CN104946686A - 用于表达猪流行性腹泻蛋白中m蛋白、n蛋白和s1蛋白的重组质粒及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于表达猪流行性腹泻蛋白中M蛋白、N蛋白和S1蛋白的重组质粒，所述重组质粒携带有：载体质粒；猪流行性腹泻病毒中的M蛋白编码基因、N蛋白编码基因、S1蛋白编码基因；及连接肽，所述M蛋白编码基因和N蛋白编码基因通过连接肽连接，所述N蛋白编码基因和S1蛋白编码基因通过连接肽连接；所述连接肽为2A肽。本发明还提供该重组质粒的构建方法和应用。本发明的重组质粒，具有诱导产生针对PEDV特异性抗体的能力强、表达能力强、应用广泛等优点。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种用于表达猪流行性腹泻蛋白中M蛋白、N蛋白和S1蛋白的重组质粒及其构建方法和应用。
背景技术
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)首次报道于英国，随后比利时，德国，加拿大，日本，瑞士等多个国家相继报道，我国于1976年发现此病并陆续报道。猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的，以猪呕吐，严重腹泻脱水为主要临床症状特征的高度接触性传染病。不同年龄和不同品种的猪均易感，哺乳仔猪、断奶仔猪和育肥猪发病率可达100％，死亡率高达95％以上。近年来，PED的流行区域有逐渐扩大的趋势，危害比较严重，给养猪业带来巨大经济损失，已成为中国甚至世界最常见的猪腹泻传染病之一。
PEDV属于尼多病毒目冠状病毒科冠状病毒属，其基因组为不分节段的单股正链RNA，基因组全长约28033bp，编码的结构蛋白主要有纤突(spike)蛋白(即S蛋白)，囊膜(Membrane)蛋白(即M蛋白)，核衣壳(nucleocapsid)蛋白(即N蛋白)。PEDV S蛋白可以被划分为2个功能区即S1(第1-789位氨基酸)和S2(第790-1383位氨基酸)，其中S1区包含了病毒主要的中和表位和受体结合域。
2A肽是近年使用较多的一种构建多基因载体的工具，与其它多基因构建策略相比，2A肽片段小，能自动切割连接的上下游蛋白，并且规避了多基因表达时蛋白活性不高或下游基因表达量低等缺点，具备明显的优势，是目前较为理想的多基因表达策略。2A肽最初于1991年被Ryan及其同事在口蹄疫病毒(FMDV)中鉴定得到，可以自裂解为小片段肽，属于小RNA病毒属小核糖核酸病毒。2A肽平均长度为18-22氨基酸(AA)。2A代表小RNA病毒多蛋白中的一段特定区域，源于研究者所参用的学术命名系统。2A肽可以在自己的C-端自动裂解，N-端被3C/3CD蛋白酶裂解或从上游壳蛋白1D处起修整的一小段肽。2A肽在多基因共表达中应用广泛，通过2A肽连接从海洋细菌中获取的胡萝卜素4，4'-氧合酶以及3，3'-羟化酶，可赋予本不能合成酮类胡萝卜素的高等植物(如西红柿和烟草等)生产虾青素以及斑蝥素的能力。在转基因动物领域，4个复杂的CD3蛋白(CD3ε，γ，δ，ζ)基因通过2A肽连接构建逆转录病毒载体后转染CD3缺陷型小鼠骨髓细胞，可活化T细胞，刺激其功能发挥。2A肽连接两个荧光报告基因转染小鼠受精卵，可实现小鼠胚胎期、成年后稳定表达两种荧光蛋白并将该基因稳定遗传给后代。
核酸疫苗是把外源基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒DNA直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，引发免疫反应。核酸疫苗与其他疫苗相比，具有无可比拟的优点：如生产成本低，易于构建适于大批量生产，可以根据需要随时进行更新，化学性质稳定，保存和运输方便，不存在减毒疫苗毒力回升的危险；选择抗原决定簇的自由空间比较大，可以同时构建编码不同蛋白质的重组质粒同时预防多种疾病，为制备联合疫苗方面提供了广阔空间。
发明内容
本发明的目的在于提供一种诱导产生针对PEDV特异性抗体的能力强、表达能力强的用于表达猪流行性腹泻蛋白中M蛋白、N蛋白和S1蛋白的重组质粒及其构建方法和应用。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种用于表达猪流行性腹泻蛋白中M蛋白、N蛋白和S1蛋白的重组质粒，所述重组质粒携带有：
