CN105695491A - 鸡新城疫糖蛋白病毒抗原的制备方法及其产品 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鸡新城疫糖蛋白病毒抗原的制备方法及其产品。本发明根据病毒流行趋势预测将鸡新城疫病毒F基因以及HN基因进行优化。本发明进一步将鸡新城疫病毒糖蛋白抗原基因、优化后的抗原基因或串联的优化抗原基因组合在家蚕生物反应器中进行表达，所表达的抗原或制备的重组病毒能为动物提供有效的免疫保护。本发明还提供了一种鸡新城疫病毒抗原基因呈递载体的制备方法，包括：将鸡新城疫病毒抗原优化基因或串联的优化抗原基因组合克隆进哺乳动物启动子控制的杆状病毒运载载体中，重组得到含哺乳动物启动子控制的基因呈递载体；通过注射或口服等方式将其进入到动物体内后，能在动物体内高效呈递抗原基因，有效抵御新城疫病毒的攻击。

Description

鸡新城疫糖蛋白病毒抗原的制备方法及其产品
本申请是申请号为“201410196203.2”，申请日为“2014年5月9日”，发明名称为“鸡新城疫糖蛋白病毒抗原的制备方法及其产品”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种鸡新城疫病毒抗原的制备方法，尤其涉及利用重组杆状病毒在昆虫体内制备鸡新城疫病毒抗原的方法以及由该制备方法得到重组抗原，本发明还涉及一种鸡新城疫病毒抗原基因家蚕杆状病毒呈递载体的制备方法及其产品，本发明进一步涉及它们在预防、治疗或诊断鸡新城疫疫苗或试剂中的用途，属于鸡新城疫病毒抗原的制备和应用领域。
背景技术
新城疫于1926年首先发现于印度尼西亚，同年发现于英国的新城，由于新城疫危害严重，国际兽疫局(OIE)把新城疫定为烈性传染病，给养殖业带来巨大经济损失。世界动物卫生组织将其列为必须报告的动物疫病。因此，寻找一种理想的免疫保护性抗原用于该病的快速诊断与免疫防治十分迫切。
随着杆状病毒作为载体，在体外和体内转导动物细胞并获得目的蛋白的高效表达，杆状病毒日益显示了其作为非复制型载体在基因治疗中的应用前景，开辟了杆状病毒应用研究的新领域(HiiserA.AmJPharmacogenomies,3(1):53-63,2003)。从杆状病毒表达系统建立以来，已有1000多种外源基因在这一系统中得到了表达。1985年，Maeda用家蚕BombyxmoriNPV作表达载体，在家蚕体内高水平地表达出人α干扰素以来，以中国和日本为代表的有蚕国家，不断发展家蚕杆状病毒表达系统，已成为比较成熟的一种蛋白表达技术(吕鸿声.昆虫病毒分子生物学免疫研究,1998)。与细菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统相比，家蚕杆状病毒表达系统在一定方面具有许多优势，因此充分利用家蚕资源来生产外源蛋白，对生物医药产业具有重要意义。但是，至今尚无利用家蚕杆状病毒表达系统在昆虫体内成功表达鸡新城疫病毒抗原的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种利用家蚕杆状病毒表达系统在昆虫体内表达鸡新城疫病毒抗原的方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
本发明提供了一种鸡新城疫病毒抗原的制备方法，包括以下步骤：
(1)将鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F或优化后的鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F-O克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达载体；或者将鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN或优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN-O克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达载体；或者将鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F或优化后的鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F-O与鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN或优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN-O串联在一起的序列克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达载体；
(2)将构建得到的转移表达载体与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞以发生同源重组或转座，获得重组杆状病毒；
(3)将重组杆状病毒感染昆虫宿主或昆虫细胞；培养被感染的昆虫宿主或昆虫细胞，诱导表达相应的鸡新城疫病毒抗原；收获并纯化所表达的抗原。
