CN103740655A - H5n1禽流感病毒样颗粒及其应用和制备方法、疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种H5N1禽流感病毒样颗粒及其应用和制备方法、疫苗。本发明的H5N1禽流感病毒样颗粒，其包含HA蛋白、NA蛋白和M2蛋白，所述HA蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No：l，所述NA蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No：3，所述M2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No：5。本发明利用酵母表达系统最嗜好的核苷酸密码子，大片段合成HA、NA、M2结构蛋白的基因，构建HA、NA、M2在酵母表达系统的重组表达载体，并经面包酵母菌转染，制备高致病型禽流感病毒样粒子。

Description

H5N1禽流感病毒样颗粒及其应用和制备方法、疫苗

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种H5N1禽流感病毒样颗粒及其应用和制备方法、疫苗。

背景技术

高致病性禽流感的广泛传播和相继的人类感染使我们认识到人类正面临由H5N1型禽流感病毒引起流感大流行的危险。已经有50多个国家从禽类中分离到高致病性H5N1禽流感病毒。首例H5N1人禽流感病例于1997年出现在香港，而基因组分析结果表明此株H5N1病毒的HA基因来源于1996年广东省鹅H5N1分离毒株；华南地区（特别是广东）四季特征不明显，是鸟类迁徙的中转地，几次流感大流行都发源于此，一直被认为是世界流感的发源地之一。

病毒样颗粒(Virus-Like Particles，VLPs)是含有病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒，没有病毒的核酸，不能自主复制，其在形态上与真正病毒粒子相同或相似，可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞，有效诱导机体免疫系统产生免疫保护反应。病毒衣壳蛋白一般具有天然的自装配能力，并且VLPs没有感染性，稳定性好，不易失活，可以制备为良好的疫苗。利用基因工程的分子克隆、合成既具有病毒稳定的自然形态、又具有病毒完整的免疫原性、但又没有病毒任何的感染源性的病毒样颗粒VLP，要求同时具备病毒分子生物学、载体系统的结构生物学、生物工程和发酵工程等诸方面的知识、技术和工艺手段。因此，到目前为止，在病毒疫苗的研究领域，国际上仅有默克公司的用于预防子宫颈癌的人乳头瘤状病毒HPV的VLP疫苗上市。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用面包酵母高效生产高致病性H5N1禽流感病毒样颗粒及其应用和制备方法、疫苗。

本发明的一个技术方案为提供一种H5N1禽流感病毒样颗粒，其包含HA蛋白、NA蛋白和M2蛋白，所述HA蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No：l，所述NA蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No：3，所述M2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No：5。

优选的，上述的H5N1禽流感病毒样颗粒中，所述HA蛋白核苷酸序列为SEQ ID No:2，所述NA蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No:4，所述M2蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No:6。

本发明的另一技术方案为提供一种含有上述H5N1禽流感病毒样颗粒的疫苗。

优选的，上述的疫苗为固态制剂、肌注或喷雾型液态制剂。

本发明的另一技术方案为提供一种H5N1禽流感病毒样颗粒的用途，用于制备预防禽流感病毒相关疾病的组合物。

本发明的另一技术方案为提供一种H5N1禽流感病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤：将人工合成的禽流感病毒基因克隆到克隆载体中，所述禽流感病毒基因的核苷酸序列为SEQID No：3、SEQ ID No：4和SEQ ID No：6依次的组合，将克隆载体的禽流感病毒基因连入重组表达载体，将重组表达载体转入到酵母感受态细胞中进行发酵培养，培养后将培养物纯化即得H5N1禽流感病毒样颗粒。

