CN110684804B - 递送外源rnp的慢病毒载体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种递送外源RNP的慢病毒载体及其制备方法；通过将含有慢病毒载体基因组序列的质粒转染入病毒生产细胞，制备而得；所述基因组序列分别位于表达膜蛋白的质粒、表达含RNA结合蛋白的慢病毒GagPol长链蛋白的质粒、表达慢病毒GagPol长链蛋白的质粒、表达形成RNP所需蛋白质的质粒和表达含RNA结合蛋白所识别的RNA茎环结构的外源目的RNA的质粒上。在包装含RNP的慢病毒颗粒的过程中，补充慢病毒GagPol长链蛋白，减少了改造后的慢病毒GagPol长链蛋白所包含的外源RNA结合蛋白对病毒颗粒正常形态的负面影响，保证了慢病毒颗粒外壳的完整性和细胞感染活性的稳定性。

Description

递送外源RNP的慢病毒载体及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种递送外源RNP的慢病毒载体及其制备方法。
背景技术
RNP在基因编辑、基因治疗、药物开发等领域具有重要的应用潜力。RNP的应用受到以下几个因素的限制，(1)RNP自身无法进入细胞，需要一套高效的载体系统；(2)RNA稳定较差，极易被环境中的核酸酶降解，而形成RNP之后，RNA变得更为稳定；(3)现有RNP递送技术如纳米金颗粒、脂质体、电转导等很难直接用于体内。
目前，RNP的递送方案有电转、纳米金颗粒、脂质体以及经过改造的慢病毒颗粒。现有技术中存在利用改造后的慢病毒颗粒递送SaCas9(一种较短的Cas9)及其gRNA的RNP(Lu,B.,et al.,Delivering SaCas9mRNA by lentivirus-like bionanoparticles fortransient expression and efficient genome editing.Nucleic Acids Res,2019.47:p.e44.Lyu,P.,et al.,Delivering Cas9/sgRNA ribonucleoprotein(RNP)by lentiviralcapsid-based bionanoparticles for efficient‘hit-and-run’genomeediting.Nucleic Acids Res,2019.gkz605.)。该方案通过(1)将适配子结合蛋白(RNA结合蛋白)整合至慢病毒核衣壳蛋白(nucleocapsid,NC)内部，(2)将适配子结合蛋白所识别的适配子茎环结构放至目的gRNA的结构中，(3)在293T细胞中共转染上述质粒，从而在细胞内生产出Cas9蛋白与gRNA，此二者形成RNP。(4)RNP通过gRNA上的适配子茎环结构与慢病毒核衣壳蛋白中的RNA结合蛋白结合，从而包装进慢病毒颗粒。然而，该方法没有证实可以递送长度更长的SpCas9及其gRNA的RNP。SpCas9是迄今发现的最长的Cas9之一，递送难度较大，具有高效的核酸剪切作用，在基因编辑和基因治疗方面有着非常广泛的应用。
申请号为201810533437.X的中国发明专利申请公开了一种慢病毒载体及其递送外源RNA的方法；利用RNA结合蛋白和其所识别的RNA序列相互结合的原理，将RNA结合蛋白整合至慢病毒GagPol长链蛋白的骨架，并将其所识别的RNA序列连接到外源目的RNA,从而使目的RNA在慢病毒颗粒的组装过程中被包装进慢病毒颗粒。利用该方法，通过慢病毒颗粒的保护，RNA变得更加稳定；借助慢病毒颗粒高效感染细胞的能力，目的RNA可高效进入细胞表达基因编辑酶、肿瘤或者病毒抗原、细胞重编程因子、嵌合抗原受体等。该发明可用于基因编辑、基因治疗、细胞治疗、免疫治疗、再生医学以及基础生学等领域。然而，通过Cas9mRNA递送的Cas9(本质为mRNA)通常比通过RNP递送的Cas9(本质为蛋白)存在时间更长，脱靶风险更大。此外，在先专利(申请号为201810533437.X)的gRNA需要通过慢病毒的基因组表达，因此，带有病毒核酸成份。本发明通过慢病毒颗粒递送SpCas9(比SaCas9更大)与gRNA组成的RNP可以有效避免上述不足。
发明内容
