TWI703983B - 豬流行性下痢病毒ts分離株及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明揭示一種新穎的豬流行性下痢病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV) TS分離株，它以寄存編號BCRC 970076被寄存於食品工業發展研究所(FIRDI)的生物資源保存及研究中心(BCRC)。該豬流行性下痢病毒TS分離株可被用於預防豬流行性下痢(porcine epidemic diarrhea, PED)。

Description

豬流行性下痢病毒TS分離株及其用途

本發明是有關於一種新穎的豬流行性下痢病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV) TS分離株，它以寄存編號BCRC 970076被寄存於食品工業發展研究所(FIRDI)的生物資源保存及研究中心(BCRC)。包含有該豬流行性下痢病毒TS分離株的免疫源性組成物可被用來預防豬流行性下痢(porcine epidemic diarrhea, PED)。

豬流行性下痢(porcine epidemic diarrhea, PED)是一種由豬流行性下痢病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)所引起的病毒型腸炎(viral enteritis)。PEDV是一種具有外膜的單股正義RNA病毒(enveloped, single-stranded, positive-sense RNA virus)，屬於冠狀病毒科(Coronaviridae)甲型冠狀病毒屬( Alphacoronavius)，其主要感染小腸的上皮細胞(epithelial cells)，造成的臨床症狀包括下痢、嘔吐、厭食(anorexia)、脫水以及體重減輕等。PEDV會感染任何年齡的豬隻，但嚴重程度可能依據豬隻年齡而不同。特別地，PEDV在仔豬(piglets)之間具有高度的傳染性，並且可能引起仔豬水狀下痢(watery diarrhea)與脫水，嚴重者甚至死亡。出生三天內的仔豬由於無法產生對抗該病毒的有效的免疫反應，死亡率更高達70%至100%。

1971年，PED疫情於歐洲首次被觀察到，並且在1978年，於比利時首次自下痢豬隻中分離出一類冠狀病毒分離株(coronavirus-like strain)，並經鑑定與分類而被命名為PEDV CV-777分離株。1980年代之後，歐洲地區僅出現零星疫情而未發生大規模流行，但卻在美國、加拿大、墨西哥以及其他養殖豬隻的亞洲國家(包括韓國、日本、越南、中國、菲律賓、泰國以及台灣)開始出現流行並持續至今，造成哺乳仔豬(suckling piglets)的大量死亡以及畜產業的巨大經濟損失。

目前主要用於預防PED的方法為接種疫苗，而自1990年代以來，世界各國皆已嘗試使用傳統PEDV CV-777分離株或者分離自當地的PEDV分離株來進行疫苗的製備。例如，在疫苗的製備上，中國主要是利用傳統PEDV CV-777分離株；韓國有利用當地分離的DR-13、KPED-9以及SM98分離株；以及日本則有使用當地分離的P-5V分離株。然而，已有研究顯示，上述作為疫苗的分離株[又被稱為疫苗株(vaccine strain)]大多在分類學上屬於G1基因群(genogroup 1, G1)，而近年來爆發的多次PED嚴重疫情皆與G2基因群(genogroup 2, G2)的分離株有關，這兩群無論在基因或抗原上皆不盡相同，因而可能導致上述疫苗株在預防G2基因群所引起的PED上具有較低的保護效力(protective efficacy)(Sato, T. et al., (2018), Virol. J., 15:28; Lee, S.H. et al., (2018), Clin. Exp. Vaccine Res., 7:61-69)。因此，本領域中仍存在有一迫切的需要去分離出新的PEDV分離株，以供發展出更能有效預防PED之疫苗。

經研究，申請人分離出一株臺灣PEDV TS分離株，並且發現利用該分離株所製得的PEDV口服疫苗(oral vaccine)以及針劑疫苗(injectable vaccine)皆能有效地提升仔豬對抗PEDV的免疫力。因此，PEDV TS分離株被預期可供用於PED的預防。

發明概要

於是，在第一個方面，本發明提供一種豬流行性下痢病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV) TS分離株，其是以寄存編號BCRC 970076被寄存於食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心。

在第二個方面，本發明提供一種免疫原性組成物(immunogenic composition)，其包含有一如上所述的豬流行性下痢病毒TS分離株。

在第三個方面，本發明提供一種如上所述的免疫原性組成物供用於製備一用來預防豬流行性下痢之醫藥品的用途。

發明的詳細說明

要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。

為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。

除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。為表清楚，下面的界定被使用於本文中。

為了開發出能更有效地預防PED之疫苗，申請人從台灣糖業股份有限公司畜殖事業部岸內畜殖場(嘉義縣義竹鄉)中疑似感染PEDV的豬隻中分離出一株PEDV TS分離株。申請人將該PEDV TS拿來進行Vero細胞適應(Vero cell adaptation)，繼而將所得到的Vero-適應的PEDV TS分離株拿來進行特徵鑑定，而判斷該Vero-適應的PEDV TS分離株是一株新穎的PEDV分離株。本發明的PEDV TS分離株已於西元2019年6月10日以寄存編號BCRC 970076被寄存於財團法人食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)。

申請人接著使用二元乙烯亞胺(binary ethylenimine, BEI)來對本發明的Vero-適應的PEDV TS分離株進行去活化(inactivation)，繼而參考Li, X.Y. et al., (2008), BMC Biotechnol.,8: 89以及Zheng X. et al., (2017), Front. Cell. Infect. Microbiol., 7: 175等文獻而將去活化之Vero-適應的PEDV TS分離株製成口服疫苗(oral vaccine)以及針劑疫苗(injectable vaccine)，所得到的疫苗經由動物免疫試驗而證實能夠有效地在豬隻體內誘發針對PEDV的免疫反應而大量生成針對PEDV的中和抗體(neutralizing antibody)，並且對於台灣的其他PEDV分離株具有交叉保護力(cross protection)。

基於上述，本發明提供一種免疫原性組成物(immunogenic composition)，其包含有如上所述的豬流行性下痢病毒TS分離株。

如本文中所使用的，術語“免疫原(immunogen)”與“抗原(antigen)”可被交替地使用，意指任何一個在被投予一個體時能夠刺激誘發一免疫反應的物質。該免疫反應包括抗原-專一性反應(antigen-specific response)、非-抗原-專一性反應(non-antigen-specific response)，以及先天性免疫反應(innate immune response)。較佳地，該免疫反應是抗原-專一性反應。