优选的，上述的H5N1禽流感病毒样颗粒的制备方法中，所述克隆载体为PVD5质粒。

优选的，上述的H5N1禽流感病毒样颗粒的制备方法中，所述重组表达载为PTG3828质粒。

优选的，上述的H5N1禽流感病毒样颗粒的制备方法中，所述酵母感受态细胞为C13BYS86。

优选的，上述的H5N1禽流感病毒样颗粒的制备方法中，所述步骤“将重组表达载体转入到酵母感受态细胞中进行发酵培养，培养后将培养物纯化即得H5N1禽流感病毒样颗粒”具体为：将重组表达载体转染酵母感受态细胞C13BYS86，经30℃，72小时震荡培养饱和培养后，进行1分钟超声波裂解，3000rpm高速离心除细胞碎片，收集上清即为液态免疫原的H5N1禽流感病毒样颗粒。

本发明有益效果：本发明利用酵母表达系统最嗜好的核苷酸密码子，大片段合成HA、NA、M2结构蛋白的基因，构建HA、NA、M2在酵母表达系统的重组表达载体，并经面包酵母工程菌转染，制备高致病型禽流感病毒样粒子。

附图说明

图1为H5N1禽流感病毒样颗粒的凝血因子HA蛋白、神经氨酸酶NA蛋白和细胞基质M2蛋白的基因表达构架；

图2为H5N1禽流感病毒样颗粒的克隆载体pVD5质粒基因表达构架；

图3为H5N1禽流感病毒样颗粒的表达载体PTG3828质粒基因表达构架；

图4为H5N1禽流感病毒样颗粒的电子显微镜照片；

图5为H5N1禽流感病毒样颗粒抗原的Western-blot免疫检测法照片。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。

H5N1型禽流感病毒的核酸是单股RNA、有8个节段组成，每个节段编码1-2个蛋白，血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)和基质蛋白（M2）构成病毒的外壳；膜内层为基质蛋白M1；病毒颗粒的内部为核衣壳，由核蛋白（NP），三种聚合酶蛋白(PB1，PB2，PA)和病毒的单链RNA片断组成。其中HA主要有三个功能：①在感染之前和细胞表面特异性病毒受体结合；②介导病毒外膜与核内体膜融合；③刺激机体产生中和抗体。NA的主要功能是清除HA、NA和细胞表面的唾液酸，帮助病毒穿过呼吸道粘蛋白，并与上皮细胞结合；促进HA蛋白水解，破坏宿主细胞上的HA受体，帮助子代病毒颗粒脱离感染细胞，有利于病毒的释放。NA既具有酶活性，同时又是流感病毒重要的表面抗原。抗NA抗体不能中和流感病毒的毒力，但可以降低病毒量，减少肺部损伤程度。因为抗NA抗体能阻止子代病毒脱离受染细胞，使这些受染细胞最终被机体的防御系统清除。M2蛋白在病毒的生活周期中起着装配病毒的作用，其功能的改变直接影响病毒复制过程。

实施例1本发明H5N1禽流感病毒样颗粒的制备

步骤1、基因片段合成和克隆

本发明H5N1高致病型禽流感病毒样粒子基因的构建是采用了世界卫生组织公布的印度尼西亚型(A/Indonesia/2005)H5N1病毒的HA病毒基因、越南型（A/Vietnam/2005）H5N1病毒的NA病毒基因、中国福建型(A/Fujian/2005)H5N1病毒的M2病毒基因，构建成“泛亚型”H5N1高致病禽流感病毒样颗粒的病毒基因架构。

本发明根据酵母表达系统最嗜好的基因编码设计了H5N1禽流感病毒凝血因子HA蛋白、神经氨酸酶NA蛋白和细胞基质M2蛋白的酵母优化基因3225个碱基的核苷酸序列、并利用DNA化学合成仪大片段合成HA、NA、M2结构蛋白的基因编码（H5N1VLP基因），所述基因的核苷酸序列为SEQ ID No：3、SEQ ID No：4和SEQ ID No：6的组合，其结构如图1所示。

