CN107353328A - 一种重组的h9n2亚型禽流感病毒样颗粒及其制备方法和用途 - Google Patents

一种重组的h9n2亚型禽流感病毒样颗粒及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种重组的H9N2 亚型禽流感病毒样颗粒，含有A/ chicken/Shanghai/06/2015(H9N2)的HA蛋白和NA蛋白。本发明还提供了上述重组的H9N2 亚型禽流感病毒的制备方法，利用RT‑PCR 法扩增HA和NA 基因片段，并同时亚克隆至杆状病毒穿梭质粒中，构建重组杆状病毒穿梭质粒，转染Sf9 昆虫细胞，获得重组的H9N2 亚型禽流感病毒样颗粒。本发明的表达的重组蛋白经透射电镜观察具有病毒样颗粒的形态结构。本发明的病毒可同时表达HA、NA蛋白，2 种蛋白可自行组装成VLPs，并分泌至细胞培养上清中，血凝效价可达1∶64。

Description

一种重组的H9N2亚型禽流感病毒样颗粒及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种重组杆状病毒样颗粒，具体来说是一种重组的H9N2亚型禽流感病毒样颗粒及其制备方法和用途。
背景技术
接种疫苗是预防禽流感发生与传播最有效的手段之一，对提高我国的禽病防制水平，保障我国养禽业的健康发展有十分积极的意义。目前使用的H9N2亚型禽流感疫苗均为灭活疫苗，我国有多个厂家生产的10多株H9N2亚型禽流感系列灭活苗，使用的疫苗株皆为2001年前分离获得的。近年来，我国H9N2亚型的禽流感病毒分离株的抗原性发生了很大变化，疫苗毒株升级迫在眉睫。研究发现，1998年-2006年间的毒株抗原性无变化，疫苗的保护率为100％。而对2009－2010年禽流感的流行病学研究中发现，H9抗体较高的免疫鸡依然携带H9N2亚型AIV。表明现有的H9N2亚型AIV灭活疫苗免疫鸡只后，尽管能使鸡只产生较高的抗体，但已经不能有效地保护其免受当前H9N2亚型AIV流行株的攻击。因此，商品化H9N2亚型AIV灭活疫苗的制备毒株急需更新。
病毒样颗粒(Virus-like particle，VLP)疫苗以其安全性和抗病毒的有效性，成为近年研究的热点。目前，已经有乙型肝炎病毒和人类乳头瘤病毒VLP疫苗上市，并获得了巨大的经济收益。VLP没有病毒核酸，不能自主复制，因而其非常安全。VLP在形态上与真正病毒粒子相同或相似，作为颗粒性抗原可激活树突状细胞等抗原提呈细胞，将其提呈给T，B淋巴细胞，从而有效地诱导机体产生有效的免疫保护反应，且具有广泛的交叉免疫作用，而后者是应对当前流感病毒抗原变异快速的关键。呼吸道黏膜不仅是流感病毒的感染部位，也是宿主防御病毒感染的部位，因而黏膜免疫是流感病毒疫苗研究中急需解决的问题。现有的传统流感病毒灭活疫苗是无法激发黏膜免疫。而VLP流感疫苗可通过鼻内吸入，更容易引起黏膜免疫，因而更具广阔的应用前景。目前，国外学者利用杆状表达系统平台，已经成功制备了H1N1、H3N2、H5N1、H5N3、H7N1、H7N9、H9N2等VLPs。此外，在影响流感VLP形成的关键病毒成分研究上，Chen等和张树梅等的结果皆表明，仅流感病毒的HA和NA两个蛋白，即可完成流感VLPs的合成和出芽，进一步地奠定了流感病毒VLPs疫苗研究的理论基础。与传统鸡胚培养的方式相比，VLP疫苗还具有反应快速的卓越性。鸡胚生产疫苗的技术，至少耗时6-7个月的时间，还常受到鸡胚来源不足的制约，难以在短时间内生产足够的疫苗以满足潜在流行或大流行的防控需求；产生大量的废物，这些废物的处理不仅需要消耗大量的能源，而且也容易造成环境污染。VLPs疫苗技术没有上述的缺点，且不用分离病毒，只需知道病毒的序列，即可作出快速反应。比如，在H7N9禽流感疫情发生后一个月左右，美国Medicago公司即宣布研发出H7N9禽流感VLPs疫苗。这种在疫情面前高效的疫苗制备技术，对于可能产生巨大经济损失的家禽养殖业、对于可能失去了成员的家庭、对于人心忐忑的社会具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种重组的H9N2亚型禽流感病毒样颗粒及其制备方法和用途，所述的这种重组的H9N2亚型禽流感病毒样颗粒及其制备方法和用途要解决现有技术中的疫苗对于预防当前H9N2亚型AIV流行株的效果不佳的技术问题。
本发明提供了一种重组的H9N2亚型禽流感病毒样颗粒，含有A/chicken/Shanghai/06/2015(H9N2)的HA蛋白和NA蛋白。
进一步的，所述的编码HA蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步的，所述的编码NA蛋白的核苷酸基因序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了上述的一种重组的H9N2亚型禽流感病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤：
