CN104248762A - 一种猪流行性腹泻疫苗组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种猪流行性腹泻疫苗组合物，该疫苗组合物含有猪流行性腹泻病毒亚单位抗原和载体；本发明还提供了一种猪流行性腹泻疫苗组合物，该疫苗组合物包括猪流行性腹泻病毒亚单位抗原、猪流行性腹泻全病毒灭活抗原和载体。本发明还公开了含该疫苗组合物的制备方法以及其在制备预防和/或治疗猪流行性腹泻的药物中的应用。该疫苗组合物中的S1蛋白可通过基因工程手段对疫苗组合物的组分进行大量重组表达，不仅耗时短，还可便于大规模生产；当该疫苗组合物含S1蛋白及猪流行性腹泻全病毒灭活抗原时，比单独使用全病毒灭活抗原免疫时，免疫效果更优，能够有效预防猪流行性腹泻病毒变异株和普通株导致的疾病。

Description

一种猪流行性腹泻疫苗组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻疫苗组合物及其制备方法和应用。

背景技术

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhoea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起猪腹泻的一种重要急性、接触性、病毒性肠道传染病，以水样腹泻、呕吐、脱水和食欲下降为特征。该病最早于上世纪70年代发生在英国和比利时，1973年先后在我国上海、辽宁、吉林等地分离到PEDV。PEDV可在猪群中持续存在，各种年龄段的猪均易感。哺乳仔猪、架子猪和育肥猪的发病率可达100％，尤以哺乳仔猪严重，病死率达100％。目前，还没有特效药物可抵抗PEDV，由于该病发病急，流行快，猪群一旦感染，就会给养殖户带来巨大的经济损失。

中国于1980年首次分离到PEDV，以后许多地区相继报道有本病发生，并主要在冬春季节散发，造成的危害巨大。从2010年至今，在我国华南、华北部分省份暴发了严重的猪流行性腹泻，已超过100万只的猪死亡(Sun RQ,Cai RJ,Chen YQ,et al.Outbreak of porcine epidemicdiarrhea in suckling piglets,China.Emerging infectious diseases,2012,18(1):161-162)。猪流行性腹泻表现为呕吐、腹泻、脱水，可发生于任何年龄的猪，年龄越小，症状越重，死亡率越高，特别地，7日龄内新生仔猪发生腹泻后3-4天，呈现严重脱水而死亡，死亡率高达50％，最高的死亡率达100％。此外，最新的研究表明还可能通过乳汁进行垂直传播。

目前，对于该病的防控主要采取传统的灭活苗、弱毒苗免疫接种。弱毒苗免疫存在潜在的生物风险，全病毒灭活疫苗病毒滴度低，导致抗原含量不足，有PEDV难以分离培养，即使营养液中加入胰酶促使其在Vero细胞中繁殖传代，但病毒滴度只能维持在1×10^3.01TCID₅₀/mL左右。如采用细胞浓缩的方法使杂蛋白含量增加从而造成副反应。因此，如何解决疫苗免疫效果的问题是猪流行性腹泻本领域急需解决的技术问题。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种猪流行性腹泻疫苗组合物及其应用。该猪流行性腹泻疫苗组合物可有效预防和治疗猪流行性腹泻病毒变异株和猪流行性腹泻病毒普通株导致的疾病。

本发明的主要目的在于提供一种猪流行性腹泻疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括猪流行性腹泻病毒亚单位抗原和载体，所述猪流行性腹泻病毒亚单位抗原包括猪流行性腹泻病毒S蛋白、S1蛋白、M蛋白、N蛋白。

术语“猪流行性腹泻病毒亚单位抗原”是指具有免疫原性的猪流行腹泻病毒蛋白片段，包括但不限于猪流行性腹泻病毒S蛋白、猪流行性腹泻病毒S1蛋白、猪流行性腹泻病毒M蛋白、猪流行性腹泻病毒N蛋白的一种或两种混合物；所述“猪流行性腹泻病毒亚单位抗原”优选为猪流行性腹泻病毒S1蛋白。优选地，所述猪流行性腹泻病毒为猪流行性腹泻病毒变异株。

术语“猪流行性腹泻病毒S蛋白”是猪流行性腹泻病毒中的四个结构蛋白之一，为纤突蛋白(spike蛋白)，位于病毒粒子表面的纤突糖蛋白，在病毒粒子与细胞表面受体结合后通过膜融合侵入宿主细胞和在感染宿主体内介导中和抗体产生的过程中发挥重要生物学作用。该蛋白是由1384个氨基酸组成的多肽，含有27-29个潜在的糖基化位点，划分为2个功能区即S1(第1-789位氨基酸)和S2(第790-1383位氨基酸)。

术语“猪流行性腹泻病毒S1蛋白”位于猪流行性腹泻病毒S蛋白的功能区之一，由789个氨基酸组成(任晓峰，贾文龙.猪流行性腹泻病毒S1蛋白截短表达及多抗制备.东北农业大学学报,2013,44(9):46-50)。

