CN105457023B

CN105457023B - 一种预防用h9n2型流感病毒样颗粒疫苗及其制备方法

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Publication number: CN105457023B
Application number: CN201610040427.3A
Authority: CN
Inventors: 蔡家利; 宋梅; 吴胜昔; 王远强; 许雁; 户国达; 张羿; 肖红; 王璐
Original assignee: Chongqing Pailuode Biological Product Co Ltd; Chongqing University of Technology
Current assignee: Chongqing Pailuode Biological Product Co Ltd; Chongqing University of Technology
Priority date: 2016-01-21
Filing date: 2016-01-21
Publication date: 2019-10-08
Anticipated expiration: 2036-01-21
Also published as: CN105457023A

Abstract

本发明提供一种预防用H9N2型流感病毒样颗粒疫苗及其制备方法；所述疫苗组分包括H9N2型流感病毒样颗粒，所述病毒样颗粒为H9N2型流感病毒的病毒样空壳颗粒结构，空壳颗粒结构囊膜表面含有H9N2型流感病毒的一种或者多种的结构蛋白；制备方法先合成HA、NA和M1基因DNA，构建重组质粒pFastBac‑DuaL‑HA‑NA‑M1，将构建的重组质粒导入E.coLi感受态细胞株DH10Bac细胞并经过蓝白筛选得到质粒rBacmid‑HA‑NA‑M1，转染SF9昆虫细胞得到病毒样颗粒，将佐剂溶于病毒样颗粒经孵育、离心清洗后得所述疫苗。本发明疫苗可刺激机体产生较强烈的免疫应答，免疫原性强。

Description

一种预防用H9N2型流感病毒样颗粒疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种预防用H9N2型流感病毒样颗粒疫苗及其制备方法。

背景技术

H9N2型流感病毒即甲型流感病毒的禽流感病毒一种亚型，它最早于20世纪末期被发现存在于火鸡之上。实验表明H9N2亚型流感病毒对鸡具有较强的致病性，引起鸡的免疫力下降，继发感染引起鸡的大批死亡，引起蛋鸡的产蛋下降，造成严重的经济损失，只具对人的致病性弱，另一方面这种病毒的传播很强，已经有了较为广泛的传播。H9N2型流感病毒不仅能让机体发生免疫抑制，还可以让各种继发性的感染发生在宿主身上。据报道某地发现猪已经被这种病毒所感染。研究表明，这种病毒完全可以传染到低等的哺乳动物，人也可以被这种病毒所感染。

由于H9N2型流感病毒的潜在危害能力较为巨大，于是世界上越来越多的人对它进行了关注，越来越多的机构对它进行了研究，研究证明了其确实可以感染人类。研究还发现病毒很有可能在人体里与其它的流感病毒亚型进行基因重组，然后形成新的病毒亚型，危害人类。

目前的传统疫苗主要用于鸡的感染，而现有的传统疫苗用分离的具有感染性的流感病毒通过鸡胚复制病毒制备，需要加灭活剂甲醛和油乳佐剂，对人类的食用存在不安全的因素，并且生产成本高，生产工艺复杂。同时由于它对人类存在的潜在危害，及在体内为其他病毒提供基因组基因而基因重组形成新亚型流感，危害人类安全，故为了人类的安全，动物禽流感的防控，防止H9N2型流感病毒的大规模、无节制的传播，研制H9N2型流感病毒的新型疫苗(VLP疫苗)很有必要且具有十分重要的经济意义和社会意义。

发明内容

基于现有技术存在的上述不足，本发明所要解决的技术问题是：如何提供一种预防用H9N2型流感病毒样颗粒疫苗及其制备方法，弥补现在尚没有H9N2型流感病毒样颗粒疫苗的空白，以防止H9N2型流感病毒在动物之间传播及向人类传播，防止H9N2型流感病毒对人类的潜在威胁，且具有安全性高、免疫原性强、稳定性好的特点。

实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种预防用H9N2型流感病毒样颗粒疫苗，其组分包括H9N2型流感病毒样颗粒；其中，所述H9N2型病毒样颗粒为H9N2型流感病毒的病毒样空壳颗粒结构，所述空壳颗粒结构的囊膜表面含有H9N2型流感病毒的一种或者多种的结构蛋白。

所述结构蛋白为H9N2型流感病毒的血凝素HA蛋白、神经氨酸酶NA蛋白和/或基质蛋白M1；其中，所述HA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述HA蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述NA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码所述NA蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述M1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码所述M1蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

上述预防用H9N2型流感病毒样颗粒疫苗的制备方法，包括如下步骤：

1)根据SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，合成HA、NA和M1基因，并设计合成HA、NA和M1基因的引物，供检测之用；其中，HA基因的上游引物序列如SEQ ID NO.7所示，HA基因的下游引物序列如SEQ ID NO.8所示，NA基因的上游引物序列如SEQ ID NO.9所示，NA基因的下游引物序列如SEQ ID NO.10所示，M1基因的上游引物序列如SEQ ID NO.11所示，M1基因的下游引物序列如SEQ ID NO.12所示；

2)用限制性内切酶BamHI和NotI对昆虫杆状病毒表达载体pFastBac-DuaL和合成的M1基因进行酶切并连接过夜后，转化入感受态细胞进行培养，抽提阳性克隆的重组质粒DNA，得到重组质粒pFastBac-DuaL-M1；

3)用限制性内切酶SmaI和NheI酶对步骤2)得到的重组质粒pFastBac-DuaL-M1和合成的HA基因进行酶切并连接过夜后，转化入感受态细胞进行培养，抽提阳性克隆的重组质粒DNA，得到重组质粒pFastBac-DuaL-HA-M1；

4)用限制性内切酶SmaI和NheI酶对步骤3)得到的重组质粒pFastBac-DuaL-HA-M1和合成的NA基因进行酶切并连接过夜后，转化入感受态细胞进行培养，抽提阳性克隆的重组质粒DNA，得到重组质粒pFastBac-DuaL-HA-NA-M1；

5)将步骤4)得到的重组质粒pFastBac-DuaL-HA-NA-M1转导入E.coLi感受态细胞株DH10Bac细胞中，并经过蓝白筛选，挑取白色菌落，并提取质粒，得到质粒rBacmid-HA-NA-M1；