1)一个设计引物的步骤，根据A/chicken/Shanghai/06/2015(H9N2)的HA基因和NA基因，设计引物，所述的HA基因的上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，所述的HA基因的上游引物序列如SEQ ID NO.4所示；所述的NA基因的上游引物序列如SEQ ID NO.5所示，所述的NA基因的上游引物序列如SEQ ID NO.6所示；
2)一个将HA和NA基因进行扩增的步骤，提取禽流感毒株A/chicken/Shanghai/06/2015(H9N2)基因组RNA，逆转录合成cDNA，以其为模板，利用引物HA基因的上游和下游序列、NA基因的上游和下游序列进行RT-PCR扩增；
3)将扩增后的HA基因酶切后连接于载体，转化后，挑取白色菌落，提取质粒，获得含有HA基因的重组质粒；将扩增后的NA基因酶切后连接于含有HA基因的重组质粒，获得含有HA基因和NA基因重组质粒；
4)将含有HA基因和NA基因重组质粒的DNA在脂质体介导下转染对数生长期的Sf9细胞，培养后收集细胞上清，收获同时含有HA蛋白和NA蛋白的重组的H9N2亚型禽流感病毒样颗粒。
进一步的，所述的载体为pFastBacDual，采用大肠杆菌DH5α进行转化。
本发明还提供了上述的一种疫苗，含有权利要求1所述的重组的H9N2亚型禽流感病毒样颗粒。
本发明利用RT-PCR法从禽流感A/chicken/Shanghai/06/2015(H9N2)中扩增HA和NA基因片段，并同时亚克隆至杆状病毒穿梭质粒pFastBacDual中，构建了重组杆状病毒穿梭质粒，转染Sf9昆虫细胞，包装重组杆状病毒Bacmid-HA-NA。
通过Western blot法和血凝试验检测HA和NA蛋白在Sf9细胞中的表达；表达的重组蛋白经透射电镜观察具有病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)的形态结构。结果已成功构建了重组杆状病毒，该病毒可同时表达HA、NA蛋白，2种蛋白可自行组装成VLPs，并分泌至细胞培养上清中，血凝效价可达1∶64。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。由于目前流行的H9N2流感基因型和抗原性与现有的灭活疫苗存在差异，本发明构建同时含有禽流感A/chicken/Shanghai/06/2015(H9N2)的血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)2种基因的重组杆状病毒，构建的重组杆状病毒可表达VLPs，为禽流感新型疫苗的研制奠定了基础。
附图说明
图1显示了重组质粒的酶切鉴定结果。
图2显示了重组杆粒rBacmid-HA-NA的PCR鉴定结果。
图3显示了转染后细胞病变的情况。
图4显示了P1、P2、P3代病毒的PCR鉴定结果。
图5显示了透射电镜观察病毒样颗粒的形态。
图6显示了重组蛋白表达的鉴定结果，a为VLP和Sf9细胞上清的SDS-PAGE和westernblot结果；b为VLP血凝试验效价。
图7显示了神经氨酸酶的试验结果。
图8显示了在二免后一周用106EID50 A/chicken/Shanghai/06/2015(H9N2)攻毒，第1、2、3、5天气管排毒结果，VLP免疫组的排毒滴度均比商业疫苗(A/chicken/Shanghai/F/1998)和PBS对照组低，但是仅在第二天和第三天差异显著(p＜0.05)。
具体实施方式
实施例1
1.1质粒、菌株及细胞：杆状病毒穿梭质粒pFast-BacDual、基因工程菌DH10Bac[含有杆状病毒质粒(Bacmid)Bmon14272、转座辅助质粒(Helper plasmid)pMON7214]均购自Invitrogen公司；感受态大肠杆菌DH5α购自TaKaRa；雌性草地贪夜蛾蛹卵巢细胞Sf9购自ATCC，编号：CRL-1711，货号：4093648。
1.2毒株：禽流感A/chicken/Shanghai/06/2015(H9N2)由本实验室分离保存。(该毒株已在genebank上公开了序列，序列号为GenBank KU720440和KU720446)。
1.3主要试剂：MagPure Viral RNA Kit for MagMax Express购自美吉公司；PrimeScript one-step RT-PCR Kit，T4DNA连接酶，DNA marker，XhoI，KpnI，BamHI，EcoRI，质粒DNA提取试剂盒，胶回收试剂盒均购自TaKaRa公司；ampicillin，kanamycin，gentamicin，tetracycline，IPTG均购自上海生工；LB琼脂和LB培养基购自OXFOID公司；S.O.C.Medium，PureLinkTM HiPure Plasmid DNA Miniprep Kit，转染试剂盒CellfectionⅡReagent，Sf-900TM III SFM，Grace’s Insect Cell Culture Medium Unsupplemented，Grace’s Insect Cell Culture Medium(2X)，4％agar均购自Invitrogen公司；鸡抗A/chicken/Shanghai/06/2015(H9N2)抗血清由本实验室制备；Bluo-gal，HRP标记的羊抗鸡IgY，Neuraminidase Assay Kit购自Sigma公司。禽流感血凝素分型血清(H9)由哈尔滨兽医研究所提供。