在本發明的一個較佳具體例中，該免疫反應能使該個體免於或抵抗豬流行性下痢，或者預防或治療豬流行性下痢。換言之，該免疫原性組成物可作為疫苗來使用。

依據本發明，該免疫原性組成物所包含的免疫原可以是呈一經減毒的(attenuated)或去活化的(inactivated)形式之豬流行性下痢病毒TS分離株的完整病毒(whole virus)，或者衍生自豬流行性下痢病毒TS分離株之具有免疫原性的分子，例如，經分離、純化或重組的蛋白質(protein)、多肽(polypeptides)、多醣(polysaccharide)、核酸(nucleic acid)或脂質(lipid)。

如本文中所使用的，術語“經減毒的(attenuated)”意指一病毒感染一細胞或個體的能力和/或誘發疾病的能力被減弱(reduced)或被消除(eliminated)。

如本文中所使用的，術語“去活化的(inactivated)”意指一病毒(通常是死亡的病毒)無法再於一宿主細胞中進行複製(replicate)。

依據本發明，減毒或去活化的處理可以採用熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術來進行。在此方面，可以參照，例如，Chen, Q. et al., (2014), J. Clin. Microbiol., 52(1):234-43、Collin, E.A. et al., (2015), BMC Vet Res., 11: 62、Yoem, M. et al., (2014), Arch. Virol., 159: 2777-2785以及Ismail, A.H. et al., (2013), J. Vet. Adv., 3(3): 117-124。

在本發明的一個較佳具體例中，該豬流行性下痢病毒TS分離株是藉由使用非洲綠猴腎臟上皮細胞(African green monkey kidney epithelial cells) Vero細胞株的細胞適應(cell adaptation)來予以馴化減毒，並且藉由BEI處理來予以去活化。

依據本發明，該免疫原性組成物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道投藥(parenteral administration)、口服投藥(oral administration)或局部投藥(topical administration)之劑型(dosage form)。

依據本發明，該免疫原性組成物可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之藥學上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，該免疫原性組成物可以一選自於由下列所構成的群組中的非經腸道途徑來投藥：腹膜內注射(intraperitoneal injection)、胸膜內注射(intrapleural injection)、肌肉內注射(intramuscular injection)、靜脈內注射(intravenous injection)、動脈內注射(intraarterial injection)、關節內注射(intraarticular injection)、滑液內注射(intrasynovial injection)、椎管內注射(intrathecal injection)、顱內注射(intracranial injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、皮內注射(intradermal injection)、病灶內注射(intralesional injection)、以及舌下投藥(sublingual administration)。較佳地，該免疫原性組成物被製造成適合於以肌肉內注射而被投藥的劑型。

依據本發明，該免疫原性組成物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於口服投藥的劑型，這包括，但不限於：無菌的粉末、錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pellet)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)以及類似之物。

依據本發明，該免疫原性組成物亦可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於局部地施用於皮膚上的外部製劑(external preparation)，這包括，但不限於：乳劑(emulsion)、凝膠(gel)、軟膏(ointment)、乳霜(cream)、貼片(patch)、擦劑(liniment)、粉末(powder)、氣溶膠(aerosol)、噴霧(spray)、乳液(lotion)、乳漿(serum)、糊劑(paste)、泡沫(foam)、滴劑(drop)、懸浮液(suspension)、油膏(salve)以及繃帶(bandage)。

依據本發明，該免疫原性組成物可進一步包含有一選自於由下列所構成之群組中的佐劑(adjuvant)：皂素(saponin)、海藻糖二黴菌酸酯(trehalose dimycolate)、霍亂毒素(choleric toxin)、單磷醯脂質A (monophosphoryl lipid A)、脂多醣(lipopolysaccharides)、細胞激素[例如，干擾素(interferon, IFN)或粒細胞－巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)、性激素脫氫表雄固酮(dehydroepiandrosterone, DHEA)、弗倫氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant)、弗倫氏不完全佐劑(Freund’s incomplete adjuvant)、鋁膠(aluminum gel)[例如，氫氧化鋁(aluminum hydroxide)、磷酸鋁(aluminum phosphate)或硫酸鋁鉀鹽(potassium aluminum sulfate)]、油質佐劑(water-in-oil-in-water, W/O/W型)、油包水型(water-in-oil, W/O)乳劑、水包油型(oil-in-water, O/W)乳劑、刀豆素A (Concanavalin A, Con A)、β-葡聚醣(β-glucan)，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該佐劑是油質佐劑(W/O/W型)。

如本文中所使用的，術語“佐劑”意指一能夠非-專一性地增強一免疫原所誘發的免疫反應之物質。

依據本發明，該免疫原性組成物可進一步包含有一攜帶該豬流行性下痢病毒TS分離株的遞送載體(delivery vehicle)。

適用於本發明的遞送載體包括，但不限於：多羧酸(polycarboxylic acid)或其鹽類、羧酸酐類(carboxylic anhydrides)以及其他單體類[例如，甲基丙烯酸甲酯(methyl (meth)acrylate)或丙烯酸(acrylic acids)]的共聚物(copolymer)、親水性乙烯基聚合物(hydrophilic vinyl polymers)[例如，聚乙酸乙烯酯(polyvinyl acetate)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)]、纖維素衍生物(cellulose derivatives)[例如，羥甲基纖維素(hydroxymethylcellulose)或羥丙基纖維素(hydroxypropylcellulose)]、天然聚合物(natural polymers)[例如，幾丁聚醣(chitosan)、膠原蛋白(collagen)、海藻酸鈉(sodium alginate)、明膠(gelatin)、透明質酸(hyaluronic acid)及該等聚合物之無毒的金屬鹽類]、生物可降解的聚合物(biodegradable polymers)[例如，聚乳酸(polylactic acid, PLA)，聚乳酸－乙醇酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA)、聚羥基丁酸(polyhydroxybutyric acid)或聚羥基丁酸－乙醇酸共聚物(poly(hydroxybutyric acid-glycolic acid) copolymer)]、合成脂肪酸酯(synthetic fatty acid esters)[例如，聚甘油脂肪酸酯(polyglycerin fatty acid esters)或蔗糖脂肪酸酯(sucrose fatty acid esters)]、陽離子聚合物(cationic polymers)[例如，聚離胺酸(polylysine)、聚組胺酸(polyhistidine)或聚精胺酸(polyarginine)]，以及pH-敏感的聚合物(pH-sensitive polymers)[例如，丙烯酸酯基聚合物(acrylate-based polymers)]。這些遞送載體可以單獨或組合使用，並且可以透過部分結晶(partial crystallization)、離子鍵結(ionic bonding)或交聯(cross-linking)等方式來提升結構完整性。