将人工合成的H5N1禽流感病毒的凝血因子HA蛋白、神经氨酸酶NA蛋白和细胞基质M2蛋白的基因克隆到中间载体PVD5质粒中。在合成该基因时，在基因的N’末端和C’末端分别人工加入Hind III（AAGCTT）和BamH I（GGATCC）酶切位点作为目的基因的克隆位点，并在基因的C’末端上游人工插入两个人工突变位点TAA TAG，作为蛋白翻译的终止位点。

步骤2.克隆载体构建

克隆载体pVD5的构建：将步骤1合成的H5N1VLP基因克隆到克隆载体pVD5的克隆位点：分别将步骤1经人工合成基因片段，即H5N1禽流感凝血因子HA蛋白、神经氨酸酶NA蛋白和细胞基质M2蛋白的酵母优化基因和克隆载体pVD5进行核酸限制性内切酶（Hind III/BamH I）酶切并线性化后，施行第一次连接反应；转染Top10感受态细胞，利用氨苄霉素筛选菌落，并获得重组克隆载体pVD5，构成中间载体PVD-H5N1-HNM，其中克隆载体pVD5基因表达构架如图2所示。

步骤3.表达载体构建

利用核酸限制性内切酶（Sal I和BamH I）线性化并释放含有：（1）、位于H5N1VLP基因上游的酵母尔法配对基因启动子（MFαI）；（2）、H5N1VLP基因；（3）、位于H5N1VLP基因下游的两个表达终止位点（TAATAG）的基因族群；并利用核酸限制性内切酶（Sal I和BglII）线性化处理表达载体PTG3828质粒，将该基因片段克隆到表达质粒PTG3828的Sal I和Bgl II的克隆位点之间，施行第二次连接反应；转染Top10感受态细胞，利用氨苄霉素筛选菌落，重组的表达载体PTG3828，形成表达载体pTG3828-H5N1-HNM。所述表达载体的基因表达架构如图3所示。

步骤4.面包酵母细胞的转染

使用C13BYS86感受态细胞，是由Global Bioreactor PTY.LTD.馈赠。

将步骤3构建得到的表达载体pTG3828-H5N1-HNM和10mg鱼精DNA，与LiCl处理制备的酵母感受态细胞充分混匀后，280C静置培育12小时，使用氨基酸缺陷型选择培养基平板筛选重组酵母菌落。只有成功转化的C13BYS86细胞才能形成菌落。利用PCR和酶切法确认所转染酵母细胞含有所克隆的目的基因。

步骤5.电子显微镜观察

利用电子显微镜对转染细胞进行观测确定：在对培养的转染细胞样本进行负染后，镜下观察可见大量的病毒样颗粒。其中有10万倍放大的酵母细胞显示放大的病毒样颗粒在细胞器内形成的过程和部位。颗粒形状与流感病毒的自然形态相同，在一维平面照片上，颗粒的基本形态是“表盘状”。

步骤6.免疫原制备：

液态发酵免疫原的制备：

将pTG3828-H5N1-HNM转染酵母细胞经30℃，72小时震荡培养饱和培养后，进行1分钟中低强度超声波裂解，3000rpm高速离心除细胞碎片，收集上清备用。

固态发酵免疫原的制备：

将pTG3828-H5N1-HNM转染酵母细胞经20%葡萄糖溶液稀释后接种于适量的市售小麦精粉中，含水量大约为50%。经30℃、24小时发酵后，加入30%新鲜小麦精粉收水后，置于旋转热风干烤箱内，经70℃烘烤12小时。粉碎至0.2厘米大小的颗粒备用。

本发明技术方案特点：

（1）用面包酵母共表达HA、NA、M2蛋白制备H5N1禽流感病毒样粒子，现有技术中多用原核表达系统和真核表达系统构建病毒样颗粒，本发明的特色之处在于用面包酵母固态发酵、大量制备H5N1型禽流感病毒样粒子。