1.4实验动物：SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，21日龄SPF白色莱航鸡，购自中国农业科学院上海兽医研究所。
1.5引物设计及合成
根据GenBank中登录的A/chicken/Shanghai/06/2015(H9N2)的HA基因(KU720440)(SEQ ID NO.1)和NA基因(KU720446序列)(SEQ ID NO.2)，利用Primer5.0引物分析软件设计引物，
序列如下：
HAP1(SEQ ID NO.3)：
HAP2(SEQ ID NO.4)： 扩增片段大小为1683bp；
NAP1(SEQ ID NO.5)：
NAP2(SEQ ID NO.6)：扩增片段大小为1401bp。
斜体带横线部分为酶切位点，引物由上海桑尼生物工程技术服务有限公司合成。
1.6 HA和NA基因的扩增及克隆
提取禽流感毒株A/chicken/Shanghai/06/2015(H9N2)基因组RNA，逆转录合成cDNA，以其为模板，利用引物HAP1、HAP2，NAP1、NAP2进行RT-PCR扩增。
反应条件：50℃30min；95℃5min；95℃30s，52℃30s，72℃2min，共30个循环；72℃10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。胶回收目的片段HA和NA，HA两端的酶切位点为XhoI和KpnI，NA两端的酶切位点为BamHI和EcoRI，先后克隆至杆状病毒穿梭质粒pFast-BacDual中，转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，经PCR及酶切鉴定，鉴定正确的质粒命名为pFastBacDual-HA-NA。
将HA基因(XhoI和KpnI)酶切连接于pFastBacDual载体，转化大肠杆菌DH5α，挑取白色菌落，提取质粒，鉴定(HA约1700bp，图1)并测序验证正确，获得重组质粒pFastBacDual-HA；按照同样的方法，将NA基因(BamHI和EcoRI)连接于重组质粒pFastBacDual-HA，获得重组质粒pFastBacDual-HA-NA，鉴定(NA约1400bp，图1)并测序验证正确。
1.7重组杆状病毒穿梭质粒的构建
将质粒pFast-BacDual-HA-NA转化DH10Bac感受态细胞，经卡那霉素(50μg/ml)、四环素(10μg/ml)和庆大霉素(7μg/ml)筛选重组转座子Bacmid-HA-NA，提取质粒，阳性杆粒用pUC/M13上下游引物进行PCR扩增，按照说明书操作。
分别提取重组质粒转化感受态E.coli DH10Bac：将重组质粒的浓度稀释为0.2ng/ul，取5ul重组质粒缓慢加入到感受态E.coli DH10Bac中并混匀，冰浴30min后42℃热激45s，然后将混合物迅速转移至冰浴中2-3min，加入1mlLB培养基，37℃摇床200rpm孵育4h，将扩大培养后的菌液做10-1、10-2、10-3连续稀释，从10-2、10-3稀释液中各取200ul涂板，所用平板为含有X-gal、IPTG的三抗(7ug/ml庆大霉素、50ug/ml卡那霉素、10ug/ml四环霉素)固体LB培养基上，37℃温箱培养36-48h，直到有白斑出现，挑选白斑菌落，加入含三抗(7ug/ml庆大霉素、50ug/ml卡那霉素、10ug/ml四环霉素)的LB培养基中37℃摇床200rpm培养12h。通过蓝白斑进行3轮筛，挑取白色菌落，提取质粒并鉴定(阳性杆粒用pUC/M13上下游引物进行PCR扩增可见到5660bp大小的条带，而阴性则扩增出300bp大小的条带(见图2)。重组杆状病毒基因组DNA的提取采用PureLinkTM HiPure Plasmid DNA Maxiprep Kit，用于下一步转染。
1.8重组杆状病毒的包装
按照昆虫杆状病毒Bac-to-Bac表达系统(Invitrogen公司)说明书进行操作，将重组转座子Bacmid-HA-NA的DNA在脂质体介导下转染对数生长期的Sf9细胞，收获同时含有HA和NA 基因的重组杆状病毒。
用rBacmid-HA-NA转染Sf9昆虫细胞，在27℃培养，观察细胞病变，当细胞病变明显时(图3)，收集细胞上清(即P1代病毒)，获得重组杆状病毒。
将P1代重组病毒接种Sf9昆虫细胞，待细胞病变明显时，收集细胞上清(即P2代病毒)；依此法，继续获得P3代病毒并用PCR鉴定(图4)，可以看到P1、P2、P3代细胞上清均能扩出5660bp的条带，正常细胞上清对照则没有条带。
1.9 HA和NA蛋白在Sf9细胞中表达的检测
1.9.1 Western blot