本发明的目的在于提供一种递送外源RNP(核糖核蛋白复合体)的慢病毒载体及其制备方法。本发明解决的是如何将RNP递送到细胞内的问题，包括RNP的体外和体内的应用。本发明中的慢病毒颗粒，可以递送最大的Cas9蛋白之一SpCas9蛋白及其gRNA。本发明也可能用于递送CRISPR的衍生技术，比如碱基编辑酶及其gRNA形成的RNP，RNA编辑酶及其gRNA形成的RNP，用于基因编辑和碱基编辑。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
第一方面，本发明涉及一种递送外源RNP的慢病毒载体，所述慢病毒载体是通过将含有慢病毒载体基因组序列的质粒转染入病毒生产细胞，制备而得；所述慢病毒载体基因组序列分别位于表达膜蛋白的质粒、表达含RNA结合蛋白的慢病毒GagPol长链蛋白的质粒、表达慢病毒GagPol长链蛋白的质粒、表达形成RNP所需蛋白质的质粒和表达含RNA结合蛋白所识别的RNA茎环结构的外源目的RNA的质粒上。
作为本发明的一个实施方案，所述表达膜蛋白的质粒包括表达VSV-G、CD4识别蛋白、CD8识别蛋白、RD114或狒狒内源逆转录病毒膜蛋白的质粒。
作为本发明的一个实施方案，所述表达含RNA结合蛋白的慢病毒GagPol长链蛋白的质粒是将RNA结合蛋白(MS2衣壳蛋白)整合至第三代慢病毒GagPol长链蛋白的N-端或C-端或者同时N-端和C-端；所述表达含RNA结合蛋白的慢病毒GagPol长链蛋白的质粒序列为SEQ ID NO.5(N-端)、SEQ ID NO.6(C-端)或SEQ ID NO.7(N-和C-端)所示。
作为本发明的一个实施方案，所述表达慢病毒GagPol长链蛋白的质粒序列为SEQID NO.2所示。
作为本发明的一个实施方案，所述表达形成RNP所需蛋白质的质粒为表达含外源蛋白质SpCas9的质粒，其质粒序列为SEQ ID NO.8所示。
作为本发明的一个实施方案，所述表达含RNA结合蛋白所识别的RNA茎环结构的外源目的RNA的质粒是通过将RNA结合蛋白(MS2衣壳蛋白)所识别的RNA序列与目的RNA序列融合而得到；所述质粒序列为SEQ ID NO.10所示。
作为本发明的一个实施方案，所述病毒生产细胞包括293T、293FT、HEK293。
第二方面，本发明涉及一种所述的递送外源RNP的慢病毒载体的制备方法，所述方法包括如下步骤：
S1、将表达膜蛋白的质粒、表达含RNA结合蛋白的慢病毒GagPol长链蛋白的质粒、表达慢病毒GagPol长链蛋白的质粒、表达形成RNP所需蛋白质的质粒和表达含RNA结合蛋白所识别的RNA茎环结构的外源目的RNA的质粒共转染病毒生产细胞；
S2、收集含病毒颗粒的上清，通过高速离心或者HPLC进行浓缩，得到含目的RNP的慢病毒颗粒。
第三方面，本发明涉及一种所述的递送外源RNP的慢病毒载体在递送Cas9或Cas9衍生物与gRNA形成的RNP用于实现基因编辑或者碱基编辑中的用途。
与已有的慢病毒载体改造而来的mRNA(在先专利)以及RNP的递送方案相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的慢病毒颗粒携带的是RNP,即Cas9蛋白与gRNA的复合体；在先发明的慢病毒载体颗粒递送的是Cas9mRNA以及表达gRNA的慢病毒基因组。
(2)本发明具有包装和携带长链基因表达的蛋白的能力，比如可以携带最大的Cas9之一(spCas9，基因约4.2kb)和碱基编辑酶(基因约5.1kb)等，极大提高了应用价值。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为慢病毒载体递送RNP(Cas9-gRNA)的病毒包装策略；
图2为慢病毒载体递送RNP(Cas9-gRNA)实现基因编辑实验；
图3为慢病毒载体递送RNP(Cas9-gRNA)在不同细胞系的的基因编辑实验。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
以下对本发明中涉及的一些术语进行解释：慢病毒载体是由HIV-1改造而来的一种没有自我复制能力的病毒载体。慢病毒载体可以高效地感染分裂细胞和非分裂细胞，是生物学研究和基因治疗常用的载体。目前，慢病毒载体已经发展到第三代，安全性越来越高。
核糖核蛋白复合体(Ribonucleoprotein，RNP)是蛋白质和RNA的复合物。核糖核蛋白复合体有信号识别颗粒、端粒酶、核糖核酸酶P、核糖体等。基因编辑系统CRISPR/Cas9在发挥作用时形成RNP，即Cas9蛋白与RNA(gRNA)的复合体。
gRNA,也即guide RNA，是CRISPR系统中与DNA配对结合，引导核酸酶Cas9定点切割DNA的一种RNA。