6)将步骤5)得到的质粒rBacmid-HA-NA-M1转染SF9昆虫细胞，得到重组杆状病毒；

7)将步骤6)得到的重组杆状病毒感染SF9昆虫细胞，培养后收集上清液，并对上清液进行纯化，得到H9N2型流感病毒样颗粒；

8)将佐剂溶于步骤7)得到的所述H9N2型流感病毒样颗粒中，于37℃下孵育3h后，离心弃去上清液，对沉淀进行清洗，即得到所述预防用H9N2型流感病毒样颗粒疫苗。

相比现有技术，本发明具有如下优点：

1、本发明H9N2型流感病毒样颗粒(Virus-Like particles，VLP)是一种不含核酸空心颗粒病毒，所述VLP上含有H9N2型流感病毒的一种或多种结构蛋白，虽然VLP是病毒颗粒，但并没有病毒的核酸物质，所以VLP不能够自主进行复制，也不具有所有病毒都具有的感染性，是一种空壳结构，安全性高。

2、本发明H9N2型流感病毒样颗粒在结构和形态上与完整的病毒非常的相似，表面能够呈现出高密度重复行，可进行抗原表位的表达，从而可以刺激机体产生较为强烈的免疫应答，免疫原性强，具有更广泛的抗感染谱。

3、本发明预防H9N2型流感用流感病毒样颗粒疫苗以H9N2型流感病毒样颗粒为有效成分，通过实验验证，鸡只注射该疫苗后体温、采食量、呼吸频率、精神状况和排泄物没有异常，体重呈正常的状态，且接种了该疫苗的注射部位没有肉眼可见的局部或全身反应；进一步通过实验验证，发现本发明疫苗具有免疫保护作用，从HI实验结果可以看出该疫苗的免疫效果良好，高于传统灭活疫苗，具有良好的市场前景；细胞免疫结果显示该疫苗的刺激指数SI达到有效刺激值，产生有效的细胞免疫。安全实验证明，该疫苗性能安全。

4、本发明预防H9N2型流感用流感病毒样颗粒疫苗稳定性好，不容易失活，没有在消化道内被酶分解掉；且本发明采用微球佐剂用来包埋H9N2型流感用流感病毒样颗粒，包埋效果良好，能有效保证病毒样颗粒的活性不被破坏，使用微球佐剂的疫苗可以采用鼻内或肌肉注射的方式接种，疫苗的吸收效果好，除动物应用外，也适用于老年人、小孩等高危人群的使用，给口服疫苗的研发奠定了基础。

5、同其他疫苗相比，本疫苗毒株制备的疫苗具有免疫用量小，免疫次数少，免疫时间长等优点，具有良好的市场潜力，能有效阻止H9N2型流感病毒对动物和人类的侵害。

6、本发明预防用H9N2型流感病毒样颗粒疫苗采用基因工程的方法进行制备，通过构建多基因共表达载体，并转染昆虫细胞获得本发明病毒样颗粒疫苗，制备过程中不易散毒，制备方向更加可控，制备出的疫苗粗品相比现有其他方法制得的疫苗更容易进行纯化，纯化效率高，易于进行筛选，纯化后疫苗的滴度由2⁶上升至2¹⁰，纯化效果良好。

附图说明

图1为HA基因和NA基因PCR鉴定结果图；

图2为M1基因PCR鉴定结果图；

图3为转染前的SF9细胞图；

图4为转染P3代重组病毒后的SF9细胞图；

图5为病毒颗粒的透射电镜图；

图6为VLP颗粒的透射电镜图；

图7为微球佐剂H9N2型疫苗在模拟胃液和人工肠液中的释放速率图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和说明书附图对本发明作进一步详细说明。

一、一种预防用H9N2型流感病毒样颗粒疫苗，其组分包括H9N2型流感病毒样颗粒；其中，所述H9N2型病毒样颗粒为H9N2型流感病毒的病毒样空壳颗粒结构，所述空壳颗粒结构的囊膜表面含有H9N2型流感病毒的一种或者多种的结构蛋白。

所述结构蛋白可以是H9N2型流感病毒的血凝素HA蛋白、神经氨酸酶NA蛋白和基质蛋白M1；其中，所述HA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述HA蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述NA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码所述NA蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述M1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码所述M1蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

上述预防用H9N2型流感病毒样颗粒疫苗的组分还可以包括佐剂；所述佐剂可以是微球佐剂，采用如下方法制备：

1)将乙酸、吐温-80、水和壳聚糖混合均匀，配制成混合溶液，所述混合溶液中壳聚糖的质量浓度为0.25％～0.3％、乙酸的质量浓度为2％～2.5％、吐温-80的质量浓度为1％～1.2％；

2)在磁力搅拌和超声作用下，将质量浓度为10％～15％的Na₂SO₄溶液以1～1.2mL/min的速度滴入步骤1)配制的混合溶液中，持续磁力搅拌和超声作用20～25min后，以2750～3500r/min离心20～30min，用超纯水清洗离心沉淀物，以2750～3500r/min离心20～30min，再次重复两次洗涤离心后，将沉淀物冷冻干燥，得到微球佐剂；其中，所述Na₂SO₄溶液与所述混合溶液的体积比为1:100～120。

二、上述预防用H9N2型流感病毒样颗粒疫苗的制备方法：

1、参考病毒株：GenBank:AF400779.1，H9N2型流感病毒HA、NA基因、M1基因的合成：

所述HA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述HA蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述NA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码所述NA蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述M1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码所述M1蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

根据以上基因序列，送由上海宝生物公司合成HA、NA和M1基因。

根据上述各基因的核苷酸序列，设计相应的引物，各基因引物如下：

HA-F：5'-GGG GAA TTT CAC AAC CAC TCA AG-3’；

HA-R：5'-TTG AGT AGA AAC AAG GGT GTT TC-3’；

NA-F：5’-AGC AAA AGC AGG AGT GAA AAT GA-3’；

NA-R：5’-CGC AAC TAGAAA CAA GGA GTT-3’；

M1-F：ATG AGC CTT CTA ACC GAG GTC GA；

M1-R：GAG GAT CAC TTG AAT CGC TGC。

RT-PCR体系(25.0μL)：RNA模板(禽流感病毒H9N2型西南毒株RNA)15.0μL，5x M-MLV RTase反应缓冲液5.0μL，dNTPs(10mmol/L)2μL，下游引物R(25pmol/μL)2.0μL，RNA酶抑制剂(40u/μL)0.5μL，M-MLV RTase(200U/μL)0.5μL；反应程序：42℃1h；95℃5min，反应结束获得cDNA。