較佳地，該遞送載體是由下列的至少一者所形成：海藻酸鹽與幾丁聚醣交聯的聚合物(alginate-chitosan crosslinked polymer)、聚離胺酸、聚組胺酸、聚精胺酸，以及丙烯酸酯基聚合物。

適用於本發明的遞送載體可以呈一選自於下列的形式：液體(fluid)或黏稠溶液(viscous solutions)、凝膠(gels)、脂質體(liposomes)、微胞(micelles)、微珠(microbeads)、微球體(microspheres)、微顆粒(microparticles)、微膠囊(microcapsules)、奈米顆粒(nanoparticles)、奈米膠囊(nanocapsules)、樹狀體(dendrimer)等。

在本發明的一較佳具體例中，該遞送載體是一由海藻酸鹽與幾丁聚醣交聯的聚合物所形成的微膠囊。

本發明亦提供一種免疫原性組成物供用於製備一用來預防豬流行性下痢之醫藥品的用途。

依據本發明，該醫藥品的投藥途徑、劑型以及可供使用之藥學上可接受的載劑、佐劑以及遞送載體是如上面所述者。

如本文中所使用的，術語“預防(preventing)”或“預防(prevention)”豬流行性下痢意指一個體在還沒有被診斷具有該豬流行性下痢時，消除(eliminate)或減少(reduce)該豬流行性下痢的發生率(incidence)，以及減緩(slow)、延遲(delay)、控制(control)或減少(decrease)該豬流行性下痢的可能性(likelihood)或機率(probability)。

本發明亦提供一種用於預防豬流行性下痢的方法，其包括對一需要預防PED的個體投藥以一如上所述的免疫原性組成物或醫藥品。

依據本發明，該免疫原性組成物或醫藥品的投藥劑量與投藥次數會視下列因素而變化：投藥途徑以及需要預防豬流行性下痢的個體之體重、年齡、身體狀況與反應。一般而言，依據本發明的免疫原性組成物或醫藥品可呈單一劑量或是分成數個劑量的形式而被口服地或非經腸道地投藥。較佳地，該免疫原性組成物或醫藥品的投藥次數為2次，投藥間隔為14天。

較佳實施例之詳細說明

本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。 實施例 一般實驗材料： 1.     Vero細胞株的來源與培養：

在下面的實施例中所使用的非洲綠猴腎臟上皮細胞(African green monkey kidney epithelial cells) Vero細胞株(BCRC 60013)是購自於台灣的食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute, FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center, BCRC)(300新竹市食品路331號，台灣)。

該Vero細胞株是以杜貝可氏改良的依格氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, DMEM)[添加有10% (v/v)胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)](Corning, NY, USA, Cat. No. 10-013)被培養於T-150細胞培養瓶(T-150 flask)中，並在設定為37℃、5% CO ₂的培養箱中進行培養。當細胞密度達到約80-90%匯聚(confluence)(亦即，充滿80-90%之生長平面空間)時，移除培養基並以杜貝可氏磷酸鹽緩衝生理鹽水(Dulbecco’s phosphate buffered saline, D-PBS)(購自於Life Technologies GIBCO BRL Co., Ltd)來清洗細胞，接著加入胰蛋白酶-EDTA (trypsin-EDTA)以使細胞自培養瓶的底部脫離。之後，加入新鮮的培養基來中和胰蛋白酶的活性並以移液管(pipette)反覆地吸沖培養基以充分打散細胞，然後將所形成的細胞懸浮液分配到新的培養瓶中，並在培養箱中進行培養。 2.     實驗動物：

在下面的實施例中所使用的約克夏品種之離乳仔豬(weaning piglet)(4週大)是來自於台灣糖業股份有限公司畜殖事業部岸內畜殖場(嘉義縣義竹鄉)。所有的實驗動物被飼養於一個室溫維持在20-26℃以及相對濕度維持在50±10%的獨立空調的動物房內，而且水分與飼料被充分地供給。有關實驗動物的處理以及一切實驗程序均符合國際實驗動物管理標準，亦經過國立屏東科技大學實驗動物照護及使用委員會審核並且認可通過。 一般實驗方法： 1.     病毒效價(viral titer)的測定

在下面的實施例中，病毒效價是參照Reed L.J. and Muench H, (1938), Am. J. Trop. Med. Hyg., 27(20):493-497使用Reed-Muench法來進行測定，並且以單位體積的50%組織培養感染劑量(50% tissue cultur  e infectious dose, TCID ₅₀)來表示。 2.     統計學分析(Statistical analysis)：

在下面的實施例中，各組的實驗被重複3次，而實驗數據是以“平均值(mean)±平均值的標準誤差(standard error of the mean, SEM)”來表示。所有的數據是藉由史徒登氏t-試驗(Student’s t-test)來作分析，俾以評估各組之間的差異性。若所得到的統計分析結果是 p>0.05，這表示有統計學顯著性(statistical significance)。 實施例 1. 豬流行性下痢病毒 (porcine epidemic diarrhea virus, PEDV) TS 分離株的分離與純化 A. PEDV 分離株的來源與分離

在本實驗中，申請人收集來自於台灣糖業股份有限公司畜殖事業部岸內畜殖場(嘉義縣義竹鄉)中疑似感染PEDV豬隻的糞便以及小腸檢體作為樣品來源來進行PEDV分離株的分離。

首先，對10 g之所收集到的糞便或小腸檢體分別取1 g並加入至10 mL的磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline, PBS)中，繼而以一均質機來進行均質化處理(homogenization)而得到一濃度為10% (w/v)的均質物(homogenate)。接著，使用一AxyPrep體液病毒DNA/RNA微量製備套組(AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit)(Axygen Biosciences, Corning)並且依據製造商的操作指南來對均質物進行基因組RNA的萃取(extraction of genomic RNA)，藉此而得到不同檢體的基因組RNA。