本发明将目的RNP包装进慢病毒颗粒，利用慢病毒颗粒保护和递送RNP。本发明的原理为：利用RNA和其识别蛋白的相互作用，将RNP包装进慢病毒颗粒。
本发明的核心特点是：通过融合有RNA结合蛋白(可以位于GagPol的N-端或C-端或者同时N-端和C-端)的慢病毒GagPol长链蛋白，含RNA结合蛋白所识别的茎环结构的目的RNA，即gRNA，以及能与gRNA组成复合体的蛋白，即spCas9的三者的相互作用，将spCas9蛋白与gRNA以RNP的形式包装进慢病毒颗粒。
实施例1
本实施例涉及一种递送外源RNP的慢病毒载体及其制备方法；包括：
步骤1：将表达膜蛋白的质粒(如表达VSV-G的质粒)、表达含RNA结合蛋白的慢病毒GagPol长链蛋白的质粒、表达慢病毒GagPol长链蛋白的质粒、表达形成RNP所需蛋白质的质粒和表达带RNA结合蛋白所识别的茎环结构的目的RNA共转染病毒生产细胞(如293T)。其中，
(1)表达膜蛋白的质粒包括VSV-G、CD4识别蛋白、CD8识别蛋白、RD114、狒狒内源逆转录病毒(baboon endogenous retrovirus)膜蛋白所改造来的膜蛋白。本实施例中选用VSV-G。表达VSV-G的质粒是公知质粒pMD2G，表达VSV-G的质粒图谱如SEQ ID NO.1所示。
(2)表达慢病毒GagPol长链蛋白的质粒是公知质粒pMDlg/PRRE的整合酶缺陷型，该表达野生型GagPol长链蛋白的质粒序列如SEQ ID NO.2所示。辅助质粒为公知质粒pRSV-REV，表达调节因子辅助病毒颗粒的包装，pRSV-REV的质粒序列如SEQ ID NO.3所示。
(3)表达含RNA结合蛋白的慢病毒GagPol长链蛋白的质粒是通过将MS2衣壳蛋白与慢病毒GagPol长链蛋白融合而得到。所述表达含RNA结合蛋白的慢病毒GagPol长链蛋白的质粒序列为SEQ ID NO.5(N-端)、SEQ ID NO.6(C-端)和SEQ ID NO.7(N-和C-端)。
其质粒制备方案如下：
MS2衣壳蛋白的基因序列如SEQ ID NO.4，其编码的蛋白可与GagPol长链蛋白相连，比如置于该GagPol长链蛋白的N-端或C-端或N-和C-端。
atggcctctaattttactcaatttgtgcttgtcgataatggggggacgggagatgtgaccgttgcccctagcaatttcgcaaatggcgttgcagaatggatctctagcaacagcagaagccaagcgtacaaagtaacgtgttccgttcgccaaagctccgcccaaaaacggaagtatacaataaaggttgaggtgccgaaagtagccactcaaacagttggtggggtagaattgcccgtagcggcatggcggtcatatctcaatatggaactcactatcccaatcttcgccacgaatagcgattgtgagctgatagttaaggctatgcaaggtcttctcaaagatggaaaccctattccatctgctatcgccgccaacagcgggatatac SEQ ID NO.4。
MS2衣壳蛋白置于GagPol长链蛋白的N-端(SEQ ID NO.5)的质粒制备方案如下：
①根据基因序列SEQ ID NO.4所示合成MS2蛋白的基因；
②PCR扩增MS2蛋白的基因，引物序列为F:5'-tagcaccggtcgccaccatggcctctaattttactca-3'(SEQ ID NO.14),R:5'-tagctccggactgcacaatcggatagttctggctgtatatcccgctgttggcgg-3'(SEQ ID NO.15)；
③限制性内切酶AgeI和AccIII分别酶切②中PCR产物(插入片段)和载体质粒pGFP-PH-gagpol-D64V(SEQ ID NO.11)；
④用T4连接酶连接载体和插入片段后转化，抽提质粒。
⑤用引物5'-attgacgcaaatgggcggtag-3'(SEQ ID NO.16)进行一代测序验证，结果与设计的质粒序列一致时进行后续步骤。
MS2衣壳蛋白置于GagPol长链蛋白的C-端(SEQ ID NO.6)的质粒制备方案如下：
①根据基因序列SEQ ID NO.4所示合成MS2蛋白的基因；
②PCR扩增MS2蛋白的基因，引物序列为F:
5'-tagcgtcgacagccagaactatccgattgtgcaggcctctaattttactcaatt-3'(SEQ IDNO.17),
R:5'-tagctccggactagtatatgccgctgttggcgg-3'(SEQ ID NO.18)；
③限制性内切酶SalI和AccIII分别酶切②中PCR产物(插入片段)和载体质粒pMDlg/pRRE-int-MCS(SEQ ID NO.12)；
④用T4连接酶连接载体和插入片段后转化，抽提质粒。
⑤用引物5'-tttggaaaggaccagcaaagctc-3'(SEQ ID NO.19)和引物5'-cctgtaccgtcagcgtcattga-3'(SEQ ID NO.20)进行一代测序验证，结果与设计的质粒序列一致时进行后续步骤。
MS2衣壳蛋白同时置于GagPol长链蛋白的N-和C-端(SEQ ID NO.7)的质粒制备方案如下：
①以表达含RNA结合蛋白的慢病毒GagPol长链蛋白的质粒(序列号为SEQ IDNO.5，N-端)为载体和PCR模板；
②PCR扩增MS2蛋白的基因，引物序列为F1:5'-agccagaactatccgattgtgcaggcctctaattttactcaatttgt-3'(SEQ ID NO.21),R1:5'-ctagtctagatgcatgctcgagtcagtatatcccgctgttggc-3'(SEQ ID NO.22)得到PCR产物1，PCR扩增载体上的一段序列，引物序列为F2:5'-tagccacgtggcctccggctacatcgagg-3'(SEQ ID NO.23),R2:5'-acaatcggatagttctggctgtcctcgtcctgcctggagg-3'(SEQ ID NO.24)得到PCR产物2。PCR产物1和PCR产物2以F2和R1为引物做融合PCR得到最终PCR产物；
③限制性内切酶PmlI和XbaI分别酶切②中PCR产物(插入片段)和载体质粒(质粒图谱序列如SEQ ID NO.5所示)；
④用T4连接酶连接载体和插入片段后转化，抽提质粒。
⑤用引物5'-ggcacagtcgaggctgatca-3'(SEQ ID NO.25)进行一代测序验证，结果与设计的质粒序列一致时进行后续步骤。
(4)表达形成RNP所需蛋白质的质粒(如Cas9蛋白)的质粒图谱序列如SEQ ID NO.8所示，制备方案如下：
①从公知质粒PX330里PCR扩增Cas9蛋白的基因，引物序列：F:5'-gtacccgcggacgcgtgccaccatggccccaaagaagaagcg-3'(SEQ ID NO.26),R:5'-atccccgcggccaattttactttttcttttttgcctggc-3'(SEQ ID NO.27)；
②限制性内切酶SacII分别酶切①中的PCR产物(插入片段)和载体质粒pCMV-GFP(SEQ ID NO.13)；
③用T4连接酶连接载体和插入片段后转化，抽提质粒。
④用引物5'-attgacgcaaatgggcggtag-3'(SEQ ID NO.16)和5'-cattataagctgcaataaac-3'(SEQ ID NO.28)进行一代测序验证，测序选项选择测通，结果与设计的质粒序列一致时进行后续步骤。
(5)表达含RNA结合蛋白所识别的RNA茎环结构的外源目的RNA的质粒是通过将MS2衣壳蛋白所识别的RNA序列与目的RNA序列融合而得到。
其中，MS2衣壳蛋白所识别的RNA序列如SEQ ID NO.9，该序列可以以单次或者多次重复的方式与外源目的RNA连接。
acatgaggatcacccatgt SEQ ID NO.9。
表达含MS2衣壳蛋白所识别的RNA茎环结构的外源gRNA(适用于spCas9)的质粒是由基因合成所得，合成的质粒图谱序列如SEQ ID NO.10所示，用引物5'-ggatgtgctgcaaggcgattaag-3'(SEQ ID NO.29)进行一代测序验证，结果与设计的质粒序列一致时进行后续步骤。
构建带有靶向特定基因的gRNA序列的质粒步骤如下：①设计并合成gRNA oligo,正向oligo为5'-cacc+gRNA序列-3'，若gRNA第一个碱基不是g时要补加；反向oligo为5'-aaac+gRNA反向互补序列-3'；
②正反向的gRNA oligo退火作为插入片段；
③用限制性内切酶BsmBI酶切载体(SEQ ID NO.10)；
④用T4连接酶连接载体和插入片段后转化，抽提质粒。