PCR体系(25.0μL)：上述得到的cDNA 5.0μL，10x Ex Taq Buffer 2.5μL，MgCl₂(2.5mmol/L)2.0μL，dNTPs(2.5mmol/L)2.0μL，上、下游引物(25pmol/μL)各0.5μL，Ex Taq酶(5U/μL)0.3μL，ddH₂O 12.2μL。反应程序：95℃预变性5min；95℃ 50s，56℃ 50s，72℃60s，进行35个循环；最后72％延伸10min。

2、构建表达M1基因的昆虫杆状病毒表达质粒：

用限制性内切酶BamHI/NotI对昆虫杆状病毒表达载体pFastBac-DuaL(Invitrogen公司)和公司合成的M1基因进行酶切，于37℃过夜消化水解后，用凝胶电泳和过柱抽提纯化。在T4DNA连接酶的作用下，酶切后的质粒与酶切后的M1基因DNA片段于16℃连接过夜，连接反应体系如下：10×T4连接缓冲液1μL，M1酶切回收的DNA片段3μL，酶切pFastBac-DuaL质粒回收产物1μL，T4DNA连接酶1μL，ddH₂O补至10μL。

将得到的连接产物转化入感受态细胞中，具体操作步骤如下：将50μL DH 5a感受态细胞移入到离心管中，加入5μL上述得到的连接反应液，混匀后将离心管置于冰上30min，随后转入42℃水浴中热休克45s，迅速放回冰上，2min后加入950μL LB培养液，于37℃摇床培养1小时。培养结束后取100μL培养菌液涂布于LB固体培养基(含有100ug/mL氨卞西林)上，37℃培养16小时，从平板上挑取阳性克隆菌落，用特异性引物(M13-F：5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’；M13-R：5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3’)进行PCR筛选，挑取筛选的阳性单克隆菌落接种于2mL LB培养液(含100ug/mL氨卞西林)中，37℃250r/min振摇培养16小时。培养液离心收集菌体，抽提质粒。经DNA序列测定后，获得重组质粒pFastBac-DuaL-M1。

3、构建表达HA和M1基因的重组质粒：

用限制性内切酶SmaI/NheI酶切上述获得的重组质粒pFastBac-DuaL-M1和HA基因，酶切后的pFastBac-DuaL-M1质粒和HA基因在T4DNA连接酶的作用下进行连接，于16℃连接过夜，连接反应体系如下：10×T4连接缓冲液1μL，HA酶切回收的DNA片段3μL，酶切重组质粒pFastBac-DuaL-M11μL，T4DNA连接酶1μL，ddH₂O补至10μL。

将上述连接后的连接产物转化入E.coLi DH5a感受态细胞中，转化的实验步骤同2，培养、抽提数个阳性克隆菌落的重组质粒DNA，序列测序确定无误后，获得重组质粒pFastBac-DuaL-HA-M1。

4、构建表达HA、NA和M1基因的重组质粒：

用限制性内切酶SmaI/NheI酶切上述获得的重组质粒pFastBac-DuaL-HA-M1和NA基因，酶切后的pFastBac-DuaL-HA-M1和NA基因在T4DNA连接酶的作用下进行连接，于16℃连接过夜，连接反应体系如下：10×T4连接缓冲液1μL，HA酶切回收的DNA片段3μL，酶切重组质粒pFastBac-DuaL-M11μL，T4DNA连接酶1μL，ddH₂O补至10μL。

将上述连接后的连接产物转化入E.coLi DH5a感受态细胞中，转化的实验步骤同2，培养、抽提数个阳性克隆菌落的重组质粒DNA，序列测序确定无误后，获得重组质粒pFastBac-DuaL-HA-NA-M1。

5、重组昆虫杆状病毒基因组的合成：

将步骤4到的重组质粒pFastBac-DuaL-HA-NA-M1转导入E.coLi感受态细胞株DH10Bac细胞中(该细胞中含有一特殊的大分子质粒BacμLovirus pLasmid，该质粒内包含有昆虫杆状病毒AcMNPV的全部基因组)(北京天恩泽科技有限公司)，转导方法同步骤2转入感受态细胞的步骤，挑取阳性克隆菌株，得rBacmid-HA-NA-M1/DH10Bac菌株。

蓝白筛选：取经过灭菌且已经添加了四环素(浓度10μg/mL)、庆大霉素(浓度7μg/mL)、卡那霉素(浓度50μg/mL)的LB平板，在无菌条件下将40μL 0.2mg/mL的IPTG(异丙基-β-D-半乳糖)加入40μL X-gaL(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖)中混合均匀，并将混合液涂布于上述含有抗生素的平板上，将平板转移至37℃恒温箱中放置2.5h，使色素底物X-gaL被培养基完全吸收。将上述得到的rBacmid-HA-NA-M1/DH10Bac菌株在无菌条件下将菌液涂布于蓝白斑平板上，将平板正面向上放置30分钟，已确认菌液完全被平板吸收后将平板倒置，将平板转移至37℃恒温箱中培养48h，观察平板，白色菌落即为所需菌株，将菌落挑取适量于LB培养液中，-20℃无菌保存待用。

6、提取质粒：

(1)在无菌条件下，将1mL步骤5的LB培养菌液用移液器移入1.5mL EP管中，将离心机调节至12000r/min，离心1min，弃尽上清；

(2)在(1)中的EP管中加入250μL Buffer S1溶液，祸旋振荡器重悬细菌沉淀；

(3)将经过(2)操作的EP管中加入250μL Buffer S2溶液，迅速轻轻反复颠倒混匀数次，室温下操作不超过5min；

(4)将300μL Buffer S3加入(3)中的EP管中，轻轻颠倒混匀数次，冰上静置10min，12000r/min离心10min；(S1和S2、S3来自Plasmid Mini Kit I试剂盒，购自天根生化科技有限公司)

(5)用移液器将上清转移至另一无菌的EP管中，加入与上清液等体积的酚氯仿(苯酸和氯仿用前等体积混匀)，轻轻颠倒混匀数次，12000r/min离心10min；

(6)吸取上清至另一无菌的EP管中，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，冰上静置15min，12000r/min离心15min；