术语“猪流行性腹泻病毒M蛋白”是猪流行性腹泻病毒中的四个结构蛋白之一，为膜蛋白(Membrane蛋白)，是PEDV中含量最多的包膜蛋白，由226个氨基酸编码而成，有三方面的生物学作用：参与病毒粒子的组装和出芽、刺激机体产生α-干扰素(α-IFN)、其产生的抗体在不提存在时具有中和病毒的能力。

术语“猪流行性腹泻病毒N蛋白”是猪流行性腹泻病毒中的四个结构蛋白之一，为核衣壳蛋白(Nucleocapsid蛋白)，由1326个核苷酸组成，编码441个氨基酸，是PEDV在感染细胞中产生最多的病毒蛋白，结构十分保守。

术语“猪流行性腹泻病毒变异株”是又称高致病性猪流行性腹泻病毒，包括但不限于其S1蛋白具有与SEQ ID No.1基本相同的核苷酸序列的PEDV。优选地，猪流行性腹泻病毒变异株其S1蛋白具有与SEQ ID No.1基本相同的核苷酸序列的PEDV。与SEQ ID No.1基本相同是指，PEDV的核苷酸序列优选包含与SEQ ID No.1有85％-100％相同的序列，优选在猪流行性腹泻病毒变异株并非本文所述PEDV的条件下，例如与作为参考病毒分离物的CH/YNKM/2012相比，S1的核苷酸同源性低于91％，优选低于92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。猪流行性腹泻病毒变异株核苷酸序列优选有超过80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％，与SEQ ID No.1相同，同样优选在猪流行性腹泻病毒变异株并非本文所述PEDV的条件下，例如与作为参考病毒分离物的CH/YNKM/2012相比，S1的核苷酸同源性低于91％，优选低于92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

术语“同源性”是指两条氨基酸序列或两条核苷酸序列的相似程度。氨基酸序列或核苷酸序列的同源性可以通过本领域公知的任何适当的方法计算得到，例如，可以将目标氨基酸(或核苷酸)序列与参比氨基酸(或核苷酸)序列进行序列比对，必要时可以引入空缺，使得两条比对的序列间相同的氨基酸(或核苷酸)数目达到最优化，并在此基础上计算两条氨基酸(或核苷酸)序列之间相同氨基酸(或核苷酸)的百分比。氨基酸(或核苷酸)序列的比对和同源性的计算可以通过本领域公知的软件实现，例如，但不限于，BLAST软件(在美国国立生物技术信息中心NCBI的网址上可获得：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，或者见，例如，Altschul S.F.et al，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990)；Stephen F.et al，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402(1997))，ClustalW2软件(在欧洲生物信息研究所网址上可获得：http://www.eji.ac.uk/Toolsa/clustalw2/，另见，例如，Higgins D.G.et al，Methods in Enzymology，266：383-402(1996)；Larkin M.A.et al，Bioinformatics(Oxford，England)，23(21)：2947-8(2007))；和TCoffee软件等(在瑞典生物信息学研究所的网站上可以获得：http://tcoffee.vital-it.ch/cgi-bin/Tcoffee/tcoffee_cgi/index.cgi，另见，例如，Poirot O.et al，Nucleic Acids Res.，31(13)：3503-6(2003)；Notredame C.etal，J.Mol.Boil.，302(1)：205-17(2000))。使用软件进行序列比对时，可以使用软件提供的默认参数，或者也可以根据实际情况对软件提供的参数进行调整，这些都在本领域技术人员的知识范围内。

优选地，所述猪流行性腹泻病毒S1蛋白核苷酸序列编码SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8或SEQ ID No.10氨基酸序列；进一步优选地，所述猪流行性腹泻病毒S1蛋白核苷酸序列编码SEQID No.2氨基酸序列。

作为本发明的一种实施方式，所述猪流行性腹泻病毒S1蛋白为SEQID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8或SEQ ID No.10编码的至少一种蛋白；优选地，所述猪流行性腹泻病毒S1蛋白为SEQ IDNo.2编码的蛋白。

作为本发明的一种实施方式，优选地，所述猪流行性腹泻病毒S1蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.7或SEQ ID No.9，优选为SEQ ID No.1。

优选地，所述猪流行性腹泻病毒S1蛋白的含量为0.5-20μg/mL。

作为本发明的一种优选实施方式，所述疫苗组合物由猪流行性腹泻病毒S1蛋白和兽医学上可接受的佐剂组成。

本发明的另一目的在于提供一种猪流行性腹泻疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括所述猪流行性腹泻病毒亚单位抗原、猪流行性腹泻全病毒灭活抗原和载体。