本发明还提供了一种鸡新城疫病毒抗原基因家蚕杆状病毒呈递载体的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)将鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F或优化后的鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F-O与哺乳动物细胞启动子一起克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达载体；或者将鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN或优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN-O与哺乳动物细胞启动子一起克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达载体；或者优化后的鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F-O与优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN-O串联在一起的序列与哺乳动物细胞启动子一起克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达载体；
(2)将构建得到的转移表达载体与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞以发生同源重组或转座，获得重组杆状病毒，将重组杆状病毒感染昆虫宿主或昆虫细胞扩增重组杆状病毒，即得。
所述鸡新城疫病毒基因F的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示，其氨基酸序列为SEQIDNO.2所示；优化后的鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F-O的核苷酸序列为SEQIDNO.5所示，其氨基酸序列为SEQIDNO.6所示；所述鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN的核苷酸序列为SEQIDNO.3所示，其氨基酸序列为SEQIDNO.4所示；所述优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN-O的核苷酸序列为SEQIDNO.7所示，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO.8所示；所述优化后的鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F-O与优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN-O串联在一起的序列(F-IRES-HN-O)为SEQIDNO.9所示。
所述的杆状病毒运载载体选自AcRP23-lacZ、AcRP6-SC、AcUWl-lacZ、BacPAK6、BactoPac、Bacmid、BlucBacII(pETL)、p2Bac、p2Blue、p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB4、PAcAS3、pAcC129、pAcC4、DZI、pAcGP67、pAcIEl、pAcJPl、pAcMLF2、pAcMLF7、pAcMLF8、pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP25、pAcRW4、pAcsMAG,pAcUWl、pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51、pAcVC2、pAcVC3、pAcYMl、pAcJcC5、pBacl、pBac2、pBlueBacIII、pBlueBacHis、pEV55、mXIV,pIEINeo、pJVETL、pJVNhel、pJVP10、pJVrsMAG、pMBac、pP10、pPAKl、pPBac、pSHONEX1.1、pSYNXIVVI+、pSYNVI+wp、pSYNXIVVI-、pVL1391、pVL1392、pVL1393、pVL941、pVL945、pVL985、pVTBac、pBM030、pUAC-5或其它类似的杆状病毒同源重组或转座载体，优选为pVL1393杆状病毒运载载体。
所述的哺乳动物细胞启动子包括但不限于CAG启动子、PEC启动子、CMV启动子、人巨细胞病毒早期启动子、人延伸因子1-亚基启动子、Rous肉瘤长末端重复序列、人leukosialin基因启动子、鼠3-磷酸甘油激酶l基因启动子、人泛素蛋白C基因启动子、鸡β-肌动蛋白启动子和CMV增强子序列构成的杂合启动子、鼠乳房瘤病毒启动子；优选为CAG启动子。