(7)上清完全除去后，加入500μL质量浓度为70％的无水乙醇，反复颠倒洗涤沉淀，12000r/min离心5min；

(8)重复上一个步骤，洗涤沉淀；

(9)除去无水乙醇，放置在无菌操作台内干燥8min，将杆粒溶于40μL TE(pH8.0)中，-20℃保存备用。

7、PCR鉴定：

对抽提的质粒rBacmid-HA-NA-M1进行PCR鉴定，其中各引物序列如下：

HA-F：5'-ggggaatttcacaaccactcaag-3’，

HA-R：5'-ttgagtagaaacaagggtgtttc-3’；

NA-F：5’-agcaaaagcaggagtgaaaatga-3’；

NA-R：5’-cgcaactagaaacaaggagtt-3’；

M-F：5’-atgagccttctaaccgaggtcga-3’；

M-R：5’-gaggatcacttgaatcgctgc-3’。

PCR反应体系：

混匀后稍离心，置于PCR仪中。

反应程序：95℃预变性5min；95℃ 50s，53℃(HA基因)或56℃(NA基因)/60℃(M1基因)50s，72℃60s，进行35个循环；最后72％延伸10min。RT—PCR产物以1.0％琼脂糖凝胶电泳，置凝胶成像系统中观察结果(图1和图2)或4℃保存。由图1和图2可以看出在1683bp、1401bp、764bp位置处均有明显条带，与预期的HA基因、NA基因、M1基因大小一致，与初期设置的结果一致。

8、接种转染：

SF9细胞株：从西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室引进，重庆理工大学药学与生物工程学院生物制药实验室保存。取SF9细胞经复苏、贴壁细胞培养、悬浮培养、细胞传代后，得到生长状态好的SF9细胞，将抽提的质粒rBacmid-HA-NA-M1转染SF9细胞，在27℃下进行培养，待细胞明显出现病变时，收集细胞培养上清液，获得第一代(P1)重组病毒；将P1代重组病毒以1:10的稀释倍数接种SF9细胞，同P1代的制备，收集细胞培养上清液，获得P2代重组病毒；采用相同的方法，将P2代重组病毒接种SF9细胞，收集细胞培养上清液，获得P3代重组病毒。其中，所述复苏、贴壁细胞培养、悬浮培养、细胞传代和转染步骤为通用生物学方法，详见分子生物学实验手册。

9、重组蛋白的表达：

将P3代重组病毒以1：10的稀释倍数接种sf9细胞，将接种了P3代重组病毒的sf9细胞进行27℃温箱培养，待细胞明显出现病变时，用PBS吹下细胞，将吹下的细胞收集起来，然后将收集的细胞反复冻融三次，超声处理样品，处理条件：AmpL 38％、pLus on5s、pLus off10s、共10min，以3000r/min 4℃离心30min，收集上清，分装后与-70℃保存备用。

转染前的SF9细胞如图3所示，转染P3代重组病毒后的SF9细胞如图4所示，对比图3和图4可以看出，转染后细胞出现了明显病变，即H9N2型流感病毒的VLP表达成功。

10、鉴定：

将P3代重组杆状病毒感染sf9细胞72小时，在感染了72小时之后，用PBS液小心的将细胞吹下来，将吹下的细胞收集起来，并将此细胞冻融三次，用超声处理细胞，然后在4摄氏度用离心机离心十分钟，离心机转速为3000转每分钟，然后收集上清液，在4摄氏度时12000r/min收集沉淀，最后用磷钨酸进行负染，再利用透射电子显微镜观察流感病毒样颗粒。

病毒颗粒的透射电镜图如图5所示，VLP颗粒的透射电镜图如图6所示，由图可以看出视野中存在着H9N2的VLP颗粒，该颗粒大小为104nm，形状为圆球状。

11、纯化：

将步骤9离心收集的细胞液装入13mL的超速离心管内，称重，平衡，封管。然后将离心管放入超速离心机(Beckman公司产品)内，离心1h，速度为29000r/min，温度为4℃；取出离心管后，小心倒掉上清液，保留离心管底的沉淀物，加入5mL的PBS，放入4摄氏度的冰箱内，溶解24小时；次日，在另一个13mL的超速离心管内，小心的加入1mL质量浓度为60％的蔗糖溶液，然后依次加入1mL质量浓度为30％及3mL质量浓度为20％的蔗糖溶液，最后将5mL的溶解后的样品液置于其上；精确称重，平衡后，封管上超速离心机，4摄氏度离心一小时，离速为29000r/min；取出离心管，分别收集位于20％与30％及30％与60％浓度交界处的二条带，得到纯化的病毒样颗粒。

对纯化后的病毒样颗粒的HA进行测定，结果显示滴度由2⁶上升至2¹⁰，说明纯化效果良好。

12、疫苗微球佐剂的制备：

将乙酸、吐温-80、水和壳聚糖混合均匀，配置成质量体积浓度为0.25％的壳聚糖溶液(其中，乙酸的浓度为2％，吐温-80的浓度为1％)，在磁力搅拌和超声波作用下将2mL10％(w/v)Na₂SO₄溶液以1mL/min的速度滴入200mL的上述配制的壳聚糖溶液中，磁力搅拌和超声波持续作用20min后，2750r/min离心20min，用超纯水清洗微球，再次离心，重复两次后冷冻干燥过夜，得到微球佐剂。

13、H9N2疫苗的制备及其免疫性能测试：

将5mg步骤12制得的疫苗微球佐剂溶于8mL步骤11纯化后的病毒样颗粒VLP中，置于37℃下孵育3h，离心弃去上清液并清洗后，得到微球佐剂H9N2型疫苗，对微球的包封率和载药量进行检测，结果显示该条件下微球载药量为89.04％，包封率为38.45％。

载药量LC＝(总抗原量-未吸附抗原量)/微球质量

包封率LE＝(总抗原量-未吸附抗原量)/总抗原量

对上述制得的微球佐剂H9N2型疫苗在模拟胃液和人工肠液中的释放速率进行检测。

向上述制得的微球佐剂H9N2型疫苗中加入5mL模拟胃液，分别于0min，15min，30min，60min，90min，120min，150min时，取20μL模拟胃液测其蛋白含量，计算包封率/载药量并分析，结果如图7所示，微球佐剂VLP疫苗在模拟胃液中在前60min内的释放速率都很平缓，到90min后则快速释放吸附的蛋白质。

向上述制得的微球佐剂H9N2型疫苗中加入5mL模拟胃液，37℃孵育箱中轻摇5min后快速清洗转入人工肠液中，分别于0min，15min,30min,60min,90min，120min,150min时取20μL样品测其蛋白含量，计算包封率/载药量并分析。结果如图7所示，微球佐剂VLP疫苗在人工肠液中也在前60min内缓慢释放，到90min后则快速释放吸附的蛋白质且其在120min以后释放的速度放缓。