优选地，所述猪流行性腹泻病毒亚单位抗原为猪流行性腹泻病毒S1蛋白，其核苷酸序列编码SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8或SEQ ID No.10氨基酸序列；所述猪流行性腹泻全病毒灭活抗原为灭活的猪流行性腹泻病毒HN1301株。

猪流行性腹泻病毒HN1301株(Porcine epidemic diarrhea virus,strainHN1301)的保藏号为CCTCC NO.V201341，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏日期为2013年9月16日。

优选地，所述猪流行性腹泻病毒S1蛋白的含量为0.5-20μg/mL；所述猪流行性腹泻全病毒灭活抗原的含量为灭活前1×10^4.0-1×10^7.0TCID₅₀/mL。

优选地，所述载体包括佐剂，所述佐剂包括铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Blockco-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种；优选地，所述佐剂为铝胶佐剂。

优选地，所述疫苗组合物还包括其他抗原，所述其他抗原包括猪传染性胃肠炎病毒抗原、猪轮状病毒抗原、猪圆环病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪细小病毒抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗原、大肠杆菌抗原、猪萎缩性鼻炎抗原、猪伪狂犬病病毒抗原、猪霍乱病原抗原、猪流感病毒抗原中的一种或多种；优选地，所述其他抗原为猪传染性胃肠炎病毒抗原。

术语“猪流行性腹泻全病毒灭活抗原”是指在动物细胞上培养猪流行性腹泻病毒，然后经过灭活剂灭活所制备的抗原。优选地，所述动物细胞是Vero细胞。

优选地，所述“猪流行性腹泻全病毒灭活抗原”为猪流行性腹泻病毒变异株的灭活抗原。

作为本发明的一种优选实施方式，所述疫苗组合物由猪流行性腹泻病毒S1蛋白、猪流行性腹泻全病毒灭活抗原和兽医学上可接受的佐剂组成。

术语“佐剂”可包括铝胶佐剂；皂苷(saponin)，如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Incorporation,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals Incorporation，Birmingham AL)；油包水乳剂；水包油乳剂；水包油包水乳剂；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物选出的化合物。

术语“乳剂”可尤其基于轻液体石蜡油(European Pharmacopea类型)；因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(isoprenoid oil)，如角鲨烷(squalane)或角鲨烯油(squalene oil)，尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇(mannide)的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，特别是L121。参见Hunter等编写的《The theory and practical application ofadjuvants》(Ed.by DES Stewart-Tull,John Wiley and Sons,New York,1995:51-94)和Todd等编写的《Vaccine》(1997,15:564-570)。例如，可使用Powell M和Newman M编写的《Vaccine design,the Subunitand adiuvant approach》(Plenum Press,1995)第147页描述的SPT乳剂及第183页描述的MF59乳剂。

术语“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联，这些化合物已知被称为卡波姆(Carbomer，商品名Carbopol)(Phameuropa,1996,8(2))。本领域技术人员还可参见美国专利US2909462，其描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基(aliphaticradical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团(ethylenically unsaturatedgroup)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出售，(BF Goodrich,Ohio,USA)特别合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allyl pentaerythritol)交联。这其中可提及卡波普974P、934P和971P，最优选使用卡波普971P。

术语“顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物”也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA(Monsanto)，这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理pH，以便产生佐剂溶液，能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。

术语“佐剂”还包括，但不限于，RIBI佐剂系统(RibiIncorporation)、Block co-polymer(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A)、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、IMS1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂等。

优选地，所述佐剂为铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种；优选地，所述佐剂为铝胶佐剂。

优选地，所述佐剂在所述疫苗组合物中的体积比为5％-30％，优选为20％。

本发明所用术语“猪流行性腹泻”与“PED”、“猪流行性腹泻病毒”与“PEDV”在本发明中可互换使用。

本发明所用缩略语为：AA，氨基酸；bp，碱基对。

本发明的再一目的在于提供一种制备所述疫苗组合物的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)克隆表达所述亚单位抗原；以及(2)按比例混合所述表达的所述亚单位抗原和佐剂。

优选地，克隆表达所述亚单位抗原为所述S1蛋白，其包括其核苷酸序列为编码SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8或SEQ ID No.10氨基酸序列的序列。

本发明的又一目的在于提供一种制备所述疫苗组合物的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)克隆表达所述亚单位抗原；(2)增殖培养所述猪流行性腹泻病毒，灭活；以及(3)按比例混合所述表达的所述亚单位抗原和灭活的猪流行性腹泻全病毒抗原，加入佐剂。

优选地，克隆表达所述亚单位抗原为所述S1蛋白，其包括其核苷酸序列为编码SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8或SEQ ID No.10氨基酸序列的序列；所述猪流行性腹泻全病毒灭活抗原为灭活的猪流行性腹泻病毒HN1301株。

