(例如，UGG→UAG或UGG→UGA)。也已知，人APOBEC3GF(hA3G/F)通过G→A超突变抑制逆转录病毒复制(Neogi等,J.Int.AIDS Soc.,16(1):18472,2013年2月25日)。此外，如下所述，通过避免在编码序列中使用色氨酸密码子，能够改进长期表达和病毒稳定性，从而避免由于hA3G/F引起的超突变而引入非天然终止密码子。例如，在一个实施方式中，MLV源性核酸序列包括GAG编码结构域、POL编码结构域和ENV编码结构域(例如，gag核酸结构域包含SEQ ID NO：2的从约核苷酸编号1203至约核苷酸2819的序列，pol结构域包含SEQ ID NO：2的从约核苷酸编号2820至约核苷酸6358的序列，env结构域包含SEQ ID NO：2的从约核苷酸编号6359至约核苷酸8323的序列)。通过修饰含有在色氨酸密码子中的表1中指定的核苷酸(参考SEQ ID NO：2的核苷酸编号)的密码子，可以提供抗hA3G/F的RRV。
表1.对使得色氨酸到终止密码子改变的周期性G到A突变的概述。“核苷酸”是指SEQ ID NO：2RRV基因组中的位置，“基因”是指核苷酸所在的基因，AA是指多肽中的氨基酸位置。
因此，在本公开的一个实施方式中，提供了具有重组复制能力的逆转录病毒，其包括色氨酸密码子中的一个或多个突变，其中所述突变将密码子改变为不同于色氨酸的氨基酸的密码子并且提供生物相容性的密码子(即不破坏载体功能的密码子)。该载体具有“ApoBec失活抗性”。重组ApoBec失活抗性载体可以包含IRES盒、启动子盒和/或2A肽盒。如本文所用，IRES盒包含与编码期望的生物活性分子的异源多核苷酸可操作地连接的内部核糖体进入位点(参见例如美国专利号8,829,173，其通过引用并入本文)。如本文所用，启动子盒包含启动对编码期望的生物学活性分子的下游异源多核苷酸进行转录的调节结构域(参见例如美国专利号8,829,173和美国专利公布号2015/0273029A1，其并入本文)。启动子可以是组织特异性启动子、polIII启动子或小启动子。在本文其它地方描述了2A肽盒。
在一个实施方式中，病毒载体可以是仅能感染分裂哺乳动物细胞的具有复制能力的逆转录病毒载体。在一个实施方式中，具有复制能力的逆转录病毒载体包含2A肽或2A肽样序列，其恰好在下游并且与逆转录包膜可操作地连接并且恰好在待表达的异源核酸序列的上游。在某些实施方式中，载体可以另外包含IRES盒或polIII(或小启动子)盒。异源多核苷酸可编码例如胞嘧啶脱氨酶、胸苷激酶、细胞因子、受体、抗体等。当包含polIII启动子或小启动子时，载体还可以表达miRNA、siRNA或其它RNAi序列。
在另一个实施方式中，本公开提供了ENV-2A异源基因盒。该盒可以包含选自兼嗜性、多变性、异嗜性、10A1、GALV、狒狒内源性、RD114、弹状、甲病毒、麻疹和流感病毒包膜中的一个的包膜。2A肽或2A肽样编码序列可以是与包膜编码序列的C末端可操作地连接的图1或图2中所示的任何序列。在另一个实施方式中，2A肽或2A肽样编码序列通过GSG连接子序列(例如ggaagcgga(SEQ ID NO：3))连接。异源基因与2A肽或2A肽样序列的C末端可操作地连接。异源基因可以是要被递送并在靶细胞中表达的任何期望的基因。在一个实施方式中，异源基因的长度为500-1500bp或在其之间的任何数值(例如，1000bp、1100bp、1200bp、1300bp、1400bp等)。在另一个实施方式中，异源基因的长度>1500bp。在另一个实施方式中，该盒包含由2A肽或2A肽样序列分开的两个异源基因。在又一个实施方式中，该盒可以包含可操作地连接在异源基因的env的C末端和N末端之间的2A肽或2A肽样序列，其中所述异源基因后接第二盒，该第二盒包含与第二异源序列连接的IRES或启动子。
本公开提供修饰的逆转录病毒载体。修饰的逆转录病毒载体可以源于逆转录病毒科的成员，并被工程化为含有ENV-2A转基因盒。如上所述，逆转录病毒科由三组组成：泡沫病毒属(或泡沫病毒)，如人泡沫病毒(HFV)；慢病毒以及绵羊髓鞘脱落病毒；和致癌病毒(尽管并非该组内的所有病毒都是致癌的)。
在一个实施方式中，本公开提供了能够感染非分裂细胞、分裂细胞或具有细胞增殖性病症的细胞的重组逆转录病毒。本公开的具有重组复制能力的逆转录病毒包括编码病毒GAG、病毒POL、病毒ENV的多核苷酸序列，之前接有2A肽或2A肽样编码序列异源多核苷酸(例如1-50(1-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50或它们之间的任何整数)个核苷酸)紧接在病毒ENV序列下游并被包封在病毒体内。
短语“非分裂”细胞是指未经有丝分裂的细胞。只要细胞没有正活跃地分裂，非分裂细胞可以在细胞周期中的任何时刻被阻断(例如G0/G1、G1/S、G2/M)。对于离体感染，可以通过本领域技术人员使用的标准技术处理分裂细胞以阻断细胞分裂，所述标准技术包括辐射、蚜肠霉素处理、血清饥饿和接触抑制。然而，应该理解，离体感染通常在不阻断细胞的情况下进行，因为许多细胞已经被抑制(例如干细胞)。例如，重组慢病毒载体能够感染非分裂细胞。体内先已存在的非分裂细胞的实例包括神经元细胞、肌肉细胞、肝脏细胞、皮肤细胞、心脏细胞、肺细胞和骨髓细胞及其派生物。对于分裂细胞，可以使用逆转录病毒载体。
“分裂”细胞是指经历活跃有丝分裂或减数分裂的细胞。这种分裂细胞包括干细胞、皮肤细胞(例如成纤维细胞和角化细胞)、配子和本领域已知的其它分裂细胞。术语分裂细胞所特别相关且包括的是具有细胞增殖性病症的细胞，例如赘生性细胞。术语“细胞增殖性病症”是指以异常数量的细胞分裂为特征的病症。该病症可以包括肥大型细胞增长(导致组织内细胞群过度生长的细胞的连续繁殖)和营养不良型细胞生长(组织内缺乏或缺乏细胞)或细胞过度汇入或迁移到身体区。细胞群不一定是转化细胞、致瘤性细胞或恶性细胞，而是也可以包括正常细胞。细胞增殖性病症包括与结缔组织过度生长相关的病症，例如各种纤维化病症，包括硬皮病、关节炎和肝硬化。细胞增殖性病症包括肿瘤性病症如头颈癌。头颈癌包括例如口腔癌、食道癌、咽喉癌，喉癌、甲状腺癌，舌癌、唇癌、唾液腺癌、鼻癌、鼻窦癌、鼻咽癌、上鼻穹窿肿瘤和鼻窦肿瘤、鼻腔神经胶质瘤、鳞状细胞癌、恶性黑素瘤、鼻窦未分化癌(SNUC)、脑瘤变(包括成胶质细胞瘤例如多形性成胶质细胞瘤)或血液瘤变。还包括局部淋巴结(包括颈部淋巴结、喉前淋巴结、肺的食管旁淋巴结和颌下淋巴结)的癌症(Harrison's Principles of Internal Medicine(eds.,Isselbacher等,McGraw-Hill,Inc.,13th Edition,ppl850-1853,1994)。其它癌症类型包括但不限于肺癌、结肠-直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、尿道癌、子宫癌淋巴瘤、口腔癌、胰腺癌、白血病、黑素瘤、胃癌、皮肤癌和卵巢癌。细胞增殖性疾病还包括类风湿性关节炎(O’Dell NEJM 350:2591 2004)和以不适当免疫系统细胞增殖为特征的其它自身免疫性疾病(Mackay等NEJM 345:340 2001)。
异源核酸序列可操作地连接至编码2A肽或2A肽样序列的序列。如本文所用，术语“异源”核酸序列或转基因是指(i)通常不存在于野生型逆转录病毒中的序列，(ii)源自外来物种的序列，或(iii)如果来自同一物种，它可以是从其原型经过实质性修改。或者，通常在细胞中不表达的未改变的核酸序列是异源核酸序列。
根据本公开的逆转录病毒载体的预期用途，可以将任何数量的异源多核苷酸或核酸序列插入逆转录病毒载体中。例如，对于体外研究，可以使用常用的标记基因或报告基因，包括抗生素抗性分子和荧光分子(例如GFP(绿色荧光蛋白))或发光分子。编码任何所需多肽序列的另外的多核苷酸序列也可插入到本公开的载体中。
当寻求异源核酸序列的体内递送时，可以使用治疗性序列和非治疗性序列两者。例如，在一些实施方式中，ENV-2A-转基因盒可以后接有polIII-RNAi盒或IRES-盒。例如，在使用微启动子或polIII盒的情况下，该盒可以包含异源序列，其包括针对与细胞增殖性病症或其它基因相关疾病或病症相关的特定基因的miRNA、siRNA等。在其它实施方式中，2A肽或2A肽样序列或IRES下游的异源基因可以是自杀基因(例如具有胞嘧啶脱氨酶活性的HSV-tk或PNP或多肽；修饰的或未修饰的)、生长因子或治疗性蛋白(例如因子IX、IL2等)。本领域容易确定可用于本公开的其它治疗性蛋白。
在一个实施方式中，载体内的异源多核苷酸包含已经被优化用于在人细胞中表达的胞嘧啶脱氨酶或胸苷激酶。在另一个实施方式中，胞嘧啶脱氨酶包含已经人密码子优化的序列，并包含与野生型胞嘧啶脱氨酶相比增加胞嘧啶脱氨酶稳定性(例如减弱的降解或增强的热稳定性)的突变和/或包括将色氨酸密码子改变为非编码色氨酸的密码子。在又一个实施方式中，异源多核苷酸编码融合构建体，其包含与编码具有UPRT或OPRT活性的多肽的多核苷酸可操作地连接的具有胞嘧啶脱氨酶活性的多肽(经人密码子优化的或未优化的，突变的或非突变的)。
如上所述，人APOBEC3g在转化G→A的病毒载体序列中引起超突变。因此，2A肽盒中所含的异源多核苷酸中的色氨酸密码子易于被hAPOBEC3转化为终止密码子。为了避免这种突变，色氨酸密码子可以用生物学允许的其它氨基酸密码子代替。例如，在一个实施方式中，本公开的2A盒可以包含编码具有胞嘧啶脱氨酶活性的多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含以下序列：
该序列包含两个色氨酸密码子(粗体/下划线)。在本公开的一个实施方式中，这些密码子独立地被改变为提供选自由D、M、T、E、S、Q、N、F、Y、A、K、H、P、R、V、L、G、I和C所组成的组中的氨基酸的密码子。所得多肽包含序列：
其中所述多肽包含胞嘧啶脱氨酶活性，其中X是除色氨酸以外的任何氨基酸。在一个实施方式中，SEQ ID NO：29中的X各自独立地选自由F、D、M、L、S或R组成的组。
在另一个实施方式中，具有复制能力的逆转录病毒载体可以包含编码包含胞嘧啶脱氨酶的多肽的异源多核苷酸(如本文所述)，并且还可以包含含有miRNA或siRNA分子(作为来自病毒启动子的初级转录本或与启动子连接)的多核苷酸，miRNA或siRNA分子可以是细胞型的或组织特异性的。在又一个实施方式中，miRNA或siRNA可以在pol III启动子之前。
微小RNA(miRNA)是小的非编码RNA。它们位于编码或非编码基因的内含子、非编码基因的外显子内或基因间区内。miRNA编码序列由RNA聚合酶II转录，其产生称为初级前体miRNA(pri-miRNA)的前体多核苷酸。核内的pri-miRNA由核糖核酸酶Drosha处理以产生形成短发夹结构的miRNA前体(pre-miRNA)。随后，pre-miRNA通过输出蛋白5被转运至细胞质，并由另一种称为Dicer的核糖核酸酶进一步处理以产生活性的成熟miRNA。
成熟miRNA长约21个核苷酸。它通过与靶基因的mRNA的3'非翻译区结合而发挥作用，并通过抑制蛋白翻译或降解mRNA来抑制蛋白表达。miRNA参与生物过程，包括发育、细胞增殖、分化和癌症进展。miRNA分布的研究表明，某些miRNA表达是组织特异性的或在某些组织中富集。例如，已证明miR-142-3p表达、miR-181表达和miR-223表达在人和小鼠的造血组织中富集(Baskerville等,2005 RNA 11,241-247；Chen等,2004 Science 303，83-86)。
已经观察到一些miRNA在多种肿瘤中上调(致癌miRNA)或下调(抑制物)(Spizzo等,2009 Cell 137,586e1)。例如，miR-21在成胶质细胞瘤、乳腺癌，肺癌、前列腺癌、结肠癌、胃癌、食道癌以及宫颈癌、子宫平滑肌肉瘤、DLBCL、头颈癌中过表达。相比之下，已报道let-7成员在成胶质细胞瘤、肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌和结肠癌中下调。在癌症中重新建立miRNA表达的内稳态是抑制或逆转癌症进展的必要机制。
在癌症中下调的miRNA可用作抗癌剂。实例包括mir-128-1、let-7、miR-26、miR-124和miR-137(Esquela-Kerscher等,2008Cell Cycle 7,759-764；Kumar等,2008 ProcNatl Acad Sci USA 105,3903-3908；Kota等,2009 Cell 137,1005-1017；Silber等,2008BMC Medicine 6:14 1-17)。已报道miR-128表达在中枢神经系统中富集并且已经观察到在成胶质细胞瘤中下调(Sempere等,2004 Genome Biology 5:R13.5-11；Godlewski等,2008Cancer Res 68:(22)9125-9130)。miR-128由两个不同的基因：miR-128-1和miR-128-2编码。两者都被处理成相同的成熟序列。已报道Bmi-1和E2F3a是miR-128的直接靶标(Godlewski等,2008 Cancer Res 68:(22)9125-9130；Zhang等,2009 J.Mol Med 87:43-51)。此外，已观察到Bmi-1表达在多种人类癌症中上调，包括神经胶质瘤、套细胞淋巴瘤、非小细胞肺癌B细胞非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、结肠直肠癌和前列腺癌。此外，已证实Bmi-1对于来自不同组织的干细胞的自我更新是必需的，所述干细胞包括神经干细胞以及神经胶质瘤中的“干样”细胞群。
如本文所用，术语“RNA干扰”(RNAi)是指由短干扰核酸(siRNA或微RNA(miRNA))介导的序列特异性的转录后基因沉默的过程。术语“能够介导RNA干扰的试剂”是指siRNA以及当在细胞内转录时编码siRNA的DNA和RNA载体。术语siRNA或miRNA意在涵盖能够介导序列特异性的RNA干扰的任何核酸分子，例如短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、短干扰寡核苷酸、短干扰核酸、短干扰经修饰寡核苷酸、经化学修饰的siRNA、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)等。
用于设计发夹型双链体的干长度的合适范围包括20-30个核苷酸、30-50个核苷酸、50-100个核苷酸、100-150个核苷酸、150-200个核苷酸、200-300个核苷酸、300-400个核苷酸、400-500个核苷酸、500-600个核苷酸和600-700个核苷酸的干长度。用于设计发夹型双链体环长度的合适范围包括4-25个核苷酸、25-50个核苷酸的环长度，或者如果毛发双链体的干长度很大，则长度更长。在某些情况下，无论环的序列和长度如何，具有长于21个核苷酸的双链区的发夹结构都可以促进有效的siRNA引导的沉默。
在又一或另外的实施方式中，异源多核苷酸可以包含细胞因子，例如白介素或干扰素γ等。可从本公开的逆转录病毒载体表达的细胞因子包括但不限于IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、1L-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35,IL-36、IL-37、IL-38、抗-CD40、CD40L、IFN-γ和TNF-α；TNF-α、淋巴毒素-α(LT-α，也称为TNF-β)、LT-β(发现于复杂异源三聚体LT-α2-β)、OPGL、FasL、CD27L、CD30L、CD40L、4-1BBL、DcR3、OX40L、TNF-γ(国际公开号WO 96/14328)、AIM-I(国际公开号WO 97/33899)、内介素(endokine)-α(国际公开号WO 98/07880)、OPG和neutrokine-α(国际公开号WO 98/18921，OX40和神经生长因子(NGF)的可溶形式；Fas、CD30、CD27、CD40和4-IBB、TR2(国际公开号WO 96/34095)、DR3(国际公开号97/33904)、DR4(国际公开号WO 98/32856)、TR5(国际公开号WO 98/30693)、TRANK、TR9(国际公开号WO 98/56892)、TR10(国际公开号WO 98/54202)、312C2(国际公开号WO 98/06842)和TR12的可溶形式，以及可溶形式CD154、CD70和CD153。血管生成蛋白可以用于一些实施方式中，特别是用于从细胞系产生蛋白。这种血管生成因子包括但不限于：神经胶质瘤衍生的生长因子(GDGF)、血小板衍生的生长因子-A(PDGF-A)、血小板衍生的生长因子-B(PDGF-B)、胎盘生长因子(PIGF)、胎盘生长因子-2(PIGF-2)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子-A(VEGF-A)、血管内皮生长因子-2(VEGF-2)、血管内皮生长因子B(VEGF-3)、血管内皮生长因子B-1 86(VEGF-B186)、血管内皮生长因子-D(VEGF-D)、血管内皮生长因子-D(VEGF-D)和血管内皮生长因子-E(VEGF-E)。成纤维细胞生长因子可以通过本公开的载体递送，包括但不限于FGF-1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14和FGF-15。造血生长因子可以使用本公开的载体递送，这种生长因子包括但不限于粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(沙格司亭)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)(非格司亭)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF、CSF-1)促红细胞生成素(epoetinα)、干细胞因子(SCF、c-kit配体、青灰因子)、巨核细胞集落刺激因子、PIXY321(GMCSF/IL-3)融合蛋白等。
术语“调控核酸序列”统指全体提供用于在受体细胞中复制、转录和翻译编码序列的启动子序列/区、多腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控结构域、复制起点、增强子等。并非需要所有这些控制序列都总是存在。只要所选择的编码序列能够在合适的宿主细胞中被复制、转录和翻译即可。本领域技术人员可以容易地从公共数据库和材料中识别调控核酸序列。此外，本领域技术人员可以识别适用于预期用途(例如体内、离体或体外)的调控序列。
术语“启动子区”在本文中以其常规含义用于指包含DNA调控序列的核苷酸区，其中调控序列源于能够结合RNA聚合酶并启动下游(3'-方向)编码序列的转录的基因。调控序列可与所需基因序列同源或异源。例如可使用多种启动子，包括病毒启动子或哺乳动物启动子。
“2A肽或2A肽样序列”是指具有SEQ ID NO：1的共有序列的肽，其是与图1和图2中的任何序列97％相同的序列，并且其含有SEQ ID NO：1的共有序列。“编码”2A肽或2A肽样序列的序列是编码具有例如SEQ ID NO：1的共有序列的2A肽或2A肽样序列的多核苷酸序列。在一个实施方式中，编码序列在ENV和异源序列之间可操作地连接并且置于它们之间，使得一旦该序列被转录，即被转录为单个转录本(例如，多mRNA)，并且当转录本被翻译时，产生两个多肽(例如，ENV多肽和异源多肽)。
内部核糖体进入位点(“IRES”)是指在编码序列(通常在IRES的3'末端)翻译的过程中促进核糖体进入或保留的核酸片段。在一些实施方式中，IRES可以包含剪接受体/供体位点，然而，优选的IRES缺少剪接受体/供体位点。通常，核糖体进入信使RNA通过位于所有真核mRNA的5'末端的帽进行。然而，也存在针对这个普遍规则的例外情况。在某些病毒mRNA中没有帽表明存在允许核糖体进入这些RNA的内部位点的可替选结构。迄今为止，基于它们的功能而命名为IRES的许多这些结构已经在未封帽的病毒mRNA的5'非编码区中得以识别，这些病毒例如小核糖核酸病毒，特别是脊髓灰质炎病毒(Pelletier等,1988,Mol.Cell.Biol.,8,1103-1112)和EMCV病毒(脑心肌炎病毒(Jang等,J.Virol.,62,2636-2643 1988；B.T.Baranick等,Proc Natl Acad Sci U S A.105:4733-8,2008)。本公开提供了IRES在具有复制能力的逆转录病毒载体的背景下的用途。
异源核酸序列通常在病毒LTR启动子-增强子元件或内部启动子的控制下，而逆转录病毒LTR内的保留元件仍然可以使载体有效整合到宿主细胞基因组中。因此，本公开的重组逆转录病毒载体、所需序列、基因和/或基因片段可以在多个位点并在不同调控序列下插入。例如，用于插入的位点可以是病毒增强子/启动子近端位点(即5'LTR驱动的基因座)。
在一个实施方式中，本公开的逆转录病毒基因组含有2A肽或2A肽样编码序列，其包含用于插入期望/异源多核苷酸的在2A肽或2A肽样编码序列下游的克隆位点。在一个实施方式中，2A肽或2A肽样编码序列位于逆转录病毒载体中的env基因的3'末端，但位于所需异源多核苷酸的5'末端。因此，编码所需多肽的异源多核苷酸与2A肽或2A肽样编码序列可操作地连接。
在另一实施方式中，包含靶向多核苷酸序列作为本公开的重组逆转录病毒载体的一部分。靶向多核苷酸序列是靶向配体(例如肽激素，例如调蛋白、单链抗体、受体或受体的配体)、组织特异性或细胞类型特异性调控元件(例如，组织特异性或细胞类型特异性启动子或增强子)或靶向配体和组织特异性/细胞类型特异性调控元件的组合。优选地，靶向配体与逆转录病毒的env蛋白可操作地连接，产生嵌合逆转录病毒env蛋白。病毒GAG蛋白、病毒POL蛋白和病毒ENV蛋白可以源于任何合适的逆转录病毒(例如源自MLV或源自慢病毒)。在另一个实施方式中，病毒ENV蛋白源自非逆转录病毒(例如CMV或VSV)。
在一个实施方式中，本公开的重组逆转录病毒被遗传修饰，以使得病毒靶向特定细胞类型(例如，平滑肌细胞、肝细胞、肾细胞、成纤维细胞、角化细胞、间充质干细胞、骨髓细胞、软骨细胞、上皮细胞、肠细胞、乳房细胞、赘生性细胞、神经胶质瘤细胞、神经元细胞和本领域已知的其它细胞)，从而使得逆转录病毒载体的重组基因组被递送至非分裂靶细胞、分裂靶细胞或具有细胞增殖性病症的靶细胞。
在一个实施方式中，逆转录病毒载体通过与在细胞外表面上具有分子的细胞结合而靶向细胞。这种使逆转录病毒靶向的方法利用靶向配体在逆转录病毒外层上的表达，来辅助将病毒靶向至具有与逆转录病毒表面上的靶向配体相互作用的受体或结合分子的细胞或组织。在病毒感染细胞后，病毒将其核酸注入细胞中，并且逆转录病毒遗传物质可以整合到宿主细胞基因组中。
通过将相关异源多核苷酸与另一个编码例如特定靶细胞上的受体的配体的基因一起插入到本公开的病毒载体中，该载体此时是靶特异性的。通过附接例如糖、糖脂或蛋白可以使病毒载体具有靶特异性。靶向可以通过使用抗体靶向病毒载体来完成。本领域技术人员将知道或可以容易地确定可以插入到病毒基因组中的特定多核苷酸序列或可以附接到病毒包膜上的蛋白，以使得靶特异性递送包含相关核酸序列的病毒载体。
因此，本公开在一个实施方式中包括嵌合env蛋白，其包含可操作地连接至靶向多肽的逆转录病毒ENV蛋白。靶向多肽可以是细胞特异性受体分子、细胞特异性受体的配体、细胞特异性抗原表位的抗体或抗体片段、或本领域容易识别的能够与靶细胞结合或相互作用的任何其它配体。靶向多肽或分子的实例包括使用生物素-链亲和素作为连接子的二价抗体(Etienne-Julan等,J.Of General Virol.,73,3251-3255(1992)；Roux等,Proc.Natl.Acad.Sci USA 86,9079-9083(1989))、在其包膜中含有编码针对半抗原的单链抗体可变区的序列的重组病毒(Russell等,Nucleic Acids Research,21,1081-1085(1993))、肽激素配体克隆到逆转录病毒包膜中(Kasahara等,Science,266,1373-1376(1994))、嵌合EPO/env构建体(Kasahara等,1994)、针对亲嗜性MLV包膜中的低密度脂蛋白(LDL)受体的单链抗体，导致表达LDL受体的HeLa细胞的特异性感染(Somia等,Proc.Natl.Acad.Sci USA,92,7570-7574(1995))，类似地，宿主范围的ALV可以通过掺入整联蛋白配体而改变，使病毒现在能够跨物种而特异性感染大鼠胶质细胞瘤细胞(Valsesia-Wittmann等,J.Virol.68,4609-4619(1994))，并且Dornberg及其合作者(Chu和Dornburg,J.Virol 69,2659-2663(1995)；M.Engelstadter等,Gene Therapy 8,1202–1206(2001))已经报道了使用包含针对肿瘤标志物的单链抗体的包膜来组织特异性靶向脾脏坏死病毒(SNV)(禽逆转录病毒)。
本公开提供了一种产生能够感染靶细胞的重组逆转录病毒的方法，其包括：用以下各项转染合适的宿主细胞：包含编码病毒gag、病毒pol和病毒env的多核苷酸序列的载体，可操作地连接在env和异源多核苷酸之间的2A肽或2A肽样编码序列；以及回收重组病毒。
本公开的逆转录病毒和方法提供了一种具有复制能力的逆转录病毒，其不需要辅助病毒或另外的核酸序列或蛋白以便繁殖和产生病毒体。例如，如上所述，本公开的逆转录病毒的核酸序列分别编码组特异性抗原和逆转录酶(以及成熟和逆转录所必需的整合酶和蛋白酶-酶)。病毒gag和pol可以源于慢病毒，例如HIV或致癌病毒或γ逆转录病毒例如MoMLV。另外，本公开的逆转录病毒的核酸基因组包含编码病毒包膜(ENV)蛋白的序列。env基因可以来自任何逆转录病毒。env可以是允许转导人和其它物种的细胞的兼嗜性包膜蛋白，或者可以是只能转导小鼠和大鼠细胞的亲嗜性包膜蛋白。此外，可能需要通过将包膜蛋白与抗体或用于靶向特定细胞类型的受体的特定配体连接来靶向重组病毒。如上所述，通过插入例如糖脂或蛋白可以使逆转录病毒载体具有靶特异性。靶向通常通过使用抗体将逆转录病毒载体靶向至特定细胞类型(例如，在某个组织中发现的细胞类型或癌细胞类型)上的抗原来完成。本领域技术人员将知道或可以无需过多实验即可容易地获得用于将逆转录病毒载体递送至特定靶标的具体方法。在一个实施方式中，env基因源自非逆转录病毒(例如CMV或VSV)。源自逆转录病毒的env基因的实例包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和劳斯肉瘤病毒(RSV)。也可使用其它env基因，例如水泡性口炎病毒(VSV)(蛋白G)、巨细胞病毒包膜(CMV)或流感病毒血凝素(HA)。
在一个实施方式中，逆转录病毒基因组源于致癌逆转录病毒，更特别地源于哺乳动物致癌逆转录病毒。在另一个实施方式中，逆转录病毒基因组源于γ逆转录病毒，更特别地源于哺乳动物γ逆转录病毒。“源于”是指，亲本多核苷酸序列是已通过插入或去除天然存在的序列(例如插入2A肽或2A肽样编码序列和编码多肽的异源多核苷酸，以及任选的一个或多个IRES或分别与另一个异源多核苷酸或相关抑制性核酸连接的polIII启动子)而被修饰的野生型致癌病毒。
在另一个实施方式中，本公开提供了使用调控序列靶向的逆转录病毒载体。细胞或组织特异性调控序列(例如启动子)可用于靶向特定细胞群中的基因序列的表达。在本文其它地方描述了用于本公开的合适的哺乳动物启动子和病毒启动子。因此，在一个实施方式中，本公开提供了一种逆转录病毒，其在逆转录病毒基因组的5'末端具有组织特异性启动子元件。通常，组织特异性调控元件/序列在逆转录病毒基因组的LTR的U3区，包括例如细胞或组织特异性启动子和赘生性细胞的增强子(例如，肿瘤细胞特异性增强子和启动子)以及诱导型启动子(例如四环素)。
本公开的转录控制序列还可以包括天然存在的与编码超级抗原、细胞因子或趋化因子的基因天然相关的转录控制序列。
在一些情况下，可能需要调控表达。例如，根据期望的表达水平，可以使用具有不同活性强度的不同病毒启动子。在哺乳动物细胞中，CMV立即早期启动子常常用于提供强烈的转录激活。当需要降低的转基因表达水平时，还已经使用效力较弱的CMV启动子的修饰版本。当需要在造血细胞中表达转基因时，可以使用逆转录病毒启动子，例如来自MLV或MMTV的LTR。可以使用的其它病毒启动子包括SV40、RSV LTR、HIV-1和HIV-2LTR、腺病毒启动子例如来自E1A、E2A、或MLP区、AAV LTR、花椰菜花叶病毒、HSV-TK和禽肉瘤病毒。
类似地，组织特异性或选择性启动子可用于实施特定组织或细胞中的转录，以减少对非靶向组织的潜在毒性或不良影响。例如，可以使用启动子例如PSA、probasin、前列腺酸性磷酸酶或前列腺特异性腺激肽释放酶(hK2)来靶向前列腺中的基因表达。乳清辅助蛋白(WAP)可用于乳房组织表达(Andres等，PNAS 84:1299-1303,1987)。下面列出了可以使用的其它启动子/调控结构域。
“组织特异性调控元件”是能够驱动基因在一个组织中转录同时在其它组织类型中在很大程度上保持“沉默”的调控元件(例如启动子)。然而，应该理解，组织特异性启动子在期望它们沉默的那些组织中可具有可检测量的“背景”或“基本”活性。启动子在靶组织中被选择性激活的程度可以表示为选择性比率(靶组织中的活性/对照组织中的活性)。在这方面，可用于本公开的实践中的组织特异性启动子通常具有大于约5的选择性比率。优选地，选择性比率大于约15。
在某些适应症中，可能需要在施用本公开的具有重组复制能力的逆转录病毒(RRV)后的特定时间激活转录。这可以用可激素或细胞因子调节的启动子完成。例如，在指征是产生特定类固醇或被递送特定类固醇的性腺组织的治疗应用中，使用雄激素或雌激素调节的启动子可以是有利的。这种可激素调节的启动子包括MMTV、MT-1、蜕皮激素和二磷酸核酮糖羧化酶。可以使用其它可激素调节的启动子，例如对甲状腺、脑垂体和肾上腺激素有应答的启动子。可使用的细胞因子和炎症蛋白应答启动子包括K激肽原和T激肽原(Kageyama等,1987)、c-fos、TNF-α、C-反应蛋白(Arcone等,1988)、触珠蛋白(Oliviero等，1987)、血清淀粉样蛋白A2、C/EBPα、IL-1、IL-6(Poli和Cortese，1989)、补体C3(Wilson等,1990)、IL-8、α-1酸性糖蛋白Prowse和Baumann，1988)、α-1抗胰蛋白酶、脂蛋白脂肪酶(Zechner等，1988)、血管紧张素原(Ron等,1990)、纤维蛋白原、c-jun(可由佛波酯、TNF-α、紫外辐射、视黄酸和过氧化氢诱导)、胶原酶(由佛波酯和视黄酸诱导)、金属硫蛋白(重金属和糖皮质激素诱导的)、溶基质素(可由佛波酯、白介素-1和EGF诱导)、α-2巨球蛋白和α-1抗胰凝乳蛋白酶。肿瘤特异性启动子例如骨钙蛋白、缺氧应答元件(HRE)、MAGE-4、CEA、α-甲胎蛋白、GRP78/BiP和酪氨酸酶也可用于调节肿瘤细胞中的基因表达。
另外，不应将该启动子列表解释为穷举或限制性的，本领域技术人员将知晓可与本文公开的启动子和方法结合使用的其它启动子。
表2组织特异性启动子
还应理解，某些启动子虽然对单一组织类型的活性不受限制，然而可以表现出选择性，因为它们可以在一组组织中有活性，而在另一组中活性较低或沉默。这种启动子也称为“组织特异性的”，并且预期与本公开一起使用。例如，在多种中枢神经系统(CNS)神经元中具有活性的启动子可能在治疗上用于防止由于中风(可能影响脑的许多不同区中的任何区)造成的损伤。因此，本公开中使用的组织特异性调控元件具有对异源蛋白的调节的适用性以及作为本逆转录病毒载体中的靶向多核苷酸序列的适用性。
在又一个实施方式中，本公开提供了包含重组逆转录病毒源性构建体的质粒。该质粒可以被直接引入靶细胞或细胞培养物中，例如HT1080、NIH 3T3或其它组织培养细胞。所得到的细胞将逆转录病毒载体释放到培养基中。
本公开提供了包含5'至3'的多核苷酸构建体：用于启动转录的启动子或调控区；psi封装信号；gag编码核酸序列、pol编码核酸序列；env编码核酸序列；2A肽或2A肽样编码序列；编码标志物、治疗性或诊断性多肽的异源多核苷酸；可选的IRES或polIII盒；和LTR核酸序列。如上所述，可以修饰gag核酸结构域、pol核酸结构域和env核酸结构域以去除由ApoBec3转化成终止密码子的色氨酸密码子。在某些其它实施方式中，载体还可以在异源多核苷酸下游和3'LTR上游包含polIII盒或IRES盒。如本文其它地方和如下所述，本公开的多核苷酸构建体(例如，具有重组复制能力的逆转录病毒多核苷酸)的多个区段在某种程度上取决于期望的宿主细胞、表达时机或表达量以及异源多核苷酸而工程化。本公开的具有复制能力的逆转录病毒构建体可以分成许多可由本领域技术人员单独修饰的结构域。
例如，所述启动子可以包含具有如SEQ ID NO：2所示的从核苷酸1至核苷酸582的序列的CMV启动子，并且可以包括对一个或多个(例如2-5、5-10、10-20、20-30、30-50、50-100或更多个核酸碱基)的修饰，只要经修饰的启动子能够引导和启动转录即可。在一个实施方式中，启动子或调控区包含CMV-R-U5结构域多核苷酸。CMV-R-U5结构域包含来自与MLVR-U5区连接的人巨细胞病毒的立即早期启动子。在一个实施方式中，CMV-R-U5结构域多核苷酸包含如SEQ ID NO：2所示的从约核苷酸1至约核苷酸1202的序列或与如SEQ ID NO：2所示的序列至少95％相同的序列，其中所述多核苷酸促进与其可操作地连接的核酸分子的转录。多核苷酸的gag结构域可以源于任何数量的逆转录病毒，但通常源于致癌逆转录病毒，更特别地来自哺乳动物致癌逆转录病毒例如MLV。在一个实施方式中，gag结构域包含SEQID NO：2的从约核苷酸编号1203至约核苷酸2819的序列或与其具有至少95％、98％、99％或99.8％(四舍五入至最接近的第10个)同一性的序列。多核苷酸的pol结构域可以源于任何数量的逆转录病毒，但通常源于致癌逆转录病毒，更特别地来自哺乳动物致癌逆转录病毒例如MLV。在一个实施方式中，pol结构域包含SEQ ID NO：2的从约核苷酸2820至约核苷酸6358的序列或与其具有至少95％、98％、99％或99.9％(四舍五入至最接近的第10个)同一性的序列。多核苷酸的env结构域可以源于任何数量的逆转录病毒，但通常源于致癌逆转录病毒或γ-逆转录病毒，更特别地来自哺乳动物致癌逆转录病毒或γ-逆转录病毒例如MLV。在一些实施方式中，env编码结构域包含兼嗜性env结构域。在一个实施方式中，env结构域包含SEQ ID NO：2的从约核苷酸6359至约核苷酸8323的序列或与其具有至少95％、98％、99％或99.8％(四舍五入至最接近的第10个)同一性的序列。2A肽或2A肽样盒在env结构域之后(例如，在大约核苷酸8324处)插入并续接到与2A或2A样肽的C末端连接的异源多核苷酸的末端。异源结构域可以后接富聚嘌呤结构域，或者可以后接IRES盒或polIII盒。3'LTR可以源于任何数量的逆转录病毒，通常源于致癌逆转录病毒，优选源于哺乳动物致癌逆转录病毒例如MLV。在一个实施方式中，3'LTR包含U3-R-U5结构域。在又一个实施方式中，LTR包含如SEQ ID NO：2所示的从约核苷酸9111至约11654的序列或与其具有至少95％、98％或99.5％(四舍五入至最接近的第10个)同一性的序列。
本发明还提供了重组逆转录病毒载体，其从5'至3'包含：CMV-R-U5，将来自人巨细胞病毒的立即早期启动子与MLV R-U5区融合；PBS，用于逆转录酶的引物结合位点；5'剪接位点；ψ封装信号；gag，用于MLV组特异性抗原的ORF；pol，用于MLV聚合酶多蛋白的ORF；3'剪接位点；4070A env，用于MLV菌株4070A的包膜蛋白的ORF；2A肽或2A肽样序列；经修饰的胞嘧啶脱氨酶(热稳定的和密码子优化的)，具有或没有对色氨酸密码子的修饰(如上所述)；PPT，多嘌呤序列；和U3-R-U5，MLV长末端重复序列。
本公开还提供了包含如下所述的序列的逆转录病毒载体。
逆转录病毒载体可用于治疗各种疾病和病症，包括许多细胞增殖性疾病和病症(参见例如美国专利号4,405,712和号4,650,764；Friedmann,1989,Science,244:1275-1281；Mulligan,1993,Science,260:926-932,R.Crystal,1995,Science 270:404-410，其各自通过引用整体并入本文，还参见：The Development of Human Gene Therapy,Theodore Friedmann,Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.,1999.ISBN 0-87969-528-5；Concepts in Genetic Medicine,ed.BoroDropulic and Barrie Carter,Wiley,2008,Hoboken,NJ.；Gene&Cell Therapy-Therapeutic Mechanism and Strategies,3rd edition ed.Nancy Smyth Templeton,CRCPress,Boca Raton FL 2008，其各自通过引用整体并入本文)。
本公开还提供了用于治疗细胞增殖性病症的基因疗法。这种疗法将通过将适当的治疗性多核苷酸(例如，反义、核酶、自杀基因、siRNA)引入具有增殖性病症的受试者的细胞中来实现其治疗效果。可以使用本公开的重组逆转录病毒载体来实现多核苷酸构建体的递送，特别是如果它是基于能够感染分裂细胞的MLV。
另外，本文所述的治疗方法(例如，基因疗法或基因递送方法)可以在体内或离体进行。在基因治疗之前，优选例如通过手术或放疗除去大部分肿瘤。在一些方面，逆转录病毒疗法可以在手术、化学疗法或放射疗法之前或之后进行。
因此，本公开提供了能够感染非分裂细胞、分裂细胞或赘生性细胞的重组逆转录病毒，其中重组逆转录病毒包含病毒GAG；病毒POL；病毒ENV；与2A肽或2A肽样编码序列可操作地连接的异源核酸；和封装、逆转录和整合所必需的顺式作用核酸序列。重组逆转录病毒可以是慢病毒，例如HIV，或可以是致癌病毒。如上文关于生成重组逆转录病毒的方法所述，本公开的重组逆转录病毒还可以包含VPR、VIF、NEF、VPX、TAT、REV和VPU蛋白中的至少一种。尽管不希望受到特定理论的约束，但认为一种或多种这些基因/蛋白质产物对于增加所产生的重组逆转录病毒的病毒效价是重要的(例如NEF)，或者对于感染和病毒体的封装是必须的。
本公开还提供了将核酸转移至靶细胞以提供特定核酸(例如异源序列)的表达的方法。因此，在另一个实施方式中，本公开提供了用于在靶细胞中导入和表达异源核酸的方法，包括用本发明的重组病毒感染靶细胞并在靶细胞中表达异源核酸，其中异源核酸在env结构域下游被工程化到重组病毒载体中并可操作地连接到2A或2A样肽。如上所述，靶细胞可以是任何细胞类型，包括分裂、非分裂的、赘生性的、永生化的、经修饰的和本领域技术人员公认的其它细胞类型，只要它们能够被逆转录病毒感染即可。
可能需要将编码生物反应调节剂(例如细胞因子)的核酸转移到细胞或受试者中。此类包括免疫增强剂，包括编码分类为“白介素”的许多细胞因子的核酸。这些包括例如白介素1至38，以及本文其它地方描述的其它反应调节剂和因子。该类别中也包括干扰素特别是γ干扰素、肿瘤坏死因子(TNF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，尽管不一定按照相同的机制作用。其它多肽包括例如血管生成因子和抗血管生成因子。可能需要将这些核酸递送至骨髓细胞或巨噬细胞以治疗酶缺陷或免疫缺陷。编码生长因子、毒性肽、配体、受体或其它生理学重要蛋白的核酸也可以被引入特定靶细胞中。任何前述生物反应调节剂在下游被工程化到本公开的RRV中并且可操作地连接至2A或2A样肽。
本公开可用于递送促进药物特异性靶向和作用的异源多核苷酸。例如，EGF2受体家族成员HER2是用于结合药物曲妥珠单抗(HerceptinTM，Genentech)的靶标。曲妥珠单抗是抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的介质。通过免疫组织化学，活性优先靶向具有2+和3+过表达水平的表达HER2的细胞，而不是1+和非表达细胞(赫赛汀处方信息，Crommelin 2002)。通过在HER2低的肿瘤中引入表达HER2或截短的HER2(仅表达胞外结构域和跨膜结构域)的载体来增强HER2的表达，可以促进ADCC的最佳触发并克服在临床应用中观察到的对赫赛汀的快速发展抗性。在这些情况下，异源基因将编码HER2。
在另一个实例中，CD20是药物利妥昔单抗(RituxanTM，Genentech)的结合靶标。利妥昔单抗是补体依赖性细胞毒性(CDC)和ADCC的介质。具有较高平均荧光强度的细胞通过流式细胞术显示对利妥昔单抗的增强的敏感性(van Meerten等,Clin Cancer Res 2006；12(13):4027-4035,2006)。通过在低CD20的B细胞中引入表达CD20的载体来增强CD20的表达，可以促进ADCC的最佳触发。在这种情况下，异源基因编码CD20。
本公开提供了用于治疗细胞增殖性病症例如癌症和肿瘤的方法，其包括施用本公开的RRV载体，然后用化疗剂或抗癌剂治疗。在一个方面，在施用允许RRV感染和复制的化学治疗剂或抗癌剂之前，将RRV载体施用给受试者一段时间。然后将受试者用化学治疗剂或抗癌剂以一定剂量治疗一段时间以减少增殖或杀死癌细胞。在一个方面，如果用化学治疗剂或抗癌剂治疗减少癌细胞但不会杀死癌症/肿瘤(例如，部分缓解或暂时缓解)，则可以用无毒治疗剂(例如，5-FC)来治疗受试者，该无毒治疗剂在表达来自RRV的细胞毒性基因(例如胞嘧啶脱氨酶)的细胞中转化为毒性治疗剂。
使用这种方法，本公开的RRV载体在肿瘤细胞的复制过程期间被扩散，然后可以通过用抗癌剂或化学治疗剂治疗来杀死这种细胞，并且可以使用本文所述的RRV治疗方法进行进一步的杀死。
在本公开的又一个实施方式中，异源基因可以包含靶抗原(例如癌抗原)的编码序列。在该实施方式中，用包含编码靶抗原的异源多核苷酸的RRV感染包含细胞增殖性病症的细胞以提供靶抗原的表达(例如癌抗原的过表达)。然后向受试者施用包含与靶抗原特异性相互作用的靶向同源部分的抗癌剂。靶向同源部分可以与细胞毒性剂可操作地连接，或者本身可以是抗癌剂。因此，由包含靶向抗原编码序列的RRV感染的癌细胞增加了癌细胞上靶标的表达，导致细胞毒性靶向的效率/功效增加。
在又一个实施方式中，本公开的RRV可以包含编码序列，所述编码序列包含与同源抗原或配体特异性相互作用的结合结构域(例如，抗体、抗体片段、抗体结构域或受体配体)。然后可以使用包含结合结构域的编码序列的RRV感染具有细胞增殖性病症的受试者中的细胞，例如癌细胞或赘生性细胞。受感染的细胞然后将表达结合结构域或抗体。然后可以将与细胞毒性剂可操作地连接的或本身具有细胞毒性的抗原或同源物施用于受试者。然后细胞毒性同源物将选择性地杀死表达结合结构域的感染细胞。或者，结合结构域本身可以是抗癌剂。
本公开提供了治疗患有细胞增殖性病症的受试者的方法。受试者可以是任何哺乳动物，并且优选是人。使受试者与本公开的具有重组复制能力的逆转录病毒载体接触。接触可以在体内或离体。施用本公开的逆转录病毒载体的方法是本领域已知的，并且包括例如全身施用、局部施用、腹腔内施用、肌内施用、颅内施用、脑脊髓施用、直接施用于肿瘤部位或细胞增殖性病症处、以及本领域已知的其它施用途径。
因此，本公开包括用于治疗细胞增殖性病症的各种药物组合物。根据本公开的药物组合物通过如下制备：使用载体、赋形剂和添加剂或助剂将含有用于治疗或调节根据本公开的细胞增殖性病症的异源多核苷酸序列的逆转录病毒载体转化成适于施用于受试者的形式。常用的载体或助剂包括碳酸镁、二氧化钛、乳糖、甘露糖醇及其它糖、滑石、乳蛋白、明胶、淀粉、维生素、纤维素及其衍生物、动植物油、聚乙二醇和溶剂例如无菌水、醇类、甘油和多元醇。静脉注射载体包括液体和营养补充剂。防腐剂包括抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。其它药学上可接受的载体包括水溶液；无毒赋形剂，包括盐、防腐剂、缓冲剂等,如例如在Remington's Pharmaceutical Sciences,15th ed.Easton:Mack PublishingCo.,1405-1412,1461-1487(1975)and The National Formulary XIV.,14thed.Washington:American Pharmaceutical Association(1975)所述，其内容通过引用结合于此。根据本领域的常规技术调整药物组合物的pH和各种组分的确切浓度。参见Goodman和Gilman的The Pharmacological Basis for Therapeutics(第7版)。
在其它实施方式中，提供了用本公开的具有复制能力的逆转录病毒载体转染的宿主细胞。宿主细胞包括真核细胞例如酵母细胞、昆虫细胞或动物细胞。宿主细胞还包括原核细胞例如细菌细胞。