收集重组杆状病毒感染细胞72h的上清，2000g，30minutes离心，经12％SDS-PAGE分离，电转移至硝酸纤维膜上，一抗为抗A/chicken/Shanghai/06/2015(H9N2)的鸡血清，二抗为HRP标记的羊抗鸡IgY(1∶1 000稀释)，以正常细胞上清作为阴性对照。
Western blot分析显示，在相对分子质量约70 000和46 000处，可见明显条带，Sf9细胞则无明显条带，见图6a。
1.9.2血凝试验
收集重组杆状病毒感染细胞72h的上清，2000g，30minutes离心，操作按GB/T18936-2003进行，以未重组杆状病毒的细胞上清作为阴性对照。
重组杆状病毒表达的蛋白具有血凝活性，血凝效价可达1∶64，见图6b。
1.9.3神经氨酸酶试验
离心后的上清使用Neuraminidase Assay Kit进行分析，分别以A/chicken/Shanghai/06/2015(H9N2)和未重组杆状病毒的细胞上清作为阳性对照和阴性对照。
VLP神经氨酸酶试验结果为1.9Unit/L，A/chicken/Shanghai/06/2015(H9N2)结果为2.0Unit/L，Sf9上清为0详细结果见图7。可知，NA蛋白表达正确。
1.9.4重组蛋白的形态学观察
离心后的上清，送华东师范大学进行电镜检测。
用透射电镜观察颗粒形态(图5)，可以观察到约80nm左右的圆形颗粒。
1.10免疫试验设计
首先将15只21日龄的SPF鸡分成3个组，每组5只鸡，第一组肌肉注射0.2ml(VLP和佐剂体积比为1:1)VLP疫苗，一免使用完全弗氏佐剂，二免使用不完全弗氏佐剂；第二组免疫商品化灭活疫苗(A/chicken/Shanghai/F/1998)，按照说明书一免和二免均肌肉注射0.2ml；第三组为不免疫疫苗只用于攻毒；在免疫前，一免后一周和二免后一周均采血，检测HI效价。二免后一周在每个免疫组中分别经滴鼻点眼途径，攻毒量106EID50(毒株为A/chicken/Shanghai/06/2015(H9N2))。攻毒后第1、2、3、5天采集所有试验鸡的泄殖腔及咽拭子进行EID50测定，数据以x±SE表示，以SPSS软件统计分析。
使用2种不同的毒株(A/chicken/Shanghai/10/2001和A/chicken/Shanghai/06/2015)作为HI试验的抗原，发现免疫前三个免疫组HI效价均为0，VLP疫苗免疫组针对A/chicken/Shanghai/06/2015的血凝抑制价在一免和二免后一周均达到1024；而对A/chicken/Shanghai/10/2001的血凝抑制价在二免后一周平均值为142.4；商业疫苗免疫组针对A/chicken/Shanghai/06/2015的血凝抑制价在二免后一周平均值为120；而对A/chicken/Shanghai/10/2001的血凝抑制价在一免和二免后一周均达到1024；不免疫攻毒组在这2个时间点HI效价均为0，检测结果详见表1。攻毒后第1、2、3、5天采集肛喉拭子,检测到只有喉拭子有排毒(mean titers log10 EID50/0.1mL±SD)，第1、2、3、5天喉拭子排毒结果表明：VLP免疫组的排毒滴度均比商业疫苗(A/chicken/Shanghai/F/1998)和PBS对照组低，但是仅在第二天和第三天差异显著(p＜0.05)，详见图8。
表1 疫苗免疫后的抗体反应
由图8可知，在二免后一周用106EID50 A/chicken/Shanghai/06/2015(H9N2)攻毒，攻毒后第1、2、3、5天采集肛喉拭子,检测到只有喉拭子有排毒(mean titerslog10EID50/0.1mL±SD)，第1、2、3、5天喉拭子排毒结果表明：VLP免疫组的排毒滴度均比商业疫苗(A/chicken/Shanghai/F/1998)和PBS对照组低，但是仅在第二天和第三天差异显著(p＜0.05)。
序列表
<110> 上海市动物疫病预防控制中心
<120> 一种重组的H9N2 亚型禽流感病毒样颗粒及其制备方法和用途
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1683
<212> DNA
<213> HA基因(A/ chicken/Shanghai/06/2015)
<400> 1
atggagacag tatcactaat aactatacta ctagtagcaa cagtgagcaa tgcagataaa 60
atctgcatcg gctaccaatc aacaaactcc acagaaactg tggacacact aacagaaaac 120
aatgtccctg tgacacatgc caaagaactg ctccacacag agcataatgg gatgctgtgt 180
gcaacaagct tgggacaacc tcttatttta gacacctgca ccattgaagg gctaatctat 240
ggcaatcctt cttgtgatct atcgctggaa ggaagagaat ggtcctatat cgtcgagaga 300