优选地，所述的克隆表达方法为采用杆状病毒表达系统表达。

本发明的还一目的在于提供所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪流行性腹泻的药物中的应用。

术语“预防和/或治疗”在涉及猪流行性腹泻病毒感染时是指抑制猪流行性腹泻病毒的复制、抑制猪流行性腹泻病毒的传播或防止猪流行性腹泻病毒在其宿主体内定居，以及减轻猪流行性腹泻病毒感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。

优选地，所述猪流行性腹泻包括由猪流行性腹泻病毒变异株和猪流行性腹泻病毒普通株导致的猪流行性腹泻。

本发明所用术语“猪”是指任何属于猪科(Suidae)成员的动物，如猪。

本发明具有以下突出的优点：

(1)所述疫苗组合物可通过基因工程手段对疫苗组合物的组分进行大量重组表达，不仅耗时短，还可便于大规模生产；

(2)所述疫苗组合物含有免疫原性蛋白及猪流行性腹泻全病毒灭活抗原时，比单独使用全病毒灭活抗原免疫时，效果更好。

(3)疫苗保护范围广，可以预防和治疗由猪流行性腹泻病毒变异株和猪流行性腹泻病毒普通株导致的猪流行性腹泻。

序列表中：

序列1为猪流行性腹泻病毒S1a蛋白的核苷酸人工序列；

序列2为猪流行性腹泻病毒S1a蛋白的氨基酸人工序列；

序列3为猪流行性腹泻病毒CH/YNKM/2012株S1蛋白的核苷酸序列；

序列4为猪流行性腹泻病毒CH/YNKM/2012株S1蛋白的氨基酸序列；

序列5为猪流行性腹泻病毒SD-M株S1蛋白的核苷酸序列；

序列6为猪流行性腹泻病毒SD-M株S1蛋白的氨基酸序列；

序列7为猪流行性腹泻病毒GDS03株S1蛋白的核苷酸序列；

序列8为猪流行性腹泻病毒GDS03株S1蛋白的氨基酸序列；

序列9为猪流行性腹泻病毒CH4株S1蛋白的核苷酸序列；

序列10为猪流行性腹泻病毒CH4株S1蛋白的氨基酸序列。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所采用猪流行性腹泻全病毒毒株为HN1301株(Porcine epidemic diarrhea virus,strain HN1301)，该毒株的保藏号为CCTCC NO.V201341，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏日期为2013年9月16日。

本发明实施例中所采用猪流行性腹泻攻毒毒株为HN1301株或沪毒株，其中，沪毒株已在中国专利CN101117627A中公开，农业部公告270号文件中将该毒株作为猪流行性腹泻普通株CV777株的效检用强毒株。

本发明实施例中所用的pH7.2PBS液配方为：1000mL蒸馏水中加入NaCl9g、Na₂HPO₄·12H₂O6g、NaH₂PO₄·2H₂O0.4g，本发明中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。

本发明实施例以体积比为20％的铝胶佐剂制备猪流行性腹泻疫苗组合物为例进行阐述，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

本发明实施例中所用的猪流行性腹泻全病毒灭活抗原含量以灭活前1×10^5.0TCID₅₀/mL为例进行阐述，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

本实施例中猪流行性腹泻发病的判定标准为：厌食、通常黄色或浅黄色水样腹泻，部分仔猪伴有呕吐、寒颤、脱水等症状，在临床观察的5-6日之内可能有部分仔猪脱水后死亡。发病程度可能轻重不同，但判定发病最基本的、也是不可少的条件是腹泻。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1 猪流行性腹泻病毒S1蛋白的制备、鉴定及含量测定

1.1猪流行性腹泻病毒S1a蛋白的制备、鉴定及含量测定

1.1.1重组载体Bacmid-S1a的构建

根据猪流行性腹泻病毒S1蛋白核苷酸序列(见序列表SEQ IDNo.1)，采用人工合成的方法，由上海生物工程有限公司合成，所合成的基因片段全长为2367bp。在此人工合成S1基因片段的基础上制备S1蛋白的模板。

以前一步骤所合成的S1全长基因片段用做PCR反应的模板，设计一对特异性引物，并分别在上下游添加XhoI、PstI酶切位点，引物序列如下：

S1a-P1：5'GCTCTCGAGATGACGCCTTTAATTTACTTCTGGT3'，

S1a-P2：5'GGGCTGCAGTCTAATACTCATACTAAAGTTGGTG3'。

运用PCR扩增S1片段，将扩增后的片段命名为S1a。PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环，72℃延伸5min。

将扩增产物使用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳产物使用DNA凝胶回收试剂盒回收后，将目的基因片段连接至pGEM-T载体，并转化DH5α感受态细胞，酶切鉴定后，将阳性质粒测序，测序正确的质粒命名为pGEM-T-S1a。S1a的测序结果如序列表SEQ ID No.1所示。