还提供了用本文提供的载体(例如，具有复制能力的逆转录病毒载体)转导(转化或转染)的工程化的宿主细胞。工程化的宿主细胞可以在被修饰为适合用于激活启动子、选择转化体或扩增编码多核苷酸的常规营养培养基中培养。培养条件例如温度和pH等是之前与被选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些，并且对于本领域技术人员显而易见，并在本文引用的参考文献(包括例如Sambrook,Ausubel和Berger以及例如Freshney(1994)Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,3rd ed.(Wiley-Liss,NewYork))和在这些参考文献中引用的参考文献中。
合适的表达宿主的实例包括：细菌细胞，例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞，例如酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母和粗糙脉孢菌；昆虫细胞例如果蝇和草地贪夜蛾；哺乳动物细胞例如CHO、COS、BHK、HEK 293br Bowes黑素瘤；或植物细胞或外植体等。将使用人细胞或细胞系；然而，为了测序、扩增和克隆的目的，可能需要将本公开的载体和多核苷酸克隆到非人宿主细胞中。
以下实施例旨在说明而非限制本公开。虽然这些实施例是可能使用的那些典型实施例，但是可以可替选地使用本领域技术人员已知的其它过程。
实施例
实施例1：设计RRV-2A-GFPm、RRV-GSG-2A、RRV-2A-yCD2和RRV-GSG-2A-yCD2。
RRV-yCD2和RRV-GFP是在env基因下游具有兼嗜性包膜基因和脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点(IRES)-转基因盒的基于莫洛尼MLV的RRV(Perez等,2012)。RRV-2A-GFP(aka pAC3-2A-GFP)和RRV-2A-yCD2(pAC3-2A-yCD2)载体基于RRV-GFP和RRV-yCD2，但IRES区已被与两性包膜蛋白和转基因(GFP或yCD2)读框符合的多种不同的2A肽替代。图3示出了RRV-2A-GFP载体和RRV-yCD2载体的克隆方案的概述。首先使用含有2个DNA片段和用BstB I和Not I位点消化的pAC3-emd骨架的Gibson组装克隆试剂盒(NEB)产生pAC3-T2A-GFP构建体。首先，合成含有以5'-3'顺序的兼嗜性env的3'末端、来自明脉扁刺蛾β四体病毒(T2A)的2A肽和GFP5'的5'序列的一对正义寡核苷酸和反义寡核苷酸(IDT)并将其杂交以产生DNA片段2A-G。Gibson组装中的第二个DNA片段是FP片段(图3)。使用以下引物通过PCR产生FP片段：GFP-F-Gib(5’-GAAGTTCG AGGGCGACAC-3’)和GFP-R-Gib(5’-TAAAATCTTTTATTTTATCTGCGGCCGCAC-3’)。
在2A-G片段中，5'包含与pAC3骨架的兼嗜性env中的BstBI位点重叠的序列；3'包含与FP DNA片段的5'重叠的序列。另外，AscI限制性内切酶位点位于T2A的3'末端，紧邻第二转基因GFP的起始密码子的上游。包括的AscI位点用于随后用其它2A肽取代T2A肽。包括的AscI限制性位点与AscI位点后面的核苷酸T，在T2A肽中的最后脯氨酸残基的C末端产生另外3个氨基酸(甘氨酸-丙氨酸-脯氨酸)。在共翻译过程中，由T2A肽介导的包膜蛋白与GFP蛋白的分离在GFP的N末端产生额外的4个氨基酸P、G、A和P。在FP片段中，FP片段的5'-末端含有与2A-G片段的3'-末端重叠24个核苷酸的序列，并且FP片段的3'-末端与pAC3-GFP骨架的5'-末端跨越NotI位点重叠26个核苷酸。从Gibson组装克隆生成的质粒DNA被命名为pAC3-T2A-GFP(图3)。
另外的RRV-2A-GFP载体随后以两种不同的结构被合成(IDT)，其含有来自猪捷申病毒-1(P2A)、口蹄疫病毒(F2A)和马鼻炎A病毒(E2A)的三种其它常用的2A肽。每个DNA片段含有兼嗜性env基因的3'和在BstBI和AscI位点代替pAC3-T2A-GFP骨架的T2A的2A肽的序列(图3)。所得质粒DNA被分别命名为pAC3-P2A-GFP、pAC3-F2A-GFP、pAC3-E2A-GFP、pAC3-GSG-T2A-GFP、pAC3-GSG-P2A-GFP、pAC3-GSG-F2A-GFP和pAC3-GSG-E2A-GFP。
随后确定，所描述的RRV-2A-GFP质粒DNA(pAC3-E2A-GFP、pAC3-F2A-GFP、pAC3-P2A-GFP、pAC3-T2A-GFP、pAC3-GSG-E2A-GFP、pAC3-GSG-F2A-GFP、pAC3-GSG-P2A-GFP和pAC3-GSG-T2A-GFP)均在GFP的3'末端含有终止密码子突变。当产生FP PCR片段时，在GFP-R-Gib引物(5'-TAAAATCTTTTATTTTATCTGCGGCCGCAC-3'(SEQ ID NO：4))中引入突变。产生自PCR的GFP中的终止密码子突变导致GFP ORF在达到终止密码子之前再通读11个氨基酸(C-A-A-A-D-K-I-K-D-F-I(SEQ ID NO：5))。质粒DNA被重新命名为pAC3-E2A-GFPm、pAC3-F2A-GFPm、pAC3-P2A-GFPm、pAC3-T2A-GFPm、pAC3-GSG-E2A-GFPm、pAC3-GSG-F2A-GFPm、pAC3-GSG-P2A-GFPm和pAC3-GSG-T2A-GFPm。在下文中，两个命名pAC3-E2A-GFP/pAC3-E2A-GFPm、pAC3-F2A-GFP/pAC3-F2A-GFPm、pAC3-P2A-GFP/pAC3-P2A-GFPm、pAC3-T2A-GFP/pAC3-T2A-GFPm、pAC3-GSG-E2A-GFP/pAC3-GSG-E2A-GFPm、pAC3-GSG-F2A-GFP/pAC3-GSG-F2A-GFPm、pAC3-GSG-P2A-GFP/pAC3-GSG-P2A-GFPm和pAC3-GSG-T2A-GFP/pAC3-GSG-T2A-GFPm互换使用。
通过在pAC3-P2A-GFPm、pAC3-GSG-P2A-GFPm、pAC3-T2A-GFPm和pAC3-GSG-T2A-GFPm质粒DNA的各自2A肽版本中用yCD2 ORF替换GFPm开放阅读框以产生4个RRV-2A-yCD2载体的等同集合(图3)。AscI-yCD2-NotIPCR片段使用引物：AscI-yCD2-F(5'-GATCGGCGCGCCTATGGTGACCGGCGGCATGGC-3'(SEQ ID NO：6)和3-37(5'-CCCCTTTTTCTGGAGACTAAATAA-3'(SEQ ID NO：7)从pAC3-yCD2质粒DNA产生。PCR产物和四种pAC3-2A-GFPm质粒DNA中的每一种都用AscI和NotI限制性内切酶消化，并将AscI-yCD2-NotI消化的PCR产物亚克隆到GFPm处以产生pAC3-P2A-yCD2、pAC3-GSG-P2A-yCD2、pAC3-T2A-yCD2和pAC3-GSG-T2A-yCD2(表3)。
表3：序列、2A肽来源和RRV质粒-2A肽-转基因名称。
实施例2：从293T细胞产生的RRV-2A-GFPm和RRV-GSG-2A-GFPm载体具有感染性并表达GFP蛋白。
在转染前18-20小时，将HEK293T细胞以2e6个细胞/10cm平板接种。第二天，在细胞接种后的20小时，使用磷酸钙法使用pAC3-2A-GFPm和pAC3-GSG-2A-GFPm质粒瞬时转染20μg质粒DNA。在转染后18小时，将细胞用DMEM完全培养基洗涤三次，并用新鲜的完全培养基温育。在转染后约42小时收集病毒上清液，并通过0.45μm注射器式过滤器过滤。如先前所述(Perez等，2012)测定来自瞬时转染HEK293T细胞的RRV-2A-GFPm、RRV-GSG-2A-GFPm和RRV-IRES-GFP的病毒效价。简而言之，通过载体的单周期感染在PC3细胞上测定载体制剂效价。感染后的24小时通过叠氮胸苷治疗保证单周期感染，接着在感染后48小时对病毒载体DNA特异性靶细胞基因组DNA(MLV LTR引物组；5-MLV-U3-R(5′-AGCCCACAACCCCTCACTC-3’(SEQID NO：20))、3-MLV-Psi(5′-TCTCCCGATCCCGGACGA-3′(SEQ ID NO：21))和探针(5′-FAM-CCCCAAATGAAAGACCCCCGCTGACG-BHQ1-3′(SEQ ID NO：22))进行定量聚合酶链反应(qPCR)，以定量每个细胞基因组中病毒DNA拷贝数的数量。通过计算阈值循环(CT)值来确定病毒效价(记录为每毫升的转导单位(TU)(TU/mL))，所述阈值循环(CT)值根据从2×107至2×101个质粒DNA拷贝范围的标准曲线并根据已知量的基因组DNA输入、细胞数量和每个反应混合物中病毒储液的稀释度来得到。图4示出了由HEK293T细胞产生的RRV-2A-GFPm和RRV-GSG-2A-GFPm的效价与RRV-IRES-GFP相当。
表4：从293T细胞产生的RRV-2A-GFPm和RRV-GSG-2A-GFPm载体的效价
TU/mL 标准偏差
pAC3-E2A-GFP 1.15E+06 2.55E+05
pAC3-F2A-GFP 1.63E+06 2.58E+05
pAC3-P2A-GFP 1.81E+06 3.11E+05
pAC3-T2A-GFP 3.31E+06 1.32E+05
pAC3-GSG-E2A-GFP 1.65E+06 2.76E+05
pAC3-GSG-F2A-GFP 1.32E+06 7.57E+04
pAC3-GSG-P2A-GFP 1.31E+06 1.22E+05
pAC3-GSG-T2A-GFP 2.66E+06 2.14E+05
pAC3emd 1.65E+06 2.12E+05
然后使用由HEK293T细胞产生的RRV-2A-GFPm病毒以0.01的感染复数(MOI)感染U87-MG。将U87-MG细胞以1×105个细胞接种于6孔板中用于初次感染。在每次传代时将细胞以1至4的稀释度传代至6孔板的新孔中，并收集每个样品的剩余细胞以通过测量表达GFPm细胞的百分比和GFPm平均荧光强度(使用BD FACS Canto II(BD Biosciences))来估计病毒扩散。绘制每次传代的GFP阳性细胞的百分比。进行长度测定直到所有RRV-2A-GFP病毒达到最高感染性(～95％或更高的GFP阳性细胞)。图4示出了由HEK293T细胞产生的RRV-2A-GFPm和RRV-GSG-2A-GFPm具有感染性。除了RRV-P2A-GFPm,RRV-T2A-GFPm和RRV-GSG-F2A-GFPm之外，RRV-2A-GFPm和RRV-GSG-2A-GFPm中的病毒扩散速率与感染的U87-MG细胞中的RRV-IRES-GFP类似，表现出滞后性。尽管如此，它们在18天内达到了最高感染性。RRV-2A-GFPm和RRV-GSG-2A-GFPm载体的GFPm表达水平也有所不同，但均在RRV-IRES-GFP感染的U87-MG细胞中表达约20-50％(图5)。
实施例3：RRV-2A-GFPm和RRV-GSG-2A-GFPm载体在U87-MG细胞中是稳定的。为确保在经RRV-2A-GFPm和RRV-GSG-2A-GFPm感染的U87-MG细胞中GFP表达的降低不是由于病毒基因组中GFP基因的缺失所致，使用跨越前病毒DNA的3'env区和3'UTR区的引物组通过终点PCR评估2A-GFPm区的完整性。在U87-MG细胞的最高感染性时，随后将细胞在T75烧瓶中培养以达到融合，此时将培养基更换为新鲜培养基，随后在培养基更换后的18-24小时收集含病毒的上清液并进行0.45μM过滤。将收集的细胞上清液等分并在-80℃储存直至用于免疫印迹测定和再感染实验。同时，将细胞分成两部分：1/10用于分离基因组DNA，9/10用于分离总细胞裂解物。通过重悬于400μL 1×PBS中以从细胞团块中提取基因组DNA，并使用PromegaMaxwell 16细胞DNA纯化试剂盒(Promega)进行分离。然后使用100纳克基因组DNA作为用于使用如下引物组的PCR的模板：IRES-F(5'-CTGATCTTACTCTTTGGACCTTG-3'(SEQ ID NO：23))和IRES-R(5'-CCCCTTTTTCTGGAGACTAAATAA-3'(SEQ ID NO：24))。将所得PCR产物在1％琼脂糖凝胶上分析。数据显示，在病毒复制的时间过程中，RRV-2A-GFPm和RRV-GSG-2A-GFPm载体的前病毒DNA中的2A-GFPm区和GSG-2A-GFPm区在U87-MG细胞中是稳定的(图6)。
实施例4：由最高感染的U87-MG细胞产生的RRV-2A-GFPm和RRV-GSG-2A-GFPm在随后的感染周期中保持感染。由于长期感染性是维持通过RRV递送的治疗效果的许多重要标准之一，因此通过在原始U87-MG细胞中执行额外的感染周期来评估从最高感染的U87-MG细胞产生的RRV-2A-GFPm和RRV-GSG-2A-GFPm的感染性。首先如所述那样从最高感染的U87-MG细胞收集病毒上清液，然后以0.01的MOI将其重新感染回原始U87-MG细胞内。图7显示，在RRV-2A-GFPm载体、RRV-GSG-2A-GFPm载体以及RRV-IRES-GFP载体中，由最高感染的U87-MG细胞产生的效价与从瞬时转染的HEK293T细胞获得的效价相当。
如上所述，在每次细胞传代监测RRV-2A-GFPm和RRV-GSG-2A-GFPm的病毒扩散。与使用由瞬时转染的HEK293T细胞产生的病毒上清液在第一感染周期中观察到的病毒扩散速率相比，图8示出了所有载体以与RRV-IRES-GFP相当的速度扩散。然而，如之前观察到的，在该感染周期中，来自RRV-2A-GFPm和RRV-GSG-2A-GFPm感染的U87-MG细胞的GFP表达水平保持在RRV-IRES-GFP细胞所表达水平的20-50％(图9)。
实施例5：在感染的U87-MG细胞中以不同效率处理RRV-2A-GFPm和RRV-GSG-2A-GFPm载体的病毒包膜和GFPm蛋白。
为了评估GFPm表达、GFPm与病毒包膜蛋白的分离效率和病毒包膜蛋白的适当处理，从感染的U87-MG细胞产生细胞裂解物。将呈融合性细胞单层的最高感染性的U87-MG细胞在1×PBS中洗涤一次，用TrpZean(Sigma)解离，重悬于完全DMEM中，再次在1×PBS中洗涤，然后在200μL RIPA裂解缓冲液(Thermo Scientific)中在冰上进行细胞溶解30分钟。通过在4℃以14000rpm离心15分钟使裂解物净化掉细胞碎片，收集上清液并转移至新管中。然后使用BCA沉淀测定法(Thermo Scientific)测定细胞裂解物的蛋白浓度，并将20μg蛋白进行SDS-PAGE。在200伏下将蛋白在4-12％XT-Tris SDS-PAGE凝胶(BioRad)上分离45分钟。随后使用iBlot干印迹系统在20伏下将蛋白转移到PVDF膜(Life Technologies)上7分钟。使用抗-gp70(大鼠抗-gp70，克隆83A25；1：500稀释)和抗-GFP(兔抗-GFP；1：1000稀释)测定膜的包膜蛋白和GFPm的gp70亚基表达。使用缀合至辣根过氧化物酶的相应二级抗体检测蛋白表达。结果表明，来自RRV-F2A-GFPm、RRV-P2A-GFPm和RRV-T2A-GFPm、RRV-GSG-F2A-GFPm和RRV-GSG-F2A-GFPm的GFPm蛋白与病毒包膜蛋白分离无效，如使用抗-GFP抗体由高分子量env-2A-GFPm融合蛋白在～120KDa所指示的(图10)。相反，与RRV-IRES-GFP相比，RRF-E2A-GFPm、RRV-GSG-P2A-GFPm和RRV-GSG-T2A-GFPm载体的GFPm与病毒包膜蛋白的分离相对有效(图10)。平行地，使用抗-gp70抗体检查感染的U87-MG中的病毒包膜蛋白的处理。结果显示，在所有RRV-2A-GFPm和RRV-GSG-2A-GFPm载体中检测到以前体(Pr85)或处理形式(gp70)的病毒包膜(图11)，表明病毒包膜蛋白与GFPm分离，如在抗-GFP免疫印迹中所见。此外，在抗-gp70印迹中观察到的分离效率与在抗GFP免疫印迹中观察到的分离效率有些一致。尽管融合多蛋白Env-GFPm的蛋白表达在RRV-2A-GFPm和RRV-GSG-2A-GFPm载体中不同，但RRV-GSG-P2A-GFPm和RRV-T2A-GFPm似乎具有最有效的分离，如通过在抗-GFP和抗-gp70免疫印迹中的病毒包膜-GFP融合多蛋白的检测缺失所表明的。
实施例6：适当处理的病毒包膜蛋白的掺入水平与病毒包膜和GFPm蛋白之间的分离效率相关。
将来自经RRV-2A-GFPm和RRV-GSG-2A-GFPm最高感染的U87-MG细胞的病毒上清液通过20％蔗糖梯度在4℃在14000rpm下沉淀30分钟，随后重悬于20μL含有5％2-巯基乙醇的1×Laemmli缓冲液中并在4-20％Tris甘氨酸凝胶(BioRad)上进行SDS PAGE。如所述进行电泳和蛋白转移。使用抗-gp70(大鼠产生的抗-gp70，克隆83A25；1：500稀释)和抗-p15E(小鼠产生的抗-TM，克隆372；1:250稀释)检测适当处理的病毒体相关的病毒包膜蛋白表达。使用缀合至辣根过氧化物酶的相应二级抗体检测蛋白表达。数据表明，除了RRV-P2A-GFPm和RRV-T2A-GFPm载体外，检测到RRV-2A-GFPm和RRV-GSG-2A-GFPm的gp70和p12E/p15E-适当处理的包膜蛋白水平与RRV-IRES-GFP在病毒体中的水平相当(图12)。正如所预期的，显示最低水平的病毒体相关包膜蛋白的RRV-GSG-P2A-GFPm和RRV-T2A-GFPm在细胞裂解物中表达最高水平的融合多蛋白。与公开的数据一致，数据支持了：未处理的包膜蛋白前体蛋白Pr85或在这种情况下病毒包膜-GFPm融合多蛋白不会掺入病毒体。此外，具有导致“基因融合的”p12E的2A肽的R肽的切割在病毒体成熟过程中似乎也足以产生感染性病毒颗粒，如由最高感染的U87-MG细胞产生的效价所表明的(图7)。感染期间p15E/p12E比率的性质及其在膜融合中的作用尚不清楚。同时，数据表明，病毒包膜蛋白掺入水平与靶细胞中测得的效价值不相关。载体(特别是RRV-GSG-P2A-GFPm和RRV-T2A-GFPm载体)之间的效价值非预期地缺乏差异，表明在RRV颗粒1上能够耐受一定范围的包膜表达水平，而不影响这些细胞的效价。
实施例7：从293T细胞产生的RRV-P2A-yCD2和RRV-T2A-yCD2载体、RRV-GSG-P2A-yCD2和RRV-GSG-T2A-yCD2载体具有感染性并表达yCD2蛋白。
转染前18-20小时，将HEK293T细胞以2e6个细胞/10cm平板接种。第二天，在细胞接种后的20小时，使用磷酸钙法使用pAC3-P2A-yCD2、pAC3-T2A-yCD2、pAC3-GSG-P2A-yCD2和pAC3-GSG-T2A-yCD2质粒瞬时转染20μg质粒DNA。在转染后18小时，将细胞用DMEM完全培养基洗涤三次，并用新鲜的完全培养基温育。在转染后约42小时收集病毒上清液，并通过0.45μm注射器式过滤器过滤。如先前所述测定来自瞬时转染的HEK293T细胞的RRV-P2A-yCD2、RRV-T2A-yCD2、RRV-GSG-P2A-yCD2和RRV-GSG-T2A-yCD2的病毒效价(Perez等,2012)。简而言之，通过载体的单周期感染在PC3细胞上测定载体制剂效价。感染后的24小时通过叠氮胸苷治疗保证单周期感染，接着在感染后48小时对病毒载体DNA特异性的靶细胞基因组DNA(MLV LTR引物组；5-MLV-U3-R(5'-AGCCCACAACCCCTCACTC-3’(SEQ ID NO：20))、3-MLV-Psi(5'-TCTCCCGATCCCGGACGA-3'(SEQ ID NO：21))和探针(5'-FAM-CCCCAAATGAAAGACCCCCGCTGACG-BHQ1-3'(SEQ ID NO：22))进行定量聚合酶链反应(qPCR)，以定量每个细胞基因组中病毒DNA拷贝数的数量。通过计算阈值循环(CT)值来确定病毒效价(记录为每毫升的转导单位(TU)(TU/mL))，所述阈值循环(CT)值根据从2×107至2×101个质粒DNA拷贝范围的标准曲线并根据已知量的基因组DNA输入、细胞数量和每个反应混合物中病毒储液的稀释度来得到。表5示出了从HEK293T细胞产生的RRV-P2A-yCD2、RRV-T2A-yCD2、RRV-GSG-P2A-yCD2和RRV-GSG-T2A-yCD2的效价与RRV-IRES-yCD2的效价相当。
表5：从293T细胞产生的RRV-P2A-yCD2、RRV-T2A-yCD2、RRV-GSG-P2A-yCD2和RRV-GSG-T2A-yCD2载体的效价
TU/mL标准偏差
此外，如所述对从最高感染的U87-MG细胞收集的病毒上清液进行效价测定以确保它们保持感染性。用于效价的引物组与含有5-MLV-U3-R、3-MLV-Psi引物和探针的引物组具有相似的引发效率。用于对来自感染的U87-MG细胞的RRV-P2A-yCD2、RRV-T2A-yCD2、RRV-GSG-P2A-yCD2和RRV-GSG-T2A-yCD2载体进行效价测定的引物组为：Env2For：5'-ACCCTCAACCTCCCCTACAAGT-3'(SEQ ID NO：25)、Env2Rev：5'-GTTAAGCGCCTGATAGGCTC-3'(SEQ ID NO：26)和探针5'-FAM-CCCCAAATGAAAGACCCCCGCTGACG-BHQ1-3'(SEQ ID NO：27)。图13示出了由最高感染的U87-MG细胞产生的效价与从瞬时转染的HEK293T细胞获得的效价相似，并且与RRV-IRES-yCD2载体相当。
实施例8：在以不同效率处理感染的U87-MG细胞中的RRV-P2A-yCD2和RRV-T2A-yCD2载体、RRV-GSG-P2A-yCD2和RRV-GSG-T2A-yCD2载体的病毒包膜和yCD2蛋白。
为了评估yCD2表达、yCD2与病毒包膜蛋白的分离效率和病毒包膜蛋白的适当处理，从感染的U87-MG细胞产生细胞裂解物。将呈融合性细胞单层的最高感染性的U87-MG细胞在1×PBS中洗涤一次，用TrpZean(Sigma)解离，重悬于完全DMEM中，再次在1×PBS中洗涤，然后在200μL RIPA裂解缓冲液(Thermo Scientific)中在冰上进行细胞溶解30分钟。通过在4℃以14000rpm离心15分钟使裂解物净化掉细胞碎片，收集上清液并转移至新管中。然后使用BCA沉淀测定法(Thermo Scientific)测定细胞裂解物的蛋白浓度，并将20μg蛋白进行SDS-PAGE。在200伏下将蛋白在4-12％XT-Tris SDS-PAGE凝胶(BioRad)上分离45分钟。随后使用iBlot干印迹系统在20伏下将蛋白转移到PVDF膜(Life Technologies)上7分钟。使用抗-gp70(大鼠抗-gp70，克隆83A25；1：500稀释)和抗-GFP(兔抗-GFP；1：1000稀释)测定膜的包膜蛋白和yCD2的gp70亚基表达。使用缀合至辣根过氧化物酶的相应二级抗体检测蛋白表达。结果显示，来自RRV-P2A-yCD2和RRV-T2A-yCD2的yCD2蛋白与病毒包膜蛋白分离无效，如使用抗-yCD2抗体由高分子量env-2A-yCD2融合多蛋白在～110KDa所指示的(图14)。相反，与来自RRV-IRES-yCD2的相比，RRV-GSG-P2A-yCD2和RRV-GSG-T2A-yCD2的yCD2蛋白与病毒包膜蛋白的分离相对有效(图14)。平行地，使用抗-gp70抗体检查感染的U87-MG中的病毒包膜蛋白的处理。结果显示，在RRV-GSG-P2A-yCD2、RRV-GSG-T2A-yCD2载体中容易检测到以前体(Pr85)或处理形式(gp70)的病毒包膜，但是在RRV-P2A-yCD2和RRV-T2A-yCD2载体中水平低得多(图15)。另外，Pr85/gp70病毒包膜蛋白的水平与在抗-yCD2免疫印迹中观察到的水平有些一致。然而，与RRV-2A-GFPm或RRV-GSG-2A-GFPm载体不同，使用抗-gp70抗体或抗-2A抗体(Cat#ABS31，EMD Millipore)不能检测到病毒包膜-yCD2融合多蛋白。在4种载体中，RRV-GSG-P2A-yCD2和RRV-GSG-T2A-yCD2载体显示融合多蛋白的最有效分离，如在抗-yCD2免疫印迹中对病毒包膜-yCD2融合多蛋白的检测缺失所示。所有这些数据表明，在RRV包膜蛋白开放阅读框的情况下，GSG-P2A和GSG-T2A结构产生最有效的多蛋白分离。
实施例9：RR-G2G-P2A-YCD2和RRV-GSG-T2A-yCD2在U87-MG细胞中具有长期稳定性。进行连续感染以评价RRV-GSG-P2A-yCD2和RRV-GSG-T2A-yCD2在U87-MG细胞中的长期载体稳定性。最初以0.1的MOI用病毒载体感染接种在6孔板中的约105个天然U87-MG细胞，并培养1周以完成单个感染循环。使用来自完全感染的细胞的2ml病毒上清液中的100μL感染105个原始细胞并重复多达16个周期。通过重悬于400μL 1×PBS中以从小团块中提取基因组DNA，并使用Promega Maxwell 16细胞DNA纯化试剂盒(Promega)进行分离。然后使用100纳克的基因组DNA作为用于跨越转基因盒的引物对；IRES-F(5'-CTGATCTTACTCTTTGGACCTTG-3'(SEQ ID NO：23))和IRES-R(5'-CCCCTTTTTCTGGAGACTAAATAA-3'(SEQ ID NO：24))进行PCR的模板。通过对来自感染细胞的整合前病毒的PCR扩增来评估2A-yCD2区的载体稳定性。预期的PCR产物大小约为0.73kb。小于0.73kb的任何条带的出现表明2A-yCD2区缺失。图16A显示，RRV-yCD2中的IRES-yCD2(1.2Kb)区稳定达感染周期16，如之前记载的(Perez等,2012)。类似地，RRV-GSG-P2A-yCD2和RRV-GSG-T2A-yCD2中的2A-yCD2区也保持稳定达感染周期16。然而，RRV-GSG-T2A-yCD2中的2A-yCD2区比RRV-GSG-P2A-yCD2稍微不稳定，因为感染循环13中存在缺失(0.4kb)，但在整个循环16期间保持稳定(图16B和图16C)。
实施例10：在用RRV-P2A-yCD2和RRV-T2A-yCD2载体、RRV-GSG-P2A-yCD2和RRV-GSG-T2A-yCD2载体感染的U87-MG细胞中，适当处理的病毒包膜蛋白的掺入与病毒包膜和yCD2蛋白之间的分离效率相关。
将从经RRV-2A-yCD2和RRV-GSG-2A-yCD2最高感染的U87-MG细胞产生的病毒上清液通过20％蔗糖梯度在4℃在14000rpm下沉淀30分钟，随后重悬于20μL含有5％2-巯基乙醇的1×Laemmli缓冲液中并在4-20％Tris甘氨酸凝胶(BioRad，Hercules CA)上进行SDSPAGE。如所述进行电泳和蛋白转移。使用抗-gp70(大鼠产生的抗-gp70，克隆83A25；1：500稀释)和抗-p15E(小鼠产生的抗-TM，克隆372；1:250稀释)测定适当处理的病毒体病毒包膜蛋白表达和成熟。使用缀合至辣根过氧化物酶的相应二级抗体检测蛋白表达。数据显示，检测到适当处理的包膜蛋白中的RRV-GSG-P2A-yCD2和RRV-GSG-T2A-yCD2的gp70的水平与RRV-IRES-yCD2在病毒体中的水平相当，而RRV-P2A-yCD2和RRV-T2A-yCD2并非如此(图17)。
重要的是，数据表明，适当处理的病毒包膜蛋白的掺入水平与效价值不相关。
实施例11：经RRV-P2A-yCD2和RRV-T2A-yCD2、RRV-GSG-P2A-yCD2和RRV-GSG-T2A-yCD2感染的U87-MG细胞的yCD2蛋白表达水平不同，但表现出与经RRV-IRES-yCD2感染的U87-MG细胞相当的5-FC敏感性
由于RRV-P2A-yCD2和RRV-T2A-yCD2、RRV-GSG-P2A-yCD2和RRV-GSG-T2A-yCD2的免疫印迹显示在感染的U87-MG细胞中表达为与病毒包膜蛋白分离的蛋白或为融合多蛋白的yCD2蛋白的量不同，所以通过进行LD50实验测量它们的5-FC敏感性。通过MTS测定法，用经RRV-P2A-yCD2和RRV-T2A-yCD2载体、RRV-GSG-P2A-yCD2和RRV-GSG-T2A-yCD2载体最高感染U87-MG细胞来确定它们的5-FC LD50。对于每个感染或未感染的U87-MG细胞系，将1×103个细胞/孔/100μL培养基一式三份接种在96孔板中。用5-FC(cat#F7129，Sigma)以范围为0.00001mM-1mM的一系列1:10稀释处理细胞。包括非5-FC处理作为对照。接种后1天加入5-FC，然后每2天补充完全培养基和5-FC。包括原始U87-MG细胞作为对照以确定5-FC的非5-FU介导的细胞毒性作用。在7天的温育时间内监测细胞，并通过使用CellTiter 96 AQueous单溶液细胞增殖测定系统(AQueous One Solution Cell Proliferation Assay System)(Promega)每2天测量细胞死亡。加入MTS后，在MTS温育后60分钟使用Infinite M200(Tecan)酶标仪获得490nm下的OD值。将每个样品的三份的平均OD值转化为相对于未治疗但经RRV感染的细胞的细胞存活百分比。随后，使用GraphPad Prim将百分比值相对于对数标度的5-FC浓度绘图以生成LD50图。通过软件使用对获得的数据点的非线性四参数拟合来计算LD50值。数据表明，虽然经RRV-GSG-P2A-yCD2和RRV-GSG-T2A-yCD2感染的U87-MG细胞中“分离的”yCD2蛋白的水平高于经RRV-P2A-yCD2和RRV-T2A-yCD2感染的U87-MG细胞，但在经RRV-P2A-yCD2和RRV-T2A-yCD2感染的U87-MG细胞中观察到的病毒包膜-yCD2融合多蛋白在将5-FC转化为5-FU时具有酶促活性，从而在与RRV-IRES-yCD2相似LC50的浓度下实现细胞毒性作用(图18)。
实施例12：经RRV-GSG-P2A-yCD2和RRV-GSG-T2A-yCD2感染的Tu2449细胞表现出与RRV-IRES-yCD2相当的5-FC敏感性
使用经RRV-GSG-P2A-GMCSF-T2A-yCD2最高感染的U87-MG细胞通过如所述的MTS测定来确定其5-FC LD50。包括RRV-IRES-yCD2作为对照。用5-FC(cat#F7129，Sigma)以范围为0.00001mM-1mM的一系列1:10稀释进行处理。包括非5-FC处理作为对照。接种后1天加入5-FC，然后每2天补充完全培养基和5-FC。包括原始U87-MG细胞作为对照以确定5-FC的非5-FU介导的细胞毒性作用。在7天的温育时间内监测细胞，并通过使用CellTiter 96 AQueous单溶液细胞增殖测定系统(AQueous One Solution Cell Proliferation Assay System)(Promega)每2天测量细胞死亡。加入MTS后，在MTS温育后60分钟使用Infinite M200(Tecan)酶标仪获得490nm下的OD值。将每个样品的三份的平均OD值转化为相对于未治疗但经RRV感染的细胞的细胞存活百分比。使用GraphPad Prim将百分比值相对于对数标度的5-FC浓度绘图以生成LD50图。通过软件使用对获得的数据点的非线性四参数拟合来计算LD50值。数据表明，由经RRV-GSG-P2A-yCD2和RRV-GSG-T2A-yCD2感染的Tu-2449细胞表达的yCD2蛋白(图20A)在将5-FC转化为5-FU时具有酶促活性，以在与RRV-IRES-yCD2相似LC50的浓度下实现细胞毒性作用(图20B)。
实施例13：通过RRV-GSG-T2A-yCD2治疗的皮下同系神经胶质瘤小鼠，显示与RRV-IRES-yCD2相当的延迟的肿瘤生长。
使用同系细胞系Tu-2449作为B6C3F1小鼠中的原位脑肿瘤模型(Ostertag等,2012)。建立Tu-2449细胞的亚系(Tu-2449SQ)用于皮下肿瘤建模。在体外制备98％原始Tu-2449SQ细胞与2％经RRV-GSG-T2A-yCD2感染的Tu-2449SQ细胞的混合物并将其重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS；Hyclone)中用于皮下肿瘤植入。包括98％原始Tu-2449SQ细胞和2％经RRV-IRES-yCD2感染的Tu-2449SQ细胞的混合物作为阳性对照以及比较物。每组中的B6C3F1小鼠(每组n＝10)在第0天经皮下植入1×106个肿瘤细胞。在肿瘤植入后第12天(在约>75％的肿瘤被RRV感染时)，对小鼠施用PBS或5-FC(剂量为每kg体重500mg，i.p.，b.i.d.)连续45天，随后2天不用药物以使载体从剩余的感染细胞中扩散。再额外重复两次5天施用2天停用的药物治疗循环。每天进行肿瘤体积测量。结果表明，未经5-FC治疗的携带RRV-IRES-yCD2或RRV-GSG-T2A的小鼠荷瘤继续生长。相反，经5-FC治疗的携带RRV-GSG-T2A的小鼠荷瘤延迟了预先建立的肿瘤的肿瘤生长并且与用RRV-IRES-yCD2+5-FC治疗的情况相当(图21)。数据表明，在皮下同系神经胶质瘤小鼠模型中，RRV-GSG-T2A-yCD2具有与RRV-IRES-yCD2相当的治疗功效。
实施例14：从HEK293T细胞产生的RRV-GSG-T2A-GMCSF-GSG-P2A-yCD2和RRV-GSG-T2A-yCD2-GSG-PS2-GMCSF载体表达GMCSF和yCD2蛋白并且具有感染性。
通过将用分别存在于5'末端和3'末端的AscI和NotI限制性位点化学合成(Genewiz)的人GMCSF-GSG-P2A-yCD2和yCD2-GSG-P2A-GMCSF盒克隆到用AscI和NotI限制性内切酶消化的pAC3-GSG-T2A-yCD2骨架中，以产生pAC3-GSG-T2A-GMCSF-GSG-P2A-yCD2和RRV-GSG-T2A-yCD2-GSG-P2A-GMCSF。得到的GMCSF-GSG-P2A-yCD2和yCD2-GSG-P2A-GMCSF盒与盒的N末端(AscI限制性位点的5'上游)处的GSG-T2A读框符合。
转染前18至20小时，将HEK293T细胞以2e6个细胞/10-cm平板接种。第二天，在细胞接种后的20小时，使用磷酸钙法使用20μg pAC3-GSG-T2A-GMCSF-GSG-P2A-yCD2或pAC3-GSG-T2A-yCD2-GSG-P2A-GMCSF质粒进行瞬时转染。在转染后18小时，将细胞用CMEM培养基洗涤三次，并用新鲜的完全培养基温育。在转染后约42小时收集病毒上清液，并通过0.45μm注射器式过滤器过滤。如所述测定来自瞬时转染的HEK293T细胞的RRV-GSG-T2A-GMCSF-GSG-P2A-yCD2的病毒效价。数据显示，RRV-GSG-T2A-GMCSF-GSG-P2A-yCD2和pAC3-GSG-T2A-yCD2-GSG-P2A-GMCSF的效价(～2E6TU/mL)与RRV-IRES-yCD2的效价相当。
为了评估yCD2蛋白表达，从经pAC3-GSG-P2A-GMCSF-GSG-T2A-yCD2或pAC3-GSG-T2A-yCD2-GSG-P2A-GMCSF瞬时转染的293T细胞产生细胞裂解物。在该实验中，还包括pAC3-IRES-yCD2和pAC3-IRES-GMCSF作为对照。对于GMCSF表达，收集瞬时转染的293T细胞上清液，以通过ELISA(Cat#DGM00，R&D Systems)测量。如所述测定全部细胞裂解物的yCD2蛋白表达。抗-yCD2结果显示，来自pAC3-GSG-P2A-GMCSF-GSG-T2A-yCD2或pAC3-GSG-T2A-yCD2-GSG-P2A-GMCSF的yCD2蛋白与GMCSF有效分离，如～15KDa带所指示的(图22A)。然而，由2A肽介导的yCD2与GMCSF(pAC3-GSG-P2A-GMCSF-GSG-T2A-yCD2)或与病毒包膜蛋白(pAC3-GSG-T2A-yCD2-GSG-P2A-GMCSF)的分离在两种结构中明显不同，具有yCD2蛋白与GMCSF的适当分离，如与来自RRV-IRES-yCD2的yCD2相比而言yCD2的大小所表明(图22A)。相比之下，从病毒env分离的yCD2蛋白具有稍高的分子量(在图22A中表示为2A-yCD2)并且与RRV-GSG-P2A-GFP、RRV-GSG-T2A-GFP、RRV-GSG-P2A-yCD2和RRV-GSG-T2A-yCD2构建体的一致。数据表明，yCD2从Env的分离可能不会在理论上预期的氨基酸序列上精确地发生。但是当yCD2被置于另一种分泌蛋白(即GMCSF)的下游时，观察到yCD2蛋白的适当分离。然而，重要的是注意，由RRV-GSG-P2A-yCD2和RRV-GSG-T2A-yCD2表达的2A-yCD2蛋白的酶活性似乎不影响体外和体内的5-FC敏感性和细胞毒性作用(图20)。
尽管GMCSF蛋白与pAC3-GSG-P2A-GMCSF-GSG-T2A-yCD2构建体中的病毒包膜蛋白或与pAC3-GSG-T2A-yCD2-GSG-P2A-GMCSF构建体中的yCD2的分离效率是未确定的，但GMCSFELISA结果表明，RRV-GSG-P2A-GMCSF-GSG-T2A-yCD2所分泌的GMCSF量为～500ng/mL，RRV-GSG-T2A-yCD2-GSG-P2A-yCD2所分泌的GMCSF量为～760ng/mL(图22B)。在这两种情况下，所表达的GMCSF的量是RRV-IRES-GMCSF(25ng/mL)的约20-30倍。平行地，使用抗-gp70抗体检测感染的U87-MG中的病毒包膜蛋白的处理。结果显示，容易检测到以前体(Pr85)或处理形式(gp70)的病毒包膜蛋白。同时，数据表明，Env-GSG-T2A-GMCSF-GSG-P2A-yCD2和Env-GSG-T2A-yCD2-GSG-P2A-GMCSF多蛋白结构能够表达GMCSF和yCD2蛋白。
另外，如所描述的那样对从最高感染的U87-MG细胞收集的病毒上清液进行效价测定以确保病毒保持感染性。数据显示，从最高感染的U87-MG细胞产生的效价(～3E6TU/mL)与从瞬时转染的HEK293T细胞获得的效价相似并且与RRV-IRES-yCD2相当。
实施例15：RRV-GSG-T2A-GMCSF-P2A-yCD2和RRV-GSG-T2A-yCD2-P2A-GMCSF载体表现出与RRV-IRES-yCD2感染的U87-MG细胞相当的5-FC敏感性。
将经RRV-GSG-T2A-GMCSF-GSG-P2A-yCD2或RRV-GSG-T2A-yCD2-GSG-P2A-GMCSF最高感染的U87-MG细胞用于通过如所述的MTS测定确定其5-FC LD50。包括RRV-IRES-yCD2作为对照。数据表明，在感染的U87-MG细胞中检测到的“分离的”yCD2蛋白的量能够在0.008mM的LD50浓度下实现细胞毒性作用，这与RRV-IRES-yCD2的相似。
实施例16：从HEK293T细胞和最高感染的U87-MG细胞产生的RRV-GSG-T2A-GMCSF-RSV-yCD2载体具有感染性并表达GMCSF蛋白和yCD2蛋白。
通过将用分别存在于5'和3'末端的AscI和NotI限制性位点化学合成的(Genewiz)人GMCSF-RSV-yCD2盒克隆到由AscI和NotI限制性内切酶消化的pAC3-GSG-T2A-yCD2骨架中，以产生pAC3-GSG-T2A-GMCSF-RSV-yCD2。化学合成的GMCSF-RSV-yCD2盒在GMCSF ORF的3'末端含有终止密码子。
转染前的18至20小时，将HEK293T细胞以2e6个细胞/10-cm平板接种。第二天，在细胞接种后的20小时，使用磷酸钙法使用20μg pAC3-GSG-T2A-GMCSF-RSV-yCD2质粒进行瞬时转染。在转染后18小时，将细胞用CMEM培养基洗涤三次，并用新鲜的完全培养基温育。在转染后约42小时收集病毒上清液，并通过0.45μm注射器式过滤器过滤。如所述测定来自瞬时转染的HEK293T细胞的RRV-GSG-T2A-GMCSF-RSV-yCD2的病毒效价。数据显示，RRV-GSG-T2A-GMCSF-RSV-yCD2的效价(～2E6TU/mL)与RRV-IRES-yCD2的效价相当。
此外，对从最高感染的U87-MG细胞收集的病毒上清液进行效价测定以确保病毒保持感染性。数据显示，从最高感染的U87-MG细胞产生的效价(～2E6 TU/mL)与从瞬时转染的HEK293T细胞获得的效价相似，并且与RRV-IRES-yCD2相当。
为了评估GMCSF和yCD2蛋白表达，从经RRV-GSG-T2A-GMCSF-RSV-yCD2感染的U87-MG细胞产生细胞裂解物。在该实验中，包括RRV-IRES-yCD2和RRV-IRES-GMCSF作为对照。收集来自最高感染的U87-MG细胞的上清液，以通过ELISA(R&D Systems)测量GMCSF的蛋白表达水平。如所述测定全部细胞裂解物的yCD2蛋白表达。抗-yCD2免疫印迹结果显示，来自经RRV-GSG-T2A-GMCSF-RSV-yCD2感染的U87-MG细胞的yCD2蛋白表达的水平比RRV-IRES-yCD2的低2-3倍。平行地，使用抗-gp70抗体检测感染的U87-MG中的病毒包膜蛋白的处理。结果显示，以前体(Pr85)或处理形式(gp70)中的病毒包膜蛋白容易检测到。如所预期的，还使用抗-gp70抗体在细胞裂解物中检测到病毒包膜-GMCSF融合多蛋白。尽管未确定GMCSF蛋白与病毒包膜蛋白的分离，但GMCSF ELISA结果表明，所分泌的GMCSF量为～300ng/mL，是RRV-IRES-GMCSF(30ng/mL)的约10倍。同时，数据表明，病毒包膜蛋白-GSG-T2A-GMCSF-RSV-yCD2多蛋白结构可以在RRV的情况下产生感染性病毒以及GMCSF和yCD2蛋白。
实施例17：RRV-GSG-T2A-GMCSF-RSV-yCD2载体表现出与经RRV-IRES-yCD2感染的U87-MG细胞相当的5-FC敏感性。
将用RRV-GSG-T2A-GMCSF-RSV-yCD2载体最高感染的U87-MG细胞用于通过如上所述的MTS测定来确定其5-FC LD50。在该实验中，包括RRV-IRES-yCD2作为对照。数据表明，在感染的U87-MG细胞中表达的yCD2蛋白量能够在0.010mM的LD50浓度下实现细胞毒性作用，并且与RRV-IRES-yCD2的相当。
实施例18：从293T细胞和感染的U87-MG细胞产生的RRV-GSG-P2A-yCD2-RSV-PDL1miR30shRNA载体具有感染性并表达yCD2蛋白。
通过将用分别存在于5'和3'末端的AscI和NotI限制性位点化学合成(Genewiz)的人yCD2-RSV-miRPDL1盒克隆到由AscI和NotI限制性内切酶消化的pAC3-GSG-T2A-yCD2骨架中产生pAC3-GSG-T2A-yCD2-RSV-miRPDL1。化学合成的yCD2-RSV-miRPDL1盒在yCD2ORF末端含有终止密码子。
转染前的18至20小时，将HEK293T细胞以2e6个细胞/10-cm平板接种。第二天，在细胞接种后20小时，使用磷酸钙法使用20μg pAC3-GSG-T2A-yCD2-RSV-miRPDL1质粒进行瞬时转染。在转染后18小时，用DMEM培养基洗涤细胞三次，并用新鲜的完全培养基温育。在转染后约42小时收集病毒上清液，并通过0.45μm注射器式过滤器过滤。如所述测定来自瞬时转染的HEK293T细胞的RRV-GSG-T2A-yCD2-RSV-mrRPDL1的病毒效价。数据显示，RRV-GSG-T2A-yCD2-RSV-miRPDL1(～2E6TU/mL)的效价与RRV-IRES-yCD2的效价相当。
此外，对从最高感染的U87-MG细胞收集的病毒上清液进行效价测定以确保病毒保持感染性。数据显示，从最高感染的U87-MG细胞产生的效价(～2E6 TU/mL)与从瞬时转染的HEK293T细胞获得的效价相似，并且与RRV-IRES-yCD2相当。
为了测量yCD2蛋白表达和PDL1细胞表面表达，收集最高感染的U87-MG细胞，并如所述测定全部细胞裂解物的yCD2蛋白表达。抗-yCD2免疫印迹结果显示，来自经RRV-GSG-T2A-yCD2-RSV-miRPDL1感染的U87-MG细胞的yCD2蛋白与病毒包膜蛋白有效分离，如使用抗-yCD2抗体通过～15KDa带所指示的。如所预期的，还使用抗-yCD2和抗-gp70抗体在细胞裂解物中检测到病毒包膜-yCD2融合多蛋白。平行地，使用抗-gp70抗体检测感染的U87-MG中的病毒包膜蛋白的处理。结果显示，以前体(Pr85)或处理形式(gp70)的病毒包膜蛋白容易检测到。此外，如在抗yCD2免疫印迹中所见，检测到融合多蛋白。
实施例19：经RRV-GSG-T2A-yCD2-RSV-miRPDL1感染的U87-MG细胞表现出与经RRV-IRES-yCD2感染的U87-MG细胞相当的5-FC敏感性。