14、动物实验：

向步骤2制得的微球佐剂H9N2型疫苗中加入6.4mL生理盐水，制得微球佐剂H9N2型疫苗悬液。

分别采用注射和口服的方法使用该疫苗悬液进行动物实验，所用动物为母源抗体下降到4Lg2以下的2-3周龄雏鸡，空白对照组为生理盐水，阴性对照组为微球佐剂(口服组)、微球佐剂(注射组)。

实验动物的免疫方案如下：

1、疫苗首免和二免的确定

(1)首免日的确定：

分别于雏鸡7、9、11、13日龄测其母源抗体，当母源抗体效价下降到4Lg2时可进行首免。

(2)二免日的确定：

首免后每周测定HI效价，当单组的平均抗体滴度低于4.5Lg2时进行二免。

2、试验雏鸡的分组

(1)将鸡只分组，分为微球VLP口服组(12只)、微球VLP注射组(12只)、空白对照生理盐水组(5只)，微球口服组、微球注射组各5只；

表1分组情况表

疫苗种类	微球VLP(注射组)	微球VLP(口服组)	生理盐水	微球(口服)	微球(注射)
						数量	12	12	5	5	5
编号	E1-E12	F1-F12	S1-S5	N31-35	N41-45

(2)注射/口服疫苗剂量的确定

有资料显示，只有每剂量疫苗中血凝素含量大于0.3μg时，才能产生较高的HI抗体；当血凝素含量大于0.4μg时，免疫鸡在攻毒后既不会出现任何临床症状，又分离不出病毒。

具体剂量根据H9-VLP及标准疫苗中HA的含量决定，用定量ELISA法测定HA含量。

HA含量的测定方法按试剂盒操作。

采用标准曲线法，得到HA-ELISA标准曲线，标准方程为y＝0.0002x-0.0203，R²＝0.9842。进一步利用该标准曲线可算出本实施例所用的VLP溶液中HA浓度为：x＝(y+0.0203)/0.0002×5×10⁶＝6.06×10⁹pg/mL＝6.06mg/mL。

进一步确定微球VLP口服组为采用0.3mL微球佐剂H9N2型疫苗悬液灌胃；微球VLP注射组为采用0.3mL微球佐剂H9N2型疫苗悬液颈部皮下注射；空白对照生理盐水组为0.3mL生理盐水颈部皮下注射；微球(口服)组、微球注射组采用0.3mL微球佐剂的生理盐水悬液颈部皮下注射或灌胃。

疫苗注射方式：注射组均采用颈部皮下注射方式。口服组采用灌胃方式。

颈部皮下注射的正确方法：小鸡一人操作，注射时用拇指和食指把鸡颈部后1/3处皮肤捏起，使皮肤和肌肉分离，注射器针头向着背部方向，以小于30度的角度刺入捏起的皮下，注射速度不宜过快。注射时要防止刺穿另一侧皮肤将疫苗注射到体外，也要防止注射到肌肉内或刺伤颈椎。

检测注射疫苗后鸡只体温、采食量、体重的变化；观察实验鸡只精神、排泄物是否出现异常现象；观察注射部位是否出现因注射疫苗而引起的局部或全身反应。

结果显示注射疫苗前后鸡只在加料后1-2h内就可将饲料吃光，嗉囊饱满。说明疫苗的注射并未使鸡只采食量变化。

注射疫苗后鸡只的体温变化如表2，结果显示注射或口服疫苗后各组均未出现明显的体温变化。各组雏鸡的体温无显著差异(p>0.05)。

表2注射后体温变化

体温(℃)	微球VLP(注射组)	微球VLP(口服组)	生理盐水	微球(口服)	微球(注射)
						首免当天	40.88±0.57	40.31±0.53	41.03±0.34	40.73±0.29	40.62±0.44
首免后2d	41.72±0.39	40.77±0.69	41.07±0.65	41.09±0.72	40.22±0.63
						首免后5d	41.03±0.62	40.43±0.37	40.82±0.52	41.73±0.61	41.66±0.55

对注射疫苗后鸡只的呼吸频率变化做检测，检测结果如下表3所示，结果显示注射或口服疫苗后各组均未出现明显的呼吸频率变化。

表3呼吸频率变化结果

呼吸频率(次)	微球VLP(注射组)	微球VLP(口服组)	生理盐水	微球(口服)	微球(注射)
						首免当天	26.47	26.32	23.62	26.73	27.49
首免后2d	25.83	24.82	27.16	26.02	24.73
						首免后5d	26.91	27.41	25.33	25.39	26.41

对注射疫苗后鸡只的体重变化做检测，检测结果如下表4所示，结果显示首免2d后鸡只体重呈正常增长状态，2d增重13～16g，首免后2d到5d之间雏鸡的体重各组均增加17-20g，首免后5d到7d之间雏鸡的体重各组均增加12-14g，首免7d到14d之间各组雏鸡的体重明显上升，且在首免后14d时各组的雏鸡体重差异不明显(p>0.05)。

表4体重变化表

对注射疫苗后鸡只的注射部位是否出现因注射疫苗而引起的局部或全身反应进行试验，结果显示注射疫苗后注射部位没有肉眼可见的局部或全身反应。

对注射疫苗后鸡只的精神和排泄物是否出现异常进行检测，结果显示注射疫苗后各组雏鸡精神状况并没有异常；鸡只的排泄物均未观察到肉眼可见的异常现象。鸡粪便像海螺一样，下面大上面小，呈螺旋状，上面有一层白色液体，粪便整体多为棕褐色。早晨排出稀软糊状的棕色粪便。

非特异性免疫保护水平的检测，溶菌酶实验：分别取14d,21d,35d雏鸡翅静脉血，静止后析出血清按试剂盒说明书操作。

表5空白对照法测定溶菌酶

混匀各检测液体，37℃水浴15min，立即取出置于0℃以下的冰水浴中3分钟，逐管取出倒入1cm光径比色皿中，530nm处以双蒸水调透光度100％，测各管透光度T15(即37℃水浴15min后的透光度值)。

计算公式：

测试结果如下表6所示，结果可知，21日龄时，微球VLP注射组和阴性对照组中的微球注射组的溶菌酶含量极显著高于其他组的溶菌酶含量(p<0.01)。微球VLP注射组和阴性对照组无显著差异(p>0.05)。14日龄和35日龄时，各组间溶菌酶的含量均无显著差异(p>0.05)。在试验过程中，溶菌酶的含量随着雏鸡日龄的增大而增高。