重组pFastbac I-S1a的构建：将pGEM-T-S1a、pFastbac I同时进行双酶切，酶切产物进行电泳，使用DNA凝胶回收试剂盒回收相应的S1a、pFastbac I片段。将回收的S1a、pFastbac I片段使用T4DNA Ligase进行连接，连接产物转化入DH5α感受态细胞。将含有充足质粒的DH5α感受态细胞进行培养，使用质粒提取试剂盒提取质粒，并进行双酶切鉴定，同时将酶切鉴定正确的质粒进行测序，测序正确的重组质粒命名为pFastbac I-S1a。S1a的测序结果如序列表SEQ ID No.1所示。

重组穿梭载体Bacmid-S1a的构建：将上述构建的pFastbac I-S1a质粒转化DH10Bac感受态细胞，转化细胞接种于含有三抗的LB固体培养基，同时进行蓝白斑筛选。挑取白斑接种于含三抗的LB液体培养基进行培养。收获菌液，使用质粒提取试剂盒提取质粒，并进行PCR鉴定，将鉴定正确的质粒命名为Bacmid-S1a。

1.1.2Bacmid-S1a质粒的转染、表达及鉴定

Bacmid-S1a质粒转染Sf9昆虫细胞：在6孔细胞板培养Sf9细胞，转染Bacmid-S1a质粒，观察转染细胞生长状态，并换液，至细胞出现病变时，收集上清，4℃避光保存。并按照0.1M.O.I进行F2代、F3代的扩增。

S1a蛋白的表达：将收获的F3代按2-5M.O.I的体积比接种Sf9细胞进行悬浮培养，分别置于液氮、37℃水浴中反复冻融2-3次，离心，去除细胞碎片，将所获上清进行SDS-PAGE电泳，同时添加0.1％甲醛于所获上清并置37℃灭活6h，电泳结果表明：相对于对照，在相应位置出现目的蛋白。并进行Western blot鉴定，结果标明：所获得的S1a蛋白能与猪抗PEDV阳性血清反应。

1.1.3S1a蛋白含量的测定

将上述获得的上清，使用硫酸铵法沉淀，离心后，沉淀使用PBS重悬，并测定蛋白浓度。将S1a蛋白使用SDS-PAGE进行电泳，分别取梯度稀释后浓度为500、375、187.5、93.75、46.875μg/mL的牛血清白蛋白(BSA)标准品同步进行电泳。SDS-PAGE电泳后，使用考马斯亮蓝染色，脱色后使用扫描仪扫描。使用Alph-Imager^TM3400软件对电泳图像进行定量分析，以BSA标准品建立回归曲线，计算重组S1a蛋白的浓度，将测定的重组S1a蛋白稀释至100μg/mL。

1.2猪流行性腹泻病毒S1b蛋白的表达、鉴定及含量测定

1.2.1重组载体Bacmid-S1b的构建

S1基因的克隆及pMD18-T-S1载体的构建：根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中报道的PEDV CH/YNKM/2012株(登录号为JX018180.1)中S1蛋白的基因序列(见序列表SEQ ID No.3)设计一对特异性引物，并分别在上下游添加XhoI、PstI，引物序列如下：

S1b-P1：5'GCTTCTCGAGATGACGCCTTTAATTTACTTCTGGT3'，

S1b-P2：5'GGGCTGCAGCCTAATACTCATACTAAAGTTGGTG3'。

运用PCR扩增S1片段，将扩增后的片段命名为S1b。PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环，72℃延伸5min。

将扩增产物使用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳产物使用DNA凝胶回收试剂盒回收后，将目的基因片段连接至pGEM-T载体，并转化DH5α感受态细胞，将阳性质粒测序，测序正确的质粒命名为pGEM-T-S1b。S1b的测序结果如序列表SEQ ID No.3所示。

重组pFastbac I-S1b的构建：将pGEM-T-S1b、pFastbac I同时进行双酶切，酶切产物进行电泳，使用DNA凝胶回收试剂盒回收相应的S1a、pFastbac I片段。将回收的S1b、pFastbac I片段使用T4DNA Ligase进行连接，连接产物转化入DH5α感受态细胞。将含有充足质粒的DH5α感受态细胞进行培养，使用质粒提取试剂盒提取质粒，并进行双酶切鉴定，同时将酶切鉴定正确的质粒进行测序，测序正确的重组质粒命名为pFastbac I-S1b。S1b的测序结果如序列表SEQ ID No.3所示。

重组穿梭载体Bacmid-S1b的构建：将上述构建的pFastbac I-S1b质粒转化DH10Bac感受态细胞，转化细胞接种于含有三抗的LB固体培养基，同时进行蓝白斑筛选。挑取白斑接种于含三抗的LB液体培养基进行培养。收获菌液，使用质粒提取试剂盒提取质粒，并进行PCR鉴定，将鉴定正确的质粒命名为Bacmid-S1b。