所述的杆状病毒选自BmNPV、AcMNPV、ApNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SlMNPV、SeMNPV或SpltNPV；优选为家蚕杆状病毒亲本株BmNPV。
本发明中所构建的重组杆状病毒包括：(1)重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV-NDV-F、rBmNPV-NDV-F-O或rBmNPV-NDV-F-IRES-HN-O；(2)重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV-CAG-NDV-F-O或rBmNPV-CAG-NDV-F-IRES-HN-O。所述的昆虫宿主选自家蚕(Bombyxmori)、野蚕(Bombyxmandarina)、蓖麻蚕(Philosamiacynthiaricim)、樟蚕(Dictyoplocajapanica)、樗蚕(Philosamiacynthiapryeri)、柞蚕(Antheraeapernyi)、日本柞蚕(Antheraeayamamai)、野天蚕(Antheraeapolyphymus)、苜蓿尺蠖(Atographacaliforica)、茶尺蠖(Ectropisobliqua)、甘兰夜蛾(Mamestrabrassicae)、斜纹夜蛾(Spodopteralittoralis)、秋粘虫(Spodopterafrugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusiani)、行军虫(Thaumetopoeawilkinsoni)、棉铃虫(Heliothisarmigera)、美国棉铃虫(Heliothiszea)、烟青虫(Heliothisassulta)、烟草夜蛾(Heliothisvirescens)、东方粘虫(Pseudaletiaseparata)、舞毒蛾(Lymantriadispar)等；优选为家蚕(Bombyxmori)。
本发明中所述的感染是指重组杆状病毒通过吞食或透过表皮来感染1-5龄的昆虫幼虫或蛹体；更优选为将重组家蚕杆状病毒感染家蚕细胞或穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫或蛹，在感染3-6天后收集含各种鸡新城疫病毒糖蛋白抗原的家蚕幼虫或蛹的体液或组织匀浆；其中，所述的蛹体最优为1-2天的早期嫩蛹。
鸡新城疫病毒抗原基因F、优化的基因F-O、鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN或优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN-O以及串联的F-IRES-HN-O基因在多角体启动子、CAG启动子或别的病毒和真核生物的强启动子控制之下，在家蚕中高效表达鸡新城疫病毒抗原，所表达的抗原或所构建的重组杆状病毒具有良好的免疫原性，能够为包括鸡在内的动物提供良好的免疫保护，可用于制备预防鸡新城疫的疫苗或药物组合物。
本发明所构建的鸡新城疫病毒抗原基因家蚕杆状病毒呈递载体通过注射或口服等方式将其进入到动物体内后，能在动物体内高效呈递抗原基因，有效抵御新城疫病毒的攻击。
ELISA检测表明，本发明中所构建的重组杆状病毒rBmNPV-NDV-F中NDV-F基因在家蚕中表达量高，平均每头家蚕或蚕蛹中的表达量至少1mg，在3200倍稀释甚至更高稀释度下仍能检测到抗原与抗体的特异性反应。Westernblotting结果表明，在重组病毒感染后家蚕血淋巴样品的上清液中可检测到59kD大小的特异性条带。动物免疫实验证明，NDV-F基因实验组全部产生针对NDV的抗体，50支苗/组实验组的检测效价可达1600倍以上；而对照组没有检测到抗体；攻毒后，50支苗/组免疫组没有鸡死亡，而对照组攻毒后3天内全部死亡，表现典型的鸡新城疫症状。
本发明所构建的重组杆状病毒rBmNPV-NDV-F-O中NDV-F-O基因在家蚕中表达量高，比NDV-F基因在家蚕中表达量高出2-3倍，在6400倍稀释甚至更高稀释度下仍能检测到抗原与抗体的特异性反应。Westernblotting结果表明，在重组病毒感染后家蚕血淋巴样品的上清液中可检测到59kD大小的特异性条带。动物免疫实验证明，实验组全部产生针对NDV的抗体，100支苗/组实验组检测效价可达3200倍以上；而对照组没有检测到抗体；攻毒后，100支苗/组免疫组没有鸡死亡，而对照组攻毒后3天内全部死亡，表现典型的鸡新城疫症状。
ELISA法检测rBmNPV-NDV-F-IRES-HN-O中NDV-F-IRES-HN-O抗原蛋白表达量，结果表明，在3200倍稀释甚至更高稀释度下仍能检测到抗原与抗体的特异性反应。Westernblotting结果表明在重组病毒感染后家蚕的血淋巴样品的上清液中可检测到F、HN蛋白大小约为59kD、64kD的特异性条带。动物免疫实验证明，实验组全部产生针对NDV的抗体，200支疫苗/组实验组检测效价可达3200倍以上；而对照组没有检测到抗体；攻毒后，200支疫苗/组免疫组没有鸡死亡，而对照组攻毒后3天内全部死亡，表现典型的鸡新城疫症状。