载体质粒；
猪流行性腹泻病毒中的M蛋白编码基因、N蛋白编码基因、S1蛋白编码基因；及
连接肽，所述M蛋白编码基因和N蛋白编码基因通过连接肽连接，所述N蛋白编码基因和S1蛋白编码基因通过连接肽连接。
本发明中，优选的方案为所述猪流行性腹泻病毒为猪流行性腹泻病毒CV777株，GeneBank公布的编号为AF353511。
本发明中，优选的方案为所述载体质粒为PVAX1载体质粒，所述连接肽为2A肽。
本发明中，优选的方案为该重组质粒为PVAX1-M-2A-N-2A-S1，其中PVAX1为载体质粒，2A为连接M和N、N和S1的连接肽2A，M、N和S1分别为猪流行性腹泻病毒中表达M蛋白编码基因、N蛋白编码基因和S1蛋白编码基因。
本发明中，优选的方案为所述重组质粒中的M-2A段之间包含一个Furin蛋白酶酶切位点，所述重组质粒中的N-2A段之间包含一个Furin蛋白酶酶切位点。
本发明还提供该用于表达猪流行性腹泻蛋白中M蛋白、N蛋白和S1蛋白的 重组质粒的构建方法，包括如下步骤：
a、制备含猪流行性腹泻病毒中的M蛋白编码基因、N蛋白编码基因序列的质粒；
b、制备含猪流行性腹泻病毒中的S1蛋白编码基因序列的质粒；
c、将a步骤得到的含猪流行性腹泻病毒中的M蛋白编码基因、N蛋白编码基因序列的质粒和步骤b得到的含猪流行性腹泻病毒中的S1蛋白编码基因序列的质粒双酶切，然后进行连接反应，得到产品。
发明中，优选的方案为：
所述a步骤中的含猪流行性腹泻病毒中的M蛋白编码基因、N蛋白编码基因序列的质粒为含M-2A-N-2A基因序列的质粒，所述含M-2A-N-2A基因序列的质粒的制备方法包括如下步骤：合成BamHI-M-2A-N-2A-NotI基因序列，然后将得到的BamHI-M-2A-N-2A-NotI基因序列与载体质粒连接，得到含M-2A-N-2A基因序列的质粒；
所述b步骤包括如下步骤：以S1蛋白编码基因序列为模板进行PCR扩增，得到NotI-S1-XhoI序列，将NotI-S1-XhoI序列与载体质粒连接，得到含S1蛋白编码基因序列的质粒。
本发明中，进一步优选的方案为所述a步骤中含M-2A-N-2A基因序列的质粒为PVAX1-M-2A-N-2A质粒，制备PVAX1-M-2A-N-2A质粒的方法包括如下步骤：
合成BamHI-M-2A-N-2A-NotI基因序列：在M蛋白编码基因前加入BamHI酶切位点和KOZAK序列，在N蛋白编码基因前加入KOZAK序列，利用2A肽将M蛋白编码基因和N蛋白编码基因连接起来，然后在N蛋白编码基因的尾 端连接上2A肽，然后在得到的片段后加入NotI酶切位点，去除M蛋白编码基因和N蛋白编码基因序列的终止密码子，得到BamHI-M-2A-N-2A-NotI基因序列；
将得到的BamHI-M-2A-N-2A-NotI基因序列与puc57载体质粒连接，得到puc57-M-2A-N-2A质粒；
将得到含M-2A-N-2A基因序列的质粒、PVAX1载体质粒双酶切，进行连接反应，得到PVAX1-M-2A-N-2A质粒。
本发明中，进一步优选的方案为在M-2A段之间加入一个Furin蛋白酶酶切位点，在N-2A段之间加入一个Furin蛋白酶酶切位点。
本发明中，进一步优选的方案为所述b步骤中含S1蛋白编码基因序列的质粒为pMD18-T-S1质粒，制备pMD18-T-S1质粒的方法包括如下步骤：
以S1基因的核酸序列为模板，以上下游引物进行PCR扩增，其中：
上游引物：ATAAGAATGCGGCCGCATGAGGTCTTTAATTTAC(NotI)；
下游引物：CCGCTCGAGAATACTCATACTAAAGTT(XhoI)；
其中GCGGCCGC为NotI酶切位点，CTCGAG为XhoI酶切位点；
将扩增得到的S1基因序列与pMD18-T-Simple载体质粒连接，得到pMD18-T-S1质粒。
本发明的用于表达猪流行性腹泻蛋白中M蛋白、N蛋白和S1蛋白的重组质粒，可用于制备猪流行性腹泻核酸疫苗。如，将本发明的重组质粒转染293T细胞，该重组质粒便会在293T细胞中表达M蛋白、N蛋白和S1蛋白。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明选取表达基因为完整的M蛋白编码基因，N蛋白编码基因，S1 蛋白编码基因，完整的包含了线性抗原表位和中和表位，因此诱导产生针对PEDV特异性抗体的能力强；