1.2.2Bacmid-S1b质粒的转染、表达及鉴定

Bacmid-S1b质粒转染Sf9昆虫细胞：在6孔细胞板培养Sf9细胞，转染Bacmid-S1b质粒，观察转染细胞生长状态，并换液，至细胞出现病变时，收集上清，4℃避光保存。并按照0.1M.O.I进行F2代、F3代的扩增。

S1b蛋白的表达：将收获的F3代按2-5M.O.I的体积比接种Sf9细胞进行悬浮培养，分别置于液氮、37℃水浴中反复冻融2-3次，离心，去除细胞碎片，将所获上清进行SDS-PAGE电泳，同时添加0.1％甲醛于所获上清置37℃灭活6h，电泳结果表明：相对于对照，在相应位置出现目的蛋白。并进行Western blot鉴定，结果标明：所获得的S1b蛋白能与猪抗PEDV阳性血清反应。

1.2.3S1b蛋白含量的测定

将上述获得的上清，使用硫酸铵法沉淀，离心后，沉淀使用PBS重悬，并测定蛋白浓度。将S1b蛋白使用SDS-PAGE进行电泳，分别取梯度稀释后浓度为500、375、187.5、93.75、46.875μg/mL的牛血清白蛋白(BSA)标准品同步进行电泳。SDS-PAGE电泳后，使用考马斯亮蓝染色，脱色后使用扫描仪扫描。使用Alph-Imager^TM3400软件对电泳图像进行定量分析，以BSA标准品建立回归曲线，计算重组S1b蛋白的浓度，将测定的重组S1b蛋白稀释至100μg/mL。

1.3猪流行性腹泻病毒S1c、S1d、S1e蛋白的表达及鉴定

根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中报道的SD-M株、GDS03株、CH4株(登录号依次为JX560761.1、AB857235.1、JQ239432.1)中S1蛋白的基因序列(依次见序列表SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ IDNo.9)，分别按照实施例1.2中1.2.1至1.2.2部分所述的方法构建重组载体，并对其进行转染、表达及鉴定，将表达后鉴定正确的蛋白依次命名为S1c、S1d、S1e蛋白。

按照实施例1.2中1.2.3部分所述的方法对表达、鉴定后的S1c蛋白进行含量测定，将测定后重组的S1c、S1d、S1e各蛋白均稀释至100μg/mL。

实施例3 猪流行性腹泻病毒疫苗组合物的制备

3.1猪流行性腹泻病毒亚单位抗原的制备

使用pH7.2PBS将实施例1制备的重组蛋白S1a、S1b、S1c、S1d、S1e分别进行稀释，并加入铝胶佐剂充分混匀，使疫苗组合物中的重组蛋白S1a、S1b、S1c、S1d、S1e的含量如表1所示，同时保证铝胶佐剂与疫苗组合物的体积比为1:5。将制备好的疫苗组合物作为免疫原，于4℃保存备用。

3.2猪流行性腹泻全病毒灭活抗原的制备

将PEDV HN1301株病毒液使用pH7.2PBS稀释，将稀释病毒液按3％(体积比)接种量接种长满致密单层的非洲绿猴肾细胞(Vero细胞，购自上海生化所)，置于37℃、5％CO₂培养箱中静置培养48-72h。当细胞出现肿胀、变圆、融合、脱落，细胞融合性病变达80％-90％时，反复冻融后收获，收获病毒液置-20℃保存。将收获的病毒液取样测定病毒含量，病毒含量≥10^7.5TCID₅₀/mL合格。将检验合格的病毒液以3000rpm离心10min，上清按0.1％体积比加入甲醛溶液，置37℃灭活12h，并进行灭活检验。将检验合格的病毒液于4℃保存。

将检验合格的病毒液用PBS稀释，并与铝胶佐剂混合，使其与疫苗组合物的体积比为1:5，以制备猪流行性腹泻灭活疫苗(疫苗I)，使所制备的疫苗中抗原的病毒含量为灭活前1×10^5.0TCID₅₀/mL(见表1)。将制备好的疫苗组合物作为免疫原，于4℃保存备用。

3.3猪流行性腹泻病毒亚单位抗原与全病毒灭活抗原疫苗组合物的制备

同时制备猪流行性腹泻病毒亚单位抗原与全病毒灭活抗原的疫苗组合物，其组成如表1疫苗H所示，同时保证铝胶佐剂与疫苗组合物的体积比为1:5。将制备好的疫苗组合物作为免疫原，于4℃保存备用。