⑤用引物5'-gagggcctatttcccatgatt-3'(SEQ ID NO.30)进行一代测序验证，结果与设计的质粒序列一致时进行后续步骤。
上述质粒制备时的连接体系的转化和抽提质粒步骤如下：
连接体系经过感受态XL1-Blue转化、挑取单克隆和摇菌，最后用质粒抽提试剂盒抽提质粒。
步骤2：收集含病毒颗粒的上清，通过高速离心或者HPLC等方法进行浓缩，得到高滴度的含目的RNP的慢病毒颗粒。
图1显示慢病毒载体递送RNP(Cas9-gRNA)的包装策略。本发明可以递送RNP(Cas9-gRNA)用于实现人或动物细胞的基因编辑。
实施例2、利用慢病毒载体递送RNP(Cas9-gRNA)
具体步骤同实施例1，外源目的RNP选用SpCas9和gRNA的复合体。SpCas9为一种核酸剪切酶蛋白，外源的RNA选用靶向人类基因组AAVS1位点的gRNA，序列为5'-ggggccactagggacaggat-3'(SEQ ID NO.31)；本实施例具体为慢病毒载体递送RNP(Cas9-gRNA)至293T细胞。
由图2可知，293T细胞感染携带RNP(Cas9-gRNA)的慢病毒颗粒72小时后，PCR扩增AAVS1位点(引物F:5'-ttcgggtcacctctcactcc-3'(SEQ ID NO.32)，引物R:5'-ggctccatcgtaagcaaacc-3'(SEQ ID NO.33))并用引物F测序。TIDE分析基因敲除效率高达83.1％。
实施例3、利用慢病毒载体递送RNP(Cas9-gRNA)对不同动物细胞进行基因编辑
具体步骤同实施例1，外源目的RNP选用SpCas9和gRNA的复合体。SpCas9为一种核酸剪切酶蛋白，外源的RNA分别选用靶向小鼠基因组vegfa位点的gRNA，靶向绿猴基因组vegfa位点的gRNA和靶向人类基因组AAVS1位点的gRNA。靶向小鼠和绿猴基因的vegfa位点的gRNA序列均为5'-ctcctggaagatgtccacca-3'(SEQ ID NO.34)。
由图3可知，鼠源NIH3T3细胞,绿猴源Cos7细胞以及人源293T细胞感染携带RNP(Cas9-gRNA)的慢病毒颗粒72小时后，PCR扩增vegfa或AAVS1位点并测序。其中PCR扩增NIH3T3细胞vegfa位点的引物F:5'-gatgagtggctgttggcctg-3'(SEQ ID NO.35)，引物R:5'-atcgtggagagcttcggcag-3'(SEQ ID NO.36)，用引物R测序；PCR扩增Cos7细胞vegfa位点的引物F:5'-tgtaggaaactggagactagc-3'(SEQ ID NO.37)，引物R:5'-gaccacctgttcccaaagtg-3'(SEQ ID NO.38)，用引物R测序；AAVS1位点同实施例2。
TIDE分析基因敲除平均效率接近或大于80％。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 递送外源RNP的慢病毒载体及其制备方法
<130> KAG41448
<160> 38
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5824
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggatcccctg agggggcccc catgggctag aggatccggc ctcggcctct gcataaataa 60
aaaaaattag tcagccatga gcttggccca ttgcatacgt tgtatccata tcataatatg 120
tacatttata ttggctcatg tccaacatta ccgccatgtt gacattgatt attgactagt 180
tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt 240
acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg 300
tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg 360
gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt 420
acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg 480
accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg 540
gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 600
ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac 660
tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg 720
tgggaggtct atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat 780
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<400> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ttcgggtcac ctctcactcc 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ggctccatcg taagcaaacc 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ctcctggaag atgtccacca 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gatgagtggc tgttggcctg 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
atcgtggaga gcttcggcag 20
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tgtaggaaac tggagactag c 21
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gaccacctgt tcccaaagtg 20

Claims (4)

1.一种递送外源RNP的慢病毒载体，所述慢病毒载体是通过将含有慢病毒载体基因组序列的质粒转染入病毒生产细胞，制备而得；其特征在于，所述慢病毒载体基因组序列分别位于表达膜蛋白的质粒、表达含RNA结合蛋白的慢病毒GagPol长链蛋白的质粒、表达慢病毒GagPol长链蛋白的质粒、表达形成RNP所需蛋白质的质粒和表达含RNA结合蛋白所识别的RNA茎环结构的外源目的RNA的质粒上；
所述表达膜蛋白的质粒包括表达VSV-G膜蛋白的质粒；
所述表达含RNA结合蛋白的慢病毒GagPol长链蛋白的质粒是将RNA结合蛋白整合至第三代慢病毒GagPol长链蛋白的N-端；所述表达含RNA结合蛋白的慢病毒GagPol长链蛋白的质粒序列为 SEQ ID NO.5所示；
所述表达慢病毒GagPol长链蛋白的质粒序列为 SEQ ID NO.2所示；
所述表达形成RNP所需蛋白质的质粒为表达含外源蛋白质SpCas9的质粒，其质粒序列为 SEQ ID NO.8所示；
所述表达含RNA结合蛋白所识别的RNA茎环结构的外源目的RNA的质粒是通过将RNA结合蛋白所识别的RNA序列与目的RNA序列融合而得到；所述质粒序列为 SEQ ID NO.10所示。
2.根据权利要求1所述的递送外源RNP的慢病毒载体，其特征在于，所述病毒生产细胞包括293T、293FT、HEK293。
3.一种根据权利要求1所述的递送外源RNP的慢病毒载体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、将表达膜蛋白的质粒、表达含RNA结合蛋白的慢病毒GagPol长链蛋白的质粒、表达慢病毒GagPol长链蛋白的质粒、表达形成RNP所需蛋白质的质粒和表达含RNA结合蛋白所识别的RNA茎环结构的外源目的RNA的质粒共转染病毒生产细胞；
S2、收集含病毒颗粒的上清，通过高速离心或者HPLC进行浓缩，得到含目的RNP的慢病毒颗粒。
4.一种根据权利要求1所述的递送外源RNP的慢病毒载体在制备递送Cas9或Cas9衍生物与gRNA形成的RNP用于实现基因编辑或者碱基编辑的产品中的用途。
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