ccatcagctg ttaacggatt gtgttacccc gggaatgtag aaaatctaga agagctaagg 360
tcacttttta gttctgctag gtcttatcaa agaatccaga ttttcccaga cacaatctgg 420
aatgtgtctt acgatggaac aagcacagca tgctcaggtt cattctacag aagcatgaga 480
tggttgactc gaaagaacgg cgattaccct acccaagacg cccaatacac aaataatcaa 540
gggaagaaca ttcttttcat gtggggcata aatcacccac ccaccgatga tacgcagaga 600
aatctgtaca cgagaaccga cacaacaacg agtgtggcaa cagaagaaat aaataggatc 660
ttcaaaccat tgataggacc aaggcctctt gtcaacggtt tgatgggaag aattgattat 720
tattggtctg tattgaaacc gggtcaaaca ctgcgaataa aatctgatgg gaatctaata 780
gctccatggt atggacacat tctttcagga gagagccatg gaagaattct gaagactgat 840
ttaaaaaggg gtagctgcac agtgcaatgt cagacagaga aaggtggctt aaacacaaca 900
ttgccattgc aaaatgtaag taagtatgca tttggaaact gctcaaaata cattggcata 960
aagagtctca aacttgcagt tggtctgagg aatgtgcctt ctagatctag tagaggacta 1020
ttcggggcca tagcagggtt tatagaggga ggttggtcag gactagttgc tggttggtat 1080
gggttccagc attcaaatga tcaaggggta ggtatggcag cagatagaga ctcaacccaa 1140
aaggcaattg ataaaataac atccaaagtg aataatatag tcgacaaaat gaacaagcag 1200
tatgaaatca ttgatcatga attcagtgag gtagaaacta gacttaacat gatcaataat 1260
aagattgatg atcaaatcca ggatatatgg gcatataatg cagaattgct agttctgctt 1320
gaaaaccaga aaacactcga tgagcatgac gcaaatgtta acaatctata taataaagta 1380
aagagggcgt tgggttccaa tgcggtggaa gatgggaaag gatgtttcga actataccac 1440
aaatgtaatg accaatgcat ggagacaatt cggaacggga cctacaacag aaggaagtat 1500
caagaggagt caaaattaga aagacagaaa atagaggggg tcaagctgga atctgaagga 1560
acttacaaaa tcctcaccat ttattcgact gttgcctcat ctcttgtgat tgcaatgggg 1620
tttgctgcct ttttgttctg ggccatgtcc aatgggtctt gcagatgcaa catttgtgta 1680
taa 1683
<210> 2
<211> 1401
<212> DNA
<213> NA基因(A/ chicken/Shanghai/06/2015)
<400> 2
atgtctccaa atcagaagat aatagcaatt ggctctgttt ctctaatcat tgcgataata 60
tgtctcctca tgcaaattgc catcttaaca acgactatga cattacattt cgggcagaaa 120
gaatgcagta acccatcgaa taatcaagtg atgccatgtg aaccgatcat aatagaaagg 180
aacacagtgc atttgaatag tactaccata gagagggaaa tttgtcctaa agtagcagaa 240
tataaaaatt ggtcaaaacc acaatgtcta attacagggt tcgctccttt ctcaaaggac 300
aactcaatta ggctttctgc aggtggggat atctgggtaa caagagaacc ttatgtctca 360
tgcagtcccg acaaatgtta tcaatttgca cttgggcagg gaaccaccct gaaaaacaag 420