依據GenBank登錄編號KF272920.1 [豬流行性下痢病毒分離株USA/Colorado/2013的完整基因組(complete genome)]當中所示的核苷酸(nucleotide)序列，申請人從PEDV的刺突基因(spike gene)(又稱為S基因)中挑選出具有高度守恆性(high conservativeness)的區域，並據此來設計出1組針對PEDV的S基因的種-特異性引子對PED-SF/PED-SR。

為表清楚，引子對PED-SF/PED-SR的相關資訊(包括：核苷酸序列、擴增產物大小以及對應於標的基因的所在位置等)已被整合於下面表1中。

a：PEDV分離株USA/Colorado/2013的完整序列。	S基因 (GenBank登錄編號KF272920.1 a當中所示的核苷酸殘基位置23895至24042處)	標的基因	表1.  被設計用於偵測PEDV的引子對
24028-24042	23895-23915	對應於標的基因內的核苷酸殘基位置
PED-SR	PED-SF	引子/探針
TCGCCATCACCACCACAAA (序列辨識編號：2)	ACCGGCAGATTATCAGCACTT (序列辨識編號：1)	核苷酸序列(5’→3’)
152	PCR產物大小(bp)

接著，在上面所得到之不同檢體的基因組RNA被用來作為模板，並使用引子對PED-SF/PED-SR以及Axygen ^®AxyPrep體液病毒DNA/RNA微量製備套組(Axygen Biosciences, Corning)並且依據製造商所提供的操作指南來進行即時反轉錄聚合酶鏈反應(real-time reverse-transcription polymerase chain reaction, real-time RT-PCR)(以下簡稱“即時RT-PCR”)，藉此偵測檢體中是否存在有PEDV。

之後，將所篩選出的PEDV-陽性檢體在4℃下以4,200 ×g進行離心歷時10分鐘，繼而收集500 μL的上澄液並以一孔徑為0.22 μm的濾紙予以過濾，而得到一PEDV-陽性檢體上澄液。

接著，申請人參考Chen Q. et al., (2014), J. Clin. Microbiol.,52:234-243當中所述的方法，將該PEDV-陽性檢體上澄液拿來接種於依據上面“一般實驗材料”的第1項來進行繼代培養的Vero細胞繼而於37℃以及5% CO ₂下進行培養，並每天以顯微鏡觀察細胞病變效應(cytopathic effect, CPE)的產生情形。當CPE達到約70%時，收集Vero細胞培養物並在25℃下以1,000 ×g予以離心歷時5分鐘，繼而收取500 μL的上澄液，藉此而分離出一株PEDV分離株的病毒液，該分離株被申請人命名為PEDV TS分離株。PEDV TS分離株的病毒液依照上面“一般實驗方法”的第1項當中所述的方法而被測得具有一為10 ⁴TCID _50/mL的病毒效價。 B. PEDV TS 分離株的 Vero 細胞適應 ( Vero cell adaptation)

Vero細胞適應已知可減低病毒的致病性(virulence)並提高病毒效價，申請人參照Chen, Q. et al., (2014), J. Clin. Microbiol., 52(1):234-243將PEDV TS分離株拿來進行Vero細胞適應。

首先，將依據上面“一般實驗材料”的第1項來進行繼代培養的Vero細胞株以一為5×10 ⁶細胞/mL的數量接種於含有20 mL DMEM (添加有10% FBS)之T-150細胞培養瓶，並在37℃以及5% CO ₂下進行培養歷時24小時。接著，移除大部分的培養基至僅剩大約2 mL，並以500 μL之在上面第A項中所得到的PEDV TS分離株病毒液予以接種，繼而置於37℃以及5% CO ₂下進行培養歷時1小時。之後，加入添加有2 μL/mL之經TPCK處理的胰蛋白酶(TPCK-treated trypsin)(Sigma)的DMEM至總體積為20 mL，繼而予以培養歷時約3-4天並每日觀察CPE的產生情形。

當CPE達到70%時，重複上述病毒液的製備與接種的步驟來進行繼代培養20次，藉此而得到Vero-適應的PEDV TS分離株(Vero-adapted PEDV TS isolate)之病毒液，其依照上面“一般實驗方法”的第1項當中所述的方法而被測得具有一為10 ⁷TCID _50/mL的病毒效價，為適應前的1000倍。 C. Vero- 適應的 PEDV TS 分離株的純度測試 (purity test)

為了確認Vero-適應的PEDV TS分離株並未受到PEDV以外的其他豬腸胃道病毒[包括豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus, TGEV)、豬A型輪狀病毒(porcine group A rotaviruses, GAR)以及豬第二型環狀病毒(porcine circovirus type 2, PCV2)]汙染，申請人參考Zhao J. et al. (2013), J. Virol. Methods.,194(1-2): 107-112當中所述的方法來進行純度測試。

而測試結果顯示，Vero-適應的PEDV TS分離株並未受到上述病毒汙染(數據未顯示)。 實施例 2. Vero- 適應的 PEDV TS 分離株的特徵鑑定

為了確認在實施例1中所得到的Vero-適應的PEDV TS分離株是否為新穎的分離株，Vero-適應的PEDV TS分離株被拿來進行下面的S基因與全基因組的序列分析以及譜系分析(phylogenic analysis)。 A. S 基因序列分析

首先，使用Axygen ^®AxyPrep體液病毒DNA/RNA微量製備套組來對在上面實施例1中所得到之Vero-適應的PEDV TS分離株病毒液進行萃取，而得到Vero-適應的PEDV TS分離株的基因組RNA。接著，參考Zhao J. et al., (2013)(同上述)使用引子對P1/P2來進行即時RT-PCR，俾以擴增出Vero-適應的PEDV TS分離株的S基因片段。之後，委託源資國際生物科技股份有限公司來進行定序分析，而得到Vero-適應的PEDV TS分離株的S基因序列(序列辨識編號：3)。然後，使用DNASTAR分析軟體(DNASTAR, USA)將之拿來與NCBI基因資料庫中習知的PEDV分離株的S基因序列進行核苷酸以及胺基酸序列的比對分析。

比對分析結果顯示，Vero-適應的PEDV TS分離株與習知的PEDV分離株的S基因不論在核苷酸序列以及胺基酸序列上皆具有相當的差異(數據未顯示)。 B. S 基因譜系分析