用本发明所构建的鸡新城疫病毒抗原基因家蚕杆状病毒呈递载体rBmNPV-CAG-NDV-F-O(或重组杆状病毒rBmNPV-CAG-NDV-F-O)注射或口服实验鸡，实验组全部产生针对NDV的抗体，抗体滴度达到1600左右，而对照组检测到的抗体滴度在20左右；攻毒后，免疫组没有鸡死亡，而对照组攻毒后3天内全部死亡，表现典型的鸡新城疫症状。用所构建的鸡新城疫病毒抗原基因家蚕杆状病毒呈递载rBmNPV-CAG-NDV-F-IRES-HN-O(或重组杆状病毒rBmNPV-CAG-NDV-F-IRES-HN-O)注射或口服育成鸡，实验组全部产生针对NDV的抗体，抗体滴度达到3200左右，而对照组检测到的抗体滴度在20以下；攻毒后，免疫组的没有鸡死亡，而对照组攻毒后3天内全部死亡，表现典型的鸡新城疫症状。
本发明采用杆状病毒表达系统在家蚕生物反应器中生产鸡新城疫糖蛋白病毒抗原，其生产成本显著低于传统的制备鸡新城疫糖蛋白病毒抗原的方法。由于家蚕已经被我国卫生部批准为食药兼用昆虫，所以将本发明方法所制备的抗原纯化后，安全性极高，可直接制作疫苗免疫动物。总之，本发明方法具有安全、高效、能耗少、成本低等诸多优点。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞。
术语“启动子”意指存在于目的基因编码序列的上游的序列，提供RNA聚合酶和正确转录起始所必需的其它因子的识别位点，启动或指导目的基因转录为mRNA。
术语“转染”意指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。
术语“表达”意指内源性基因或转基因在细胞中的转录和/或翻译。
术语“贴壁”意指当细胞悬液被接种到培养器皿后，首先要发生粘附，结合到生长基质表面，形成贴壁。
术语“疫苗”意指将病原微生物(如细菌、立克次氏体、病毒等)及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。
术语“佐剂”意指非特异性免疫增强剂，当与抗原一起注射或预先注入机体时，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。
术语“抗体”意指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
术语“抗原”意指能够刺激机体产生(特异性)免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应(特异性反应)的物质。
附图说明
图1为NDVF基因的演化趋势的序列比对图；
图2为NDVHN基因的演化趋势的序列比对图；
图3为重组NDV-F蛋白的Western杂交分析；M：预染的蛋白质分子质量标准；1：重组rBmNPV-NDV-F-O感染的幼虫血淋巴；2：阴性对照；
图4为重组NDV-F蛋白的Western杂交分析；M：预染的蛋白质分子质量标准；1-2：重组rBmNPV-NDV-F-IRES-HN-O感染的幼虫血淋巴；3：阴性对照；
图5为重组NDV-HN蛋白的Western杂交分析；M：预染的蛋白质分子质量标准；1：重组rBmNPV-NDV-F-IRES-HN-O感染的幼虫血淋巴；2：阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
1、实验材料
1.1菌株、病毒株与载体
BmNPV(为中国发明专利公开号CN102286534A中的BmBacmid)；家蚕细胞BmN、原核表达载体pET-28a+为中国农业科学院生物技术研究所分子微生物实验室保存；运载载体pVL1393、大肠杆菌(Top10，DH10B)购自Promega公司；pMD-18T载体购自TaKaRa公司；pEASY-T3载体购自北京全式金生物技术有限公司；LaSota疫苗株购自山东绿都生物科技有限公司。
1.2培养基
大肠杆菌培养基为LB培养基；家蚕细胞培养基为TC-100培养基；DMEM培养基购自Sigma公司和Invitrogen公司。
实施例1鸡新城疫病毒F基因的原始序列在家蚕生物反应器中的表达及表达产物的检测
1重组质粒pT-NDV-F的构建及鉴定
1.1引物设计与目的基因的合成
TRIzol法提取LaSota疫苗株基因组RNA。设计引物，通过RT-PCR方法扩增出鸡新城疫病毒F基因原始序列(SEQIDNO.1)，所设计反转录特异引物为：NDV-F-RT：5'-TCACATTTTTGTAGTGGCTC-3'。F基因的原始序列的扩增引物为：NDV-F上游：5'-CGGATCCATGGGCTCCAAACCTTCT-3'(BamHI)；NDV-F下游：5'-CTCTAGATCACATTTTTGTAGTGGC-3'(Xba1)。PCR扩增结束后，取5.0μL反应产物用1.0％的TAE琼脂糖凝胶电泳，获得预期大小的条带。采用玻璃奶纯化回收DNA片段。
1.2DNA片段与克隆载体连接
克隆载体pMD18-T连接体系：0.5μLpMD18-Tvector，2.5μL目的片段，3μLLigationsolutionI，16℃连接8h以上。
1.3连接产物的热转化