表1 猪流行性腹泻疫苗组合物所含组分及比例

注：/表示无或者0。

实施例4 猪流行性腹泻疫苗组合物免疫效力评价

4.1主动免疫试验

选取3日龄PEDV抗体阴性仔猪88头，随机分成11组(详情见表2)，8头/组，第1-1至1-9组依次经后海穴免疫实施例3所制备的疫苗组合物A-I，1mL/头；第1-10组经后海穴免疫实施例3制备的疫苗组合物B；第1-11组设为空白对照组，免疫注射相同剂量的pH7.2的PBS溶液。免疫后14日，采集免疫组和对照组猪血清，分别检测各组血清中和抗体效价。使用SPSS15.0软件对各仔猪平均抗体效价进行统计分析。同时，免疫组(第1-1至1-9组)和空白对照组(第1-11组)均使用分离的猪流行性腹泻病毒HN1301株进行攻毒，每头口服1mL HN1301株病毒液(病毒液TCID₅₀不低于10^7.0/mL)；免疫组(第1-10组)使用猪流行性腹泻病毒沪毒株口服1mL(病毒液TCID₅₀不低于10^7.0/mL)。攻毒后观察7天，统计各组发病情况。

主动免疫效力试验结果见表2。

表2 主动免疫效力试验结果

由表2可知：

(1)仔猪免疫后，测定中和抗体效价，免疫猪流行性腹泻亚单位抗原和猪流行性腹泻全病毒灭活抗原组(第1-8组)仔猪的几何平均抗体效价分别为1:95，高于单独分别免疫猪流行性腹泻亚单位抗原组(第1-1至1-7组、第1-10组)、猪流行性腹泻全病毒灭活抗原组(第1-9组)，且均差异显著(p＜0.05)。仔猪免疫猪流行性腹泻亚单位抗原组(第1-1至1-7组、第1-10组)抗体效价相当，各组之间差异不显著(p＞0.05)，但均高于猪流行性腹泻全病毒灭活抗原组(第1-9组)(p＜0.05)；特别地，免疫相同剂量的S1蛋白抗原(即第1-2组、第1-4至1-7组)时，第1-2组的中和抗体效价稍高。

(2)攻毒后，免疫猪流行性腹泻亚单位抗原和猪流行性腹泻全病毒灭活抗原组(第1-8组)的仔猪，除免疫当日食欲有所下降外，在观察期未见腹泻，精神、饮食均正常。单独免疫猪流行性腹泻亚单位抗原组(第1-1至1-7组、第1-10组)，除第1-1组攻毒后有1头仔猪出现腹泻外，其余仔猪精神、饮食未见异常。仔猪免疫猪流行性腹泻全病毒灭活抗原组(第1-9组)，攻毒后，免疫HN1301株组的仔猪的发病率为37.5％，不能获得完全保护。攻毒对照组仔猪于攻毒后第2天发病，至观察期结束，发病率为100％，部分仔猪因腹泻脱水而死亡。对比第1-2组与第1-10组后发现，免疫相同的猪流行性腹泻亚单位疫苗，用不同毒株攻毒后，均能获得完全保护。

4.2被动免疫试验

选取55头外观正常、同期配种，PEDV、PEDV、TGEV等抗体检测均呈阴性的妊娠后期母猪，随机分为11组(详情见表3)，5头/组。第2-1至2-9组依次经后海穴注射免疫实施例3所制备的疫苗组合物A-I，4mL/头，产前免疫2次，首免后2周进行二免；第2-10组经后海穴注射免疫实施例3所制备的疫苗组合物B，4mL/头，产前免疫2次，首免后2周进行二免；第2-11组设为空白对照组，免疫注射相同剂量的pH7.2的PBS溶液。

妊娠母猪产仔后，立即采集每头母猪的初乳并采集血清，用ELISA试剂盒分别检测抗体效价。ELISA抗体效价测定结果表明：同时免疫猪流行性腹泻亚单位抗原和猪流行性腹泻全病毒灭活抗原组(第2-8组)所产抗体高于单独分别免疫猪流行性腹泻亚单位抗原组(第2-1至2-7组、第2-10组)、猪流行性腹泻全病毒灭活疫苗组(第2-9组)，并且免疫猪流性腹泻亚单位抗原组(第2-1至2-7组、第2-10组)的抗体效价均高于免疫猪流行性腹泻全病毒灭活抗原组(第2-9组)的。其中，第2-2组的免疫效果略优于第2-4至2-7组；特别地，第2-1至2-3组免疫效果显示：不同蛋白含量的猪流行性腹泻亚单位抗原组免疫母猪后所产抗体，随着抗原含量增加，抗体效价有所增高。

从各免疫组母猪所产仔猪随机挑选8头15日龄仔猪，采血分离血清测定各仔猪血清中和抗体效价。使用SPSS15.0软件对各仔猪平均抗体效价进行统计分析。同时，除第2-10组外的其他组使用分离的猪流行性腹泻病毒HN1301株进行攻毒，每头口服2mL HN1301株病毒液(病毒液TCID₅₀不低于10^6.0/mL)；第2-10组使用猪流行性腹泻病毒沪毒株口服1mL(病毒液TCID₅₀不低于10^6.0/mL)。攻毒后，观察7天，统计各组发病情况。