将用RRV-GSG-T2A-yCD2-RSV-miRPDL1载体最高感染的U87-MG细胞用于通过如所述的MTS测定法来确定其5-FC LD50。在该实验中，包括RRV-IRES-yCD2作为对照。数据表明，在感染的U87-MG细胞中检测到的“分离的”yCD2蛋白量能够在与RRV-IRES-yCD2相当的LD50浓度(0.008mM)下实现细胞毒性作用。
实施例20：经RRV-GSG-P2A-yCD2-RSV-miRPDL1感染的MDA-MB231细胞在细胞表面表现出有效的PD-L1敲低。
为了评估RRV-GSG-T2A-yCD2-RSV-miRPDL1的PDL1敲低活性，使用0.1的MOI来感染已显示表达显著水平的PDL1的MDA-MB231细胞。在该实验中，包括RRV-RSV-miRPDL1作为评估PDL1敲低活性的阳性对照。在感染后大约第14天，收集细胞并进行细胞表面染色以通过FACS测量PDL1蛋白的水平。数据显示，在用RRV-GSG-T2A-yCD2-RSV-miRPDL1感染的MDA-MB231细胞中PDL1的细胞表面表达减少了约75％，并且与RRV-RSV-miRPDL1的相当。同时，数据表明，病毒包膜蛋白-GSG-T2A-yCD2-RSV-miRPDL1结构能够在RRV的情况下产生感染性病毒、yCD2蛋白和miRPDL1。
实施例21：从HEK293T细胞和最高感染的U87-MG细胞产生的RRV-P2A-TKO RRV-GSG-P2A-TKO、RRV-T2A-TKO和RRV-GSG-T2A-TKO载体具有感染性并表达TKO蛋白
通过将具有人密码子优化(TKO)(参见国际申请公布号WO2014/066700，通过引用并入本文)盒的Sr39-tk(Black等,Cancer Res.,61:3022–3026,2001；Kokoris et al.,Protein Science 11:2267–2272,2002)克隆到pAC3-2A骨架中产生pAC3-P2A-TKO、pAC3-GSG-P2A-TKO、pAC3-T2A-TKO和pAC3-GSG-T2A-TKO。分别用在5'和3'末端存在的AscI和NotI限制位点化学合成(Genewiz)TKO序列，进入用AscI和NotI限制性内切酶消化的pAC3-GSG-P2A-yCD2或pAC3-GSG-T2A-yCD2骨架中。
转染前18至20小时，将HEK293T细胞以2e6个细胞/10-cm平板接种。第二天，在细胞接种后20小时，使用磷酸钙法用20μg pAC3-GSG-P2A-TKO或pAC3-GSG-T2A-TKO质粒进行瞬时转染。在转染后18小时，用DMEM培养基洗涤细胞三次，并用新鲜的完全培养基温育。在转染后约42小时收集病毒上清液，并通过0.45μm注射器式过滤器过滤。如所述测定来自瞬时转染的HEK293T细胞的RRV-P2A-TKO、RRV-GSG-P2A-TKO、RRV-T2A-TKO和RRV-GSG-T2A-TKO的病毒效价。数据显示，效价与RRV-IRES-yCD2的效价相当(表6)。
表6：从HER293T细胞产生的RRV-P2A-TKO RRV-GSG-P2A-TKO、RRV-T2A-TKO和RRV-GSG-T2A-TKO载体的效价
此外，如所描述对从最高感染的U87-MG细胞收集的病毒上清液进行效价测定以确保病毒保持感染性。数据显示，由最高感染的U87-MG细胞产生的效价与从瞬时转染的HEK293T细胞获得的效价相当(图23)。
为了评估TKO蛋白表达，从经RRV-P2A-TKO RRV-GSG-P2A-TKO、RRV-T2A-TKO和RRV-GSG-T2A-TKO感染的U87-MG细胞产生细胞裂解物。使用抗HSV-tk抗体(Cat#sc28037，SantaCruz Biotech Inc)以1：200测定全部细胞裂解物的TKO蛋白表达。结果显示，如先前在GFP和yCD2转基因下所见，与RRV-GSG-P2A-TKO和RRV-GSG-T2A-TKO相比，来自经RRV-P2A-TKO和RRV-T2A-TKO感染的U87-MG细胞的TKO蛋白分离更低效(图24)。
实施例22：RRV-P2A-TKO RRV-GSG-P2A-TKO、RRV-T2A-TKO和RRV-GSG-T2A-TKO载体在U87-MG细胞中是稳定的。
为了评估最高感染的U87-MG细胞中的载体稳定性，使用Promega Maxwell 16细胞DNA纯化试剂盒(Promega)从细胞中提取基因组DNA。然后如之前所述使用100纳克的基因组DNA作为用于跨越转基因盒的引物对；IRES-F(5'-CTGATCTTACTCTTTGGACCTTG-3'(SEQ IDNO：23))和IRES-R(5'-CCCCTTTTTCTGGAGACTAAATAA-3'(SEQ ID NO：24))进行PCR的模板。所有RRV-2A-TKO构建体的预期PCR产物为1.4kb。数据显示，前病毒DNA RRV-P2A-TKO RRV-GSG-P2A-TKO、RRV-T2A-TKO和RRV-GSG-T2A-TKO载体中的2A-TKO和GSG-2A-TKO区在病毒复制的时间过程中在U87-MG细胞中时稳定的(图25)。
实施例23：经RRV-P2A-TKO、RRV-GSG-P2A-TKO、RRV-T2A-TKO和RRV-GSG-T2A-TKO感染的U87-MG细胞表现出优于RRV-S1-TKO的GCV敏感性
将用RRV-P2A-TKO、RRV-GSG-P2A-TKO、RRV-T2A-TKO和RRV-GSG-T2A-TKO最高感染的U87-MG细胞用于通过MTS测定法来测定其GCV LD50。包括TKO表达由合成最小启动子驱动的RRV-S1-TKO(参见国际专利公布号WO2014/066700，通过引用并入本文)作为对照。用GCV(cat#345700-50MG，EMD Millipore)以范围为0.0001μM-0.5μM的一系列1:2稀释进行处理。包括未经GCV处理作为对照。在接种后1天添加GCV，然后每2天补充完全培养基与GCV。包括原始U87-MG细胞作为对照以确定GCV的细胞毒性作用。在7天的温育时间内监测细胞，并通过使用CellTiter 96 AQueous单溶液细胞增殖测定系统(Promega)每2天测量细胞死亡。加入MTS后，在MTS温育后60分钟使用Infinite M200(Tecan)酶标仪获得490nm下的OD值。将每个样品的三份的平均OD值转化为相对于未处理但RRV感染的细胞的细胞存活百分比。使用GraphPad Prim以百分比值相对于对数标度的GCV浓度作图以生成LD50图。通过软件使用获得的数据点的非线性四参数拟合来计算LD50值。数据表明，由RRV-P2A-TKO、RRV-GSG-P2A-TKO、RRV-T2A-TKO和RRV-GSG-T2A-TKO表达的TKO蛋白在十分之一微摩尔范围酶促活性地将GCV转化为细胞毒性GCV，以实现细胞毒作用(图26)。与RRV-S1-TKO相比，RRV-P2A-TKO、RRV-GSG-P2A-TKO、RRV-T2A-TKO和RRV-GSG-T2A-TKO显示出12.5-20倍高的GCV敏感性。此外，尽管TKO与Env-TKO融合多蛋白分离存在差异，但RRV-P2A-TKO与RRV-GSG-P2A-TKO或RRV-T2A-TKO与RRV-GSG-T2A-TKO之间的GCV LD50没有显著差异。类似于2A-yCD2，数据表明，在细胞中表达的TKO蛋白量足以将GCV转化为细胞毒性GCV。
实施例24：通过RRV-GSG-P2A-TKO和RRV-GSG-T2A-TKO治疗的皮下同系神经胶质瘤小鼠显示与RRV-IRES-yCD2相当的延迟的肿瘤生长。
使用同系细胞系Tu-2449作为B6C3F1小鼠中的原位脑肿瘤模型(Ostertag等,2012)。在Tocagen建立Tu-2449细胞的亚系(Tu-2449SQ)用于皮下肿瘤模型。在体外制备98％原始Tu-2449SQ细胞与2％经RRV-GSG-P2A-TKO、RRV-GSG-T2A-TKO或RRV-S1-TKO感染的Tu-2449SQ细胞的混合物，并将其重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS；Hyclone)中用于皮下肿瘤植入。将包括98％原始Tu-2449SQ细胞和2％经RRV-IRES-yCD2感染的Tu-2449SQ细胞的混合物作为阳性对照以及比较物。将每组中的B6C3F1小鼠(每组n＝10)在第0天经皮下植入1×106个肿瘤细胞。在肿瘤植入后第12天(在大约>75％的肿瘤被RRV感染的时间)，给小鼠施用PBS、5-FC(剂量为每kg体重500mg，i.p.，b.i.d.)或GCV(剂量为每kg体重50mg，i.p.，b.i.d.)连续5天，接着2天不用药物以使载体从剩余的感染细胞中扩散。再额外重复两次5天施用2天停用的药物治疗循环。每天进行肿瘤体积测量。结果表明，未经GCV治疗的携带RRV-GSG-P2A-TKO、RRV-GSG-T2A-TKO或未经5-FC治疗的携带RRV-IRES-yCD2的小鼠荷瘤继续生长。相反，用RRV-GSG-P2A-TKO、RRV-GSG-T2A-TKO+GCV治疗的小鼠荷瘤延迟了预先建立的肿瘤的肿瘤生长。此外，用RRV-S1-TKO+GCV治疗的小鼠荷瘤也显示出肿瘤生长延迟，尽管程度较小且时间较经RRV-GSG-P2A-TKO、RRV-GSG-T2A-TKO+GCV治疗的肿瘤更长，这可能是由于降低了TKO表达。同时，数据表明，RRV-GSG-P2A-TKO+GCV和RRV-GSG-T2A-TKO+GCV的肿瘤生长延迟与用RRV-IRES-yCD2+5-FC处理的肿瘤生长延迟相当。数据表明，在皮下同系神经胶质瘤小鼠模型中，RRV-GSG-P2A-TKO和RRV-GSG-T2A-TKO具有与RRV-IRES-yCD2相当的治疗功效。
实施例25：从HEK293T细胞和最高感染的U87-MG细胞产生的RRV-GSG-T2A-PDL1scFv和RRV-GSG-T2A-PDL1scFvFc载体具有感染性并表达scFv和scFvFc蛋白。
产生pAC3-T2A-PDL1scFv、pAC3-T2A-PDL1scFv-标签、pAC3-T2A-PDL1scFvFc和pAC3-T2A-PDL1scFvFc-标签以用作针对人和小鼠PDL1的阻断单链可变片段(scFv)。设计具有或不具有人IgG1的片段可结晶(Fc)区的PDL1scFv盒。此外，还生成了在scFv或ScFvFc的C末端掺入HA和Flag表位标签的匹配盒用于检测scFv或scFvFc蛋白表达。用分别存在于5'和3'末端的AscI和NotI限制性位点化学合成(Genewiz)每个盒(PDL1scFv、PDL1scFv-标签、PDL1scFvFc和PDL1scFvFC-标签)的序列，并将其克隆到用AscI和NotI限制性内切酶消化的pAC3-GSG-T2A-yCD2骨架中。
转染前18至20小时，将HEK293T细胞以2e6个细胞/10-cm平板接种。第二天，在细胞接种后20小时，使用磷酸钙法使用20μg pAC3-T2A-PDL1scFv、pAC3-T2A-PDL1scFv-标签、pAC3-T2A-PDL1scFvFc和pAC3-T2A-PDL1scFvFc-标签进行瞬时转染。在转染后18小时，用DMEM培养基洗涤细胞三次，并用新鲜的完全培养基温育。在转染后约42小时收集病毒上清液，并通过0.45μm注射器式过滤器过滤。如所述测定来自瞬时转染的HEK293T细胞的RRV-GSG-T2A-GMCSF-GSG-P2A-yCD2的病毒效价。数据显示，RRV-GSG-T2A-PDL1scFv、RRV-GSG-T2A-PDL1scFvFc、RRV-GSG-T2A-PDL1scFv-标签、RRV-GSG-T2A-PDL1scFvFc-标签的效价值与RRV-IRES-yCD2的效价值相当(表7)。
表7：来自瞬时转染的HEK293T细胞的RRV-GSG-T2A-PDL1scFv、RRV-GSG-T2A-PDL1scFvFc、RRV-GSG-T2A-PDL1scFv-标签、RRV-GSG-T2A-PDL1scFvFc-标签的效价值
TU/mL 标准偏差
RRV-PDL 1scFv 2.09E+06 4.80E+05
RRV-PDL 1scFv Fc 1.98E+06 4.38E+05
RRV-PDL 1scFv-Tag 2.08E+06 6.73E+05
RRV-PDL 1scFv Fc-Tag 1.29E+06 1.87E+05
为了评价scFv蛋白表达，从经RRV-GSG-T2A-PDL1scFv和RRV-GSG-T2A-PDL1scFvFc转染的HEK293T细胞产生细胞裂解物。使用抗-Flag抗体和抗HA抗体(Cat#1804和Cat#H3663，Sigma Aldrich)以1∶1000测定全部细胞裂解物的scFv蛋白表达。结果显示，来自经RRV-GSG-T2A-PDL1scFv-标签、RRV-GSG-T2A-PDL1scFvFc-标签瞬时转染的HEK293T细胞的PDL1scFv-标签和PDL1scFvFc-标签表达与Env-scFv多蛋白分离(图27A)，如先前在GFP和yCD2和TKO转基因下所看到的。
平行地，使用抗2A抗体检测HEK293T细胞中病毒包膜蛋白的处理。结果显示，在全部4种载体中检测到包含2A肽序列的以前体(Pr85)或处理形式(p15E)的病毒包膜(图27B)，表明病毒包膜蛋白与scFv和scFvFc蛋白分离，如在抗-Flag和抗-HA免疫印迹中所见。尽管在细胞裂解物中检测到融合多蛋白Env-scFv或Env-scFvFc的表达，但明显量的PDL1scFv和PDL1scFvFc蛋白与融合多蛋白分离，如由细胞裂解物和上清液的免疫印迹所表明。
类似地，通过用抗-Flag抗体进行免疫沉淀然后用抗HA检测(反之亦然)，在来自瞬时转染的HEK293T细胞的上清液中也检测到大量的scFv-标签和scFvFc-标签蛋白表达。此外，还从最高感染的MDA-MB231(人乳腺癌细胞系)和CT-26(鼠结肠直肠癌细胞系)细胞的裂解物以及上清液中检测到scFv-标签和scFvFc-标签蛋白表达水平比瞬时转染的HEK293T细胞低约2-3倍。
实施例26：RRV-GSG-T2A-PDL1scFv和RRV-GSG-T2A-PDL1scFvFc在体外恢复PHA刺激的T细胞活化并显示PDL1阻断抗体的等效性。为了确定RRV-GSG-T2A-PDL1scFv或RRV-GSG-T2A-PDL1scFvFc对肿瘤细胞的PDL1阻断是否可以缓解PDL1介导的T细胞抑制，进行了PDL1介导的反抑制共培养实验。在此评价了针对各种肿瘤细胞系对PDL1表达的调节是否可以改变健康供体PBMC的PHA刺激的活化，如通过IFNγ的细胞内表达或IFNγ到上清液中的释放所测量的。为了消除IFNγ预处理在反抑制共培养测定中的潜在多效性效应，使用具有高PDL1基底细胞表面表达水平的人乳腺癌细胞系MDA-MB-231建立了共培养系统。为了证实PDL1参与该测定的必要性，还包括抗-PDL1阻断抗体。PDL1+肿瘤细胞MDA-MB-231细胞在抗PDL1阻断抗体存在下不能抑制CD8+ T细胞活化，如通过IFNγ+/CD8+T细胞频率增加所表明。类似地，用RRV-GSG-T2A-scFv或RRV-GSG-T2A-scFvFc感染的MDA-MB-231细胞等效地恢复CD8+T细胞活化。数据表明，通过PDL1阻断scFv发生的PDL1：PD1轴对肿瘤细胞和淋巴细胞的破坏显示与抗-PDL1阻断抗体活性相当，并为来自RRV-GSG-T2A-PDL1scFv和RRV-GSG-T2A-PDL1scFv的实质性免疫益处提供了证据。
实施例27：RRV、TOCA-511、突变分析。
各种肿瘤类型可变地能够支持快速RRV复制，并且这种可变性能够改变不同肿瘤对基于RRV的治疗性治疗的敏感性，例如RRV Toca 511(又名T5.0002)和前药Toca FC治疗对于高等级胶质瘤的治疗(TF Cloughsey等,Sci Transl Med.,8(341):341ra75,June 1,2016,doi:10.1126/scitranslmed.aad9784.)。这种可变性归因于多种因素，但根据我们的编码修饰的酵母胞嘧啶脱氨酶(从患者的血液或肿瘤中回收的)的RRV的测序数据，一个似乎关系重大的因素是通过APOBEC功能(特别是APOBEC3B和APOBEC3)的修饰(B.P.Doehle等,J.Virol.79:8201-8207,2005)。表达的修饰推断自：在复制型逆转录病毒载体中随着其在肿瘤组织中逐渐复制的失活或衰减突变积累频率。研究表明，最常见的事件之一是G至A突变，其与来自逆转录步骤中第一复制步骤中在负链单链DNA上的APOBEC介导的突变的C至T转换特性对应。这些突变可导致RRV蛋白的氨基酸组成发生改变，例如从TGG(色氨酸)至终止密码子(TAG、TGA或TAA)的破坏性改变。已经表明，对于一些肿瘤(特别是膀胱癌、宫颈癌、肺癌(腺癌和鳞状细胞癌)、头颈癌和乳腺癌)，APOBEC3B活性上调，并且这种上调与突变负荷增加相关，其变化与APOBEC3B活性一致(MB.Burns等,Nature Genetics 45:977-83,2013；doi:10.1038/ng.2701)。推测这种上调背后的驱动因素是，更高的突变率有利于肿瘤进化和选择对肿瘤有益的基因型和表型。在一个实施方式中，通过替代为具有类似化学或结构特性的其它氨基酸(例如将不会被APOBEC转化的苯丙氨酸或酪氨酸)的密码子来避免病毒中的失活变化。Toca 511是源自MLV的RRV，其编码与IRES连接的热稳定密码子优化的酵母胞嘧啶脱氨酶，该酶催化前药5-FC到细胞毒性5-FU转化。在Toca 511治疗过程中，由于逆转录和细胞抗病毒防御机制例如APOBEC介导的胞苷脱氨酶的错误，Toca 511易于发生突变。APOBEC蛋白靶向单链DNA，主要在Toca 511RNA基因组的逆转录期间，表现为G至A点。
通过对从肿瘤和血液中分离的临床样品的Toca 511进行高通量测序来分析Toca511序列突变谱。G至A点突变是Toca 511中最常见的突变类型，与APOBEC活性一致(图28)。这是通过高通量测序对来自人样品的γ-逆转录病毒基因疗法突变谱的首次表征。对G至A突变的分析表明这些通常导致编码序列中的非同义变化。在编码胞嘧啶脱氨酶多肽的基因内，在来自多个患者的样品中存在两个复发G至A突变的位置(表8)。这些突变将编码色氨酸的密码子TGG转化为TGA、TAG或TAA终止密码子，并因此在仅9个氨基酸后终止CD翻译。这些结果强调色氨酸密码子是逆转录病毒基因治疗失活的潜在来源。
表8.Toca 511的重组胞嘧啶脱氨酶(SEQ ID NO：28-29)中的点突变总结。位置是CD蛋白内的氨基酸位置。样品显示来自显示突变的血液或肿瘤的临床样品的数量。密码子和改变显示原始密码子序列和随后的改变。AA是由原始密码子编码的原始氨基酸，并且改变显示在密码子突变后氨基酸改变为什么。
因此，将色氨酸密码子改变为编码与蛋白质功能相容的氨基酸的替代密码子，能够减轻APOBEC介导的逆转录病毒基因疗法的失活。
为了测试突变对稳定性的影响，Toca511基因组序列(参见例如美国专利号8,722,867，'867专利的SEQ ID NO：19、20和22，其通过引用并入本文)被工程化为将显示ApoBec超突变的密码子改变为编码保留稳定性和功能的替代氨基酸的密码子(例如，将色氨酸的密码子改变为某种其它允许的氨基酸)。具有胞嘧啶脱氨酶活性的Toca 511多肽(参见SEQ IDNO：29)与天然存在的真菌胞嘧啶脱氨酶蛋白密切相关，并且这种胞嘧啶脱氨酶的高分辨率结构是可用的。因此，可以利用来自种系发生不同的真菌CD蛋白的结构序列比对和多序列比对的组合来鉴定对生物功能不具有不利影响的潜在氨基酸替代，例如使用ROSETTA、Provean、PSIpred或类似程序。然后通过改变Toca511基因组并测量酶和生物活性、溶解度、溶液中的热稳定性以及在细胞培养测定和小鼠肿瘤模型中的作用能力(例如5-FC到5-FU的转化)、启动细胞死亡的能力以及激活针对肿瘤的免疫应答以实现持久应答的能力，来测试推定的氨基酸取代集合。对于GAG、POL和ENV序列可以使用类似的分析来修饰这些序列以去除对ApoBec超突变敏感的密码子。
实施例28：APOBEC抗性yCD病毒载体对裸鼠中的颅内人类异种移植物(T98G)是治疗性的。
建立使用高度表达APOBEC的T98G人神经胶质瘤细胞系的颅内异种移植模型，以在高APOBEC活性条件下在裸鼠宿主中测试RRV载体扩散和生物分布以及APOBEC-抗性RCR-载体介导的胞嘧啶脱氨酶自杀基因治疗的疗效。
适应环境后，将小鼠随机分配到9个治疗组中的一组(参见下面的组描述)。在第0天对8组进行颅内给药至右侧纹状体内(给药1×105个T98G细胞/小鼠)。组9小鼠没有植入肿瘤。在第5天，仅对小鼠注射配制缓冲液、9×105TU/5μl的T5.0002(表达yCD的APOBEC敏感性RRV；组3)或9×105TU/5μl、9×104TU/5μl或9×103TU/5μl的APOBEC抗性RCR载体(T5.002A)。以500mg/kg/天进行随机5-FC给药，从第19天开始以单次IP注射给药，或者对某些组不给予5-FC(组1、组4、组8)。接受中剂量载体的小鼠均接受5-FC(即，对于该剂量没有单独的对照组)。继续每天5-FC给药连续7天，随后15天不进行治疗。将药物加上休息的周期重复多达4个周期。将除了第8组以外的每组的10只小鼠随机分配到存活分析类别。按照预定的时间表处死剩下的小鼠。
组分配和剂量水平
通过注射到尾静脉进行静脉内给药。通过腹腔注射进行腹腔注射，小心避开膀胱。对于颅内注射，将小鼠用异氟烷麻醉并置于具有钝耳棒的立体定位装置中。将皮肤剃去并且使用必妥碘处理头皮以准备手术部位。将动物置于加热垫上，并在无菌条件下使用手术刀以通过皮肤进行中线切开。在切开部位回缩皮肤且折回筋膜将允许头骨可视。将具有3mm突起的引导套管(装配有具有3.5mm突起的帽)通过颅骨上的小钻孔插入，并用牙科粘合剂和三颗小螺丝附接在颅骨上。粘合剂硬化后，用缝线封闭皮肤。投射的立体坐标是AP＝0.5-1.0mm、ML＝1.8-2.0mm、DV＝3.0mm。通过注射染料并确定其位置，在预试验实验(2-3只动物)中确定动物群的精确立体坐标。在麻醉恢复期间监测动物。在手术结束前皮下(SC)给药止痛剂丁丙诺啡，然后大约每12小时施用丁丙诺啡长达3天。每天监测动物。将细胞或载体通过具有3.5mm突起的注射套管颅内注入，注射套管通过引导套管插入。速率由装有汉密尔顿注射器和柔性管的注射器泵控制。对于细胞注射，以0.2微升/分钟的流速递送1微升细胞(总共5分钟)。对于载体注射，以0.33微升/分钟的流速递送5微升载体(总共15分钟)。
递送APOBEC抗性载体并将其计算为小鼠每克脑重量的转化单位(TU)。使用这种计算，可以计算用于包括人在内的其它哺乳动物的剂量转化。APOBEC抗性载体显示有效的剂量反应，而对APOBEC活性敏感的载体显示有效反应减弱。在用人APOBEC3G或APOBEC3B的表达载体转染的U87细胞系中进行相同的实验，所述APOBEC3G或APOBEC3B的表达载体表达这些蛋白的水平超过在植入异种移植模型中的U87天然水平至少3倍。这些实验表明，设计为APOBEC抗性的修饰的密码子病毒在U87系中具有复制和/或治疗反应优势：相比于对APOBEC抗性未经密码子修饰的原始RRV，具有增加的APOBEC水平。
实施例29：APOBEC抗性yCD病毒载体在脑癌的同系小鼠模型中具有治疗性。
在同基因动物模型中进行用于证明本发明的方法和组合物的其它实验。
建立使用在同系BALB/c小鼠中稳定转染以产生鼠APOBEC3的CT26结直肠癌细胞系的颅内植入物模型，以测试APOBEC抗性RRV载体扩散和生物分布以及RRV-载体介导的胞嘧啶脱氨酶自杀基因疗法的疗效及其免疫学影响。
该研究包括129只动物：0只雄性、119只雌性和10只应急动物(10只雌性)。适应环境后，将小鼠随机分配到9个治疗组中的一组(参见下面的组描述)。在第0天对8组进行颅内给药至右侧纹状体内(给药1×104个CT26细胞/小鼠)。组9小鼠没有植入肿瘤。在第5天，仅对小鼠注射配制缓冲液、9×105TU/5μl的对APOBEC(T5.0002)仍敏感的控制载体或9×105TU/5μl、9×104TU/5μl或9×103TU/5μl的APOBEC抗性载体(T5.002A)。从第13天开始，通过IP注射给药使未接受载体或接受9×105TU/5μl或9×103TU/5μl载体得小鼠随机接受5-FC(500mg/kg/BID)，或者不接受5-FC，如所示(PBS)。接受中剂量载体的小鼠均接受5-FC(即，对于该剂量没有单独的对照组)。继续每天5-FC给药连续7天，随后10天不进行治疗。将药物加上休息的周期重复多达4个周期。将除了第9组以外的每组的10只小鼠随机分配到存活分析类别。按照预定的时间表处死剩下的小鼠。
将原始哨兵小鼠与按时间表处死的动物共同饲养并在相同时间点使其患病以通过分散评估载体传递。
组分配和剂量水平
通过注射到尾静脉进行静脉内给药。通过向腹腔注射进行腹腔内注射，小心避开膀胱。对于颅内给药，使用具有3.2mm突起的引导套管(装配有具有3.7mm突起的帽)植入小鼠的右侧纹状体。投射的立体坐标是AP＝0.5-1.0mm、ML＝1.8-2.0mm、DV＝3.2mm(来自前囟)。将细胞或载体通过具有3.7mm突起的注射套管颅内注入，注射套管通过引导套管插入。速率由装有汉密尔顿注射器和柔性管的注射器泵控制。
对于细胞注射，以0.2微升/分钟的流速递送1微升细胞(总共5分钟)。对于载体注射，以0.33微升/分钟的流速递送5微升载体(总共15分钟)。
递送载体并将其计算为小鼠每克脑重量的转化单位(TU)。使用这种计算，可以计算用于包括人在内的其它哺乳动物的剂量转化。该研究的结果将显示，APOBEC抗性病毒遍布肿瘤，保持yCD完整性，与APOBEC敏感性RRV相比，5FC联合治疗肿瘤更有效。APOBEC抗性RRV也不会水平扩散至原始笼养配偶。
如上所述，RRV包含“2A盒”。例如，SEQ ID NO：AA提供了包含2A盒的一般构建体。该盒可以用许多不同的盒替换。例如，可以制备以下盒并将其克隆到SEQ ID NO：AA载体骨架中，以替代SEQ ID NO：AA中的盒。
使用本文提供的方法和序列，设计许多如下载体：
pAC3-T2A-GFPm(SEQ ID NO：43)
pAC3-GSG-T2A-GFPm(SEQ ID NO：44)
pAC3-P2A-GFPm(SEQ ID NO：45)
pAC3-GSG-P2A-GFPm(SEQ ID NO：46)
pAC3-E2A-GFP(SEQ ID NO：47)
pAC3-GSG-E2A-GFPm(SEQ ID NO：48)
pAC3-F2A-GFPm(SEQ ID NO：49)
pAC3-GSG-F2A-GFPm(SEQ ID NO：50)
pAC3-T2A-yCD2(SEQ ID NO：51)
pAC3-GSG-T2A-yCD2(SEQ ID NO：52)
pAC3-P2A-yCD2(SEQ ID NO：53)
pAC3-GSG-P2A-yCD2(SEQ ID NO：54)
已经描述了本公开的多个实施方式。然而，应该理解，在不脱离本公开的精神和范围的情况下可以进行各种修改。因此，其它实施方式在所附权利要求的范围内。
序列表
<110> 托卡根公司
<120> 包含2A肽的重组载体
<130> 00014-024WO1
<140> 尚未指定
<141> 2016-09-01
<150> US 62/214,884
<151> 2015-09-04
<160> 125
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A肽共有序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是V或I
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是任何氨基酸
<400> 1
Asp Xaa Glu Xaa Asn Pro Gly Pro
1 5
<210> 2
<211> 11654
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有2A盒的RRV载体
<400> 2
tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 480
ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540
acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cggcgccagt cctccgattg 600
actgagtcgc ccgggtaccc gtgtatccaa taaaccctct tgcagttgca tccgacttgt 660
ggtctcgctg ttccttggga gggtctcctc tgagtgattg actacccgtc agcgggggtc 720
tttcatttgg gggctcgtcc gggatcggga gacccctgcc cagggaccac cgacccacca 780
ccgggaggta agctggccag caacttatct gtgtctgtcc gattgtctag tgtctatgac 840
tgattttatg cgcctgcgtc ggtactagtt agctaactag ctctgtatct ggcggacccg 900
tggtggaact gacgagttcg gaacacccgg ccgcaaccct gggagacgtc ccagggactt 960
cgggggccgt ttttgtggcc cgacctgagt ccaaaaatcc cgatcgtttt ggactctttg 1020
gtgcaccccc cttagaggag ggatatgtgg ttctggtagg agacgagaac ctaaaacagt 1080
tcccgcctcc gtctgaattt ttgctttcgg tttgggaccg aagccgcgcc gcgcgtcttg 1140
tctgctgcag catcgttctg tgttgtctct gtctgactgt gtttctgtat ttgtctgaga 1200
atatgggcca gactgttacc actcccttaa gtttgacctt aggtcactgg aaagatgtcg 1260
agcggatcgc tcacaaccag tcggtagatg tcaagaagag acgttgggtt accttctgct 1320
ctgcagaatg gccaaccttt aacgtcggat ggccgcgaga cggcaccttt aaccgagacc 1380
tcatcaccca ggttaagatc aaggtctttt cacctggccc gcatggacac ccagaccagg 1440
tcccctacat cgtgacctgg gaagccttgg cttttgaccc ccctccctgg gtcaagccct 1500
ttgtacaccc taagcctccg cctcctcttc ctccatccgc cccgtctctc ccccttgaac 1560
ctcctcgttc gaccccgcct cgatcctccc tttatccagc cctcactcct tctctaggcg 1620
ccaaacctaa acctcaagtt ctttctgaca gtggggggcc gctcatcgac ctacttacag 1680
aagacccccc gccttatagg gacccaagac cacccccttc cgacagggac ggaaatggtg 1740
gagaagcgac ccctgcggga gaggcaccgg acccctcccc aatggcatct cgcctacgtg 1800
ggagacggga gccccctgtg gccgactcca ctacctcgca ggcattcccc ctccgcgcag 1860
gaggaaacgg acagcttcaa tactggccgt tctcctcttc tgacctttac aactggaaaa 1920
ataataaccc ttctttttct gaagatccag gtaaactgac agctctgatc gagtctgttc 1980
tcatcaccca tcagcccacc tgggacgact gtcagcagct gttggggact ctgctgaccg 2040
gagaagaaaa acaacgggtg ctcttagagg ctagaaaggc ggtgcggggc gatgatgggc 2100
gccccactca actgcccaat gaagtcgatg ccgcttttcc cctcgagcgc ccagactggg 2160
attacaccac ccaggcaggt aggaaccacc tagtccacta tcgccagttg ctcctagcgg 2220
gtctccaaaa cgcgggcaga agccccacca atttggccaa ggtaaaagga ataacacaag 2280
ggcccaatga gtctccctcg gccttcctag agagacttaa ggaagcctat cgcaggtaca 2340
ctccttatga ccctgaggac ccagggcaag aaactaatgt gtctatgtct ttcatttggc 2400
agtctgcccc agacattggg agaaagttag agaggttaga agatttaaaa aacaagacgc 2460
ttggagattt ggttagagag gcagaaaaga tctttaataa acgagaaacc ccggaagaaa 2520
gagaggaacg tatcaggaga gaaacagagg aaaaagaaga acgccgtagg acagaggatg 2580
agcagaaaga gaaagaaaga gatcgtagga gacatagaga gatgagcaag ctattggcca 2640
ctgtcgttag tggacagaaa caggatagac agggaggaga acgaaggagg tcccaactcg 2700
atcgcgacca gtgtgcctac tgcaaagaaa aggggcactg ggctaaagat tgtcccaaga 2760
aaccacgagg acctcgggga ccaagacccc agacctccct cctgacccta gatgactagg 2820
gaggtcaggg tcaggagccc ccccctgaac ccaggataac cctcaaagtc ggggggcaac 2880
ccgtcacctt cctggtagat actggggccc aacactccgt gctgacccaa aatcctggac 2940
ccctaagtga taagtctgcc tgggtccaag gggctactgg aggaaagcgg tatcgctgga 3000
ccacggatcg caaagtacat ctagctaccg gtaaggtcac ccactctttc ctccatgtac 3060
cagactgtcc ctatcctctg ttaggaagag atttgctgac taaactaaaa gcccaaatcc 3120
actttgaggg atcaggagcc caggttatgg gaccaatggg gcagcccctg caagtgttga 3180
ccctaaatat agaagatgag catcggctac atgagacctc aaaagagcca gatgtttctc 3240
tagggtccac atggctgtct gattttcctc aggcctgggc ggaaaccggg ggcatgggac 3300
tggcagttcg ccaagctcct ctgatcatac ctctgaaagc aacctctacc cccgtgtcca 3360
taaaacaata ccccatgtca caagaagcca gactggggat caagccccac atacagagac 3420
tgttggacca gggaatactg gtaccctgcc agtccccctg gaacacgccc ctgctacccg 3480
ttaagaaacc agggactaat gattataggc ctgtccagga tctgagagaa gtcaacaagc 3540
gggtggaaga catccacccc accgtgccca acccttacaa cctcttgagc gggctcccac 3600
cgtcccacca gtggtacact gtgcttgatt taaaggatgc ctttttctgc ctgagactcc 3660
accccaccag tcagcctctc ttcgcctttg agtggagaga tccagagatg ggaatctcag 3720
gacaattgac ctggaccaga ctcccacagg gtttcaaaaa cagtcccacc ctgtttgatg 3780
aggcactgca cagagaccta gcagacttcc ggatccagca cccagacttg atcctgctac 3840
agtacgtgga tgacttactg ctggccgcca cttctgagct agactgccaa caaggtactc 3900
gggccctgtt acaaacccta gggaacctcg ggtatcgggc ctcggccaag aaagcccaaa 3960
tttgccagaa acaggtcaag tatctggggt atcttctaaa agagggtcag agatggctga 4020
ctgaggccag aaaagagact gtgatggggc agcctactcc gaagacccct cgacaactaa 4080
gggagttcct agggacggca ggcttctgtc gcctctggat ccctgggttt gcagaaatgg 4140
cagccccctt gtaccctctc accaaaacgg ggactctgtt taattggggc ccagaccaac 4200
aaaaggccta tcaagaaatc aagcaagctc ttctaactgc cccagccctg gggttgccag 4260
atttgactaa gccctttgaa ctctttgtcg acgagaagca gggctacgcc aaaggtgtcc 4320
taacgcaaaa actgggacct tggcgtcggc cggtggccta cctgtccaaa aagctagacc 4380
cagtagcagc tgggtggccc ccttgcctac ggatggtagc agccattgcc gtactgacaa 4440
aggatgcagg caagctaacc atgggacagc cactagtcat tctggccccc catgcagtag 4500
aggcactagt caaacaaccc cccgaccgct ggctttccaa cgcccggatg actcactatc 4560
aggccttgct tttggacacg gaccgggtcc agttcggacc ggtggtagcc ctgaacccgg 4620
ctacgctgct cccactgcct gaggaagggc tgcaacacaa ctgccttgat atcctggccg 4680
aagcccacgg aacccgaccc gacctaacgg accagccgct cccagacgcc gaccacacct 4740
ggtacacgga tggaagcagt ctcttacaag agggacagcg taaggcggga gctgcggtga 4800
ccaccgagac cgaggtaatc tgggctaaag ccctgccagc cgggacatcc gctcagcggg 4860
ctgaactgat agcactcacc caggccctaa agatggcaga aggtaagaag ctaaatgttt 4920
atactgatag ccgttatgct tttgctactg cccatatcca tggagaaata tacagaaggc 4980
gtgggttgct cacatcagaa ggcaaagaga tcaaaaataa agacgagatc ttggccctac 5040
taaaagccct ctttctgccc aaaagactta gcataatcca ttgtccagga catcaaaagg 5100
gacacagcgc cgaggctaga ggcaaccgga tggctgacca agcggcccga aaggcagcca 5160
tcacagagac tccagacacc tctaccctcc tcatagaaaa ttcatcaccc tacacctcag 5220
aacattttca ttacacagtg actgatataa aggacctaac caagttgggg gccatttatg 5280
ataaaacaaa gaagtattgg gtctaccaag gaaaacctgt gatgcctgac cagtttactt 5340
ttgaattatt agactttctt catcagctga ctcacctcag cttctcaaaa atgaaggctc 5400
tcctagagag aagccacagt ccctactaca tgctgaaccg ggatcgaaca ctcaaaaata 5460
tcactgagac ctgcaaagct tgtgcacaag tcaacgccag caagtctgcc gttaaacagg 5520
gaactagggt ccgcgggcat cggcccggca ctcattggga gatcgatttc accgagataa 5580
agcccggatt gtatggctat aaatatcttc tagtttttat agataccttt tctggctgga 5640
tagaagcctt cccaaccaag aaagaaaccg ccaaggtcgt aaccaagaag ctactagagg 5700
agatcttccc caggttcggc atgcctcagg tattgggaac tgacaatggg cctgccttcg 5760
tctccaaggt gagtcagaca gtggccgatc tgttggggat tgattggaaa ttacattgtg 5820
catacagacc ccaaagctca ggccaggtag aaagaatgaa tagaaccatc aaggagactt 5880
taactaaatt aacgcttgca actggctcta gagactgggt gctcctactc cccttagccc 5940
tgtaccgagc ccgcaacacg ccgggccccc atggcctcac cccatatgag atcttatatg 6000
gggcaccccc gccccttgta aacttccctg accctgacat gacaagagtt actaacagcc 6060
cctctctcca agctcactta caggctctct acttagtcca gcacgaagtc tggagacctc 6120
tggcggcagc ctaccaagaa caactggacc gaccggtggt acctcaccct taccgagtcg 6180
gcgacacagt gtgggtccgc cgacaccaga ctaagaacct agaacctcgc tggaaaggac 6240
cttacacagt cctgctgacc acccccaccg ccctcaaagt agacggcatc gcagcttgga 6300
tacacgccgc ccacgtgaag gctgccgacc ccgggggtgg accatcctct agactgacat 6360
ggcgcgttca acgctctcaa aaccccctca agataagatt aacccgtgga agcccttaat 6420
agtcatggga gtcctgttag gagtagggat ggcagagagc ccccatcagg tctttaatgt 6480
aacctggaga gtcaccaacc tgatgactgg gcgtaccgcc aatgccacct ccctcctggg 6540
aactgtacaa gatgccttcc caaaattata ttttgatcta tgtgatctgg tcggagagga 6600
gtgggaccct tcagaccagg aaccgtatgt cgggtatggc tgcaagtacc ccgcagggag 6660
acagcggacc cggacttttg acttttacgt gtgccctggg cataccgtaa agtcggggtg 6720
tgggggacca ggagagggct actgtggtaa atgggggtgt gaaaccaccg gacaggctta 6780