取-70℃冻存的E.coli感受态细胞，用双手搓至大部分融化后迅速置冰上；感受态细胞完全融化后加入连接产物5μL，轻轻混匀，冰浴30min；42℃热激90s，迅速置冰上1～2min；加入1mL已温浴至37℃的LB培养基，37℃温育培养1h；5000r/min离心3min，去部分上清后(留150～200μL)涂布于含适当抗生素的LB平板上；37℃倒置培养过夜。
1.4重组质粒的鉴定
1.4.1细胞破碎法快速鉴定
分别挑取多个单菌落转化子接种于4mL含80μg/mLAmp的LB培养基中，37℃振荡培养过夜；取300～500μL菌液于Eppendorf管中，12000g离心10s，弃上清，加入30μL缓冲液(6％蔗糖，0.1％溴酚蓝)，再加入20μL酚/氯仿(1：1)，充分振荡将菌体弹起；12000g离心5min，取上清上样电泳，观察结果。
1.4.2重组质粒的酶切鉴定
碱法少量快速抽提质粒DNA，用于酶切鉴定。37℃酶切1～2h，加Marker作为参考标准，用琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，将鉴定的阳性克隆命名为pT-NDV-F。
1.4.3重组质粒的测序鉴定及分析
将鉴定的阳性克隆pT-NDV-F的菌种进行测序分析；测定的序列结果为SEQIDNO.1所示，氨基酸序列为SEQIDNO.2所示。
2鸡新城疫病毒衣壳蛋白F基因原始序列在家蚕生物反应器中的表达
2.1重组杆状病毒转移载体pVL1393-NDV-F的构建
2.1.1目的片段及载体的获得
测序鉴定过的重组质粒pT-NDV-F双酶切，使其线性化。37℃反应2h，取5μL电泳检测是否酶切完全，向反应体系中加入1/10体积的3MNaAc，2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min；4℃，12000rpm离心10min，用预冷的70％乙醇洗沉淀一次；4℃，12000rpm离心5min，真空干燥沉淀，加入35μLddH2O溶解，加入4μLBufferE，XbaI1μL，37℃反应3h，65℃灭活15min，保存于-20℃备用。
2.1.2目的片段与载体连接
连接体系：
16℃反应8-12h，转化大肠杆菌感受态细胞。
2.1.3重组质粒的抽提及鉴定
提取重组质粒，进行酶切鉴定；37℃酶切2h，用琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，加Marker作为参考标准。将鉴定正确的阳性克隆命名为pVL1393-NDV-F。
2.1.4重组质粒的测序鉴定以及分析
将阳性克隆pVL1393-NDV-F的菌种重新加入含有Amp的LB培养液，220r/min摇培过夜后后，吸取1mL新鲜菌液至无菌的Eppendorf管中，加入少量甘油，以封口膜封好后进行测序；测序结果证实，F基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。测序结果用DNAStar、DNAMAN软件对序列进行分析。
3重组家蚕杆状病毒rBmNPV-NDV-F的构建和鉴定
3.1家蚕核型多角体病毒Bm-BacmidDNA的繁殖及病毒DNA的制备
按Sigma公司产品说明配制1×TC-100培养基，用2MNaOH将pH调至6.22，过滤除菌后的培养基补加10％胎牛血清，27℃下培养家蚕细胞BmN。用家蚕核型多角体病毒Bm-BacmidDNA感染对数生长期的家蚕细胞BmN约50ml，感染复数为1，3～4天后收集病毒感染液，离心(10000rpm×10min)，除去沉淀，上清25000rpm离心1h，除上清，用1ml病毒DNA抽提液(1000ml中含Tris12.1g，EDTA33.6g，KCl14.1g，pH7.5)悬浮病毒粒子沉淀，转移至1.5ml离心管中，加入蛋白酶K至终浓度为50μg/ml，50℃保温2小时，再加入35％的Sarkorsel至终浓度为1％，继续于50℃保温2小时，分别用等体积的饱和酚、苯酚：氯仿(1：1)、氯仿依次抽提，将上层水相转移到一个新管中，加入1/10体积的3MNaCl，再加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置2小时以上沉淀病毒DNA，5000rpm离心10min，沉淀用75％乙醇洗一次，冷冻干燥。溶解在100μlTEBuffer中，4℃保存备用。
3.2重组家蚕杆状病毒rBmNPV-NDV-F的构建和获得