有關Vero-適應的PEDV TS分離株的S基因譜系分析是參考Tamura, K. et al., (2007), Mol. Biol. Evol., 24:1596-1599來進行。將Vero-適應的PEDV TS分離株的S基因序列拿來與NCBI基因資料庫中之PEDV分離株的S基因序列進行比對分析，繼而使用分子演化遺傳學分析軟體第4.0版(molecular evolutionary genetics analysis software version 4.0, MEGA4)(Pennsylvania State University, USA)並藉由最大複合概似方法(maximum composite likelihood method, MCL method)來繪製出一譜系樹(phylogenetic tree)，而結果顯示於圖1中。

由圖1可見，Vero-適應的PEDV TS分離株與習知的PEDV分離株之間的親緣關係差距較大，特別是傳統上用於製備疫苗的CV-777-S-CD、JPN-83P-5與Korea-DR13分離株。

此外，申請人進一步將適應前的PEDV TS分離株拿來進行如上所述的S基因序列分析以及譜系分析，而結果發現適應前後的PEDV TS分離株的S基因序列具有高達99%的相同性，並且譜系分析之結果亦無明顯差異(數據未顯示)，這表示：適應過程並未使PEDV TS分離株的基因產生顯著改變。 C. 全基因組序列分析與譜系分析

首先，委託國立台灣大學嚴慶齡工業研究中心來進行Vero-適應的PEDV TS分離株的全基因組序列分析，接著，使用分子演化遺傳學分析軟體第6.0版(MEGA6)將所得到的全基因組序列拿來與NCBI網站上的基因資料庫中之PEDV分離株的全基因組序列進行比對，並藉由近鄰結合法(Neighbor-joining method)而繪製出一譜系樹，而所得到的結果被顯示於圖2中。

由圖2可見，Vero-適應的PEDV TS分離株與習知的PEDV分離株之間的親緣關係差距較大，特別是傳統上用於製備疫苗的PEDV CV-777分離株。

綜合以上各項特徵鑑定結果，申請人認為：本發明的Vero-適應的PEDV TS分離株是一株新穎的PEDV分離株。

Vero-適應的PEDV TS分離株已於西元2019年6月10日以寄存編號BCRC 970076被寄存於財團法人食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)(300新竹市食品路331號，台灣)。 實施例 3. 製備本發明的 PEDV 口服疫苗 (oral vaccine) A. 去活化 (inactivation)

首先，取500 μL上面實施例1中所得到之Vero-適應的PEDV TS分離株病毒液並予以加入適量的0.1 M的二元乙烯亞胺(binary ethylenimine, BEI)溶液(購自於台灣默克股份有限公司)至最終濃度為0.001 M，繼而於37℃、150 rpm下進行培育歷時24小時以進行去活化。之後，添加硫代硫酸鈉溶液(sodium thiosulfate solution)至最終濃度為0.1% (w/v)來中和剩餘的BEI活性，藉此而得到去活化之Vero-適應的PEDV TS分離株的病毒液。

另外，經測試而發現，該病毒液在接種Vero細胞並經三次繼代培養之後皆未觀察到有CPE產生(數據未顯示)，這表示：Vero-適應的PEDV TS分離株已被成功地去活化。 B. 包覆 (encapsulation)

首先，將40 mL之1% (w/v, g/mL)幾丁聚醣溶液(chitosan solution)以及40 mL之7.5%氯化鈣溶液(calcium chloride solution)[皆配於1% (v/v)醋酸水溶液中，並預先以孔徑為0.22 μm的濾膜予以過濾]充分混合，接著加入80 mL之去離子水，並以4 N氫氧化鈉溶液將pH值調整至4.0，最後添加去離子水至總體積為200 mL，而得到一具有0.2% (w/v)幾丁聚醣以及1.5% (w/v)氯化鈣的第一溶液。

接著，將60 mL之在上面第A項中得到的去活化之Vero-適應的PEDV TS分離株病毒液以及40 mL之5%海藻酸鈉(alginate solution)充分混合，而得到一含有2%海藻酸鈉以及去活化的PEDV TS分離株的第二溶液。

之後，將第一溶液置於一500 mL的燒杯中並以400 rpm的速度持續攪拌，同時使用一連接有32G針頭的蠕動幫浦(peristaltic pump)並以一為10 mL/h的流速將第二溶液滴入該第一溶液中，而使得該第二溶液液滴中的海藻酸鈉與該第一溶液中的幾丁聚醣相互交聯(cross-linking)，藉此而得到一具有海藻酸鹽與幾丁聚醣交聯的微膠囊(alginate-chitosan cross-linked microcapsules)結構的PEDV口服疫苗，其包覆有去活化之Vero-適應的PEDV TS分離株。該PEDV口服疫苗依照上面“一般實驗方法”的第1項當中所述的方法而被測得具有一為5×10 ⁶TCID ₅₀/mL的病毒效價。

所得到的PEDV口服疫苗在被進行冷凍乾燥處理之後儲存於-80℃備用。 實施例 4. 本發明的 PEDV 口服疫苗的特性分析 實驗方法： A. 顆粒粒徑分析 (particle size analysis)

以肉眼直接觀察在上面實施例3中所得到之未經冷凍乾燥處理的PEDV口服疫苗顆粒的型態並測量其粒徑，之後依照上面“一般實驗方法”的第2項當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 B. 掃描式電子顯微術 (SEM) 分析 [scanning electron microscopy (SEM) analysis]

為了瞭解該PEDV口服疫苗在經過冷凍乾燥處理之後其表面結構是否產生變化，申請人將該經冷凍乾燥處理的PEDV口服疫苗拿來委託國立屏東科技大學研發處貴重儀器中心進行掃描式電子顯微術分析。

首先，使用一高真空蒸鍍儀(HITACHI，型號為HUS-SGB)來對該經冷凍乾燥處理的PEDV口服疫苗之顆粒表面進行鍍金處理(gold coating)，接著使用一場發射掃描式電子顯微鏡(field-emission scanning electron microscope, FESEM)(JEOL Ltd.，型號為JSM-7600F)並在一為500倍的放大倍率下對經冷凍乾燥處理的PEDV口服疫苗顆粒進行觀察以及拍照，所得到的掃描式電子顯微影像被顯示於圖3中。 C. 活體外細胞毒性測試 ( in vitrocytotoxicity test)