2、本发明选取2A肽作为连接表达蛋白的连接肽(Linker)，2A肽序列短，具有高裂解活性，能够实现编码基因与连接肽直接达到良好的连接；
3、M-2A段之间、N-2A段之间包含一个Furin蛋白酶裂解位点(-RAKR)，可以保证蛋白在没有残留氨基酸的情况下表达，保证了蛋白的活性和空间结构的正确；
4、本发明选取PVAX1作为表达载体，它能使重组蛋白在哺乳动物细胞中高效的表达。
下面结合附图及具体实施方式对本发明进行详细说明。
附图说明
图1是实施例1的用于表达猪流行性腹泻蛋白中M蛋白、N蛋白和S1蛋白的重组质粒的构建示意图；
图2是实施例1的用于表达猪流行性腹泻蛋白中M蛋白、N蛋白和S1蛋白的重组质粒双酶切结果的电泳图；
图3是实施例1的用于表达猪流行性腹泻蛋白中M蛋白、N蛋白和S1蛋白的重组质粒的PCR扩增基因的电泳图；
图4是实施例1的间接免疫荧光法测定PVAX1-M-2A-N-2A-S1质粒转染293T细胞后N蛋白的表达图，其中一抗采用N蛋白单克隆抗体，二抗采用绿色荧光二抗；
其中，图2中，M、10KB核酸Marker；1、PVAX1-M-2A-N-2A-S1质粒； 2、利用NotI/XhoI对PVAX1-M-2A-N-2A-S1质粒进行双酶切后的质粒；
图3中，M、5KB核酸Marker；1、PVAX1-M-2A-N-2A-S1质粒中扩增的M蛋白编码基因；2、PVAX1-M-2A-N-2A-S1质粒中扩增的N蛋白编码基因；3、PVAX1-M-2A-N-2A-S1质粒中扩增的S1蛋白编码基因。
具体实施方式
实施例1
一种用于表达猪流行性腹泻蛋白中M蛋白、N蛋白和S1蛋白的重组质粒，所述重组质粒携带有：载体质粒；猪流行性腹泻病毒中的M蛋白编码基因、N蛋白编码基因、S1蛋白编码基因；及连接肽，所述M蛋白编码基因和N蛋白编码基因通过连接肽连接，所述N蛋白编码基因和S1蛋白编码基因通过连接肽连接；所述连接肽为2A肽；该重组质粒为PVAX1-M-2A-N-2A-S1，其中PVAX1为载体质粒，2A为连接M和N、N和S1的连接肽2A，M、N和S1分别为猪流行性腹泻病毒中表达M蛋白编码基因、N蛋白编码基因和S1蛋白编码基因；所述猪流行性腹泻病毒为猪流行性腹泻病毒CV777株，GeneBank公布的编号为AF353511。
构建本实施例的用于表达猪流行性腹泻蛋白中M蛋白、N蛋白和S1蛋白的重组质粒，所采用的实验试剂和设备如下：
实验试剂：载体:PVAX1(2999bp)(购自invitrogen，life technologies)，转染试剂lipofectamine LTX PLUS Reagent(购自invitrogen，life technologies)，N蛋白单克隆抗体由上海兽医研究所猪病实验室赠送，二抗Goat anti mouse Alexa488(购自invitrogen,life technologies)。
实验设备：PCR仪(BioRad，美国)、移液器(eppendorf，德国)超净工作台(上海苏净安泰)、实验室冷冻冷藏冰箱(海尔)、电热恒温培养箱(上海一恒)、恒温摇床(上海一恒)、电热恒温水浴锅(上海一恒)、电泳仪(Biorad，美国)、数码凝胶成像系统(天能科学仪器)、其他试剂等均购于上海化学试剂有限公司)。
本实施例中选取真核载体PVAX1用于构建cDNA表达载体，目的cDNA插入到多克隆位点(MCS)中。本实施例中选取的M，N，S1蛋白编码基因均参考PEDV经典毒株CV777的序列，GeneBank所公布的编号为：AF353511；其中M蛋白编码基因全长681bp，插入目的基因的mRNA片段序列为全部ORF区域，位于25682bp-26362bp；N蛋白编码基因全长681bp，插入目的基因的mRNA片段序列为其全部ORF区域，位于26374bp-27699bp；PEDV-S基因长4152bp，位于20638bp-24789bp，插入目的基因S1蛋白编码基因(该基因的具体序相见序列表中的序列SEQ ID NO：1)包含了病毒主要的中和表位和受体结合域，位于20638bp-23004bp位置，长2367bp。。
本实施例的用于表达猪流行性腹泻蛋白中M蛋白、N蛋白和S1蛋白的重组质粒的构建方法，包括如下步骤：
a、制备含M-2A-N-2A基因序列的质粒：合成BamHI-M-2A-N-2A-NotI基因序列(该基因的序列见序列表中的序列SEQ ID NO：2)，然后将得到的Ba mHI-M-2A-N-2A-NotI基因序列与PVAX1载体质粒连接，得到含M-2A-N-2A基因序列的PVAX1质粒；