表6非特异性免疫结果

特异性免疫保护水平的检测：

1、体液免疫检测：HA/HI试验

首免后7d,10d,14d,21d,28d,35d,42d,49d,56d，……，每组每只鸡翅静脉采血0.3-0.4mL，37℃静置60min后收集血清，参照中华人民共和国农业部规定方法(国家标准GB/T18936-2003)测定抗体水平。具体方法如下：使用V型96孔塑料血凝板，每孔加入25μL稀释液(0.01mol/L,pH7.2PBS)，从第1孔开始加入25μL血清，倍比稀释，到第10孔时弃去25μL。1-11每孔加入4U(单位)的标准抗原25μL，室温静置25min，每孔再加1％鸡红细胞悬液25μL，混匀；静置30min(18-22℃)后判定结果。

实验结果如表7所示。

表7体液免疫结果

2、细胞免疫检测：MTT法测定淋巴细胞增殖指数

每组鸡随机抽取5只在首免后14d，28d，42d，56d进行细胞免疫水平的检测。

①淋巴细胞分离：

取新鲜抗凝血1-2mL，与稀释液1:1混匀；

取与混合液等体积的细胞分离液于10mL玻璃离心管，小心加入混合液于分离液之液面上(勿混匀)；

以400g(约1500rpm)离心15min(半径15CM水平转子)；

第二层为环状乳白色淋巴细胞层，收集第二层细胞放入含4-5mL细胞洗涤液的试管中，充分混匀后，以1800rpm离心20min，弃去上清留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需细胞。用600μL加血清和双抗的培养基重悬即得淋巴细胞悬液。(细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，吹打100次左右。)

②MTT法测定淋巴细胞增殖指数SI:

将淋巴细胞悬液加入96孔培养板(向每孔中用枪头加入细胞时不可太快，否则细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲力而聚集于孔底)，100μL/孔，前3孔加10μL浓度为1mg/mL的ConA，后3孔不加ConA。置37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养44h，再每孔加5mg/mL MTT溶液10μL，继续培养4h。细胞培养终止后，吸去每孔液体，加入DMSO溶液100μL，避光37℃静置约15min，用酶标仪测定各孔OD值，测定波长为490nm。以刺激指数(SI，又称活化指数)作为判断T淋巴细胞转化程度的指标。

空白对照组加培养基、(ConA)、MTT、DMSO。

③计算SI

SI＝ConA刺激孔平均OD值/无ConA刺激孔平均OD值。

实验结果如表8所示，结果显示微球VLP注射组和微球VLP口服组的SI值高于生理盐水组/微球口服组/微球注射组，且差异极显著(p<0.01)，且试验组的刺激指数SI均达到有效刺激值(有效刺激指数应大于等于3)。因此，从以上数据可以看出微球VLP注射组和微球VLP口服组均产生有效的细胞免疫。

表8细胞免疫结果

SI(刺激指数)	E-微球VLP注射	F-微球VLP口服	生理盐水	微球(口服)	微球(注射)
						14d	3.1517±0.26	3.1542±0.14	0.0013±0.24	1.0134±0.20	0.9945±0.27
28d	3.1533±0.15	3.1559±0.22	0.9991±0.22	1.0212±0.18	1.0001±0.16
						42d	3.1495±0.25	3.1539±0.14	1.0008±0.22	0.9923±0.30	1.0074±0.28
56d	3.1499±0.27	3.1554±0.24	0.9997±0.23	0.9899±0.25	1.0127±0.24

本发明病毒样颗粒(virus-Like particLes，VLP)是一种空心颗粒，在其颗粒内含有禽流感病毒的结构蛋白，这些结构蛋白可以是一个也有可能是很多个。因为VLP是病毒颗粒并没有病毒的核酸物质，所以VLP不能够自主进行复制，也不具有所有病毒都具有的感染性。然而，在VLP表面能够呈现出高密度重复行，进行抗原表位的表达，从而可以刺激机体产生较为强烈的免疫应答，具有更广泛的抗感染谱，能有效预防家禽禽流感的发生，同时也适合于老年人、小孩等高危人群的使用。

本发明的上述实施例仅仅是为说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化和变动。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