首先，為供比較，一不含有病毒的對照疫苗是參照上面實施例3的第B項當中所述的步驟而被製得，不同之處在於：以PBS來取代病毒液。

接著，將依據上面“一般實驗材料”的第1項來進行繼代培養的Vero細胞分成3組，其中包括空白對照組(blank)、對照疫苗組以及實驗組，繼而將各組細胞以一為5×10 ³細胞/井的數量培養於含有200 μL的DMEM (添加有10% FBS)的96-井培養盤的各井中，並於37℃，5% CO ₂下予以培養歷時72小時。

之後，將1 mg之對照疫苗添加至對照疫苗組的細胞培養物中，而將1 mg之在上面實施例3中得到的PEDV口服疫苗添加至實驗組的細胞培養物中。至於空白對照組的細胞培養物則不作任何處理。各組細胞培養物於37℃，5% CO ₂下進行培養歷時24小時之後，將10 μL之細胞計數套組-8 (Cell Counting Kit-8, Dojindo Moleculer Technologies, Japan)檢測試劑分別添加至各井中並於37℃，5% CO ₂下予以培養歷時1小時。之後，於450 nm的波長下以一ELISA讀取機(ELISA reader)(型號為EZ Read 2000，廠牌為Biochrome)來讀取各井的吸光值(OD ₄₅₀)。

細胞可活性百分比(%)是藉由將所測得的吸光值(OD ₄₅₀)代入下列公式(1)而被計算出： 公式 (1) ： A=( B/C) ×100其中：A=細胞可活性百分比(%) B=各組所測得的OD ₄₅₀吸光值 C=空白對照組所測得的OD ₄₅₀吸光值

之後，依照上面“一般實驗方法”的第2項當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 D. 安定性測試 (stability test)

首先，將在上面實施例3中得到的PEDV口服疫苗分成2組，其中包括無菌水組以及PBS組，每組5 mg。將各組的PEDV口服疫苗對應地添加至30 mL無菌水與磷酸鹽緩衝生理鹽水中，繼而將所形成的混合物於4℃下靜置歷時40天，並在開始靜置之後的第5、10、20、30、40天，從各組混合物分別取0.5 mg的PEDV口服疫苗並將之溶解於1 mL之0.5 N氫氧化鈉溶液中，繼而以一為12,600 ×g的速度予以離心歷時15分鐘。之後，取0.1 mL的上澄液，並使用Pierce™ BCA蛋白質分析套組來測定抗原濃度(μg/mL)。

之後，依照上面“一般實驗方法”的第2項當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 E. 活體外釋放測試 ( in vitrorelease test)

首先，將在上面實施例3中得到的PEDV口服疫苗分成3組，其中包括PBS組、胃液組以及腸液組，每組5 mg。將各組的PEDV口服疫苗對應地添加至30 mL的PBS、人工胃液以及人工腸液(含有10 mg/mL的胰蛋白酶以及6.8 mg/mL的磷酸二氫鉀的水溶液，pH值7.5±0.1)中，繼而將所形成的混合物於室溫下以200 rpm予以震盪歷時420分鐘，並於開始震盪之後的第5、10、15、20、30、60、120、300以及第420分鐘之時，分別對各組混合物取適量的液體部分並以12,600 ×g予以離心歷時15分鐘，繼而取0.1 mL的上澄液，並使用Pierce™ BCA蛋白質分析套組來測定抗原濃度(μg/mL)。

之後，依照上面“一般實驗方法”的第2項當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 結果： A. 顆粒粒徑分析

觀察與量測結果顯示，未經冷凍乾燥處理的PEDV口服疫苗顆粒具有一為2.0±0.2 mm的平均粒徑，並且具有良好的分散性，而無黏結或團聚(aggregation)的情形。 B. 掃描電子顯微鏡分析

圖3顯示使用掃描式電子顯微鏡來對經冷凍乾燥處理之本發明的PEDV口服疫苗顆粒進行拍照所得到的影像。由圖3可見，該經冷凍乾燥處理的PEDV口服疫苗顆粒具有一約為1.0±0.2 mm的粒徑，顯示該PEDV口服疫苗的大小在經過冷凍乾燥處理之會略為縮小，且其表面平滑。 C. 活體外細胞毒性測試

圖4顯示Vero細胞在與本發明的PEDV口服疫苗進行共培養後所測得的細胞可活性百分比。從圖5可見，實驗組與對照疫苗組的細胞可活性百分比與對照組相較之下皆沒有明顯的差異存在。這個實驗結果顯示：本發明的PEDV口服疫苗與不含有病毒的對照疫苗相同，皆不具有細胞毒性。 D. 安定性測試

圖5顯示分別保存於無菌水與PBS中的PEDV口服疫苗所含有的抗原濃度隨著時間的變化。由圖5可見，在整個測試期間，無菌水組的PEDV口服疫苗所含有的抗原濃度皆穩定地維持在90至110 μg/mL之間，沒有顯著的變化；另一方面，PBS組的PEDV口服疫苗所含有的抗原濃度則是在第5天之後大幅地下降。這個實驗結果顯示：依據本發明的PEDV口服疫苗在無菌水中具有極為優異的安定性，而可長期保存。 E. 活體外釋放測試

圖6顯示分別置於PBS、人工腸液以及人工胃液中的PEDV口服疫苗所釋放出的抗原濃度隨著時間的變化。由圖6可見，腸液組的PEDV口服疫苗的抗原釋放速度最快，約在第120分鐘時全部釋出，而相較於腸液組，PBS組的PEDV口服疫苗的抗原釋放速度較慢。至於胃液組則測不到抗原存在(圖未示)。這個實驗結果顯示：依據本發明的PEDV口服疫苗能夠有效抵抗胃酸的破壞，並且在腸道的鹼性環境中則能快速釋放病毒，因而有利於透過腸道黏膜途徑來誘發黏膜免疫反應(mucosal immunity)。 實施例 5. 製備本發明的 PEDV 針劑疫苗 (injectable vaccine)

對在上面實施例3的第A項所得到的去活化之Vero-適應的PEDV TS分離株病毒液以PBS予以稀釋至病毒效價為10 ⁷TCID ₅₀/mL，繼而將之與等體積的MONTANIDE™ ISA 206 VG油質佐劑混合均勻，藉此而得到一含有去活化的PEDV TS分離株的PEDV針劑疫苗，其具有一為5×10 ⁶TCID ₅₀/mL的病毒效價。 實施例 6. 本發明的 PEDV 口服疫苗與針劑疫苗的動物免疫試驗