b、制备含S1蛋白编码基因序列的质粒：以S1蛋白编码基因序列为模板进行PCR扩增，得到NotI-S1-XhoI序列，将NotI-S1-XhoI序列与载体质粒连接， 得到含S1蛋白编码基因序列的质粒；
所述b步骤中含S1蛋白编码基因序列的质粒为pMD18-T-S1质粒，其构建方法包括如下步骤：
以S1基因的核酸序列为模板，以上下游引物进行PCR扩增，其中：
上游引物(该引物的序列见序列表中的序列SEQ ID NO：3)：ATAAGAATGCGGCCGCATGAGGTCTTTAATTTAC(NotI)；
下游引物(该引物的序列见序列表中的序列SEQ ID NO：4)：CCGCTCGAGAATACTCATACTAAAGTT(XhoI)；
其中GCGGCCGC为NotI酶切位点，CTCGAG为XhoI酶切位点；选择LA Taq，扩增条件为：起始变性95℃，5min，然后执行如下反应条件：95℃，1min，54.4℃，3min；72℃，1min；30个循环，最后72℃延伸10min；得到的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，扩增出2367bp特异性的S1片段，回收并纯化；
将扩增得到的S1基因序列(即NotI-S1-XhoI序列)与pMD18-T-Simple载体质粒连接，得到pMD18-T-S1质粒；
c、将a步骤得到的PVAX1-M-2A-N-2A质粒、pMD18-T-S1质粒分别用NotI和XhoI双酶切，两者在T4DNA连接酶的作用下发生连接反应，得到产品。连接产物转化DH5α，涂布于含有卡那青霉素抗性的琼脂糖培养基上培养过夜，小提质粒，进行PCR鉴定(测试结果详见图3)和NotI/XhoI双酶切鉴定(测试结果详见图2)，得到阳性克隆，并送测序，证实PVAX1-M-2A-N-2A-S1质粒构建成功(具体的PCR和酶切鉴定图详见图2、图3)。
将得到的PVAX1-M-2A-N-2A-S1质粒转染293T细胞，具体操作如下：
使用去内毒素的试剂盒提取质粒PVAX1-M-2A-N-2A-S1,并使用紫外分光光 度计测得核酸浓度。
培养293T细胞，转染前一天进行细胞传代并铺24孔板(50％-80％的细胞汇集度)，每孔中含有500μl完全生长培养基，细胞培养过夜，在细胞密度达到70％-90％可进行转染；转染复合物中的实际配比详见表1：
表1：转染复合物组分配比数据表
轻柔混合均匀后，在常温下孵育15-30min，得到转染复合物；
将细胞培养板中的完全培养液弃去，用PBS冲洗干净后，以逐滴加入的方式，在每孔中加入100μl转染复合物。轻柔晃动24孔板，将转染复合物和细胞培养物混合，细胞继续培养24-72h后，进行检测。
使用间接免疫荧光的方法鉴定真核蛋白表达：使用上海兽医研究所赠送的N蛋白单克隆抗体进行间接免疫荧光检测，具体操作如下：
固定细胞培养板：用PBS洗1次，弃去PBS；加入4％的多聚甲醛，室温下静止10min；用PBS洗两次，后弃去PBS。用0.2％的TritonX-100透化固定后的细胞，2min，室温。PBS洗4次。
间接免疫荧光检测：1、每孔加入稀释好的抗PEDV N蛋白单抗100μl，轻柔晃动24孔板，使单抗和细胞混合，将24孔板放入湿盒中，37℃，孵育1h；2、单抗弃去，PBS，洗涤5遍；3、加入二抗，同步骤1；4、洗涤，同步骤2；5、荧光显微镜下观察，具体结果参见图4。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (10)
1.用于表达猪流行性腹泻蛋白中M蛋白、N蛋白和S1蛋白的重组质粒，其特征在于所述重组质粒携带有：
载体质粒；
猪流行性腹泻病毒中的M蛋白编码基因、N蛋白编码基因、S1蛋白编码基因；及
连接肽，所述M蛋白编码基因和N蛋白编码基因通过连接肽连接，所述N蛋白编码基因和S1蛋白编码基因通过连接肽连接。
2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于：所述猪流行性腹泻病毒为猪流行性腹泻病毒CV777株，GeneBank公布的编号为AF353511。
3.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于：所述载体质粒为PVAX1载体质粒，所述连接肽为2A肽。