（2）制备的H5N1禽流感病毒样粒子疫苗：目前多种H5N1禽流感疫苗正处于研发阶段，如灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、腺病毒载体疫苗、DNA疫苗，但所有这些处于研发阶段的疫苗都存在生产成本高、产量相对较低、难以大规模生产、免疫程序额费工费时等问题。而利用重组的面包酵母固态或液态发酵大量生产包括口服型、喷雾型和注射型高致病禽流感H5N1疫苗的发明以及相关的技术和工艺，由于在病毒基因的最佳组合、面包酵母工程菌的筛选、以及重组面包酵母工程菌的表达稳定性等关键技术和工艺方面仍有许多难题亟待解决，所以本发明中利用面包酵母工程菌制备H5N1病毒样颗粒疫苗的设计、相关的技术和工艺，在国际上处于领先水平。

（3）H5N1高致病型禽流感病毒样粒子的鉴定：采用电子显微镜技术和Western-blot免疫检测法对所表达的病毒样粒子进行鉴定，图4所示为禽流感病毒（H5N1）样颗粒的电子显微镜照片，H5N1病毒样粒子(10万倍)电子显微镜照片显示：图1所示的H5N1病毒的HA、NA和M2基因族群在转染的面包酵母细胞中自然装配成均匀一致如“表盘状”形状的病毒样颗粒状物质；图5所示为禽流感病毒（H5N1）样颗粒抗原的Western-blot免疫检测法照片，检测中采用标准的H5N1抗原检测试剂盒（美国新泽西检测试剂公司Dr Sun馈赠）；检测中的阴性对照为未转染的面包酵母细胞的裂解产物，其检测结果未显示与H5N1病毒相关的抗原反应；而经pTG3828-H5N1-HNM转染的面包酵母的固态或液态发酵物的裂解液，在检测中则分别显示与H5N1病毒HA抗原的阳性反应。

（4）病毒样粒子表达条件的优化：优化在不同条件下的最佳表达状态。本发明的重组酵母细胞的最佳生长条件为：将48小时震荡培养的菌种、经20%葡萄糖溶液稀释后，以1%-3%的接种量、接种于优质小麦精粉，接种后通过缓慢搅拌、使得培养基氧气的分布均匀和充分，发酵温度为30℃，相对湿度75％，发酵的PH值是4-6度之间，发酵时间为24小时，期间进行3次深层的温和搅拌以增加有氧发酵，发酵培养基中糖含量应控制在6%以下，以确保酵母菌种在适宜的渗透压下高效繁殖。

实施例2

免疫效果测定：用实施例1所得H5N1禽流感病毒样颗粒对健康青年鸡进行不同途径的免疫接种，对疫苗的安全性、免疫原性和免疫保护效果进行评价。

免疫方案：对4周龄未接种免疫的小鸡，分别于1天进行一次免疫、第14天和21天、进行两次免疫加强的程序。每次免疫前采血，末次免疫1周后（第28天）采血、收集血清。

免疫途径：

免疫分组：每组由9羽随机性别的鸡群所组成，在统计表中以w1-w9所代表。

免疫效果判定：以未接种H5N1禽流感疫苗的健康鸡血清、判定为阴性对照；以ELISA被检血清抗体效价高于阴性对照2倍以上者、判定为阳性。以ELISA被检血清抗体效价高于阴性对照、但低于阴性对照2倍以上者、判为可疑。

第一组：实施例1中所得固态发酵免疫原分别于1、14、21天直接饲喂；

第二组：实施例1中所得固态发酵免疫原经制粒并经聚丙烯酸钠包被成抗胃酸微囊剂型后，分别于1、14、21天直接饲喂；

第三组：实施例1中所得液态发酵免疫原经超声波破碎后，经紫外分光光度计测定，蛋白含量约为3%的浓度，分别于1、14、21天直接鸡翅膀下肌肉注射0.2毫升/次；

第四组：实施例1中所得液态发酵免疫原经超声波破碎后，经紫外分光光度计测定，蛋白含量约为3%的浓度，经纯净水10倍稀释至蛋白浓度值为0.3%后，分别于1、14、21天直接喷雾，平均每只鸡0.2毫升/次。