接种大约1×106家蚕细胞BmN于15cm2培养瓶中，家蚕细胞贴壁后，除去含胎牛血清(FBS)培养基，用不含FBS的培养基洗三次，加1.5ml无FBS培养基。向一灭菌管中依次加入1μg家蚕杆状病毒Bm-BacmidDNA，2μg重组转移质粒pVL1393-NDV-FDNA和5μL脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60μl，轻轻混匀，静置15min后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。27℃培养4h后补加1.5mL无血清培养基和300μLFBS。27℃恒温培养4～5天，收集上清液用于重组病毒rBmNPV-NDV-F的筛选。接种适量细胞(约70～80％)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将共转染上清进行不同浓度稀释，取1mL共转染液加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1h后，吸去感染液，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与40℃预热的2×TC-100培养基(含20％FBS)混合均匀，每平皿加4mL胶，待凝固后用Parafilm封口，27℃倒置培养3～5天，显微镜观察。将不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmNPV-NDV-F。
3.3重组病毒rBmNPV-NDV-F在家蚕细胞中的扩增
将重组家蚕杆状病毒rBmNPV-NDV-F感染正常生长的BmN细胞，培养3天后收集上清液，上清中即含有大量的重组病毒rBmNPV-NDV-F。
3.4重组病毒rBmNPV-NDV-F的PCR鉴定
利用PCR方法分析外源基因的整合。
游离病毒基因组DNA的提取方法如下：取病毒上清150μl，加入150μl(0.5mol/L)的NaOH后混匀，再加入20μl(8mol/L)的醋酸铵，混匀后用等体积的酚和氯仿分别抽提一次，酒精沉淀后用20μl的TE溶解DNA。
以新城疫F基因原始序列为模板设计特异性引物进行扩增，扩增片段长度为624bp，能够扩增出目的片段的说明转移载体与杆状病毒已重组成功。寡核苷酸引物为：
上游引物：5'-ATGGGCTCCAGACCTTCTACC-3'；
下游引物：5'-TACACCAACTTGCTGTGCAAT-3'；
取上述病毒基因组DNA1μl进行PCR扩增，反应条件为：94℃变性5min、94℃40sec、58℃40sec、72℃45sec，30个循环，最后72℃延伸5min。
取15μl反应产物电泳分析。结果，扩增出长度为624bp片段，证明获得了重组病毒rBmNPV-NDV-F。
3.5NDV-F在家蚕蛹和蚕体中的表达
所用的家蚕蛹为高表达品种JY1(由中国农业科学院生物技术研究所分子微生物实验室保存)。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。饷食后48h选择平均体重相同的家蚕及结茧七天后平均体重相同的15粒蚕蛹，每头蚕蛹和蚕接种约1.0×105rBmNPV-NDV-F，4-5天后收集发病蚕蛹和取蚕血，-20℃冻存。
3.5.1ELISA检测表达产物
注射病毒后的家蚕，待发病时收集蚕血。ELISA法检测NDV-F抗原蛋白表达量的高低，包被液作为空白对照，以正常蚕血作为阴性对照，原核表达的NDV-F蛋白免疫小鼠后的血清为第一抗体，HRP标记的羊抗鼠抗体为第二抗体。任取所收蚕血中的样品，用包被液做梯度稀释，从50×两倍倍比稀释到6400倍，每个梯度处做双孔检测，计算时取平均值，各取100μL包被到酶标板上。
检测结果见表1，表明NDV-F基因在家蚕中表达量高，平均每头家蚕或蚕蛹中的表达量至少1mg，在3200倍稀释甚至更高稀释度下仍能检测到抗原与抗体的特异性反应。
表1ELISA检测家蚕生物反应器表达的NDV-F基因
3.5.2Westernblotting检测表达产物
Westernblotting结果表明在重组病毒感染后家蚕血淋巴样品的上清液中可检测到59kD大小的特异性条带。
3.6动物免疫实验
按国家标准(中华人民共和国兽药典)将收集的纯化抗原NDV病毒F抗原经肌肉注射试验组(分为50支苗/组：3mlNDV蛋白抗原母液与等体积油佐剂混合试制疫苗；150支疫苗/组：1mlNDV蛋白抗原母液+2mlPBS+3ml油佐剂混合试制疫苗)；每组均为12羽，0.5ml/只在鸡上进行动物试验，另设12羽鸡只注射佐剂和喂食抗原的为对照组。在免疫后14天后取血，进行ELISA抗体效价检测。
实验结果表明，实验组全部产生针对NDV的抗体，实验组的50支苗/组检测效价可达1600倍以上；而对照组没有检测到抗体；在免疫后21-28d进行攻毒实验，免疫组50支苗/组的没有鸡死亡，而对照组攻毒后3天内全部死亡，表现典型的鸡新城疫症状。
实施例2鸡新城疫经密码子优化后F-O基因的序列在家蚕生物反应器中的表达及表达产物的检测
1优化后序列F-O的获得
收集近年来的NDVF基因的序列，尤其是比较现行疫苗株与流行株的差异，预测其演化趋势，调整其原始序列(图1)。首先根据氨基酸序列的变化趋势，选择其保守位点，通过收集不同地区新城疫F基因序列进行同源性比较分析，结果表明，虽然氨基酸序列保守性较高，但是不同位点氨基酸还存在可预测的变化趋势，通常是疫苗株的广泛使用导致现在的流行株的氨基酸位点发生点突变，长此以往将导致疫苗株的免疫效果下降，甚至丧失保护效果。如在19、20、27、28位氨基酸的变化，强毒株氨基酸位点有V突变成I、A突变成M、V突变成I、P突变成L的趋势，根据此原则进行相应的氨基酸序列的调整。