cactcaaatg gcactacaca tgatagaacc cctcacagaa ctcttttaat gaatgagtta 480
ggtgtcccat ttcatttagg aaccaaacaa gtgtgcatag catggtctag ttcaagctgc 540
tatgatggaa aagcatggtt acatatttgt gttactgggg atgataaaaa tgctactgct 600
agtatcatct atgatgggat gcttgttgac agtattggat catggtccaa aaacatcctc 660
agaactcagg agtcagaatg cgtttgcatc aatggaactt gtacagtagt aatgactgat 720
ggaagtgcat caggagtggc cgacactaga gtattattca taagagaagg aaaaattata 780
aatattagac cattgtcagg aagtgctcag cacgttgagg aatgctcctg ttatccccgg 840
tatcctgaaa ttagatgtgt ttgcagagac aattggaagg gctccaatag gcccattata 900
tatataaata tggctgatta tagcattgag tccagttatg tgtgctcagg acttgttggc 960
gacacaccaa gaaatgatga tagctccagc agcagcaact gcagagaccc taataacgaa 1020
agaggggccc caggagtgaa agggtgggct tttgacgacg ggaatgatgt ttggatggga 1080
cggacaatca aaaatggttc acgctcaggt tatgagactt ttagggtcat aaatggttgg 1140
accatggcta attcaaagtc acagataaat aggcaagtca tagttgacag tgacgactgg 1200
tctgggtatt ccggcatctt ctctgttgaa ggcaaagaat gcatcaacag gtgtttttat 1260
gtggagttga taagagggag accacaggaa cccagagtgt ggtggacatc aaatagcatc 1320
attgtattct gtggaacctc aggtacatat gggacaggct catggcctga tggagcgaat 1380
atcaacttca tgcctatata a 1401
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> HAP1上游引物(人工序列)
<400> 3
aatcctcgag atggagacag tatcactaat 30
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> HAP2下游引物(人工序列)
<400> 4
tgcaggtacc ttatacacaa atgttgcatc tgcaa 35
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> NAP1上游引物(人工序列)
<400> 5
agctggatcc atgtctccaa atcagaagat 30
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> NAP2下游引物(人工序列)
<400> 6
cttagaattc ttatataggc atgaagttga tattc 35

Claims (6)

1.一种重组的H9N2 亚型禽流感病毒样颗粒，其特征在于：含有A/ chicken/Shanghai/06/2015(H9N2)的HA蛋白和NA蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种重组的H9N2 亚型禽流感病毒样颗粒，其特征在于：所述的编码HA蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的一种重组的H9N2 亚型禽流感病毒样颗粒，其特征在于：所述的编码NA蛋白的核苷酸基因序列如SEQ ID NO.2所示。
4.权利要求1所述的一种重组的H9N2 亚型禽流感病毒样颗粒的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
一个设计引物的步骤，根据A/ chicken/Shanghai/06/2015(H9N2)的HA基因和NA基因，设计引物，所述的HA基因的上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，所述的HA基因的上游引物序列如SEQ ID NO.4所示；所述的NA基因的上游引物序列如SEQ ID NO.5所示，所述的NA基因的上游引物序列如SEQ ID NO.6所示；