<110> 重庆理工大学、重庆拜洛德生物制品有限公司；

<120> 一种预防用H9N2型流感病毒样颗粒疫苗及其制备方法；

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 560

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO.1氨基酸序列

<400> 1

METASLITML LVATVSNADK ICIGYQSTNS TETVDTLTEN NVPVTHAKEL LHTEHNGMLC 60

ATSLGHPLIL DTCTVEGLIY GNPSCDPLLG GREWSYIVER PSAVNGLCYP GNVENLEELR 120

SLFSSASSYQ RIQIFPDTIW NVSYSGTSKA CSDSFYRSMR WLTQKNNAYP IQDAQYTNHQ 180

EKNILFMWGI NHPPTDTAQT NLYTRTDTIT SVATEEINRT FKPLIGPRPL VNGLQGRIDY 240

YWSVLKPGQT LRIRSNGNLI APWYGHILSG ESHGRILKTD LKRGSCTVQC QTEKGGLNTT 300

LPFQNVSKYA FGNCSKYIGI KSLKLAVGLR NVPSRSSRGL FGAIAGFIEG GWSGLVAGWY 360

GFQHSNDQGV GMAADRDSTQ KAIDKITSKV NNIVDKMNKQ YEIIDHEFSE VETRLNMINN 420

KIDDQIQDIW AYNAELLVLL ENQKTLDEHD ANVNNLYNKV KRALGSNAVE DGKGCFELYH 480

KCDDQCMETI RNGTYNRRKY QEESKLERQK IEGVKLESEG TYKILTIYST VASSLVIAMG 540

FAAFLFWAMS NGSCRCNICI 560

<210> 2

<211> 1683

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO.2核苷酸序列

<400> 2

atggaaacag catcactaat aactatgcta ctagtagcaa cagtaagcaa tgcagacaaa 60

atctgcatcg gctaccaatc aacaaactcc acagaaactg tagacacact tacagaaaac 120

aatgtccctg tgacacatgc caaagaactg ctccacacag agcataatgg gatgttgtgt 180

gcaacaagct tgggacatcc tcttattcta gacacctgta ctgttgaagg actaatctat 240

ggcaatccgt cttgtgaccc actgttggga ggaagagaat ggtcctatat cgtcgagaga 300

ccatcggctg ttaatggatt gtgttacccc gggaatgtag aaaatctaga ggagctaagg 360

tcacttttta gttctgctag ttcttatcaa aggatccaga tttttccaga cacaatctgg 420

aatgtgtctt acagtgggac tagcaaagca tgttcagatt cattctacag aagcatgaga 480

tggttgaccc aaaagaacaa cgcttaccct attcaagatg cccaatacac aaatcatcaa 540

gaaaaaaaca ttcttttcat gtggggcata aaccacccac ccaccgatac tgcgcagaca 600

aatctgtaca caagaaccga cacaataaca agtgtggcaa cagaagaaat aaataggacc 660

ttcaaaccat tgatagggcc aaggcctctt gttaatggtt tgcaggggag aattgactat 720

tattggtcgg tattgaaacc aggtcaaaca ctgcgaataa gatccaatgg gaatctaata 780

gctccatggt atggacacat tctttcagga gagagccacg gaagaatcct gaagactgat 840

ttaaaaaggg gtagctgcac agtgcaatgt cagacagaaa aaggtggctt aaacacaaca 900

ttgccattcc aaaacgtaag taagtatgca tttggaaact gctcgaaata tattggaata 960

aagagtctca aacttgcagt cggtctgaga aatgtgcctt ctagatctag tagaggacta 1020

ttcggggcca tagcaggatt catagaagga ggttggtcag gactagttgc tggttggtat 1080

ggattccagc attcaaatga ccaaggggtt ggtatggcag cagatagaga ctcaacccaa 1140

aaggcaattg ataaaataac atccaaggtg aataacatag tcgacaaaat gaacaagcag 1200

tatgaaatta ttgatcatga attcagtgag gttgaaacta gacttaacat gatcaataac 1260

aagattgatg atcaaatcca agacatatgg gcatataatg cagaattgct agttctgctt 1320

gaaaaccaga aaacactcga tgagcatgat gcaaatgtaa acaatctata taataaagtg 1380

aagagggcat tgggttccaa tgcggtggaa gatgggaaag ggtgtttcga gctataccac 1440

aaatgtgatg accagtgcat ggagacaatc cggaatggga cctacaacag gaggaagtat 1500

caagaggaat caaaattaga aagacagaaa atagaggggg tcaagctgga atctgaagga 1560

acttacaaaa tcctcaccat ttattcgact gtcgcctcat ctcttgtgat tgcaatgggg 1620

tttgctgcct tcttattctg ggccatgtcc aatgggtctt gcagatgcaa catttgtata 1680

taa 1683

<210> 3

<211> 466

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO.3氨基酸序列

<400> 3

MNPNQKIIAI GSVSLTIAII CFLMQIAILT TTMTLHFRQN ECSNPSNNQV VPCEPIIIER 60

NTVHLNSTTI EKEICPKVAE YKNWSKPQCQ ITGFAPFSKD NSIRLSASGD IWVTREPYVS 120

CNLGKCYQFA LGQGTTLKNK HSNGTTHDRI PHRTLLMNEL GVPFHLGTKQ VCIAWSSSSC 180

HDGKAWLHIC VTGDDKNATA SIIYDGMLVD SIGSWSKNIL RTQESECVCI NGTCAVVMTD 240

GSASGKADTR ILFIREGKII NIRPLSGSAQ HVEECSCYPR YPEVRCVCRD NWKGSNRPAL 300

YINMADYSIE SSYVCSGLVG DTPRDDDNSS SSNCRDPNNE RGGPGVKGWA FDDGNDIWMG 360

RTIKSDSRSG YETFRVVNGW ITANSKSQIN RQVIVDSDNW SGYSGIFSVE GKNCINRCFY 420

VELIRGRPQE TRVWWTSNSI IVFCGTSGTY GTGSWPDGAN INFMPI 466

<210> 4

<211> 1401

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO.4核苷酸序列

<400> 4

atgaatccaa atcagaagat aatagcaatt ggctctgttt ctctaaccat tgcgataata 60

tgttttctca tgcagattgc catcttaaca acgaccatga cactacattt caggcagaat 120

gaatgcagca acccatcgaa taatcaagtg gtgccatgtg aaccgatcat aatagagagg 180

aacacagtgc atttgaatag tactaccata gaaaaggaaa tttgtcctaa agtggcagaa 240

tacaagaatt ggtcaaagcc acaatgtcaa attacagggt tcgctccttt ctcaaaggac 300

aactcaatta ggctttctgc aagtggtgat atctgggtga caagagaacc ttatgtgtcg 360

tgcaatcttg gcaaatgtta tcaatttgca cttggacagg gaaccactct gaaaaacaag 420

cactcaaatg gcactacaca tgataggatt ccccacagaa ctcttttaat gaatgagtta 480

ggtgtcccat tccatttggg aaccaaacaa gtgtgcatag catggtctag ttcaagctgc 540

catgatggga aagcatggct acatatttgt gtgactgggg atgataaaaa tgctactgct 600

agtatcattt atgatgggat gctggttgac agtattggtt catggtccaa aaacatccta 660

agaactcagg agtcagaatg cgtttgcatc aatggaactt gtgcagtagt aatgactgat 720

ggaagtgcat caggaaaggc tgacactaga atattgttca taagagaggg aaaaattata 780

aacattaggc cattgtcagg aagtgctcag cacgtggagg aatgctcctg ttacccccgg 840

tatcctgaag tcaggtgtgt ttgcagagac aattggaagg gctccaatag gcccgctcta 900