ctggaagccc acatcatcgt gggacctaat ctcccttaag cgcggtaaca ccccctggga 6840
cacgggatgc tctaaagttg cctgtggccc ctgctacgac ctctccaaag tatccaattc 6900
cttccaaggg gctactcgag ggggcagatg caaccctcta gtcctagaat tcactgatgc 6960
aggaaaaaag gctaactggg acgggcccaa atcgtgggga ctgagactgt accggacagg 7020
aacagatcct attaccatgt tctccctgac ccggcaggtc cttaatgtgg gaccccgagt 7080
ccccataggg cccaacccag tattacccga ccaaagactc ccttcctcac caatagagat 7140
tgtaccggct ccacagccac ctagccccct caataccagt tacccccctt ccactaccag 7200
tacaccctca acctccccta caagtccaag tgtcccacag ccacccccag gaactggaga 7260
tagactacta gctctagtca aaggagccta tcaggcgctt aacctcacca atcccgacaa 7320
gacccaagaa tgttggctgt gcttagtgtc gggacctcct tattacgaag gagtagcggt 7380
cgtgggcact tataccaatc attccaccgc tccggccaac tgtacggcca cttcccaaca 7440
taagcttacc ctatctgaag tgacaggaca gggcctatgc atgggggcag tacctaaaac 7500
tcaccaggcc ttatgtaaca ccacccaaag cgccggctca ggatcctact accttgcagc 7560
acccgccgga acaatgtggg cttgcagcac tggattgact ccctgcttgt ccaccacggt 7620
gctcaatcta accacagatt attgtgtatt agttgaactc tggcccagag taatttacca 7680
ctcccccgat tatatgtatg gtcagcttga acagcgtacc aaatataaaa gagagccagt 7740
atcattgacc ctggcccttc tactaggagg attaaccatg ggagggattg cagctggaat 7800
agggacgggg accactgcct taattaaaac ccagcagttt gagcagcttc atgccgctat 7860
ccagacagac ctcaacgaag tcgaaaagtc aattaccaac ctagaaaagt cactgacctc 7920
gttgtctgaa gtagtcctac agaaccgcag aggcctagat ttgctattcc taaaggaggg 7980
aggtctctgc gcagccctaa aagaagaatg ttgtttttat gcagaccaca cggggctagt 8040
gagagacagc atggccaaat taagagaaag gcttaatcag agacaaaaac tatttgagac 8100
aggccaagga tggttcgaag ggctgtttaa tagatccccc tggtttacca ccttaatctc 8160
caccatcatg ggacctctaa tagtactctt actgatctta ctctttggac cttgcattct 8220
caatcgattg gtccaatttg ttaaagacag gatctcagtg gtccaggctc tggttttgac 8280
tcagcaatat caccagctaa aacccataga gtacgagcca gtgaaacaga ctttgaattt 8340
tgaccttctc aagttggcgg gagacgtgga gtccaaccct ggacctggcg cgcctatggc 8400
cagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga 8460
cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgaaggagag ggcgatgcca cctacggcaa 8520
gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt 8580
gaccaccttg acctacggcg tgcagtgctt cgcccgctac cccgaccaca tgaagcagca 8640
cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa 8700
ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa 8760
ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct 8820
ggagtacaac tacaacagcc acaaggtcta tatcaccgcc gacaagcaga agaacggcat 8880
caaggtgaac ttcaagaccc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca 8940
ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct 9000
gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct 9060
ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtgtgcggc 9120
cgcagataaa ataaaagatt ttatttagtc tccagaaaaa ggggggaatg aaagacccca 9180
cctgtaggtt tggcaagcta gcttaagtaa cgccattttg caaggcatgg aaaaatacat 9240
aactgagaat agagaagttc agatcaaggt caggaacaga tggaacagct gaatatgggc 9300
caaacaggat atctgtggta agcagttcct gccccggctc agggccaaga acagatggaa 9360
cagctgaata tgggccaaac aggatatctg tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc 9420
caagaacaga tggtccccag atgcggtcca gccctcagca gtttctagag aaccatcaga 9480
tgtttccagg gtgccccaag gacctgaaat gaccctgtgc cttatttgaa ctaaccaatc 9540
agttcgcttc tcgcttctgt tcgcgcgctt ctgctccccg agctcaataa aagagcccac 9600
aacccctcac tcggggcgcc agtcctccga ttgactgagt cgcccgggta cccgtgtatc 9660
caataaaccc tcttgcagtt gcatccgact tgtggtctcg ctgttccttg ggagggtctc 9720
ctctgagtga ttgactaccc gtcagcgggg gtctttcatt acatgtgagc aaaaggccag 9780
caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc 9840
cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta 9900
taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg 9960
ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcaatgc 10020
tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 10080
gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac 10140
ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg 10200
aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga 10260
aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt 10320
agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag 10380
cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct 10440
gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg 10500
atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat 10560
gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc 10620
tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg 10680
gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct 10740
ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca 10800
actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg 10860
ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctgcag gcatcgtggt gtcacgctcg 10920
tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc 10980
cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag 11040
ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg 11100
ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag 11160
tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaacac gggataatac cgcgccacat 11220
agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg 11280
atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca 11340
gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca 11400
aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat 11460
tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag 11520
aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa 11580
gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt 11640
cttcaagaat tcat 11654
<210> 3
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GSG连接子序列
<400> 3
ggaagcgga 9
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GFP-R-Gib引物
<400> 4
taaaatcttt tattttatct gcggccgcac 30
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽通读序列
<400> 5
Cys Ala Ala Ala Asp Lys Ile Lys Asp Phe Ile
1 5 10
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ascl-yCD2正向引物
<400> 6
gatcggcgcg cctatggtga ccggcggcat ggc 33
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3-37引物
<400> 7
cccctttttc tggagactaa ataa 24
<210> 8
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A肽序列
<400> 8
gagggcagag gaagtcttct aacatgcggt gacgtggagg agaatcccgg ccct 54
<210> 9
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A肽序列
<400> 9
ggaagcggag agggcagagg aagtcttcta acatgcggtg acgtggagga gaatcccggc 60
cct 63
<210> 10
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A肽序列
<400> 10
gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacct 57
<210> 11
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A肽序列
<400> 11
ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60
ggacct 66
<210> 12
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A肽序列
<400> 12
gtgaaacaga ctttgaattt tgaccttctc aagttggcgg gagacgtgga gtccaaccct 60
ggacct 66
<210> 13
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A肽序列
<400> 13
ggaagcggag tgaaacagac tttgaatttt gaccttctca agttggcggg agacgtggag 60
tccaaccctg gacct 75
<210> 14
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A肽序列
<400> 14
cagtgtacta attatgctct cttgaaattg gctggagatg ttgagagcaa ccctggacct 60
<210> 15
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A肽序列
<400> 15
ggaagcggac agtgtactaa ttatgctctc ttgaaattgg ctggagatgt tgagagcaac 60
cctggacct 69
<210> 16
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A肽序列
<400> 16
gagggcagag gaagtcttct aacatgcggt gacgtggagg agaatcccgg ccct 54
<210> 17
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A肽序列
<400> 17
ggaagcggag agggcagagg aagtcttcta acatgcggtg acgtggagga gaatcccggc 60
cct 63
<210> 18
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A肽序列
<400> 18
gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacct 57
<210> 19
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A肽序列
<400> 19
ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60
ggacct 66
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5-MLV-U3-R引物
<400> 20
agcccacaac ccctcactc 19
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3-MLV-Psi引物序列
<400> 21
tctcccgatc ccggacga 18
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针序列
<400> 22
ccccaaatga aagacccccg ctgacg 26
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IRES正向引物
<400> 23
ctgatcttac tctttggacc ttg 23
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IRES反向引物
<400> 24
cccctttttc tggagactaa ataa 24
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ENV正向引物
<400> 25
accctcaacc tcccctacaa gt 22
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ENV反向引物
<400> 26
gttaagcgcc tgataggctc 20
<210> 27
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Env探针序列
<400> 27
ccccaaatga aagacccccg ctgacg 26
<210> 28
<211> 477
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人密码子优化的热稳定CD编码序列
<400> 28
atggtgaccg gcggcatggc ctccaagtgg gatcaaaagg gcatggatat cgcttacgag 60
gaggccctgc tgggctacaa ggagggcggc gtgcctatcg gcggctgtct gatcaacaac 120
aaggacggca gtgtgctggg caggggccac aacatgaggt tccagaaggg ctccgccacc 180
ctgcacggcg agatctccac cctggagaac tgtggcaggc tggagggcaa ggtgtacaag 240
gacaccaccc tgtacaccac cctgtcccct tgtgacatgt gtaccggcgc tatcatcatg 300
tacggcatcc ctaggtgtgt gatcggcgag aacgtgaact tcaagtccaa gggcgagaag 360
tacctgcaaa ccaggggcca cgaggtggtg gttgttgacg atgagaggtg taagaagctg 420
atgaagcagt tcatcgacga gaggcctcag gactggttcg aggatatcgg cgagtaa 477
<210> 29
<211> 158
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 热稳定的经APOBEC修饰的CD多肽
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (10)..(10)
<223> Xaa 是任何氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (152)..(152)
<223> Xaa 是任何氨基酸
<400> 29
Met Val Thr Gly Gly Met Ala Ser Lys Xaa Asp Gln Lys Gly Met Asp
1 5 10 15
Ile Ala Tyr Glu Glu Ala Leu Leu Gly Tyr Lys Glu Gly Gly Val Pro
20 25 30
Ile Gly Gly Cys Leu Ile Asn Asn Lys Asp Gly Ser Val Leu Gly Arg
35 40 45
Gly His Asn Met Arg Phe Gln Lys Gly Ser Ala Thr Leu His Gly Glu
50 55 60
Ile Ser Thr Leu Glu Asn Cys Gly Arg Leu Glu Gly Lys Val Tyr Lys
65 70 75 80
Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Thr Leu Ser Pro Cys Asp Met Cys Thr Gly
85 90 95
Ala Ile Ile Met Tyr Gly Ile Pro Arg Cys Val Ile Gly Glu Asn Val
100 105 110
Asn Phe Lys Ser Lys Gly Glu Lys Tyr Leu Gln Thr Arg Gly His Glu
115 120 125
Val Val Val Val Asp Asp Glu Arg Cys Lys Lys Leu Met Lys Gln Phe
130 135 140
Ile Asp Glu Arg Pro Gln Asp Xaa Phe Glu Asp Ile Gly Glu
145 150 155
<210> 30
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A肽编码序列
<400> 30
gagggcagag gaagtcttct aacatgcggt gacgtggagg agaatcccgg ccct 54
<210> 31
<211> 1062
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BstBI-env-T2A-GFPm of pAC3-T2A-GFPm
<400> 31
ttcgaagggc tgtttaatag atccccctgg tttaccacct taatctccac catcatggga 60
cctctaatag tactcttact gatcttactc tttggacctt gcattctcaa tcgattggtc 120
caatttgtta aagacaggat ctcagtggtc caggctctgg ttttgactca gcaatatcac 180
cagctaaaac ccatagagta cgagccagag ggcagaggaa gtcttctaac atgcggtgac 240
gtggaggaga atcccggccc tggcgcgcct atggccagca agggcgagga gctgttcacc 300
ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg 360
tccggcgaag gagagggcga tgccacctac ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc 420
accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca ccttgaccta cggcgtgcag 480
tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc 540
gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc 600
gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac 660
ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac aagctggagt acaactacaa cagccacaag 720
gtctatatca ccgccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg tgaacttcaa gacccgccac 780
aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc agcagaacac ccccatcggc 840
gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa 900
gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc 960
actctcggca tggacgagct gtacaagtgt gcggccgcag ataaaataaa agattttatt 1020
tagtctccag aaaaaggggg gaatgaaaga ccccacctgt ag 1062
<210> 32
<211> 1026
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BstBI-env-P2A-GFPm of pAC3-P2A-GFPm
<400> 32
ttcgaagggc tgtttaatag atccccctgg tttaccacct taatctccac catcatggga 60
cctctaatag tactcttact gatcttactc tttggacctt gcattctcaa tcgattggtc 120
caatttgtta aagacaggat ctcagtggtc caggctctgg ttttgactca gcaatatcac 180
cagctaaaac ccatagagta cgagccagct actaacttca gcctgctgaa gcaggctgga 240
gacgtggagg agaaccctgg acctggcgcg cctatggcca gcaagggcga ggagctgttc 300
accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc 360
gtgtccggcg aaggagaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc 420
accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccttgac ctacggcgtg 480
cagtgcttcg cccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg 540
cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc 600
cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc 660
gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac 720
aaggtctata tcaccgccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagacccgc 780
cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc 840
ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgccctgagc 900
aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg 960
atcactctcg gcatggacga gctgtacaag tgtgcggccg cagataaaat aaaagatttt 1020
atttag 1026
<210> 33
<211> 1029
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BstBI-env-E2A-GFPm of pAC3-E2A-GFPm
<400> 33
ttcgaagggc tgtttaatag atccccctgg tttaccacct taatctccac catcatggga 60
cctctaatag tactcttact gatcttactc tttggacctt gcattctcaa tcgattggtc 120
caatttgtta aagacaggat ctcagtggtc caggctctgg ttttgactca gcaatatcac 180
cagctaaaac ccatagagta cgagccacag tgtactaatt atgctctctt gaaattggct 240
ggagatgttg agagcaaccc tggacctggc gcgcctatgg ccagcaaggg cgaggagctg 300
ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc 360
agcgtgtccg gcgaaggaga gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc 420
tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg tgaccacctt gacctacggc 480
gtgcagtgct tcgcccgcta ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc 540
atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg caactacaag 600
acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga accgcatcga gctgaagggc 660
atcgacttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc 720
cacaaggtct atatcaccgc cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagacc 780
cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc 840
atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg 900
agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc 960
gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac aagtgtgcgg ccgcagataa aataaaagat 1020
tttatttag 1029
<210> 34
<211> 1035
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BstBI-env-F2A-GFPm of pAC3-F2A-GFPm
<400> 34
ttcgaagggc tgtttaatag atccccctgg tttaccacct taatctccac catcatggga 60
cctctaatag tactcttact gatcttactc tttggacctt gcattctcaa tcgattggtc 120
caatttgtta aagacaggat ctcagtggtc caggctctgg ttttgactca gcaatatcac 180
cagctaaaac ccatagagta cgagccagtg aaacagactt tgaattttga ccttctcaag 240
ttggcgggag acgtggagtc caaccctgga cctggcgcgc ctatggccag caagggcgag 300
gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac 360
aagttcagcg tgtccggcga aggagagggc gatgccacct acggcaagct gaccctgaag 420
ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccttgacc 480
tacggcgtgc agtgcttcgc ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag 540
tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac 600
tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg 660
aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaactac 720
aacagccaca aggtctatat caccgccgac aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc 780
aagacccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac 840
acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag cacccagtcc 900
gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc 960
gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt gtgcggccgc agataaaata 1020
aaagatttta tttag 1035
<210> 35
<211> 1032
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BstBI-env-GSG-T2A-GFPm of pAC3-GSG-T2A-GFPm
<400> 35
ttcgaagggc tgtttaatag atccccctgg tttaccacct taatctccac catcatggga 60
cctctaatag tactcttact gatcttactc tttggacctt gcattctcaa tcgattggtc 120
caatttgtta aagacaggat ctcagtggtc caggctctgg ttttgactca gcaatatcac 180
cagctaaaac ccatagagta cgagccagga agcggagagg gcagaggaag tcttctaaca 240
tgcggtgacg tggaggagaa tcccggccct ggcgcgccta tggccagcaa gggcgaggag 300
ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag 360
ttcagcgtgt ccggcgaagg agagggcgat gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc 420
atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac cttgacctac 480
ggcgtgcagt gcttcgcccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc 540
gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga cggcaactac 600
aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag 660
ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta caactacaac 720
agccacaagg tctatatcac cgccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag 780
acccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca gcagaacacc 840
cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc 900
ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc 960
gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagtgtg cggccgcaga taaaataaaa 1020
gattttattt ag 1032
<210> 36
<211> 1035
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BstBI-env-GSG-P2A-GFPm of pAC3-GSG-P2A-GFPm
<400> 36
ttcgaagggc tgtttaatag atccccctgg tttaccacct taatctccac catcatggga 60
cctctaatag tactcttact gatcttactc tttggacctt gcattctcaa tcgattggtc 120
caatttgtta aagacaggat ctcagtggtc caggctctgg ttttgactca gcaatatcac 180
cagctaaaac ccatagagta cgagccagga agcggagcta ctaacttcag cctgctgaag 240
caggctggag acgtggagga gaaccctgga cctggcgcgc ctatggccag caagggcgag 300
gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac 360
aagttcagcg tgtccggcga aggagagggc gatgccacct acggcaagct gaccctgaag 420
ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccttgacc 480
tacggcgtgc agtgcttcgc ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag 540
tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac 600
tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg 660
aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaactac 720
aacagccaca aggtctatat caccgccgac aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc 780
aagacccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac 840
acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag cacccagtcc 900
gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc 960
gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt gtgcggccgc agataaaata 1020
aaagatttta tttag 1035
<210> 37
<211> 1044
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BstBI-env-GSG-F2A-GFPm of pAC3-GSG-F2A-GFPm
<400> 37
ttcgaagggc tgtttaatag atccccctgg tttaccacct taatctccac catcatggga 60
cctctaatag tactcttact gatcttactc tttggacctt gcattctcaa tcgattggtc 120
caatttgtta aagacaggat ctcagtggtc caggctctgg ttttgactca gcaatatcac 180
cagctaaaac ccatagagta cgagccagga agcggagtga aacagacttt gaattttgac 240
cttctcaagt tggcgggaga cgtggagtcc aaccctggac ctggcgcgcc tatggccagc 300
aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta 360
aacggccaca agttcagcgt gtccggcgaa ggagagggcg atgccaccta cggcaagctg 420
accctgaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc 480
accttgacct acggcgtgca gtgcttcgcc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac 540
ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac 600
gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc 660
atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag 720
tacaactaca acagccacaa ggtctatatc accgccgaca agcagaagaa cggcatcaag 780
gtgaacttca agacccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac 840
cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc 900
acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag 960
ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaagtg tgcggccgca 1020
gataaaataa aagattttat ttag 1044
<210> 38
<211> 1038
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BstBI-env-GSG-E2A-GFPm of pAC3-GSG-E2A-GFPm
<400> 38
ttcgaagggc tgtttaatag atccccctgg tttaccacct taatctccac catcatggga 60
cctctaatag tactcttact gatcttactc tttggacctt gcattctcaa tcgattggtc 120
caatttgtta aagacaggat ctcagtggtc caggctctgg ttttgactca gcaatatcac 180
cagctaaaac ccatagagta cgagccagga agcggacagt gtactaatta tgctctcttg 240
aaattggctg gagatgttga gagcaaccct ggacctggcg cgcctatggc cagcaagggc 300
gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 360
cacaagttca gcgtgtccgg cgaaggagag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 420
aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccttg 480
acctacggcg tgcagtgctt cgcccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 540
aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc 600
aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 660
ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac 720
tacaacagcc acaaggtcta tatcaccgcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 780
ttcaagaccc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag 840
aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag 900
tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 960
accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtgtgcggc cgcagataaa 1020
ataaaagatt ttatttag 1038
<210> 39
<211> 548
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A-AscI-yCD2 of pAC3-T2A-yCD2
<400> 39
gagggcagag gaagtcttct aacatgcggt gacgtggagg agaatcccgg ccctggcgcg 60
cctatggtga ccggcggcat ggcctccaag tgggatcaaa agggcatgga tatcgcttac 120
gaggaggccc tgctgggcta caaggagggc ggcgtgccta tcggcggctg tctgatcaac 180
aacaaggacg gcagtgtgct gggcaggggc cacaacatga ggttccagaa gggctccgcc 240
accctgcacg gcgagatctc caccctggag aactgtggca ggctggaggg caaggtgtac 300
aaggacacca ccctgtacac caccctgtcc ccttgtgaca tgtgtaccgg cgctatcatc 360
atgtacggca tccctaggtg tgtgatcggc gagaacgtga acttcaagtc caagggcgag 420
aagtacctgc aaaccagggg ccacgaggtg gtggttgttg acgatgagag gtgtaagaag 480
ctgatgaagc agttcatcga cgagaggcct caggactggt tcgaggatat cggcgagtaa 540
gcggccgc 548
<210> 40
<211> 551
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A-AscI-yCD2 of pAC3-P2A-yCD2
<400> 40
gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacctggc 60
gcgcctatgg tgaccggcgg catggcctcc aagtgggatc aaaagggcat ggatatcgct 120
tacgaggagg ccctgctggg ctacaaggag ggcggcgtgc ctatcggcgg ctgtctgatc 180
aacaacaagg acggcagtgt gctgggcagg ggccacaaca tgaggttcca gaagggctcc 240
gccaccctgc acggcgagat ctccaccctg gagaactgtg gcaggctgga gggcaaggtg 300
tacaaggaca ccaccctgta caccaccctg tccccttgtg acatgtgtac cggcgctatc 360
atcatgtacg gcatccctag gtgtgtgatc ggcgagaacg tgaacttcaa gtccaagggc 420
gagaagtacc tgcaaaccag gggccacgag gtggtggttg ttgacgatga gaggtgtaag 480
aagctgatga agcagttcat cgacgagagg cctcaggact ggttcgagga tatcggcgag 540
taagcggccg c 551
<210> 41
<211> 557
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GSG-T2A-AscI-yCD2 of pAC3-GSG-T2A-yCD2
<400> 41
ggaagcggag agggcagagg aagtcttcta acatgcggtg acgtggagga gaatcccggc 60
cctggcgcgc ctatggtgac cggcggcatg gcctccaagt gggatcaaaa gggcatggat 120
atcgcttacg aggaggccct gctgggctac aaggagggcg gcgtgcctat cggcggctgt 180
ctgatcaaca acaaggacgg cagtgtgctg ggcaggggcc acaacatgag gttccagaag 240
ggctccgcca ccctgcacgg cgagatctcc accctggaga actgtggcag gctggagggc 300
aaggtgtaca aggacaccac cctgtacacc accctgtccc cttgtgacat gtgtaccggc 360
gctatcatca tgtacggcat ccctaggtgt gtgatcggcg agaacgtgaa cttcaagtcc 420
aagggcgaga agtacctgca aaccaggggc cacgaggtgg tggttgttga cgatgagagg 480
tgtaagaagc tgatgaagca gttcatcgac gagaggcctc aggactggtt cgaggatatc 540
ggcgagtaag cggccgc 557
<210> 42
<211> 560
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GSG-P2A-AscI-yCD2 of pAC3-GSG-P2A-yCD2
<400> 42
ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60
ggacctggcg cgcctatggt gaccggcggc atggcctcca agtgggatca aaagggcatg 120
gatatcgctt acgaggaggc cctgctgggc tacaaggagg gcggcgtgcc tatcggcggc 180
tgtctgatca acaacaagga cggcagtgtg ctgggcaggg gccacaacat gaggttccag 240
aagggctccg ccaccctgca cggcgagatc tccaccctgg agaactgtgg caggctggag 300
ggcaaggtgt acaaggacac caccctgtac accaccctgt ccccttgtga catgtgtacc 360
ggcgctatca tcatgtacgg catccctagg tgtgtgatcg gcgagaacgt gaacttcaag 420
tccaagggcg agaagtacct gcaaaccagg ggccacgagg tggtggttgt tgacgatgag 480
aggtgtaaga agctgatgaa gcagttcatc gacgagaggc ctcaggactg gttcgaggat 540
atcggcgagt aagcggccgc 560
<210> 43
<211> 11642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pAC3-T2A-GFPm
<400> 43
tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 480
ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540
acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cggcgccagt cctccgattg 600
actgagtcgc ccgggtaccc gtgtatccaa taaaccctct tgcagttgca tccgacttgt 660
ggtctcgctg ttccttggga gggtctcctc tgagtgattg actacccgtc agcgggggtc 720
tttcatttgg gggctcgtcc gggatcggga gacccctgcc cagggaccac cgacccacca 780
ccgggaggta agctggccag caacttatct gtgtctgtcc gattgtctag tgtctatgac 840
tgattttatg cgcctgcgtc ggtactagtt agctaactag ctctgtatct ggcggacccg 900
tggtggaact gacgagttcg gaacacccgg ccgcaaccct gggagacgtc ccagggactt 960
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gtgcaccccc cttagaggag ggatatgtgg ttctggtagg agacgagaac ctaaaacagt 1080
tcccgcctcc gtctgaattt ttgctttcgg tttgggaccg aagccgcgcc gcgcgtcttg 1140
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attacaccac ccaggcaggt aggaaccacc tagtccacta tcgccagttg ctcctagcgg 2220
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ggcccaatga gtctccctcg gccttcctag agagacttaa ggaagcctat cgcaggtaca 2340
ctccttatga ccctgaggac ccagggcaag aaactaatgt gtctatgtct ttcatttggc 2400
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tagggtccac atggctgtct gattttcctc aggcctgggc ggaaaccggg ggcatgggac 3300
tggcagttcg ccaagctcct ctgatcatac ctctgaaagc aacctctacc cccgtgtcca 3360
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aaaaggccta tcaagaaatc aagcaagctc ttctaactgc cccagccctg gggttgccag 4260
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at 11642
<210> 44
<211> 11651
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pAC3-GSG-T2A-GFPm
<400> 44
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ttgtacaccc taagcctccg cctcctcttc ctccatccgc cccgtctctc ccccttgaac 1560
ctcctcgttc gaccccgcct cgatcctccc tttatccagc cctcactcct tctctaggcg 1620
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gaggtcaggg tcaggagccc ccccctgaac ccaggataac cctcaaagtc ggggggcaac 2880
ccgtcacctt cctggtagat actggggccc aacactccgt gctgacccaa aatcctggac 2940
ccctaagtga taagtctgcc tgggtccaag gggctactgg aggaaagcgg tatcgctgga 3000
ccacggatcg caaagtacat ctagctaccg gtaaggtcac ccactctttc ctccatgtac 3060
cagactgtcc ctatcctctg ttaggaagag atttgctgac taaactaaaa gcccaaatcc 3120
actttgaggg atcaggagcc caggttatgg gaccaatggg gcagcccctg caagtgttga 3180
ccctaaatat agaagatgag catcggctac atgagacctc aaaagagcca gatgtttctc 3240
tagggtccac atggctgtct gattttcctc aggcctgggc ggaaaccggg ggcatgggac 3300
tggcagttcg ccaagctcct ctgatcatac ctctgaaagc aacctctacc cccgtgtcca 3360
taaaacaata ccccatgtca caagaagcca gactggggat caagccccac atacagagac 3420
tgttggacca gggaatactg gtaccctgcc agtccccctg gaacacgccc ctgctacccg 3480
ttaagaaacc agggactaat gattataggc ctgtccagga tctgagagaa gtcaacaagc 3540
gggtggaaga catccacccc accgtgccca acccttacaa cctcttgagc gggctcccac 3600
cgtcccacca gtggtacact gtgcttgatt taaaggatgc ctttttctgc ctgagactcc 3660
accccaccag tcagcctctc ttcgcctttg agtggagaga tccagagatg ggaatctcag 3720
gacaattgac ctggaccaga ctcccacagg gtttcaaaaa cagtcccacc ctgtttgatg 3780
aggcactgca cagagaccta gcagacttcc ggatccagca cccagacttg atcctgctac 3840
agtacgtgga tgacttactg ctggccgcca cttctgagct agactgccaa caaggtactc 3900
gggccctgtt acaaacccta gggaacctcg ggtatcgggc ctcggccaag aaagcccaaa 3960
tttgccagaa acaggtcaag tatctggggt atcttctaaa agagggtcag agatggctga 4020
ctgaggccag aaaagagact gtgatggggc agcctactcc gaagacccct cgacaactaa 4080
gggagttcct agggacggca ggcttctgtc gcctctggat ccctgggttt gcagaaatgg 4140
cagccccctt gtaccctctc accaaaacgg ggactctgtt taattggggc ccagaccaac 4200
aaaaggccta tcaagaaatc aagcaagctc ttctaactgc cccagccctg gggttgccag 4260
atttgactaa gccctttgaa ctctttgtcg acgagaagca gggctacgcc aaaggtgtcc 4320
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aggatgcagg caagctaacc atgggacagc cactagtcat tctggccccc catgcagtag 4500
aggcactagt caaacaaccc cccgaccgct ggctttccaa cgcccggatg actcactatc 4560
aggccttgct tttggacacg gaccgggtcc agttcggacc ggtggtagcc ctgaacccgg 4620
ctacgctgct cccactgcct gaggaagggc tgcaacacaa ctgccttgat atcctggccg 4680
aagcccacgg aacccgaccc gacctaacgg accagccgct cccagacgcc gaccacacct 4740
ggtacacgga tggaagcagt ctcttacaag agggacagcg taaggcggga gctgcggtga 4800
ccaccgagac cgaggtaatc tgggctaaag ccctgccagc cgggacatcc gctcagcggg 4860
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atactgatag ccgttatgct tttgctactg cccatatcca tggagaaata tacagaaggc 4980
gtgggttgct cacatcagaa ggcaaagaga tcaaaaataa agacgagatc ttggccctac 5040
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ataaaacaaa gaagtattgg gtctaccaag gaaaacctgt gatgcctgac cagtttactt 5340
ttgaattatt agactttctt catcagctga ctcacctcag cttctcaaaa atgaaggctc 5400
tcctagagag aagccacagt ccctactaca tgctgaaccg ggatcgaaca ctcaaaaata 5460
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agcccggatt gtatggctat aaatatcttc tagtttttat agataccttt tctggctgga 5640
tagaagcctt cccaaccaag aaagaaaccg ccaaggtcgt aaccaagaag ctactagagg 5700
agatcttccc caggttcggc atgcctcagg tattgggaac tgacaatggg cctgccttcg 5760
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taactaaatt aacgcttgca actggctcta gagactgggt gctcctactc cccttagccc 5940
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gggcaccccc gccccttgta aacttccctg accctgacat gacaagagtt actaacagcc 6060
cctctctcca agctcactta caggctctct acttagtcca gcacgaagtc tggagacctc 6120
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gtgggaccct tcagaccagg aaccgtatgt cgggtatggc tgcaagtacc ccgcagggag 6660
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ctggaagccc acatcatcgt gggacctaat ctcccttaag cgcggtaaca ccccctggga 6840
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cttccaaggg gctactcgag ggggcagatg caaccctcta gtcctagaat tcactgatgc 6960
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ccccataggg cccaacccag tattacccga ccaaagactc ccttcctcac caatagagat 7140
tgtaccggct ccacagccac ctagccccct caataccagt tacccccctt ccactaccag 7200
tacaccctca acctccccta caagtccaag tgtcccacag ccacccccag gaactggaga 7260
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cgtgggcact tataccaatc attccaccgc tccggccaac tgtacggcca cttcccaaca 7440
taagcttacc ctatctgaag tgacaggaca gggcctatgc atgggggcag tacctaaaac 7500
tcaccaggcc ttatgtaaca ccacccaaag cgccggctca ggatcctact accttgcagc 7560
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gctcaatcta accacagatt attgtgtatt agttgaactc tggcccagag taatttacca 7680
ctcccccgat tatatgtatg gtcagcttga acagcgtacc aaatataaaa gagagccagt 7740
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agggacgggg accactgcct taattaaaac ccagcagttt gagcagcttc atgccgctat 7860
ccagacagac ctcaacgaag tcgaaaagtc aattaccaac ctagaaaagt cactgacctc 7920
gttgtctgaa gtagtcctac agaaccgcag aggcctagat ttgctattcc taaaggaggg 7980
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caccatcatg ggacctctaa tagtactctt actgatctta ctctttggac cttgcattct 8220
caatcgattg gtccaatttg ttaaagacag gatctcagtg gtccaggctc tggttttgac 8280
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caccttgacc tacggcgtgc agtgcttcgc ccgctacccc gaccacatga agcagcacga 8640
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cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg 8760
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agataaaata aaagatttta tttagtctcc agaaaaaggg gggaatgaaa gaccccacct 9180
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tgagaataga gaagttcaga tcaaggtcag gaacagatgg aacagctgaa tatgggccaa 9300
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ctgaatatgg gccaaacagg atatctgtgg taagcagttc ctgccccggc tcagggccaa 9420
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ccctcactcg gggcgccagt cctccgattg actgagtcgc ccgggtaccc gtgtatccaa 9660
taaaccctct tgcagttgca tccgacttgt ggtctcgctg ttccttggga gggtctcctc 9720
tgagtgattg actacccgtc agcgggggtc tttcattaca tgtgagcaaa aggccagcaa 9780
aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct 9840
gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa 9900
agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg 9960
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cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa 10080
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gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg 10200
tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg 10260
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taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt 10620
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ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca 10740
gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact 10800
ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca 10860
gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctgcaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg 10920
tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc 10980
atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg 11040
gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca 11100
tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt 11160
atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaacacggg ataataccgc gccacatagc 11220
agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc 11280
ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca 11340
tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa 11400
aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat 11460
tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa 11520
aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa 11580
accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtctt 11640
caagaattca t 11651
<210> 45
<211> 11645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pAC3-P2A-GFPm
<400> 45
tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 480
ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540
acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cggcgccagt cctccgattg 600
actgagtcgc ccgggtaccc gtgtatccaa taaaccctct tgcagttgca tccgacttgt 660
ggtctcgctg ttccttggga gggtctcctc tgagtgattg actacccgtc agcgggggtc 720
tttcatttgg gggctcgtcc gggatcggga gacccctgcc cagggaccac cgacccacca 780
ccgggaggta agctggccag caacttatct gtgtctgtcc gattgtctag tgtctatgac 840
tgattttatg cgcctgcgtc ggtactagtt agctaactag ctctgtatct ggcggacccg 900
tggtggaact gacgagttcg gaacacccgg ccgcaaccct gggagacgtc ccagggactt 960
cgggggccgt ttttgtggcc cgacctgagt ccaaaaatcc cgatcgtttt ggactctttg 1020
gtgcaccccc cttagaggag ggatatgtgg ttctggtagg agacgagaac ctaaaacagt 1080
tcccgcctcc gtctgaattt ttgctttcgg tttgggaccg aagccgcgcc gcgcgtcttg 1140
tctgctgcag catcgttctg tgttgtctct gtctgactgt gtttctgtat ttgtctgaga 1200
atatgggcca gactgttacc actcccttaa gtttgacctt aggtcactgg aaagatgtcg 1260
agcggatcgc tcacaaccag tcggtagatg tcaagaagag acgttgggtt accttctgct 1320
ctgcagaatg gccaaccttt aacgtcggat ggccgcgaga cggcaccttt aaccgagacc 1380
tcatcaccca ggttaagatc aaggtctttt cacctggccc gcatggacac ccagaccagg 1440
tcccctacat cgtgacctgg gaagccttgg cttttgaccc ccctccctgg gtcaagccct 1500
ttgtacaccc taagcctccg cctcctcttc ctccatccgc cccgtctctc ccccttgaac 1560
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ccaaacctaa acctcaagtt ctttctgaca gtggggggcc gctcatcgac ctacttacag 1680
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gagaagcgac ccctgcggga gaggcaccgg acccctcccc aatggcatct cgcctacgtg 1800
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ataataaccc ttctttttct gaagatccag gtaaactgac agctctgatc gagtctgttc 1980
tcatcaccca tcagcccacc tgggacgact gtcagcagct gttggggact ctgctgaccg 2040
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attacaccac ccaggcaggt aggaaccacc tagtccacta tcgccagttg ctcctagcgg 2220
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ggcccaatga gtctccctcg gccttcctag agagacttaa ggaagcctat cgcaggtaca 2340
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ccctaaatat agaagatgag catcggctac atgagacctc aaaagagcca gatgtttctc 3240
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tggcagttcg ccaagctcct ctgatcatac ctctgaaagc aacctctacc cccgtgtcca 3360
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accccaccag tcagcctctc ttcgcctttg agtggagaga tccagagatg ggaatctcag 3720
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aaaaggccta tcaagaaatc aagcaagctc ttctaactgc cccagccctg gggttgccag 4260
atttgactaa gccctttgaa ctctttgtcg acgagaagca gggctacgcc aaaggtgtcc 4320
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tcacagagac tccagacacc tctaccctcc tcatagaaaa ttcatcaccc tacacctcag 5220
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ataaaacaaa gaagtattgg gtctaccaag gaaaacctgt gatgcctgac cagtttactt 5340
ttgaattatt agactttctt catcagctga ctcacctcag cttctcaaaa atgaaggctc 5400
tcctagagag aagccacagt ccctactaca tgctgaaccg ggatcgaaca ctcaaaaata 5460
tcactgagac ctgcaaagct tgtgcacaag tcaacgccag caagtctgcc gttaaacagg 5520
gaactagggt ccgcgggcat cggcccggca ctcattggga gatcgatttc accgagataa 5580
agcccggatt gtatggctat aaatatcttc tagtttttat agataccttt tctggctgga 5640
tagaagcctt cccaaccaag aaagaaaccg ccaaggtcgt aaccaagaag ctactagagg 5700
agatcttccc caggttcggc atgcctcagg tattgggaac tgacaatggg cctgccttcg 5760
tctccaaggt gagtcagaca gtggccgatc tgttggggat tgattggaaa ttacattgtg 5820
catacagacc ccaaagctca ggccaggtag aaagaatgaa tagaaccatc aaggagactt 5880
taactaaatt aacgcttgca actggctcta gagactgggt gctcctactc cccttagccc 5940
tgtaccgagc ccgcaacacg ccgggccccc atggcctcac cccatatgag atcttatatg 6000
gggcaccccc gccccttgta aacttccctg accctgacat gacaagagtt actaacagcc 6060
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agtcatggga gtcctgttag gagtagggat ggcagagagc ccccatcagg tctttaatgt 6480
aacctggaga gtcaccaacc tgatgactgg gcgtaccgcc aatgccacct ccctcctggg 6540
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ctggaagccc acatcatcgt gggacctaat ctcccttaag cgcggtaaca ccccctggga 6840
cacgggatgc tctaaagttg cctgtggccc ctgctacgac ctctccaaag tatccaattc 6900
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aggaaaaaag gctaactggg acgggcccaa atcgtgggga ctgagactgt accggacagg 7020
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tgtaccggct ccacagccac ctagccccct caataccagt tacccccctt ccactaccag 7200
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tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact 10560
tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt 10620
cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta 10680
ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta 10740
tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc 10800
gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat 10860
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tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca 11040
gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta 11100
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ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg 11280
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ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc 11460
atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa 11520
caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt 11580
attatcatga cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tcttcaagaa 11640
ttcat 11645
<210> 46
<211> 11654