被动免疫效力试验结果见表3。

表3 被动免疫效力试验结果

由表3可知：

(1)免疫猪流行性腹泻亚单位抗原和猪流行性腹泻全病毒灭活抗原组(第2-8组)的母猪所产仔猪的几何平均抗体效价高于单独分别免疫猪流行性腹泻亚单位抗原组(第2-1至2-7组、第2-10组)、猪流行性腹泻全病毒灭活抗原组(第2-8组)，差异均显著(p＜0.05)。免疫猪流行性腹泻亚单位抗原组(第2-1至2-7组、第2-10组)间抗体效价差异不显著(p＞0.05)，但均高于猪流行性腹泻全病毒灭活抗原组(p＜0.05)。并且，免疫相同剂量的S1蛋白抗原(即第2-2组、第2-4至2-7组)时，第2-2组的中和抗体效价稍高。

(2)使用分离的猪流行性腹泻病毒HN1301株或沪毒株攻毒后，免疫猪流行性腹泻亚单位抗原和猪流行性腹泻全病毒灭活抗原组(第2-8组)母猪所产仔猪，均未出现腹泻等症状，精神、食欲正常。使用猪流行性腹泻亚单位抗原组(第2-1至2-7组、第2-10组)，第2-1组有1头仔猪出现腹泻，于6天后恢复，其余仔猪生长状况均良好，食欲均正常；第2-2至2-7组、第2-10组仔猪除攻毒后第1天仔猪食欲轻微下降外，第2天均恢复，其余均未出现腹泻现象。猪流行性腹泻全病毒灭活抗原组母猪所产仔猪，第2-9组仔猪4头出现腹泻，其余仔猪生长状况均良好，食欲均正常。未免疫的母猪所产仔猪攻毒后，第2天出现腹泻等临床症状，至第7天观察期结束，全部仔猪出现腹泻，部分仔猪因脱水发生死亡。对比第2-2组与第2-10组后发现，免疫相同的猪流行性腹泻亚单位疫苗的母猪所产仔猪用不同毒株攻毒后，均能获得完全保护。

综上所述，不论是主动免疫还是被动免疫，免疫猪流行性腹泻亚单位抗原和猪流行性腹泻全病毒灭活抗原组的免疫效果较好，均能获得完全保护；其次为单独免疫不同剂量的猪流行性腹泻亚单位抗原组，且亚单位抗原对仔猪的免疫保护效果随抗原含量的增加而升高；最后为单独免疫猪流行性腹泻全病毒灭活抗原组，对仔猪产生保护效果较差。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种猪流行性腹泻疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括猪流行性腹泻病毒亚单位抗原和载体；其中，所述猪流行性腹泻病毒亚单位抗原包括猪流行性腹泻病毒S蛋白、S1蛋白、M蛋白、N蛋白。

2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒S1蛋白核苷酸序列编码SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.8或SEQ ID No.10氨基酸序列；优选地，所述猪流行性腹泻病毒S1蛋白核苷酸序列编码SEQ ID No.2氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒S1蛋白的含量为0.5-20μg/mL。

4.一种猪流行性腹泻疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括权利要求1-2任一项所述猪流行性腹泻病毒亚单位抗原、猪流行性腹泻全病毒灭活抗原和载体。

5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒亚单位抗原为猪流行性腹泻病毒S1蛋白，其核苷酸序列编码SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8或SEQ ID No.10氨基酸序列；所述猪流行性腹泻全病毒灭活抗原为灭活的猪流行性腹泻病毒HN1301株。

6.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒S1蛋白的含量为0.5-20μg/mL；所述猪流行性腹泻全病毒灭活抗原的含量为灭活前1×10^4.0-1×10^7.0TCID₅₀/mL。

7.根据权利要求1-6任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，所述载体包括佐剂，所述佐剂包括铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种；优选地，所述佐剂为铝胶佐剂。

8.根据权利要求1-6任一项所述疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物还包括其他抗原，所述其他抗原包括猪传染性胃肠炎病毒抗原、猪轮状病毒抗原、猪圆环病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪细小病毒抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗原、大肠杆菌抗原、猪萎缩性鼻炎抗原、猪伪狂犬病病毒抗原、猪霍乱病原抗原、猪流感病毒抗原中的一种或多种；优选地，所述其他抗原为猪传染性胃肠炎病毒抗原。

9.一种制备权利要求1-3所述疫苗组合物的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)克隆表达所述亚单位抗原；以及

(2)按比例混合所述表达的亚单位抗原和佐剂。

10.一种制备权利要求4-6所述疫苗组合物的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)克隆表达所述亚单位抗原；

(2)增殖培养所述猪流行性腹泻病毒，灭活；以及

(3)按比例混合所述表达的亚单位抗原和灭活的猪流行性腹泻全病毒抗原，加入佐剂。

11.权利要求1-6任一项所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪流行性腹泻的药物中的应用。