tatataaata tggcagatta tagtattgag tccagttatg tgtgctcagg acttgttggc 960

gacacaccaa gagatgatga taactccagc agcagcaact gcagagaccc caataacgaa 1020

agagggggcc caggagtgaa agggtgggcc tttgacgatg ggaatgacat ttggatggga 1080

cgaacaatca aaagtgattc acgctcaggt tatgaaactt ttagggtcgt taatggttgg 1140

atcacggcta attccaagtc acagataaat aggcaagtca tagttgacag tgacaactgg 1200

tctgggtatt ctggtatctt ctctgttgaa ggcaagaact gcatcaacag gtgtttttat 1260

gtggagttga taagagggag accacaggag accagagtgt ggtggacatc aaacagcatc 1320

attgtattct gtggaacctc aggtacatat ggaacaggct catggcctga tggggcgaat 1380

atcaacttca tgcctatata a 1401

<210> 5

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO.5氨基酸序列

<400> 5

TYVLSIIPSG PLKAEIAQRL EDVFAGKNTD LEALMEWLKT RPILSPLTKG ILGFVFTLTV 60

PSERGLQRRR FVQNALNGNG DPNNMDRAVK LYKKLKREMT FHGAKEVALS YSTGALASCM 120

GLIYNRMGTV TTEVALGLVC ATCEQIADSH HRSHRQMATT TNPLIRHENR MVLASTTAKA 180

MEQMAGSSEQ AAEAMEVASQ ARQMVQAMRT IGTQPSSSAG LKDDLIENLQ AYQKRMGVQM 240

QRFK 244

<210> 6

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO.6核苷酸序列

<400> 6

acgtacgttc tctctatcat cccgtcaggc cccctcaaag ccgagatcgc gcagagactt 60

gaagatgtct ttgcagggaa gaacacagat cttgaggctc tcatggaatg gctaaagaca 120

agaccaatcc tgtcacctct gactaagggg attttagggt ttgtgttcac gctcaccgtg 180

cccagtgagc gaggactgca gcgtagacga tttgtccaaa atgccctaaa tgggaatgga 240

gacccaaaca acatggacag ggcagtcaaa ctatacaaga agctgaagag ggaaatgacg 300

ttccatggag caaaggaagt tgcactcagt tactcaactg gtgcgcttgc cagttgcatg 360

ggtctcatat acaaccgaat gggaacggta accacagaag tggctcttgg cctagtatgt 420

gccacttgtg agcagattgc tgattcacac cataggtctc acagacagat ggcgactacc 480

accaacccac taatcaggca tgagaacaga atggtactag ccagcactac agctaaggcc 540

atggagcaaa tggctggatc gagtgagcag gcagcggaag ccatggaggt tgcaagtcag 600

gctaggcaga tggtgcaggc gatgaggaca attgggactc aacctagctc cagtgcaggc 660

ctgaaagatg atcttattga aaatttgcag gcataccaga aacggatggg ggtgcagatg 720

cagcgattca agtga 735

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO.7核苷酸序列

<400> 7

ggggaatttc acaaccactc aag 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO.8核苷酸序列

<400> 8

ttgagtagaa acaagggtgt ttc 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO.9核苷酸序列

<400> 9

agcaaaagca ggagtgaaaa tga 23

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO.10核苷酸序列

<400> 10

cgcaactaga aacaaggagt t 21

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO.11核苷酸序列

<400> 11

atgagccttc taaccgaggt cga 23

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO.12核苷酸序列

<400> 12

gaggatcact tgaatcgctg c 21

<210> 13

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物M13-F核苷酸序列

<400> 13

gttttcccag tcacgac 17

<210> 14

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物M13-R核苷酸序列

<400> 14

caggaaacag ctatgac 17

Claims

1.一种预防用H9N2型流感病毒样颗粒疫苗，其特征在于，其组分包括H9N2型流感病毒样颗粒；其中，所述H9N2型病毒样颗粒为H9N2型流感病毒的病毒样空壳颗粒结构，所述空壳颗粒结构的囊膜表面含有H9N2型流感病毒的结构蛋白；

所述结构蛋白为H9N2型流感病毒的血凝素HA蛋白、神经氨酸酶NA蛋白和基质蛋白M1；其中，所述HA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述HA蛋白的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；所述NA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码所述NA蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述M1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码所述M1蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述疫苗的组分还包括佐剂；所述佐剂为微球佐剂；

所述微球佐剂采用如下方法制备：

1）将乙酸、吐温-80、水和壳聚糖混合均匀，配制成混合溶液，所述混合溶液中壳聚糖的质量浓度为0.25%~0.3%、乙酸的质量浓度为2%~2.5%、吐温-80的质量浓度为1%~1.2%；

2）在磁力搅拌和超声作用下，将质量浓度为10%~15%的Na₂SO₄溶液以1~1.2 mL/min的速度滴入步骤1）配制的混合溶液中，持续磁力搅拌和超声作用20~25min后，以2750~3500r/min离心20~30min，用超纯水清洗离心沉淀物，以2750~3500r/min离心20~30min，再次重复两次洗涤离心后，将沉淀物冷冻干燥，得到微球佐剂；其中，所述Na₂SO₄溶液与所述混合溶液的体积比为1:100~120。

2.一种如权利要求1所述预防用H9N2型流感病毒样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）根据权利要求1所述SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，合成HA、NA和M1基因，并设计合成HA、NA和M1基因的引物，供检测之用；其中，HA基因的上游引物序列如SEQ ID NO.7所示，HA基因的下游引物序列如SEQ ID NO.8所示，NA基因的上游引物序列如SEQ ID NO.9所示，NA基因的下游引物序列如SEQ ID NO.10所示，M1基因的上游引物序列如SEQ ID NO.11所示，M1基因的下游引物序列如SEQ ID NO.12所示；

2）用限制性内切酶BamHI和NotI对昆虫杆状病毒表达载体pFastBac-DuaL和合成的M1基因进行酶切并连接过夜后，转化入感受态细胞进行培养，抽提阳性克隆的重组质粒DNA，得到重组质粒pFastBac-DuaL-M1；所述感受态细胞为DH5a感受态细胞；

3）用限制性内切酶SmaI和NheI酶对步骤2）得到的重组质粒pFastBac-DuaL-M1和合成的HA基因进行酶切并连接过夜后，转化入感受态细胞进行培养，抽提阳性克隆的重组质粒DNA，得到重组质粒pFastBac-DuaL-HA-M1；

4）用限制性内切酶SmaI和NheI酶对步骤3）得到的重组质粒pFastBac-DuaL-HA-M1和合成的NA基因进行酶切并连接过夜后，转化入感受态细胞进行培养，抽提阳性克隆的重组质粒DNA，得到重组质粒pFastBac-DuaL-HA-NA-M1；

5）将步骤4）得到的重组质粒pFastBac-DuaL-HA-NA-M1转导入E.coLi感受态细胞株DH10Bac细胞中，并经过蓝白筛选，挑取白色菌落，并提取质粒，得到质粒rBacmid-HA-NA-M1；

6）将步骤5）得到的质粒rBacmid-HA-NA-M1转染SF9昆虫细胞，得到重组杆状病毒；

7）将步骤6）得到的重组杆状病毒感染SF9昆虫细胞，培养后收集上清液，并对上清液进行纯化，得到H9N2型流感病毒样颗粒；

8）将佐剂溶于步骤7）得到的所述H9N2型流感病毒样颗粒中，于37℃下孵育3h后，离心弃去上清液，对沉淀进行清洗，即得到所述预防用H9N2型流感病毒样颗粒疫苗。

3.根据权利要求2所述预防用H9N2型流感病毒样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤3）和步骤4）中所述感受态细胞均为E.coLiDH5a感受态细胞。