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pAC3-GSG-P2A-GFPm
<400> 46
tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 480
ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540
acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cggcgccagt cctccgattg 600
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ggtctcgctg ttccttggga gggtctcctc tgagtgattg actacccgtc agcgggggtc 720
tttcatttgg gggctcgtcc gggatcggga gacccctgcc cagggaccac cgacccacca 780
ccgggaggta agctggccag caacttatct gtgtctgtcc gattgtctag tgtctatgac 840
tgattttatg cgcctgcgtc ggtactagtt agctaactag ctctgtatct ggcggacccg 900
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cgggggccgt ttttgtggcc cgacctgagt ccaaaaatcc cgatcgtttt ggactctttg 1020
gtgcaccccc cttagaggag ggatatgtgg ttctggtagg agacgagaac ctaaaacagt 1080
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gagaggaacg tatcaggaga gaaacagagg aaaaagaaga acgccgtagg acagaggatg 2580
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atcgcgacca gtgtgcctac tgcaaagaaa aggggcactg ggctaaagat tgtcccaaga 2760
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ccctaagtga taagtctgcc tgggtccaag gggctactgg aggaaagcgg tatcgctgga 3000
ccacggatcg caaagtacat ctagctaccg gtaaggtcac ccactctttc ctccatgtac 3060
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ccctaaatat agaagatgag catcggctac atgagacctc aaaagagcca gatgtttctc 3240
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agggacgggg accactgcct taattaaaac ccagcagttt gagcagcttc atgccgctat 7860
ccagacagac ctcaacgaag tcgaaaagtc aattaccaac ctagaaaagt cactgacctc 7920
gttgtctgaa gtagtcctac agaaccgcag aggcctagat ttgctattcc taaaggaggg 7980
aggtctctgc gcagccctaa aagaagaatg ttgtttttat gcagaccaca cggggctagt 8040
gagagacagc atggccaaat taagagaaag gcttaatcag agacaaaaac tatttgagac 8100
aggccaagga tggttcgaag ggctgtttaa tagatccccc tggtttacca ccttaatctc 8160
caccatcatg ggacctctaa tagtactctt actgatctta ctctttggac cttgcattct 8220
caatcgattg gtccaatttg ttaaagacag gatctcagtg gtccaggctc tggttttgac 8280
tcagcaatat caccagctaa aacccataga gtacgagcca ggaagcggag ctactaactt 8340
cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct ggacctggcg cgcctatggc 8400
cagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga 8460
cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgaaggagag ggcgatgcca cctacggcaa 8520
gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt 8580
gaccaccttg acctacggcg tgcagtgctt cgcccgctac cccgaccaca tgaagcagca 8640
cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa 8700
ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa 8760
ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct 8820
ggagtacaac tacaacagcc acaaggtcta tatcaccgcc gacaagcaga agaacggcat 8880
caaggtgaac ttcaagaccc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca 8940
ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct 9000
gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct 9060
ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtgtgcggc 9120
cgcagataaa ataaaagatt ttatttagtc tccagaaaaa ggggggaatg aaagacccca 9180
cctgtaggtt tggcaagcta gcttaagtaa cgccattttg caaggcatgg aaaaatacat 9240
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caaacaggat atctgtggta agcagttcct gccccggctc agggccaaga acagatggaa 9360
cagctgaata tgggccaaac aggatatctg tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc 9420
caagaacaga tggtccccag atgcggtcca gccctcagca gtttctagag aaccatcaga 9480
tgtttccagg gtgccccaag gacctgaaat gaccctgtgc cttatttgaa ctaaccaatc 9540
agttcgcttc tcgcttctgt tcgcgcgctt ctgctccccg agctcaataa aagagcccac 9600
aacccctcac tcggggcgcc agtcctccga ttgactgagt cgcccgggta cccgtgtatc 9660
caataaaccc tcttgcagtt gcatccgact tgtggtctcg ctgttccttg ggagggtctc 9720
ctctgagtga ttgactaccc gtcagcgggg gtctttcatt acatgtgagc aaaaggccag 9780
caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc 9840
cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta 9900
taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg 9960
ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcaatgc 10020
tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 10080
gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac 10140
ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg 10200
aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga 10260
aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt 10320
agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag 10380
cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct 10440
gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg 10500
atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat 10560
gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc 10620
tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg 10680
gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct 10740
ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca 10800
actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg 10860
ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctgcag gcatcgtggt gtcacgctcg 10920
tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc 10980
cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag 11040
ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg 11100
ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag 11160
tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaacac gggataatac cgcgccacat 11220
agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg 11280
atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca 11340
gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca 11400
aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat 11460
tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag 11520
aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa 11580
gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt 11640
cttcaagaat tcat 11654
<210> 47
<211> 11648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pAC3-E2A-GFP
<400> 47
tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 480
ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540
acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cggcgccagt cctccgattg 600
actgagtcgc ccgggtaccc gtgtatccaa taaaccctct tgcagttgca tccgacttgt 660
ggtctcgctg ttccttggga gggtctcctc tgagtgattg actacccgtc agcgggggtc 720
tttcatttgg gggctcgtcc gggatcggga gacccctgcc cagggaccac cgacccacca 780
ccgggaggta agctggccag caacttatct gtgtctgtcc gattgtctag tgtctatgac 840
tgattttatg cgcctgcgtc ggtactagtt agctaactag ctctgtatct ggcggacccg 900
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cgggggccgt ttttgtggcc cgacctgagt ccaaaaatcc cgatcgtttt ggactctttg 1020
gtgcaccccc cttagaggag ggatatgtgg ttctggtagg agacgagaac ctaaaacagt 1080
tcccgcctcc gtctgaattt ttgctttcgg tttgggaccg aagccgcgcc gcgcgtcttg 1140
tctgctgcag catcgttctg tgttgtctct gtctgactgt gtttctgtat ttgtctgaga 1200
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agcggatcgc tcacaaccag tcggtagatg tcaagaagag acgttgggtt accttctgct 1320
ctgcagaatg gccaaccttt aacgtcggat ggccgcgaga cggcaccttt aaccgagacc 1380
tcatcaccca ggttaagatc aaggtctttt cacctggccc gcatggacac ccagaccagg 1440
tcccctacat cgtgacctgg gaagccttgg cttttgaccc ccctccctgg gtcaagccct 1500
ttgtacaccc taagcctccg cctcctcttc ctccatccgc cccgtctctc ccccttgaac 1560
ctcctcgttc gaccccgcct cgatcctccc tttatccagc cctcactcct tctctaggcg 1620
ccaaacctaa acctcaagtt ctttctgaca gtggggggcc gctcatcgac ctacttacag 1680
aagacccccc gccttatagg gacccaagac cacccccttc cgacagggac ggaaatggtg 1740
gagaagcgac ccctgcggga gaggcaccgg acccctcccc aatggcatct cgcctacgtg 1800
ggagacggga gccccctgtg gccgactcca ctacctcgca ggcattcccc ctccgcgcag 1860
gaggaaacgg acagcttcaa tactggccgt tctcctcttc tgacctttac aactggaaaa 1920
ataataaccc ttctttttct gaagatccag gtaaactgac agctctgatc gagtctgttc 1980
tcatcaccca tcagcccacc tgggacgact gtcagcagct gttggggact ctgctgaccg 2040
gagaagaaaa acaacgggtg ctcttagagg ctagaaaggc ggtgcggggc gatgatgggc 2100
gccccactca actgcccaat gaagtcgatg ccgcttttcc cctcgagcgc ccagactggg 2160
attacaccac ccaggcaggt aggaaccacc tagtccacta tcgccagttg ctcctagcgg 2220
gtctccaaaa cgcgggcaga agccccacca atttggccaa ggtaaaagga ataacacaag 2280
ggcccaatga gtctccctcg gccttcctag agagacttaa ggaagcctat cgcaggtaca 2340
ctccttatga ccctgaggac ccagggcaag aaactaatgt gtctatgtct ttcatttggc 2400
agtctgcccc agacattggg agaaagttag agaggttaga agatttaaaa aacaagacgc 2460
ttggagattt ggttagagag gcagaaaaga tctttaataa acgagaaacc ccggaagaaa 2520
gagaggaacg tatcaggaga gaaacagagg aaaaagaaga acgccgtagg acagaggatg 2580
agcagaaaga gaaagaaaga gatcgtagga gacatagaga gatgagcaag ctattggcca 2640
ctgtcgttag tggacagaaa caggatagac agggaggaga acgaaggagg tcccaactcg 2700
atcgcgacca gtgtgcctac tgcaaagaaa aggggcactg ggctaaagat tgtcccaaga 2760
aaccacgagg acctcgggga ccaagacccc agacctccct cctgacccta gatgactagg 2820
gaggtcaggg tcaggagccc ccccctgaac ccaggataac cctcaaagtc ggggggcaac 2880
ccgtcacctt cctggtagat actggggccc aacactccgt gctgacccaa aatcctggac 2940
ccctaagtga taagtctgcc tgggtccaag gggctactgg aggaaagcgg tatcgctgga 3000
ccacggatcg caaagtacat ctagctaccg gtaaggtcac ccactctttc ctccatgtac 3060
cagactgtcc ctatcctctg ttaggaagag atttgctgac taaactaaaa gcccaaatcc 3120
actttgaggg atcaggagcc caggttatgg gaccaatggg gcagcccctg caagtgttga 3180
ccctaaatat agaagatgag catcggctac atgagacctc aaaagagcca gatgtttctc 3240
tagggtccac atggctgtct gattttcctc aggcctgggc ggaaaccggg ggcatgggac 3300
tggcagttcg ccaagctcct ctgatcatac ctctgaaagc aacctctacc cccgtgtcca 3360
taaaacaata ccccatgtca caagaagcca gactggggat caagccccac atacagagac 3420
tgttggacca gggaatactg gtaccctgcc agtccccctg gaacacgccc ctgctacccg 3480
ttaagaaacc agggactaat gattataggc ctgtccagga tctgagagaa gtcaacaagc 3540
gggtggaaga catccacccc accgtgccca acccttacaa cctcttgagc gggctcccac 3600
cgtcccacca gtggtacact gtgcttgatt taaaggatgc ctttttctgc ctgagactcc 3660
accccaccag tcagcctctc ttcgcctttg agtggagaga tccagagatg ggaatctcag 3720
gacaattgac ctggaccaga ctcccacagg gtttcaaaaa cagtcccacc ctgtttgatg 3780
aggcactgca cagagaccta gcagacttcc ggatccagca cccagacttg atcctgctac 3840
agtacgtgga tgacttactg ctggccgcca cttctgagct agactgccaa caaggtactc 3900
gggccctgtt acaaacccta gggaacctcg ggtatcgggc ctcggccaag aaagcccaaa 3960
tttgccagaa acaggtcaag tatctggggt atcttctaaa agagggtcag agatggctga 4020
ctgaggccag aaaagagact gtgatggggc agcctactcc gaagacccct cgacaactaa 4080
gggagttcct agggacggca ggcttctgtc gcctctggat ccctgggttt gcagaaatgg 4140
cagccccctt gtaccctctc accaaaacgg ggactctgtt taattggggc ccagaccaac 4200
aaaaggccta tcaagaaatc aagcaagctc ttctaactgc cccagccctg gggttgccag 4260
atttgactaa gccctttgaa ctctttgtcg acgagaagca gggctacgcc aaaggtgtcc 4320
taacgcaaaa actgggacct tggcgtcggc cggtggccta cctgtccaaa aagctagacc 4380
cagtagcagc tgggtggccc ccttgcctac ggatggtagc agccattgcc gtactgacaa 4440
aggatgcagg caagctaacc atgggacagc cactagtcat tctggccccc catgcagtag 4500
aggcactagt caaacaaccc cccgaccgct ggctttccaa cgcccggatg actcactatc 4560
aggccttgct tttggacacg gaccgggtcc agttcggacc ggtggtagcc ctgaacccgg 4620
ctacgctgct cccactgcct gaggaagggc tgcaacacaa ctgccttgat atcctggccg 4680
aagcccacgg aacccgaccc gacctaacgg accagccgct cccagacgcc gaccacacct 4740
ggtacacgga tggaagcagt ctcttacaag agggacagcg taaggcggga gctgcggtga 4800
ccaccgagac cgaggtaatc tgggctaaag ccctgccagc cgggacatcc gctcagcggg 4860
ctgaactgat agcactcacc caggccctaa agatggcaga aggtaagaag ctaaatgttt 4920
atactgatag ccgttatgct tttgctactg cccatatcca tggagaaata tacagaaggc 4980
gtgggttgct cacatcagaa ggcaaagaga tcaaaaataa agacgagatc ttggccctac 5040
taaaagccct ctttctgccc aaaagactta gcataatcca ttgtccagga catcaaaagg 5100
gacacagcgc cgaggctaga ggcaaccgga tggctgacca agcggcccga aaggcagcca 5160
tcacagagac tccagacacc tctaccctcc tcatagaaaa ttcatcaccc tacacctcag 5220
aacattttca ttacacagtg actgatataa aggacctaac caagttgggg gccatttatg 5280
ataaaacaaa gaagtattgg gtctaccaag gaaaacctgt gatgcctgac cagtttactt 5340
ttgaattatt agactttctt catcagctga ctcacctcag cttctcaaaa atgaaggctc 5400
tcctagagag aagccacagt ccctactaca tgctgaaccg ggatcgaaca ctcaaaaata 5460
tcactgagac ctgcaaagct tgtgcacaag tcaacgccag caagtctgcc gttaaacagg 5520
gaactagggt ccgcgggcat cggcccggca ctcattggga gatcgatttc accgagataa 5580
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tctccaaggt gagtcagaca gtggccgatc tgttggggat tgattggaaa ttacattgtg 5820
catacagacc ccaaagctca ggccaggtag aaagaatgaa tagaaccatc aaggagactt 5880
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tgtaccgagc ccgcaacacg ccgggccccc atggcctcac cccatatgag atcttatatg 6000
gggcaccccc gccccttgta aacttccctg accctgacat gacaagagtt actaacagcc 6060
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tacacgccgc ccacgtgaag gctgccgacc ccgggggtgg accatcctct agactgacat 6360
ggcgcgttca acgctctcaa aaccccctca agataagatt aacccgtgga agcccttaat 6420
agtcatggga gtcctgttag gagtagggat ggcagagagc ccccatcagg tctttaatgt 6480
aacctggaga gtcaccaacc tgatgactgg gcgtaccgcc aatgccacct ccctcctggg 6540
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gtgggaccct tcagaccagg aaccgtatgt cgggtatggc tgcaagtacc ccgcagggag 6660
acagcggacc cggacttttg acttttacgt gtgccctggg cataccgtaa agtcggggtg 6720
tgggggacca ggagagggct actgtggtaa atgggggtgt gaaaccaccg gacaggctta 6780
ctggaagccc acatcatcgt gggacctaat ctcccttaag cgcggtaaca ccccctggga 6840
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cttccaaggg gctactcgag ggggcagatg caaccctcta gtcctagaat tcactgatgc 6960
aggaaaaaag gctaactggg acgggcccaa atcgtgggga ctgagactgt accggacagg 7020
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tacaccctca acctccccta caagtccaag tgtcccacag ccacccccag gaactggaga 7260
tagactacta gctctagtca aaggagccta tcaggcgctt aacctcacca atcccgacaa 7320
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ctcccccgat tatatgtatg gtcagcttga acagcgtacc aaatataaaa gagagccagt 7740
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caccatcatg ggacctctaa tagtactctt actgatctta ctctttggac cttgcattct 8220
caatcgattg gtccaatttg ttaaagacag gatctcagtg gtccaggctc tggttttgac 8280
tcagcaatat caccagctaa aacccataga gtacgagcca cagtgtacta attatgctct 8340
cttgaaattg gctggagatg ttgagagcaa ccctggacct ggcgcgccta tggccagcaa 8400
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cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaagg agagggcgat gccacctacg gcaagctgac 8520
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cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga 8700
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tggtggaact gacgagttcg gaacacccgg ccgcaaccct gggagacgtc ccagggactt 960
cgggggccgt ttttgtggcc cgacctgagt ccaaaaatcc cgatcgtttt ggactctttg 1020
gtgcaccccc cttagaggag ggatatgtgg ttctggtagg agacgagaac ctaaaacagt 1080
tcccgcctcc gtctgaattt ttgctttcgg tttgggaccg aagccgcgcc gcgcgtcttg 1140
tctgctgcag catcgttctg tgttgtctct gtctgactgt gtttctgtat ttgtctgaga 1200
atatgggcca gactgttacc actcccttaa gtttgacctt aggtcactgg aaagatgtcg 1260
agcggatcgc tcacaaccag tcggtagatg tcaagaagag acgttgggtt accttctgct 1320
ctgcagaatg gccaaccttt aacgtcggat ggccgcgaga cggcaccttt aaccgagacc 1380
tcatcaccca ggttaagatc aaggtctttt cacctggccc gcatggacac ccagaccagg 1440
tcccctacat cgtgacctgg gaagccttgg cttttgaccc ccctccctgg gtcaagccct 1500
ttgtacaccc taagcctccg cctcctcttc ctccatccgc cccgtctctc ccccttgaac 1560
ctcctcgttc gaccccgcct cgatcctccc tttatccagc cctcactcct tctctaggcg 1620
ccaaacctaa acctcaagtt ctttctgaca gtggggggcc gctcatcgac ctacttacag 1680
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gagaagcgac ccctgcggga gaggcaccgg acccctcccc aatggcatct cgcctacgtg 1800
ggagacggga gccccctgtg gccgactcca ctacctcgca ggcattcccc ctccgcgcag 1860
gaggaaacgg acagcttcaa tactggccgt tctcctcttc tgacctttac aactggaaaa 1920
ataataaccc ttctttttct gaagatccag gtaaactgac agctctgatc gagtctgttc 1980
tcatcaccca tcagcccacc tgggacgact gtcagcagct gttggggact ctgctgaccg 2040
gagaagaaaa acaacgggtg ctcttagagg ctagaaaggc ggtgcggggc gatgatgggc 2100
gccccactca actgcccaat gaagtcgatg ccgcttttcc cctcgagcgc ccagactggg 2160
attacaccac ccaggcaggt aggaaccacc tagtccacta tcgccagttg ctcctagcgg 2220
gtctccaaaa cgcgggcaga agccccacca atttggccaa ggtaaaagga ataacacaag 2280
ggcccaatga gtctccctcg gccttcctag agagacttaa ggaagcctat cgcaggtaca 2340
ctccttatga ccctgaggac ccagggcaag aaactaatgt gtctatgtct ttcatttggc 2400
agtctgcccc agacattggg agaaagttag agaggttaga agatttaaaa aacaagacgc 2460
ttggagattt ggttagagag gcagaaaaga tctttaataa acgagaaacc ccggaagaaa 2520
gagaggaacg tatcaggaga gaaacagagg aaaaagaaga acgccgtagg acagaggatg 2580
agcagaaaga gaaagaaaga gatcgtagga gacatagaga gatgagcaag ctattggcca 2640
ctgtcgttag tggacagaaa caggatagac agggaggaga acgaaggagg tcccaactcg 2700
atcgcgacca gtgtgcctac tgcaaagaaa aggggcactg ggctaaagat tgtcccaaga 2760
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gaggtcaggg tcaggagccc ccccctgaac ccaggataac cctcaaagtc ggggggcaac 2880
ccgtcacctt cctggtagat actggggccc aacactccgt gctgacccaa aatcctggac 2940
ccctaagtga taagtctgcc tgggtccaag gggctactgg aggaaagcgg tatcgctgga 3000
ccacggatcg caaagtacat ctagctaccg gtaaggtcac ccactctttc ctccatgtac 3060
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actttgaggg atcaggagcc caggttatgg gaccaatggg gcagcccctg caagtgttga 3180
ccctaaatat agaagatgag catcggctac atgagacctc aaaagagcca gatgtttctc 3240
tagggtccac atggctgtct gattttcctc aggcctgggc ggaaaccggg ggcatgggac 3300
tggcagttcg ccaagctcct ctgatcatac ctctgaaagc aacctctacc cccgtgtcca 3360
taaaacaata ccccatgtca caagaagcca gactggggat caagccccac atacagagac 3420
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ttaagaaacc agggactaat gattataggc ctgtccagga tctgagagaa gtcaacaagc 3540
gggtggaaga catccacccc accgtgccca acccttacaa cctcttgagc gggctcccac 3600
cgtcccacca gtggtacact gtgcttgatt taaaggatgc ctttttctgc ctgagactcc 3660
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gacaattgac ctggaccaga ctcccacagg gtttcaaaaa cagtcccacc ctgtttgatg 3780
aggcactgca cagagaccta gcagacttcc ggatccagca cccagacttg atcctgctac 3840
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gggccctgtt acaaacccta gggaacctcg ggtatcgggc ctcggccaag aaagcccaaa 3960
tttgccagaa acaggtcaag tatctggggt atcttctaaa agagggtcag agatggctga 4020
ctgaggccag aaaagagact gtgatggggc agcctactcc gaagacccct cgacaactaa 4080
gggagttcct agggacggca ggcttctgtc gcctctggat ccctgggttt gcagaaatgg 4140
cagccccctt gtaccctctc accaaaacgg ggactctgtt taattggggc ccagaccaac 4200
aaaaggccta tcaagaaatc aagcaagctc ttctaactgc cccagccctg gggttgccag 4260
atttgactaa gccctttgaa ctctttgtcg acgagaagca gggctacgcc aaaggtgtcc 4320
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aggcactagt caaacaaccc cccgaccgct ggctttccaa cgcccggatg actcactatc 4560
aggccttgct tttggacacg gaccgggtcc agttcggacc ggtggtagcc ctgaacccgg 4620
ctacgctgct cccactgcct gaggaagggc tgcaacacaa ctgccttgat atcctggccg 4680
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ggtacacgga tggaagcagt ctcttacaag agggacagcg taaggcggga gctgcggtga 4800
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tctccaaggt gagtcagaca gtggccgatc tgttggggat tgattggaaa ttacattgtg 5820
catacagacc ccaaagctca ggccaggtag aaagaatgaa tagaaccatc aaggagactt 5880
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gggcaccccc gccccttgta aacttccctg accctgacat gacaagagtt actaacagcc 6060
cctctctcca agctcactta caggctctct acttagtcca gcacgaagtc tggagacctc 6120
tggcggcagc ctaccaagaa caactggacc gaccggtggt acctcaccct taccgagtcg 6180
gcgacacagt gtgggtccgc cgacaccaga ctaagaacct agaacctcgc tggaaaggac 6240
cttacacagt cctgctgacc acccccaccg ccctcaaagt agacggcatc gcagcttgga 6300
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acagcggacc cggacttttg acttttacgt gtgccctggg cataccgtaa agtcggggtg 6720
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aacagatcct attaccatgt tctccctgac ccggcaggtc cttaatgtgg gaccccgagt 7080
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tgtaccggct ccacagccac ctagccccct caataccagt tacccccctt ccactaccag 7200
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taagcttacc ctatctgaag tgacaggaca gggcctatgc atgggggcag tacctaaaac 7500
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atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca 11340