一个将HA和NA基因进行扩增的步骤，提取禽流感毒株A/ chicken/Shanghai/06/2015(H9N2)基因组RNA，逆转录合成cDNA，以其为模板，利用引物HA基因的上游和下游序列、NA基因的上游和下游序列进行RT-PCR 扩增；
将扩增后的HA基因酶切后连接于载体，转化后，挑取白色菌落，提取质粒，获得含有HA基因的重组质粒；将扩增后的NA基因酶切后连接于含有HA基因的重组质粒，获得含有HA基因和NA基因重组质粒；
将含有HA基因和NA基因重组质粒的DNA在脂质体介导下转染对数生长期的Sf9细胞，培养后收集细胞上清，收获同时含有HA蛋白和NA蛋白的重组的H9N2 亚型禽流感病毒样颗粒。
5.根据权利要求4所述的一种重组的H9N2 亚型禽流感病毒样颗粒的制备方法，其特征在于：所述的载体为pFastBacDual，采用大肠杆菌DH5α进行转化。
6.一种疫苗，含有权利要求1所述的重组的H9N2 亚型禽流感病毒样颗粒。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109136199A (zh) * 2018-09-14 2019-01-04 青岛农业大学 一种表达h5亚型ha的复制缺陷型重组h9n2禽流感病毒
CN113264989A (zh) * 2021-05-17 2021-08-17 吉林大学 一种h9n2亚型禽流感嵌合病毒样颗粒制备方法及应用
CN113403343A (zh) * 2021-04-30 2021-09-17 吉林大学 一种h3n2与h9n2亚型禽流感二价嵌合型病毒样颗粒的制备

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1849134A (zh) * 2003-07-11 2006-10-18 诺瓦瓦克斯股份有限公司 功能性流感病毒样颗粒(VLPs)
WO2007047831A2 (en) * 2005-10-18 2007-04-26 Novavax, Inc. Functional influenza virus like particles (vlps)
CN105457023A (zh) * 2016-01-21 2016-04-06 重庆理工大学 一种预防用h9n2型流感病毒样颗粒疫苗及其制备方法
CN105969741A (zh) * 2016-06-15 2016-09-28 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 共表达h9亚型禽流感病毒ha和鸡白介素6蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1849134A (zh) * 2003-07-11 2006-10-18 诺瓦瓦克斯股份有限公司 功能性流感病毒样颗粒(VLPs)
WO2007047831A2 (en) * 2005-10-18 2007-04-26 Novavax, Inc. Functional influenza virus like particles (vlps)
CN105457023A (zh) * 2016-01-21 2016-04-06 重庆理工大学 一种预防用h9n2型流感病毒样颗粒疫苗及其制备方法
CN105969741A (zh) * 2016-06-15 2016-09-28 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 共表达h9亚型禽流感病毒ha和鸡白介素6蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XIN LI等: "Influenza virus-like partiproteins induce a protective immune response in chickencles harboring H9N2 HA and NA proteins induce a protective immune response in chicken", 《INFLUENZA AND OTHER RESPIRATORY VIRUSES》 *
李鑫等: "上海地区H9N2亚型禽流感病毒的遗传演化分析", 《微生物与感染》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109136199A (zh) * 2018-09-14 2019-01-04 青岛农业大学 一种表达h5亚型ha的复制缺陷型重组h9n2禽流感病毒
CN113403343A (zh) * 2021-04-30 2021-09-17 吉林大学 一种h3n2与h9n2亚型禽流感二价嵌合型病毒样颗粒的制备
CN113264989A (zh) * 2021-05-17 2021-08-17 吉林大学 一种h9n2亚型禽流感嵌合病毒样颗粒制备方法及应用

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