同时根据家蚕密码子的偏嗜性、序列的GC含量、限制性内切酶位点等对实施例1获得的鸡新城疫F基因原始序列进行调整和优化，得到适宜在家蚕中表达的基因序列NDV-F-O(SEQIDNO.5)，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO.6所示。原始序列中含有串联的稀有密码子，这减少了翻译序列或者甚至解除翻译装置；优化后序列CAI值由0.72提高为0.79，调整了GC含量及不宜峰以延长mRNA的半衰期。
直接将人工合成优化后的序列NDV-F-O并克隆到载体pUC57上获得重组质粒pUC57-F-O；F序列5′端加入PstI，EcoRI，BamHI位点和Kozak序列；3′端加入XbaI，PstI位点。
2重组杆状病毒转移载体pVL1393-NDV-F-O的构建
测序鉴定过的重组质粒pUC57-F-O用BamHI/XbaI双酶切，使其线性化；真核表达载体质粒pVL1393作同样酶切处理。将酶切回收的NDV-F-O与pVL1393连接，连接产物转化感受态细胞，在含氨苄青霉素抗性的琼脂平板上筛选，挑选克隆后，提取质粒。重组质粒经酶切、测序，鉴定正确的命名为pVL1393-NDV-F-O。
3重组家蚕杆状病毒rBmNPV-NDV-F-O的构建和鉴定
3.1家蚕核型多角体病毒Bm-BacmidDNA的繁殖及病毒DNA的制备
具体方法同实施例1。
3.2重组家蚕杆状病毒rBmNPV-NDV-F-O的构建和获得
具体方法同实施例1。
3.3重组病毒rBmNPV-NDV-F-O在家蚕细胞中的扩增
将重组家蚕杆状病毒rBmNPV-NDV-F-O感染正常生长的BmN细胞，培养3天后收集上清液，上清液中即含有大量的重组病毒rBmNPV-NDV-F-O。
3.4重组病毒rBmNPV-NDV-F-O的PCR鉴定
利用PCR方法分析外源基因整合。游离病毒基因组DNA的提取方法同实施例1。以新城疫F-O基因序列为模板设计特异性引物进行扩增分析，扩增片段长度为651bp，能够扩增出目的片段的说明转移载体杆状病毒已重组成功。寡核苷酸引物为：
上游引物:5'-ATGGGCTCAAAACCTTCCACT-3'；
下游引物:5'-GAGCTCGGTGAGGTACAAGTT-3'；
取上述病毒基因组DNA1μl进行PCR扩增，反应条件为：94℃变性5min、94℃50sec、58℃50sec、72℃50sec，30个循环，最后72℃延伸5min。
取15μl反应产物电泳分析。结果，扩增出长度为651bp片段，证明获得了重组病毒rBmNPV-NDV-F-O。
4NDV-F-O在家蚕蛹和蚕体中表达产物的检测
所用的家蚕蛹为高表达品种为JY1(同实施例1)。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。饷食后48h选择平均体重相同的家蚕及结茧七天后平均体重相同的15粒蚕蛹，每头蚕蛹和蚕接种约1.0×105pfu/头rBmNPV-NDV-F-O，4-5天后收集发病蚕蛹和取蚕血，-20℃冻存。
4.1鸡新城疫病毒检测抗体的制备
4.1.1引物设计
设计三对特异引物将优化后的序列F-O分三段进行原核表达，引物设计如下：
NDV-F1：5'-CGGATCCAGACTTACCTCATCTCTTGACG-3'；
NDV-R1：5'-CAAGCTTCTACTGGTCATTAACGAACTGT-3'；
NDV-F2：5'-CGGATCCAACCAGAATGCCGCAAACATAT-3'；
NDV-R2：5'-CAAGCTTCTAAGAGTAGATACCTGGACTC-3'；
NDV-F3：5'-CGGATCCGTGATCGGTAGCGTTGCATTAG-3'；
NDV-R3：5'-CGGATCCAACCAGAATGCCGCAAACATAT-3'。
4.1.2优化后的序列F-O进行原核表达
分别构建含新城疫F-O基因的重组质粒pT3-NDV-F-FR1、pT3-NDV-F-FR2和pT3-NDV-F-FR3。
以质粒pUC57-F-O模板，分别用上述三对引物扩增目的片段NDV-FR1、NDV-FR2、NDV-FR3；玻璃奶法纯化回收PCR产物，PCR纯化产物与克隆载体pEASY-T3连接，连接产物转化已制备的大肠杆菌热击感受态细胞，挑斑培养进行重组质粒的鉴定。细胞破碎法快速鉴定后挑取质粒带退后的菌株，碱裂解法提取重组质粒pT3-NDV-F-FR1、pT3-NDV-F-FR2和pT3-NDV-F-FR3，用BamHI/HindIII进行双酶切鉴定，并将酶切鉴定正确的重组菌菌液送北京擎科生物技术有限公司进行DNA测序验证。将测序结果与先前质粒pUC57-F-O的序列进行核酸序列比对，结果表明，三个重组质粒中的目的序列与先前质粒序列结果一致，没有发生移码突变并含有设计的酶切位点。
4.1.3重组质粒pET28a-NDV-FR1、pET28a-NDV-FR2、pET28a-NDV-FR3的构建
测序正确的重组质粒pT3-NDV-F-FR1、pT3-NDV-F-FR2、pT3-NDV-F-FR3经BamHI/HindIII双酶切消化后，玻璃奶法纯化回收酶切产物，将其连接到已被BamHI/HindIII双酶切消化的表达载体pET-28a+上，连接产物转化Top10感受态细胞，挑斑后先进行细胞破碎法快速鉴定，而后碱法少量快速抽提重组质粒pET28a-NDV-F-FR1、pET28a-NDV-F-FR2、pET28a-NDV-F-FR3用BamHI/HindIII双酶切鉴定。