4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于：该重组质粒为PVAX1-M-2A-N-2A-S1，其中PVAX1为载体质粒，2A为连接M和N、N和S1的连接肽2A，M、N和S1分别为猪流行性腹泻病毒中表达M蛋白编码基因、N蛋白编码基因和S1蛋白编码基因。
5.根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于：所述重组质粒中的M-2A段之间包含一个Furin蛋白酶酶切位点，所述重组质粒中的N-2A段之间包含一个Furin蛋白酶酶切位点。
6.如权利要求1所述的用于表达猪流行性腹泻蛋白中M蛋白、N蛋白和S1蛋白的重组质粒的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
a、制备含猪流行性腹泻病毒中的M蛋白编码基因、N蛋白编码基因序列的质粒；
b、制备含猪流行性腹泻病毒中的S1蛋白编码基因序列的质粒；
c、将a步骤得到的含猪流行性腹泻病毒中的M蛋白编码基因、N蛋白编码基因序列的质粒和步骤b得到的含猪流行性腹泻病毒中的S1蛋白编码基因序列的质粒双酶切，然后进行连接反应，得到产品。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于：
所述a步骤中的含猪流行性腹泻病毒中的M蛋白编码基因、N蛋白编码基因序列的质粒为含M-2A-N-2A基因序列的质粒，所述含M-2A-N-2A基因序列的质粒的制备方法包括如下步骤：合成BamHI-M-2A-N-2A-NotI基因序列，然后将得到的BamHI-M-2A-N-2A-NotI基因序列与载体质粒连接，得到含M-2A-N-2A基因序列的质粒；
所述b步骤具体为：以S1蛋白编码基因序列为模板进行PCR扩增，得到NotI-S1-XhoI序列，将NotI-S1-XhoI序列与载体质粒连接，得到含S1蛋白编码基因序列的质粒。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于：
所述a步骤中含M-2A-N-2A基因序列的质粒为PVAX1-M-2A-N-2A质粒，制备PVAX1-M-2A-N-2A质粒的方法包括如下步骤：
合成BamHI-M-2A-N-2A-NotI基因序列：在M蛋白编码基因前加入BamHI酶切位点和KOZAK序列，在N蛋白编码基因前加入KOZAK序列，利用2A肽将M蛋白编码基因和N蛋白编码基因连接起来，然后在N蛋白编码基因的尾端连接上2A肽，然后在得到的片段后加入NotI酶切位点，去除M蛋白编码基因和N蛋白编码基因序列的终止密码子，得到BamHI-M-2A-N-2A-NotI基因序列；
将得到的BamHI-M-2A-N-2A-NotI基因序列与puc57载体质粒连接，得到puc57-M-2A-N-2A质粒；
将得到含M-2A-N-2A基因序列的质粒、PVAX1载体质粒双酶切，进行连接反应，得到PVAX1-M-2A-N-2A质粒。
9.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于：
所述b步骤中含S1蛋白编码基因序列的质粒为pMD18-T-S1质粒，制备pMD18-T-S1质粒的方法包括如下步骤：
以S1基因的核酸序列为模板，以上下游引物进行PCR扩增，其中：
上游引物：ATAAGAATGCGGCCGCATGAGGTCTTTAATTTAC；
下游引物：CCGCTCGAGAATACTCATACTAAAGTT；
其中GCGGCCGC为NotI酶切位点，CTCGAG为XhoI酶切位点；
将扩增得到的S1基因序列与pMD18-T-Simple载体质粒连接，得到pMD18-T-S1质粒。
10.如权利要求1-5任一项所述的用于表达猪流行性腹泻蛋白中M蛋白、N蛋白和S1蛋白的重组质粒在制备猪流行性腹泻核酸疫苗中的应用。
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2015
- 2015-05-29 CN CN201510290759.2A patent/CN104946686A/zh active Pending
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