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cttcaagaat tcat 11654
<210> 50
<211> 11663
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pAC3-GSG-F2A-GFPm
<400> 50
tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60
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gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240
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catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420
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ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540
acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cggcgccagt cctccgattg 600
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tttcatttgg gggctcgtcc gggatcggga gacccctgcc cagggaccac cgacccacca 780
ccgggaggta agctggccag caacttatct gtgtctgtcc gattgtctag tgtctatgac 840
tgattttatg cgcctgcgtc ggtactagtt agctaactag ctctgtatct ggcggacccg 900
tggtggaact gacgagttcg gaacacccgg ccgcaaccct gggagacgtc ccagggactt 960
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ctgcagaatg gccaaccttt aacgtcggat ggccgcgaga cggcaccttt aaccgagacc 1380
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ccacggatcg caaagtacat ctagctaccg gtaaggtcac ccactctttc ctccatgtac 3060
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actttgaggg atcaggagcc caggttatgg gaccaatggg gcagcccctg caagtgttga 3180
ccctaaatat agaagatgag catcggctac atgagacctc aaaagagcca gatgtttctc 3240
tagggtccac atggctgtct gattttcctc aggcctgggc ggaaaccggg ggcatgggac 3300
tggcagttcg ccaagctcct ctgatcatac ctctgaaagc aacctctacc cccgtgtcca 3360
taaaacaata ccccatgtca caagaagcca gactggggat caagccccac atacagagac 3420
tgttggacca gggaatactg gtaccctgcc agtccccctg gaacacgccc ctgctacccg 3480
ttaagaaacc agggactaat gattataggc ctgtccagga tctgagagaa gtcaacaagc 3540
gggtggaaga catccacccc accgtgccca acccttacaa cctcttgagc gggctcccac 3600
cgtcccacca gtggtacact gtgcttgatt taaaggatgc ctttttctgc ctgagactcc 3660
accccaccag tcagcctctc ttcgcctttg agtggagaga tccagagatg ggaatctcag 3720
gacaattgac ctggaccaga ctcccacagg gtttcaaaaa cagtcccacc ctgtttgatg 3780
aggcactgca cagagaccta gcagacttcc ggatccagca cccagacttg atcctgctac 3840
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gggccctgtt acaaacccta gggaacctcg ggtatcgggc ctcggccaag aaagcccaaa 3960
tttgccagaa acaggtcaag tatctggggt atcttctaaa agagggtcag agatggctga 4020
ctgaggccag aaaagagact gtgatggggc agcctactcc gaagacccct cgacaactaa 4080
gggagttcct agggacggca ggcttctgtc gcctctggat ccctgggttt gcagaaatgg 4140
cagccccctt gtaccctctc accaaaacgg ggactctgtt taattggggc ccagaccaac 4200
aaaaggccta tcaagaaatc aagcaagctc ttctaactgc cccagccctg gggttgccag 4260
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gggcaccccc gccccttgta aacttccctg accctgacat gacaagagtt actaacagcc 6060
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ccctttcgtc ttcaagaatt cat 11663
<210> 51
<211> 11399
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pAC3-T2A-yCD2
<400> 51
tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240
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ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540
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tctccaaggt gagtcagaca gtggccgatc tgttggggat tgattggaaa ttacattgtg 5820
catacagacc ccaaagctca ggccaggtag aaagaatgaa tagaaccatc aaggagactt 5880
taactaaatt aacgcttgca actggctcta gagactgggt gctcctactc cccttagccc 5940
tgtaccgagc ccgcaacacg ccgggccccc atggcctcac cccatatgag atcttatatg 6000
gggcaccccc gccccttgta aacttccctg accctgacat gacaagagtt actaacagcc 6060
cctctctcca agctcactta caggctctct acttagtcca gcacgaagtc tggagacctc 6120
tggcggcagc ctaccaagaa caactggacc gaccggtggt acctcaccct taccgagtcg 6180
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ctggaagccc acatcatcgt gggacctaat ctcccttaag cgcggtaaca ccccctggga 6840
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tgtaccggct ccacagccac ctagccccct caataccagt tacccccctt ccactaccag 7200
tacaccctca acctccccta caagtccaag tgtcccacag ccacccccag gaactggaga 7260
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caccatcatg ggacctctaa tagtactctt actgatctta ctctttggac cttgcattct 8220
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gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg 11040
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cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata 11280
ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc 11340
atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtcttca agaattcat 11399
<210> 52
<211> 11408
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pAC3-GSG-T2A-yCD2
<400> 52
tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60
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catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420
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ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540
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cgagatctcc accctggaga actgtggcag gctggagggc aaggtgtaca aggacaccac 8640
cctgtacacc accctgtccc cttgtgacat gtgtaccggc gctatcatca tgtacggcat 8700
ccctaggtgt gtgatcggcg agaacgtgaa cttcaagtcc aagggcgaga agtacctgca 8760
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gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg 10920
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tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag 11160
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agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat 11280
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attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtcttcaa 11400
gaattcat 11408
<210> 53
<211> 11402
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pAC3-P2A-yCD2
<400> 53
tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180
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tacaccctca acctccccta caagtccaag tgtcccacag ccacccccag gaactggaga 7260
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ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata 11160
agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt 11220
tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa 11280
ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt 11340
atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct tcaagaattc 11400
at 11402
<210> 54
<211> 11411
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pAC3-GSG-P2A-yCD2
<400> 54
tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 480
ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540
acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cggcgccagt cctccgattg 600
actgagtcgc ccgggtaccc gtgtatccaa taaaccctct tgcagttgca tccgacttgt 660
ggtctcgctg ttccttggga gggtctcctc tgagtgattg actacccgtc agcgggggtc 720
tttcatttgg gggctcgtcc gggatcggga gacccctgcc cagggaccac cgacccacca 780
ccgggaggta agctggccag caacttatct gtgtctgtcc gattgtctag tgtctatgac 840
tgattttatg cgcctgcgtc ggtactagtt agctaactag ctctgtatct ggcggacccg 900
tggtggaact gacgagttcg gaacacccgg ccgcaaccct gggagacgtc ccagggactt 960
cgggggccgt ttttgtggcc cgacctgagt ccaaaaatcc cgatcgtttt ggactctttg 1020
gtgcaccccc cttagaggag ggatatgtgg ttctggtagg agacgagaac ctaaaacagt 1080
tcccgcctcc gtctgaattt ttgctttcgg tttgggaccg aagccgcgcc gcgcgtcttg 1140
tctgctgcag catcgttctg tgttgtctct gtctgactgt gtttctgtat ttgtctgaga 1200
atatgggcca gactgttacc actcccttaa gtttgacctt aggtcactgg aaagatgtcg 1260
agcggatcgc tcacaaccag tcggtagatg tcaagaagag acgttgggtt accttctgct 1320
ctgcagaatg gccaaccttt aacgtcggat ggccgcgaga cggcaccttt aaccgagacc 1380
tcatcaccca ggttaagatc aaggtctttt cacctggccc gcatggacac ccagaccagg 1440
tcccctacat cgtgacctgg gaagccttgg cttttgaccc ccctccctgg gtcaagccct 1500
ttgtacaccc taagcctccg cctcctcttc ctccatccgc cccgtctctc ccccttgaac 1560
ctcctcgttc gaccccgcct cgatcctccc tttatccagc cctcactcct tctctaggcg 1620
ccaaacctaa acctcaagtt ctttctgaca gtggggggcc gctcatcgac ctacttacag 1680
aagacccccc gccttatagg gacccaagac cacccccttc cgacagggac ggaaatggtg 1740
gagaagcgac ccctgcggga gaggcaccgg acccctcccc aatggcatct cgcctacgtg 1800
ggagacggga gccccctgtg gccgactcca ctacctcgca ggcattcccc ctccgcgcag 1860
gaggaaacgg acagcttcaa tactggccgt tctcctcttc tgacctttac aactggaaaa 1920
ataataaccc ttctttttct gaagatccag gtaaactgac agctctgatc gagtctgttc 1980
tcatcaccca tcagcccacc tgggacgact gtcagcagct gttggggact ctgctgaccg 2040
gagaagaaaa acaacgggtg ctcttagagg ctagaaaggc ggtgcggggc gatgatgggc 2100
gccccactca actgcccaat gaagtcgatg ccgcttttcc cctcgagcgc ccagactggg 2160
attacaccac ccaggcaggt aggaaccacc tagtccacta tcgccagttg ctcctagcgg 2220
gtctccaaaa cgcgggcaga agccccacca atttggccaa ggtaaaagga ataacacaag 2280
ggcccaatga gtctccctcg gccttcctag agagacttaa ggaagcctat cgcaggtaca 2340
ctccttatga ccctgaggac ccagggcaag aaactaatgt gtctatgtct ttcatttggc 2400
agtctgcccc agacattggg agaaagttag agaggttaga agatttaaaa aacaagacgc 2460
ttggagattt ggttagagag gcagaaaaga tctttaataa acgagaaacc ccggaagaaa 2520
gagaggaacg tatcaggaga gaaacagagg aaaaagaaga acgccgtagg acagaggatg 2580
agcagaaaga gaaagaaaga gatcgtagga gacatagaga gatgagcaag ctattggcca 2640
ctgtcgttag tggacagaaa caggatagac agggaggaga acgaaggagg tcccaactcg 2700
atcgcgacca gtgtgcctac tgcaaagaaa aggggcactg ggctaaagat tgtcccaaga 2760
aaccacgagg acctcgggga ccaagacccc agacctccct cctgacccta gatgactagg 2820
gaggtcaggg tcaggagccc ccccctgaac ccaggataac cctcaaagtc ggggggcaac 2880
ccgtcacctt cctggtagat actggggccc aacactccgt gctgacccaa aatcctggac 2940
ccctaagtga taagtctgcc tgggtccaag gggctactgg aggaaagcgg tatcgctgga 3000
ccacggatcg caaagtacat ctagctaccg gtaaggtcac ccactctttc ctccatgtac 3060
cagactgtcc ctatcctctg ttaggaagag atttgctgac taaactaaaa gcccaaatcc 3120
actttgaggg atcaggagcc caggttatgg gaccaatggg gcagcccctg caagtgttga 3180
ccctaaatat agaagatgag catcggctac atgagacctc aaaagagcca gatgtttctc 3240
tagggtccac atggctgtct gattttcctc aggcctgggc ggaaaccggg ggcatgggac 3300
tggcagttcg ccaagctcct ctgatcatac ctctgaaagc aacctctacc cccgtgtcca 3360
taaaacaata ccccatgtca caagaagcca gactggggat caagccccac atacagagac 3420
tgttggacca gggaatactg gtaccctgcc agtccccctg gaacacgccc ctgctacccg 3480
ttaagaaacc agggactaat gattataggc ctgtccagga tctgagagaa gtcaacaagc 3540
gggtggaaga catccacccc accgtgccca acccttacaa cctcttgagc gggctcccac 3600
cgtcccacca gtggtacact gtgcttgatt taaaggatgc ctttttctgc ctgagactcc 3660
accccaccag tcagcctctc ttcgcctttg agtggagaga tccagagatg ggaatctcag 3720
gacaattgac ctggaccaga ctcccacagg gtttcaaaaa cagtcccacc ctgtttgatg 3780
aggcactgca cagagaccta gcagacttcc ggatccagca cccagacttg atcctgctac 3840
agtacgtgga tgacttactg ctggccgcca cttctgagct agactgccaa caaggtactc 3900
gggccctgtt acaaacccta gggaacctcg ggtatcgggc ctcggccaag aaagcccaaa 3960
tttgccagaa acaggtcaag tatctggggt atcttctaaa agagggtcag agatggctga 4020
ctgaggccag aaaagagact gtgatggggc agcctactcc gaagacccct cgacaactaa 4080
gggagttcct agggacggca ggcttctgtc gcctctggat ccctgggttt gcagaaatgg 4140
cagccccctt gtaccctctc accaaaacgg ggactctgtt taattggggc ccagaccaac 4200
aaaaggccta tcaagaaatc aagcaagctc ttctaactgc cccagccctg gggttgccag 4260
atttgactaa gccctttgaa ctctttgtcg acgagaagca gggctacgcc aaaggtgtcc 4320
taacgcaaaa actgggacct tggcgtcggc cggtggccta cctgtccaaa aagctagacc 4380
cagtagcagc tgggtggccc ccttgcctac ggatggtagc agccattgcc gtactgacaa 4440
aggatgcagg caagctaacc atgggacagc cactagtcat tctggccccc catgcagtag 4500
aggcactagt caaacaaccc cccgaccgct ggctttccaa cgcccggatg actcactatc 4560
aggccttgct tttggacacg gaccgggtcc agttcggacc ggtggtagcc ctgaacccgg 4620
ctacgctgct cccactgcct gaggaagggc tgcaacacaa ctgccttgat atcctggccg 4680
aagcccacgg aacccgaccc gacctaacgg accagccgct cccagacgcc gaccacacct 4740
ggtacacgga tggaagcagt ctcttacaag agggacagcg taaggcggga gctgcggtga 4800
ccaccgagac cgaggtaatc tgggctaaag ccctgccagc cgggacatcc gctcagcggg 4860
ctgaactgat agcactcacc caggccctaa agatggcaga aggtaagaag ctaaatgttt 4920
atactgatag ccgttatgct tttgctactg cccatatcca tggagaaata tacagaaggc 4980
gtgggttgct cacatcagaa ggcaaagaga tcaaaaataa agacgagatc ttggccctac 5040
taaaagccct ctttctgccc aaaagactta gcataatcca ttgtccagga catcaaaagg 5100
gacacagcgc cgaggctaga ggcaaccgga tggctgacca agcggcccga aaggcagcca 5160
tcacagagac tccagacacc tctaccctcc tcatagaaaa ttcatcaccc tacacctcag 5220
aacattttca ttacacagtg actgatataa aggacctaac caagttgggg gccatttatg 5280
ataaaacaaa gaagtattgg gtctaccaag gaaaacctgt gatgcctgac cagtttactt 5340
ttgaattatt agactttctt catcagctga ctcacctcag cttctcaaaa atgaaggctc 5400
tcctagagag aagccacagt ccctactaca tgctgaaccg ggatcgaaca ctcaaaaata 5460
tcactgagac ctgcaaagct tgtgcacaag tcaacgccag caagtctgcc gttaaacagg 5520
gaactagggt ccgcgggcat cggcccggca ctcattggga gatcgatttc accgagataa 5580
agcccggatt gtatggctat aaatatcttc tagtttttat agataccttt tctggctgga 5640
tagaagcctt cccaaccaag aaagaaaccg ccaaggtcgt aaccaagaag ctactagagg 5700
agatcttccc caggttcggc atgcctcagg tattgggaac tgacaatggg cctgccttcg 5760
tctccaaggt gagtcagaca gtggccgatc tgttggggat tgattggaaa ttacattgtg 5820
catacagacc ccaaagctca ggccaggtag aaagaatgaa tagaaccatc aaggagactt 5880
taactaaatt aacgcttgca actggctcta gagactgggt gctcctactc cccttagccc 5940
tgtaccgagc ccgcaacacg ccgggccccc atggcctcac cccatatgag atcttatatg 6000
gggcaccccc gccccttgta aacttccctg accctgacat gacaagagtt actaacagcc 6060
cctctctcca agctcactta caggctctct acttagtcca gcacgaagtc tggagacctc 6120
tggcggcagc ctaccaagaa caactggacc gaccggtggt acctcaccct taccgagtcg 6180
gcgacacagt gtgggtccgc cgacaccaga ctaagaacct agaacctcgc tggaaaggac 6240
cttacacagt cctgctgacc acccccaccg ccctcaaagt agacggcatc gcagcttgga 6300
tacacgccgc ccacgtgaag gctgccgacc ccgggggtgg accatcctct agactgacat 6360
ggcgcgttca acgctctcaa aaccccctca agataagatt aacccgtgga agcccttaat 6420
agtcatggga gtcctgttag gagtagggat ggcagagagc ccccatcagg tctttaatgt 6480
aacctggaga gtcaccaacc tgatgactgg gcgtaccgcc aatgccacct ccctcctggg 6540
aactgtacaa gatgccttcc caaaattata ttttgatcta tgtgatctgg tcggagagga 6600
gtgggaccct tcagaccagg aaccgtatgt cgggtatggc tgcaagtacc ccgcagggag 6660
acagcggacc cggacttttg acttttacgt gtgccctggg cataccgtaa agtcggggtg 6720
tgggggacca ggagagggct actgtggtaa atgggggtgt gaaaccaccg gacaggctta 6780
ctggaagccc acatcatcgt gggacctaat ctcccttaag cgcggtaaca ccccctggga 6840
cacgggatgc tctaaagttg cctgtggccc ctgctacgac ctctccaaag tatccaattc 6900
cttccaaggg gctactcgag ggggcagatg caaccctcta gtcctagaat tcactgatgc 6960
aggaaaaaag gctaactggg acgggcccaa atcgtgggga ctgagactgt accggacagg 7020
aacagatcct attaccatgt tctccctgac ccggcaggtc cttaatgtgg gaccccgagt 7080
ccccataggg cccaacccag tattacccga ccaaagactc ccttcctcac caatagagat 7140
tgtaccggct ccacagccac ctagccccct caataccagt tacccccctt ccactaccag 7200
tacaccctca acctccccta caagtccaag tgtcccacag ccacccccag gaactggaga 7260
tagactacta gctctagtca aaggagccta tcaggcgctt aacctcacca atcccgacaa 7320
gacccaagaa tgttggctgt gcttagtgtc gggacctcct tattacgaag gagtagcggt 7380
cgtgggcact tataccaatc attccaccgc tccggccaac tgtacggcca cttcccaaca 7440
taagcttacc ctatctgaag tgacaggaca gggcctatgc atgggggcag tacctaaaac 7500
tcaccaggcc ttatgtaaca ccacccaaag cgccggctca ggatcctact accttgcagc 7560
acccgccgga acaatgtggg cttgcagcac tggattgact ccctgcttgt ccaccacggt 7620
gctcaatcta accacagatt attgtgtatt agttgaactc tggcccagag taatttacca 7680
ctcccccgat tatatgtatg gtcagcttga acagcgtacc aaatataaaa gagagccagt 7740
atcattgacc ctggcccttc tactaggagg attaaccatg ggagggattg cagctggaat 7800
agggacgggg accactgcct taattaaaac ccagcagttt gagcagcttc atgccgctat 7860
ccagacagac ctcaacgaag tcgaaaagtc aattaccaac ctagaaaagt cactgacctc 7920
gttgtctgaa gtagtcctac agaaccgcag aggcctagat ttgctattcc taaaggaggg 7980
aggtctctgc gcagccctaa aagaagaatg ttgtttttat gcagaccaca cggggctagt 8040
gagagacagc atggccaaat taagagaaag gcttaatcag agacaaaaac tatttgagac 8100
aggccaagga tggttcgaag ggctgtttaa tagatccccc tggtttacca ccttaatctc 8160
caccatcatg ggacctctaa tagtactctt actgatctta ctctttggac cttgcattct 8220
caatcgattg gtccaatttg ttaaagacag gatctcagtg gtccaggctc tggttttgac 8280
tcagcaatat caccagctaa aacccataga gtacgagcca ggaagcggag ctactaactt 8340
cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct ggacctggcg cgcctatggt 8400
gaccggcggc atggcctcca agtgggatca aaagggcatg gatatcgctt acgaggaggc 8460
cctgctgggc tacaaggagg gcggcgtgcc tatcggcggc tgtctgatca acaacaagga 8520
cggcagtgtg ctgggcaggg gccacaacat gaggttccag aagggctccg ccaccctgca 8580
cggcgagatc tccaccctgg agaactgtgg caggctggag ggcaaggtgt acaaggacac 8640
caccctgtac accaccctgt ccccttgtga catgtgtacc ggcgctatca tcatgtacgg 8700
catccctagg tgtgtgatcg gcgagaacgt gaacttcaag tccaagggcg agaagtacct 8760
gcaaaccagg ggccacgagg tggtggttgt tgacgatgag aggtgtaaga agctgatgaa 8820
gcagttcatc gacgagaggc ctcaggactg gttcgaggat atcggcgagt aagcggccgc 8880
agataaaata aaagatttta tttagtctcc agaaaaaggg gggaatgaaa gaccccacct 8940
gtaggtttgg caagctagct taagtaacgc cattttgcaa ggcatggaaa aatacataac 9000
tgagaataga gaagttcaga tcaaggtcag gaacagatgg aacagctgaa tatgggccaa 9060
acaggatatc tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg gccaagaaca gatggaacag 9120
ctgaatatgg gccaaacagg atatctgtgg taagcagttc ctgccccggc tcagggccaa 9180
gaacagatgg tccccagatg cggtccagcc ctcagcagtt tctagagaac catcagatgt 9240
ttccagggtg ccccaaggac ctgaaatgac cctgtgcctt atttgaacta accaatcagt 9300
tcgcttctcg cttctgttcg cgcgcttctg ctccccgagc tcaataaaag agcccacaac 9360
ccctcactcg gggcgccagt cctccgattg actgagtcgc ccgggtaccc gtgtatccaa 9420
taaaccctct tgcagttgca tccgacttgt ggtctcgctg ttccttggga gggtctcctc 9480
tgagtgattg actacccgtc agcgggggtc tttcattaca tgtgagcaaa aggccagcaa 9540
aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct 9600
gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa 9660
agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg 9720
cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcaatgctca 9780
cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa 9840
ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg 9900
gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg 9960
tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg 10020
acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc 10080
tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag 10140
attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac 10200
gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc 10260
ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag 10320
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ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca 10500
gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact 10560
ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca 10620
gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctgcaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg 10680
tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc 10740
atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg 10800
gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca 10860
tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt 10920
atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaacacggg ataataccgc gccacatagc 10980
agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc 11040
ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca 11100
tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa 11160
aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat 11220
tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa 11280
aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa 11340
accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtctt 11400
caagaattca t 11411
<210> 55
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 马鼻炎A病毒2A肽
<400> 55
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 56
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 口蹄疫2A肽
<400> 56
Pro Val Lys Gln Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 57
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 猪捷申病毒2A肽
<400> 57
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 58
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 明脉扁刺蛾β四体病毒2A肽