免疫效果：将采集的所有试验鸡群血清、应用间接ELISA检测禽流感病毒血清特异性抗体。表1所示为禽流感病毒（H5N1）颗粒样疫苗对鸡群免疫后的病毒特异性抗体的水平。所有四个组别均显示抗H5N1抗体阳性反应。其中，第一组，固态发酵免疫原直接饲喂组，抗体效价低于第二组为固态发酵免疫原经制粒并经聚丙烯酸钠包被后的饲喂组；而第二组抗体效价又低于第三组的肌注免疫组；而最高抗体效价的是第四组的液态发酵免疫原经超声波破碎后的直接喷雾接种组。因为喷雾接种组最接近于H5N1高致病性禽流感并得的自然感染途径。因此这几种不同的免疫接种途径、以及所产生的免疫效果也包括在本发明中。

表1

raw food：禽流感病毒样颗粒H5N1-M2固态发酵物制备成2mm颗粒后、直接饲喂实验组鸡群（9只）；

capsule food：高致病性禽流感病毒样颗粒H5N1-M2固态发酵物制备成2mm颗粒、并经聚丙烯酸钠包被制成肠溶性微囊后、直接饲喂实验组鸡群（9只）；

inject：实验组鸡群（9只）、直接翅膀下每次肌注50微升；

air：高致病性禽流感病毒样颗粒H5N1-M2液态发酵物，经离心沉淀、细胞破碎、分离上清、获得可溶性蛋白溶液、生理盐水稀释抗原浓度至20ug/mL，鸡舍内直接喷雾接种；

鸡（-）：未接种H5N1禽流感疫苗的健康鸡血清，设为阴性对照；

鸡IgY：H5N1禽流感病毒的高免卵黄抗体（中山大学医学院病毒教研室赠送）。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种H5N1禽流感病毒样颗粒，其特征在于，其包含HA蛋白、NA蛋白和M2蛋白，所述HA蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No：l，所述NA蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No：3，所述M2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No：5。

2.根据权利要求1所述的H5N1禽流感病毒样颗粒，其特征在于，所述HA蛋白核苷酸序列为SEQ ID No:2，所述NA蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No:4，所述M2蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No:6。

3.含有权利要求1-2任一项所述H5N1禽流感病毒样颗粒的疫苗。

4.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗为固态制剂、肌注或喷雾型液态制剂。

5.如权利要求1-2任一项所述H5N1禽流感病毒样颗粒的用途，用于制备预防禽流感病毒相关疾病的组合物。

6.一种如权利要求2所述的H5N1禽流感病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将人工合成的禽流感病毒基因克隆到克隆载体中，所述禽流感病毒基因的核苷酸序列为SEQ ID No：3、SEQ ID No：4和SEQ ID No：6依次的组合，将克隆载体的禽流感病毒基因连入重组表达载体，将重组表达载体转入到酵母感受态细胞中进行发酵培养，培养后将培养物纯化即得H5N1禽流感病毒样颗粒。

7.根据权利要求6所述的H5N1禽流感病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述克隆载体为PVD5质粒。

8.根据权利要求6所述的H5N1禽流感病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述重组表达载为PTG3828质粒。

9.根据权利要求6所述的H5N1禽流感病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述酵母感受态细胞为C13BYS86。

10.根据权利要求6所述的H5N1禽流感病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤“将重组表达载体转入到酵母感受态细胞中进行发酵培养，培养后将培养物纯化即得H5N1禽流感病毒样颗粒”具体为：将重组表达载体转染酵母感受态细胞C13BYS86，经30℃，72小时震荡培养饱和培养后，进行1分钟超声波裂解，3000rpm高速离心除细胞碎片，收集上清即为液态免疫原的H5N1禽流感病毒样颗粒。

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