在本實施例中，申請人將在上面實施例3中所得到的PEDV口服疫苗以及在上面實施例5中所得到的PEDV針劑疫苗拿來進行動物免疫試驗，俾以評估該等疫苗在誘發針對PEDV的免疫反應上的效用。 A. 疫苗接種與病毒攻毒 (vaccination and viral challenge)

首先，將所有的實驗豬隻分為5組，其中包括模擬接種(mock vaccination)組(n=3)、注射接種組1 (n=5)、注射接種組2 (n=4)、口服接種組1 (n=6)，以及口服接種組2 (n=5)。在第0天時，對注射接種組1與2的豬隻頸部以肌肉內注射(intramuscular injection)的方式接種2 mL之PEDV針劑疫苗，以及對口服接種組1與2的豬隻以口服的方式接種10 mL之PEDV口服疫苗；在初次接種(primary vaccination)之後的第14天，對注射接種組2的豬隻追加接種(boost)以2 mL之PEDV針劑疫苗，以及對口服接種組2的豬隻追加接種以10 mL之PEDV口服疫苗；至於模擬接種組則是在第0天時被肌肉內注射以2 mL的生理鹽水(saline)，以及口服10 mL的生理鹽水。為表清楚，各組豬隻的接種劑量被顯示於下面的表2中。 表2. 各組豬隻的PEDV接種劑量

組別	接種途徑	接種劑量(TCID 50/mL)	總接種劑量(TCID 50/mL)
初次接種	追加接種
模擬接種組	-	-	-	-
注射接種組1	肌肉內注射	10 7	-	10 7
注射接種組2	肌肉內注射	10 7	10 7	2×10 7
口服接種組1	口服	10 7	-	10 7
口服接種組2	口服	10 7	10 7	2×10 7

在初次接種後的第28天，將實施例1中所得之Vero-適應的PEDV TS分離株以一為10 ⁸TCID ₅₀/mL的劑量來對各組豬隻進行口服攻毒(challenge)。 B. 臨床症狀 (clinical signs) 的評估

在初次接種之後的第28天至第42天(亦即攻毒的第0天至攻毒後第14天)，每天觀察與紀錄各組下痢(diarrhea)的豬隻數目。各組的下痢百分比(%)是藉由將該組別出現下痢情形之豬隻數量除以該組別豬隻總數而得到。 C. 血清病毒中和 (serum virus neutralization) 抗體效價的測定

各組豬隻血清中的中和抗體效價是使用血清病毒中和(serum virus neutralization, SVN)試驗來進行測定。

在初次接種之後的第0、7、14、21、28、35，以及第42天，對各組豬隻採集血液樣本，繼而對該血液樣本進行一離心處理而分離出血清(serum)。將各組的血清樣本置於56℃水浴下進行去活化處理歷時30分鐘，之後，分別取0.4 mL去活化的血清樣本，予以進行2倍連續稀釋(2-fold serial dilution)而配製成具有不同稀釋倍數(2至2 ¹⁶倍)的血清樣本，繼而對各個經稀釋的血清樣本各取0.05 mL並將之添加至96-井培養盤的各井中。接著，對各井分別加入0.05 mL之實施例1中所得之Vero-適應的PEDV TS分離株病毒液(其具有一為2×10 ³TCID ₅₀/mL的病毒效價)，繼而於37℃下進行中和反應歷時1小時。

之後，將依據上面“一般實驗材料”的第1項來進行繼代培養的Vero細胞株一為1×10 ⁴細胞/井的數量添加至各井中，繼而於37℃以及5% CO ₂下進行培養歷時3至5天並每天觀察CPE產生情形，能夠抑制CPE的血清樣本的最高稀釋倍數則被視為該血清樣本的SVN抗體效價。

之後，依照上面“一般實驗方法”的第2項當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 結果： A. 臨床症狀的評估

圖7顯示各組豬隻的下痢百分比(%)隨著時間的變化。由圖7可見，模擬接種組在攻毒後第1天的下痢百分比即達到100%，並且在攻毒後第8天才降至0%；注射接種組1與2在攻毒後第1天的下痢百分比分別為80%與75%，並且分別在攻毒後第7與6天降至0%；口服接種組1與2在攻毒後第1天的下痢百分比分別降低至60%與40%，並且皆在攻毒後第6天降至0%。這個實驗結果顯示：依據本發明的PEDV口服疫苗與針劑疫苗能夠有效控制PEDV感染同時減緩其所造成的下痢情形，特別地，PEDV口服疫苗具有最佳的療效。 B. 血清病毒中和抗體效價的測定

圖8顯示各組豬隻在初次接種之後血清中的SVN抗體效價隨著時間的變化。由圖8可見，模擬接種組在初次接種後第0至28天內血清中均無SVN抗體存在，而在初次接種後第28天之後才出現SVN抗體，並且在初次接種後第42天僅達到2 ⁶倍SVN抗體效價。相對地，接種疫苗的組別均在初次接種後第14天開始出現SVN抗體，特別地，注射接種組2以及口服接種組1與2的SVN抗體效價提升速度較快，在第42天時達至2 ¹³至2 ¹⁴倍的SVN抗體效價，顯著高於模擬接種組所具者。這個實驗結果顯示：依據本發明的PEDV口服疫苗與針劑疫苗皆能有效地在豬隻體內誘發針對PEDV的免疫反應，而大量生成針對PEDV的SVN抗體。 實施例 7. 本發明的 PEDV 口服疫苗與針劑疫苗的交叉保護力 (cross protection) 測試 實驗方法：

為了瞭解依據本發明的PEDV口服疫苗與針劑疫苗對於PEDV的其他分離株(亦即非疫苗株)是否具有交叉保護力，申請人將在上面實施例6中的各組豬隻於初次接種後第28天的血清拿來依照上面實施例6的第B項當中所述的方法來對本發明的Vero-適應的PEDV TS分離株以及一得自於台灣糖業股份有限公司畜殖事業部善化畜殖場(台南市善化區)的PEDV TN分離株進行SVN抗體效價測試。 結果：

圖9顯示各組豬隻在接種後第28天的血清對於本發明的Vero-適應的PEDV TS分離株以及PEDV TN分離株的SVN抗體效價。由圖9可見，模擬接種組在接種後第28天的血清內無SVN抗體存在。相對地，注射接種組1的血清對於本發明的PEDV TS分離株以及PEDV TN分離株皆具有約2 ³倍的SVN抗體效價，而注射接種組2、口服接種組1以及口服接種組2的血清對於本發明的PEDV TS分離株以及PEDV TN分離株則具有高達2 ⁵至2 ⁶倍的SVN抗體效價。這個實驗結果顯示：依據本發明的PEDV口服疫苗與針劑疫苗對於台灣的其他PEDV分離株具有交叉保護力。