<400> 58
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 59
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Encephalomyocarditis virus-B 2A肽
<400> 59
Gly Ile Phe Asn Ala His Tyr Ala Gly Tyr Phe Ala Asp Leu Leu Ile
1 5 10 15
His Asp Ile Glu Thr Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 60
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脑心肌炎病毒-D 2A肽
<400> 60
Gly Tyr Phe Ala Asp Leu Leu Ile His Asp Ile Glu Thr Asn Pro Gly
1 5 10 15
Pro
<210> 61
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脑心肌炎病毒-PV21 2A肽
<400> 61
Arg Ile Phe Asn Ala His Tyr Ala Gly Tyr Phe Ala Asp Leu Leu Ile
1 5 10 15
His Asp Ile Glu Thr Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 62
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 门果病毒2A肽
<400> 62
His Val Phe Glu Thr His Tyr Ala Gly Tyr Phe Ser Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
His Asp Val Glu Thr Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 63
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 泰勒脑脊髓炎病毒-GD7 2A肽
<400> 63
Lys Ala Val Arg Gly Tyr His Ala Asp Tyr Tyr Lys Gln Arg Leu Ile
1 5 10 15
His Asp Val Glu Met Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 64
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 泰勒脑脊髓炎病毒-DA 2A肽
<400> 64
Arg Ala Val Arg Ala Tyr His Ala Asp Tyr Tyr Lys Gln Arg Leu Ile
1 5 10 15
His Asp Val Glu Met Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 65
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 泰勒脑脊髓炎病毒-BEAN 2A肽
<400> 65
Lys Ala Val Arg Gly Tyr His Ala Asp Tyr Tyr Arg Gln Arg Leu Ile
1 5 10 15
His Asp Val Glu Thr Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 66
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 泰勒样病毒 2A肽
<400> 66
Lys His Val Arg Glu Tyr His Ala Ala Tyr Tyr Lys Gln Arg Leu Met
1 5 10 15
His Asp Val Glu Thr Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 67
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 永安河病毒-174F 2A肽
<400> 67
Met His Ser Asp Glu Met Asp Phe Ala Gly Gly Lys Phe Leu Asn Gln
1 5 10 15
Cys Gly Asp Val Glu Thr Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 68
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 永安河病毒-145SL 2A肽
<400> 68
Met His Asn Asp Glu Met Asp Tyr Ser Gly Gly Lys Phe Leu Asn Gln
1 5 10 15
Cys Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 69
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 永安河病毒-(87-012) 2A肽
<400> 69
Met His Ser Asp Glu Met Asp Phe Ala Gly Gly Lys Phe Leu Asn Gln
1 5 10 15
Cys Gly Asp Val Glu Thr Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 70
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 永安河病毒-(M1146) 2A肽
<400> 70
Tyr His Asp Lys Asp Met Asp Tyr Ala Gly Gly Lys Phe Leu Asn Gln
1 5 10 15
Cys Gly Asp Val Glu Thr Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 71
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 口蹄疫病毒 2A肽
<400> 71
Ala Pro Ala Lys Gln Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly
1 5 10 15
Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 72
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 口蹄疫病毒-A12 2A肽
<400> 72
Ala Pro Gly Lys Gln Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly
1 5 10 15
Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 73
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 口蹄疫病毒-C1 2A肽
<400> 73
Ala Pro Ala Lys Gln Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly
1 5 10 15
Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 74
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 口蹄疫病毒-O1G 2A肽
<400> 74
Ala Pro Val Lys Gln Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly
1 5 10 15
Asp Met Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 75
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 口蹄疫病毒 O1K 2A肽
<400> 75
Ala Pro Val Lys Gln Leu Thr Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly
1 5 10 15
Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 76
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 口蹄疫病毒-O (台湾) 2A肽
<400> 76
Ala Pro Ala Lys Gln Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly
1 5 10 15
Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 77
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 口蹄疫病毒-O/SK 2A肽
<400> 77
Ala Pro Val Lys Gln Leu Leu Ser Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly
1 5 10 15
Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 78
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 口蹄疫病毒-SAT3 2A肽
<400> 78
Lys Pro Asp Lys Gln Met Cys Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly
1 5 10 15
Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 79
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 口蹄疫病毒-SAT2 2A肽
<400> 79
Gly Val Ala Lys Gln Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly
1 5 10 15
Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 80
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 马鼻炎A病毒 2A肽
<400> 80
Asn Ile Asn Lys Gln Cys Thr Asn Tyr Ser Leu Leu Lys Leu Ala Gly
1 5 10 15
Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 81
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 马鼻炎B病毒 2A肽
<400> 81
Thr Ile Leu Ser Glu Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Leu Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 82
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 内源性逆转录病毒-3 2A肽
<400> 82
Asn Leu Leu Ser Gln Gly Ala Thr Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 83
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 庞塔托鲁白蛉热病毒-1 2A肽
<400> 83
Val Met Ala Phe Gln Gly Pro Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys
1 5 10 15
Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 84
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 庞塔托鲁白蛉热病毒-2 2A肽
<400> 84
Thr Met Met Leu Gln Gly Pro Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys
1 5 10 15
Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 85
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 庞塔托鲁白蛉热病毒-3 2A肽
<400> 85
Thr Met Ser Phe Gln Gly Pro Gly Ala Ser Ser Phe Ser Leu Leu Lys
1 5 10 15
Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 86
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 庞塔托鲁白蛉热病毒-4 2A肽
<400> 86
Thr Met Met Leu Gln Gly Pro Gly Ala Ser Asn Phe Ser Leu Leu Lys
1 5 10 15
Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 87
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 庞塔托鲁白蛉热病毒-5 2A肽
<400> 87
Thr Met Leu Phe Gln Gly Pro Gly Ala Ala Asn Phe Ser Leu Leu Arg
1 5 10 15
Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 88
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 庞塔托鲁白蛉热病毒-6 2A肽
<400> 88
Thr Met Ser Phe Gln Gly Pro Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys
1 5 10 15
Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 89
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 庞塔托鲁白蛉热病毒-7 2A肽
<400> 89
Val Val Ser Phe Gln Gly Pro Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys
1 5 10 15
Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 90
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 庞塔托鲁白蛉热病毒-8 2A肽
<400> 90
Thr Met Ser Leu Gln Gly Pro Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys
1 5 10 15
Gln Ala Gly Asp Ile Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 91
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 庞塔托鲁白蛉热病毒-9 2A肽
<400> 91
Thr Met Ala Phe Gln Gly Pro Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys
1 5 10 15
Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 92
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 庞塔托鲁白蛉热病毒-10 2A肽
<400> 92
Thr Leu Ser Phe Gln Gly Pro Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys
1 5 10 15
Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 93
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 庞塔托鲁白蛉热病毒-11 2A肽
<400> 93
Arg Met Ser Phe Gln Gly Pro Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys
1 5 10 15
Arg Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 94
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蟋蟀麻痹病毒 2A肽
<400> 94
Phe Leu Arg Lys Arg Thr Gln Leu Leu Met Ser Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 95
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 果蝇C病毒2A肽
<400> 95
Glu Ala Ala Arg Gln Met Leu Leu Leu Leu Ser Gly Asp Val Glu Thr
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 96
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 急性蜜蜂麻痹病毒 2A肽
<400> 96
Gly Ser Trp Thr Asp Ile Leu Leu Leu Leu Ser Gly Asp Val Glu Thr
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 97
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 急性蜜蜂麻痹病毒波兰1分离体2A肽
<400> 97
Gly Ser Trp Thr Asp Ile Leu Leu Leu Leu Ser Gly Asp Val Glu Thr
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 98
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 急性蜜蜂麻痹病毒 匈牙利1分离体2A肽
<400> 98
Gly Ser Trp Thr Asp Ile Leu Leu Leu Trp Ser Gly Asp Val Glu Thr
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 99
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 感染性蚕软腐病病毒2A肽
<400> 99
Thr Arg Ala Glu Ile Glu Asp Glu Leu Ile Arg Ala Gly Ile Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 100
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 番茄不孕病毒2A肽
<400> 100
Arg Ala Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 101
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 马器质性脑病病毒2A肽
<400> 101
Gln Gly Ala Gly Arg Gly Ser Leu Val Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 102
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鸟多瘤病毒2A肽
<400> 102
Asn Tyr Pro Met Pro Glu Ala Leu Gln Lys Ile Ile Asp Leu Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Pro Pro
20
<210> 103
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克什米尔蜜蜂病毒 2A肽
<400> 103
Gly Thr Trp Glu Ser Val Leu Asn Leu Leu Ala Gly Asp Ile Glu Leu
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 104
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 榕透翅毒蛾微小核糖核酸病毒样病毒(a) 2A肽
<400> 104
Ala Gln Gly Trp Val Pro Asp Leu Thr Val Asp Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 105
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 榕透翅毒蛾微小核糖核酸病毒样病毒(b) 2A肽
<400> 105
Ile Gly Gly Gly Gln Lys Asp Leu Thr Gln Asp Gly Asp Ile Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 106
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 茶尺蛾微小核糖核酸病毒样病毒(a) 2A肽
<400> 106
Ala Gln Gly Trp Ala Pro Asp Leu Thr Gln Asp Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 107
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 茶尺蛾微小核糖核酸病毒样病毒(b) 2A肽
<400> 107
Ile Gly Gly Gly Gln Arg Asp Leu Thr Gln Asp Gly Asp Ile Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 108
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 普罗维登斯病毒 (a) 2A肽
<400> 108
Val Gly Asp Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Ser Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 109
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 普罗维登斯病毒 (b) 2A肽
<400> 109
Gly Asp Pro Ile Glu Asp Leu Thr Asp Asp Gly Asp Ile Glu Lys Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 110
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 普罗维登斯病毒 (c) 2A肽
<400> 110
Ser Gly Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Ala Gly Asp Val Glu Lys Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 111
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 牛轮状病毒2A肽
<400> 111
Ser Lys Phe Gln Ile Asp Arg Ile Leu Ile Ser Gly Asp Ile Glu Leu
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 112
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 猪轮状病毒2A肽
<400> 112
Ala Lys Phe Gln Ile Asp Lys Ile Leu Ile Ser Gly Asp Val Glu Leu
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 113
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人轮状病毒2A肽
<400> 113
Ser Lys Phe Gln Ile Asp Lys Ile Leu Ile Ser Gly Asp Ile Glu Leu
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 114
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 家蚕呼肠孤病毒 2A肽
<400> 114
Phe Arg Ser Asn Tyr Asp Leu Leu Lys Leu Cys Gly Asp Ile Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 115
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 舞毒蛾呼肠孤病毒 2A肽
<400> 115
Phe Arg Ser Asn Tyr Asp Leu Leu Lys Leu Cys Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 116
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 马尾松毛虫呼肠孤病毒 2A肽
<400> 116
Phe Arg Ser Asn Tyr Asp Leu Leu Lys Leu Cys Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 117
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 布氏锥虫TSR1 2A肽
<400> 117
Ser Ser Ile Ile Arg Thr Lys Met Leu Val Ser Gly Asp Val Glu Glu
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 118
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 锥体虫CAB95325.1 2A肽
<400> 118
Ser Ser Ile Ile Arg Thr Lys Met Leu Leu Ser Gly Asp Val Glu Glu
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 119
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 锥体虫CAB95559.1 2A肽
<400> 119
Ser Ser Ile Ile Arg Thr Lys Ile Leu Leu Ser Gly Asp Val Glu Glu
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 120
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 枯氏锥虫2A肽
<400> 120
Cys Asp Ala Gln Arg Gln Lys Leu Leu Leu Ser Gly Asp Ile Glu Gln
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 121
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 海栖热袍菌aguA 2A肽
<400> 121
Tyr Ile Pro Asp Phe Gly Gly Phe Leu Val Lys Ala Asp Ser Glu Phe
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 122
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 支气管败血鲍特氏菌2A肽
<400> 122
Val His Cys Ala Gly Arg Gly Gly Pro Val Arg Leu Leu Asp Lys Glu
1 5 10 15
Gly Asn Pro Gly Pro
20
<210> 123
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠mor-1F 2A肽
<400> 123
Asp Leu Glu Leu Glu Thr Val Gly Ser His Gln Ala Asp Ala Glu Thr
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 124
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 黑腹果蝇mod(mdg4) 2A肽
<400> 124
Thr Ala Ala Asp Lys Ile Gln Gly Ser Trp Lys Met Asp Thr Glu Gly
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 125
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 构巢曲菌Ca通道MID1 2A肽
<400> 125
Pro Ile Thr Asn Arg Pro Arg Asn Ser Gly Leu Ile Asp Thr Glu Ile
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20

Claims (58)

1.一种具有重组复制能力的逆转录病毒，其包含：
逆转录病毒GAG蛋白；
逆转录病毒POL蛋白；
逆转录病毒包膜；
逆转录病毒多核苷酸，所述逆转录病毒多核苷酸包含：在逆转录病毒多核苷酸序列的3'末端的长末端重复(LTR)序列、在所述逆转录病毒多核苷酸的5'末端的启动子序列、gag核酸结构域、pol核酸结构域和env核酸结构域，所述启动子适于在哺乳动物细胞中表达；
包含可操作地连接至异源多核苷酸的2A肽或2A肽样编码序列的盒，其中，所述盒定位成5'连至所述3'LTR并可操作地连接，并且3'连至编码所述逆转录病毒包膜的env核酸结构域；以及
在靶细胞中逆转录、封装和整合中所需的顺式作用序列。
2.根据权利要求1所述的具有重组复制能力的逆转录病毒，其中，所述包膜选自兼嗜性病毒包膜、多变性病毒包膜、异嗜性病毒包膜、10A1病毒包膜、GALV病毒包膜、狒狒内源性病毒包膜、RD114病毒包膜、弹状病毒包膜、甲病毒包膜、麻疹病毒包膜或流感病毒包膜中的一个。
3.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中，所述逆转录病毒多核苷酸序列从选自由以下所组成的组中的病毒工程化：鼠白血病病毒(MLV)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、猫白血病病毒(FeLV)、狒狒内源性逆转录病毒(BEV)、猪内源性病毒(PERV)、猫源性逆转录病毒RD114、松鼠猴逆转录病毒、异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(XMRV)、禽网状内皮组织增生病毒(REV)或长臂猿白血病病毒(GALV)。
4.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中，所述逆转录病毒是γ逆转录病毒。
5.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中，所述靶细胞是哺乳动物细胞。
6.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中，所述2A肽或2A肽样编码序列编码含有SEQID NO：1的序列的肽。
7.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中，所述2A肽或2A肽样编码序列编码SEQ IDNO：55-125中任一个的肽。
8.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中，所述2A肽或2A肽样编码序列包含如SEQ IDNO：8-19中任一个所示的序列。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的逆转录病毒，其中，所述异源多核苷酸>500bp。
10.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中，所述异源多核苷酸包含至少2个编码序列。
11.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其还包含第二盒，所述第二盒在所述盒的下游包含2A肽或2A肽样编码序列。
12.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其还包含位于所述盒的下游的第二盒，其中，所述第二盒包含与第二异源多核苷酸可操作地连接的内部核糖体进入位点(IRES)或微启动子或polIII启动子。
13.一种具有重组复制能力的逆转录病毒，
其包含：
逆转录病毒GAG蛋白；
逆转录病毒POL蛋白；
逆转录病毒包膜；
逆转录病毒多核苷酸，所述逆转录病毒多核苷酸包含：在逆转录病毒多核苷酸序列的3'末端的长末端重复(LTR)序列、在所述逆转录病毒多核苷酸的5'末端的启动子序列、gag核酸结构域、pol核酸结构域和env核酸结构域，所述启动子适于在哺乳动物细胞中表达；
包含可操作地连接至第一异源多核苷酸的调控结构域的盒，所述第一异源多核苷酸可操作地连接至至少一个2A盒，所述2A盒包含可操作地连接至第二异源多核苷酸的2A肽或2A肽样编码序列，其中，所述盒定位成5'连至所述3'LTR，以及3'连至编码所述逆转录病毒包膜的env核酸结构域，并且其中，所述2A盒在下游并且可操作地连接至第一异源多核苷酸；以及
在靶细胞中逆转录、封装和整合中所需的顺式作用序列。
14.根据权利要求13所述的逆转录病毒，其中，所述包膜选自选自兼嗜性病毒包膜、多变性病毒包膜、异嗜性病毒包膜、10A1病毒包膜、GALV病毒包膜、狒狒内源性病毒包膜、RD114病毒包膜、弹状病毒包膜、甲病毒包膜、麻疹病毒包膜或流感病毒包膜中的一个。
15.根据权利要求13所述的逆转录病毒，其中，所述逆转录病毒多核苷酸序列源于选自由以下所组成的组中的病毒：鼠白血病病毒(MLV)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、猫白血病病毒(FeLV)、狒狒内源性逆转录病毒(BEV)、猪内源性病毒(PERV)、猫源性逆转录病毒RD114、松鼠猴逆转录病毒、异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(XMRV)、禽网状内皮组织增生病毒(REV)或长臂猿白血病病毒(GALV)。
16.根据权利要求13所述的逆转录病毒，其中，所述逆转录病毒是γ逆转录病毒。
17.根据权利要求13所述的逆转录病毒，其中，所述靶细胞是哺乳动物细胞。
18.根据权利要求13所述的逆转录病毒，其中，所述2A肽或2A肽样编码序列编码含有SEQ ID NO：1的序列的肽。
19.根据权利要求13所述的逆转录病毒，其中，所述2A肽或2A肽样编码序列编码图1或2中所示的肽。
20.根据权利要求13所述的逆转录病毒，其中，所述2A肽或2A肽样编码序列包含如SEQID NO：8-19中任一个所示的序列。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的逆转录病毒，其中，所述靶细胞选自由肺癌细胞、结肠-直肠癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、尿道癌细胞、子宫癌细胞、脑癌细胞、头颈癌细胞、胰腺癌细胞、黑素瘤细胞、胃癌细胞和卵巢癌细胞所组成的组。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的逆转录病毒，其中，所述启动子序列与生长调节基因相关。
23.根据权利要求1-21中任一项所述的逆转录病毒，其中，所述启动子序列包含组织特异性启动子序列。
24.根据权利要求23所述的逆转录病毒，其中，所述组织特异性启动子序列包含至少一个雄激素应答元件(ARE)。
25.根据权利要求1或13所述的逆转录病毒，其中，所述启动子包含具有如SEQ ID NO：2所示的从核苷酸1到约核苷酸582的序列的CMV启动子，可包括对一个或多个核酸碱基的修饰，并且其能够引导和启动转录。
26.根据权利要求1或13所述的逆转录病毒，其中，所述启动子包含CMV-R-U5结构域多核苷酸。
27.根据权利要求26所述的逆转录病毒，其中，所述CMV-R-U5结构域包含与MLV R-U5区连接的来自人巨细胞病毒的立即早期启动子。
28.根据权利要求27所述的逆转录病毒，其中，所述CMV-R-U5结构域多核苷酸包含如SEQ ID NO：2所示的从约核苷酸1至约核苷酸1202的序列或与如SEQ ID NO：2所示的从核苷酸1至约核苷酸1202的序列至少95％相同的序列，其中，所述多核苷酸促进与其可操作地连接的核酸分子的转录。
29.根据权利要求1或13所述的逆转录病毒，其中，所述gag多核苷酸源于γ逆转录病毒。
30.根据权利要求29所述的逆转录病毒，其中，所述gag核酸域包含SEQ ID NO：2的从约核苷酸编号1203至约核苷酸2819的序列或与其具有至少95％、98％、99％或99.8％同一性的序列。
31.根据权利要求1或13所述的逆转录病毒，其中，所述多核苷酸的pol结构域源于γ逆转录病毒。
32.根据权利要求31所述的逆转录病毒，其中，所述pol结构域包含SEQ ID NO：2的从约核苷酸编号2820至约核苷酸6358的序列或与其具有至少95％、98％、99％或99.9％同一性的序列。
33.根据权利要求1或13所述的逆转录病毒，其中，所述env结构域包含SEQ ID NO：2的从约核苷酸编号6359至约核苷酸8323的序列或与其具有至少95％、98％、99％或99.8％同一性的序列。
34.根据权利要求1或13所述的逆转录病毒，其中，所述3'LTR源于γ逆转录病毒。
35.根据权利要求34所述的逆转录病毒，其中，所述3'LTR包含U3-R-U5结构域。
36.根据权利要求35所述的逆转录病毒，其中，所述3'LTR包含如SEQ ID NO：2所述的从约核苷酸9111至约核苷酸11654的序列或与其具有至少95％、98％或99.5％同一性的序列。
37.根据权利要求1或13所述的逆转录病毒，其中，所述异源核酸序列编码生物反应调节剂或免疫增强细胞因子。
38.根据权利要求37所述的逆转录病毒，其中，所述免疫增强细胞因子选自由白介素1至38、干扰素、肿瘤坏死因子(TNF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)所组成的组。
39.根据权利要求37所述的逆转录病毒，其中，所述免疫增强细胞因子是干扰素γ。
40.根据权利要求1或13所述的逆转录病毒，其中，所述异源核酸编码将无毒前药转化为毒性药物的多肽。
41.根据权利要求40所述的逆转录病毒，其中，将无毒前药转化成毒性药物的多肽是胸苷激酶、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)或胞嘧啶脱氨酶。
42.根据权利要求1或13所述的逆转录病毒，其中，所述异源核酸序列编码受体结构域、抗体或抗体片段。
43.根据权利要求12所述的逆转录病毒，其中，所述第二盒包含抑制性多核苷酸。
44.根据权利要求43所述的逆转录病毒，其中，所述抑制性多核苷酸包含miRNA、RNAi或siRNA序列。
45.一种用于产生根据权利要求1或13所述的逆转录病毒的重组逆转录病毒多核苷酸基因组。
46.根据权利要求45所述的多核苷酸，其包含与具有或不具有GSG连接子编码序列的2A肽或2A肽样编码序列读框符合的MLV 4070A包膜蛋白基因，和与所述2A肽或2A肽样编码序列读框符合的第二基因。
47.根据权利要求45所述的多核苷酸，其包含与具有或不具有GSG连接子编码序列的2A肽或2A肽样编码序列读框符合的MLV 10A1包膜蛋白基因，和与所述2A肽或2A肽样编码序列读框符合的第二基因。
48.根据权利要求45所述的多核苷酸，其包含与具有或不具有GSG连接子编码序列的2A肽或2A肽样编码序列读框符合的XMRV包膜蛋白基因，和与所述2A肽或2A肽样编码序列读框符合的第二基因。
49.根据权利要求45所述的多核苷酸，其包含与具有或不具有GSG连接子编码序列的2A肽或2A肽样编码序列读框符合的非友性MLV包膜蛋白基因，和与所述2A肽或2A肽样编码序列读框符合的第二基因。
50.根据权利要求45-49中任一项所述的多核苷酸，其中，所述异源是分泌型、膜型、细胞质型、细胞核型或细胞区室特异性蛋白。
51.根据权利要求1所述的具有重组复制能力的逆转录病毒，其中，所述逆转录病毒和/或异源多核苷酸已被工程化以去除对人APOBEC超突变敏感的色氨酸密码子。
52.根据权利要求13所述的具有重组复制能力的逆转录病毒，其中，所述逆转录病毒和/或所述第一异源多核苷酸和/或所述第二异源多核苷酸已被工程化以除去对人类APOBEC超突变敏感的色氨酸密码子。
53.根据权利要求52或52所述的重组可逆性逆转录病毒，其中，所述异源多核苷酸编码具有胞嘧啶脱氨酶活性的多肽。
54.根据权利要求53所述的具有重组复制能力的逆转录病毒，其中，所述具有胞嘧啶脱氨酶活性的多肽编码SEQ ID NO：29的多肽，其中，X是除色氨酸以外的任何氨基酸。
55.一种具有重组复制能力的逆转录病毒，其通过将在逆转录病毒多核苷酸中的对APOBEC超突变敏感的密码子工程化为非敏感密码子而抵抗被人APOBEC进行的失活。
56.根据权利要求55所述的具有重组复制能力的逆转录病毒，其中，对APOBEC超突变敏感的密码子编码色氨酸氨基酸。
57.根据权利要求55或56所述的具有重组复制能力的逆转录病毒，其中，所述逆转录病毒包含IRES盒、启动子盒和/或在所述env基因下游的2A肽盒。
58.一种治疗细胞增殖性病症的方法，其包括在使得所述异源多核苷酸被表达的情况下使受试者接触权利要求1或13所述的逆转录病毒，并且其中，所述异源多核苷酸编码将前药转化为细胞毒性药物的蛋白。
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