於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。

雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。

本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯，其中： 圖1顯示依據本發明的Vero-適應的PEDV TS分離株(Vero-adapted PEDV TS isolate)的S基因與NCBI基因資料庫中習知的PEDV分離株的S基因序列比對結果而繪製成的譜系樹(phylogenetic tree)； 圖2顯示依據本發明的Vero-適應的PEDV TS分離株的全基因組序列與NCBI基因資料庫中習知的PEDV分離株的全基因組序列比對結果而繪製成的譜系樹； 圖3顯示使用一場發射掃描式電子顯微鏡(field-emission scanning electron microscope, FESEM)來對經冷凍乾燥處理之本發明的PEDV口服疫苗顆粒進行拍照所得到的影像； 圖4顯示Vero細胞在與本發明的PEDV口服疫苗進行共培養歷時24小時之後所測得的細胞可活性百分比，其中空白對照組表示未經任何處理的細胞；對照疫苗組表示與1 mg之不含有病毒的對照疫苗共培養的細胞；實驗組表示與1 mg之本發明的PEDV口服疫苗顆粒共培養的細胞； 圖5顯示分別保存於無菌水與PBS中的PEDV口服疫苗所含有的抗原濃度隨著時間的變化；其中無菌水組表示保存於無菌水中的PEDV口服疫苗；PBS組表示保存於PBS中的PEDV口服疫苗； 圖6顯示分別置於PBS以及人工腸液中的PEDV口服疫苗所釋放出的抗原濃度隨著時間的變化；其中PBS組表示被添加至PBS中的PEDV口服疫苗；腸液組表示被添加至人工腸液中的PEDV口服疫苗； 圖7顯示各組豬隻在攻毒之後第0天至第14天之間的下痢百分比隨著時間的變化；其中模擬接種組表示被肌肉內注射以生理鹽水且被口服以生理鹽水的豬隻；注射接種組1表示被肌肉內注射接種以1劑PEDV針劑疫苗(10 ⁷TCID ₅₀/mL)的豬隻；注射接種組2表示被肌肉內注射接種以2劑PEDV針劑疫苗(2×10 ⁷TCID ₅₀/mL)的豬隻；口服接種組1表示被口服接種以1劑PEDV口服疫苗(10 ⁷TCID ₅₀/mL)的豬隻；口服接種組2表示被口服接種以2劑PEDV針劑疫苗(2×10 ⁷TCID ₅₀/mL)的豬隻； 圖8顯示各組豬隻在初次接種之後的血清中的血清病毒中和(serum virus neutralization, SVN)抗體效價(Log ₂)隨著時間的變化；其中模擬接種組表示被肌肉內注射以生理鹽水且被口服以生理鹽水的豬隻；注射接種組1表示被肌肉內注射接種以1劑PEDV針劑疫苗(10 ⁷TCID ₅₀/mL)的豬隻；注射接種組2表示被肌肉內注射接種以2劑PEDV針劑疫苗(2×10 ⁷TCID ₅₀/mL)的豬隻；口服接種組1表示被口服接種以1劑PEDV口服疫苗(10 ⁷TCID ₅₀/mL)的豬隻；口服接種組2表示被口服接種以2劑PEDV口服疫苗(2×10 ⁷TCID ₅₀/mL)的豬隻；以及 圖9顯示各組豬隻在初次接種之後第28天的血清對於本發明的Vero-適應的PEDV TS分離株以及PEDV TN分離株的SVN抗體效價(Log ₂)；其中模擬接種組表示被肌肉內注射以生理鹽水且被口服以生理鹽水的豬隻；注射接種組1表示被肌肉內注射接種以1劑PEDV針劑疫苗(10 ⁷TCID ₅₀/mL)的豬隻；注射接種組2表示被肌肉內注射接種以2劑PEDV針劑疫苗(2×10 ⁷TCID ₅₀/mL)的豬隻；口服接種組1表示被口服接種以1劑PEDV口服疫苗(10 ⁷TCID ₅₀/mL)的豬隻；口服接種組2表示被口服接種以2劑PEDV口服疫苗(2×10 ⁷TCID ₅₀/mL)的豬隻。

TW中華民國；食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)；2019/06/10；BCRC 970076。

Claims (10)

1. 一種豬流行性下痢病毒TS分離株，其是以寄存編號BCRC 970076被寄存於食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心。
2. 一種免疫原性組成物，其包含有一如請求項1的豬流行性下痢病毒TS分離株。
3. 如請求項2的免疫原性組成物，其中該豬流行性下痢病毒TS分離株是呈一經減毒或去活化的形式。
4. 如請求項2的免疫原性組成物，其進一步包含一藥學上可接受之載劑。
5. 如請求項3的免疫原性組成物，其是呈一供非經腸道投藥的劑型。
6. 如請求項3的免疫原性組成物，其是呈一供口服投藥的劑型。
7. 如請求項2的免疫原性組成物，其進一步包含有一選自於由下列所構成之群組中的佐劑：皂素、海藻糖二黴菌酸酯、霍亂毒素、單磷醯脂質A、脂多醣、細胞激素[例如，干擾素或粒細胞－巨噬細胞集落刺激因子、性激素二羥表雄甾酮、弗倫氏完全佐劑、弗倫氏不完全佐劑、鋁膠(例如，氫氧化鋁、磷酸鋁或硫酸鋁鉀鹽)、油質佐劑、油包水型乳劑、水包油型乳劑、刀豆素A、β-葡聚醣，以及它們的組合。
8. 如請求項2的免疫原性組成物，其進一步包含有一攜帶該豬流行性下痢病毒TS分離株的遞送載體。
9. 如請求項8的免疫原性組成物，其中該遞送載體是由下列的至少一者所形成：海藻酸鹽與幾丁聚醣交聯的聚合物、聚離胺酸、聚組胺酸、聚精胺酸，以及丙烯酸酯基聚合物。
10. 一種如請求項2至9中任一項的免疫原性組成物供用於製備一用來預防豬流行性下痢之醫藥品的用途。

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