4.1.4重组质粒在大肠杆菌中诱导融合表达
酶切正确的上述重组质粒分别转化BL21感受态细胞，IPTG诱导4h后收集菌液，用SDS-PAGE电泳分析表达情况。结果显示，与阴性对照相比，转化重组质粒pET28a-NDV-F-FR2的菌株出现的融合蛋白表达条带最浓集，挑取其单菌落振荡培养后进行诱导。经超声破碎后，SDS-PAGE电泳分析显示，表达的融合蛋白His-NDV-F-FR2存在于沉淀中，表明表达的蛋白以包涵体形式存在。
4.1.5融合蛋白的纯化及其抗体的制备
挑取转化重组质粒pET28a-NDV-F-FR2的菌株单菌落振荡培养后进行大量诱导表达，采用处理包涵体蛋白的相关溶液与方法将包涵体溶解后，用Ni+-NTA树脂层析柱纯化该表达蛋白，在脲NTA-25、脲NTA-50、脲NTA-100、脲NTA-250、脲NTA-500，5个梯度收集洗脱液，收集穿透液、洗脱液，每管收集一个NTA体积，SDS-PAGE分析确定蛋白质的结合情况、目标蛋白在洗脱液中的分布情况。SDS-PAGE结果显示大小正确的单一条带，表达的目标蛋白His-NDV-F-FR2大小与阳性对照一致；用脲NTA-100进行洗脱时，洗脱峰最大。
SDS-PAGE胶纯化蛋白后用灭菌小刀割下纯化条带蛋白，并切成1mm3的小胶块，将处理好的胶粒进行基质辅助激光串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF/MS)分析，有2段氨基酸至少有11个连续氨基酸肽段与理论肽段能够完全匹配，就可认为与理论序列一致。经分析，确定纯化蛋白就是目标基因His-NDV-F-FR2的表达产物。
纯化表达的融合蛋白并进行蛋白浓缩，采用Bradford法测浓缩后蛋白溶液的浓度。将纯化好的浓度大于1mg/ml，总量不低于3mg的融合蛋白进行SDS-PAGE后，割下目的条带，把胶粒磨碎后制备鼠源多克隆抗体。
4.1.6多克隆抗体效价检测
纯化的NDV-F-FR2蛋白免疫小鼠4次后获得多克隆抗体。用纯化的融合蛋白作包被抗原，用PBS稀释不同倍数100、200、400、800、1600、3200、6400、12800、25600、51200的多克隆抗血清作一抗，夹心ELISA检测法测抗体效价图，免疫前鸡血清作阴性对照。测定在A492nm处吸光值，以各个稀释倍数为X轴，各稀释倍数下的吸光值平均值为Y轴。通常大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性(以空白对照孔调零后计算)。结果显示：自制的抗体在抗原蛋白浓度为10μg/ml时抗体的效价可达1：3200。
4.2NDV-F-O表达产物的检测
4.2.1ELISA检测
注射病毒后的家蚕，待发病时收集蚕血。ELISA法检测NDV-F-O、抗原蛋白表达量的高低，包被液作为空白对照，以正常蚕血作为阴性对照，原核表达的NDV-F-FR2蛋白免疫小鼠之后的鼠血清为第一抗体，HRP标记的羊抗鼠抗体为第二抗体。任取所收蚕血中样品，用包被液做梯度稀释，从100×两倍倍比稀释到6400倍。每个梯度处做双孔检测，各取100μL包被到酶标板上。
检测结果见表2，表明NDV-F-O基因在家蚕中表达量高，比NDV-F基因在家蚕中表达量高出2-3倍，在6400倍稀释甚至更高稀释度下仍能检测到抗原与抗体的特异性反应。
表2ELISA检测家蚕生物反应器中表达的NDV-F-O基因
4.2.2Westernblotting检测
Westernblotting结果表明在重组病毒感染后家蚕的血淋巴样品的上清液中可检测到F蛋白大小约为59kD的特异性条带(图3)。
5动物免疫实验
按国家标准(中华人民共和国兽药典)将收集的纯化抗原NDV病毒F抗原经肌肉注射试验组(分为100支苗/组：3mlNDV蛋白抗原母液与等体积油佐剂混合试制疫苗；200支疫苗/组：1.5mlNDV蛋白抗原母液+1.5mlPBS+3ml油佐剂混合试制疫苗)；每组均为12羽，0.5ml/只在鸡上进行动物试验，另设12羽鸡只注射佐剂和喂食抗原的为对照组。在免疫后14天后取血，进行ELISA抗体效价检测。
结果表明，实验组全部产生针对NDV的抗体，100支苗/组实验组检测效价可达3200倍以上；实验组96％产生保护抗体，而对照组没有检测到抗体；在免疫后21-28d进行攻毒实验，100支苗/组免疫组的没有鸡死亡，而对照组攻毒后3天内全部死亡，表现典型的鸡新城疫症状。
实施例3鸡新城疫病毒F-IRES-HN-O基因序列在家蚕生物反应器中的联合表达及表达产物的检测
1鸡新城疫HN基因的原始序列的获得
设计引物，通过RT-PCR方法扩增出鸡新城疫病毒HN基因原始序列(SEQIDNO.3)，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO.4所示。
2优化后序列NDV-F-O、NDV-HN-O的获得
收集近年来的NDVHN基因的序列，尤其是比较现行疫苗株与流行株的差异，预测其演化趋势，调整其原始序列(图2)。首先根据氨基酸序列的变化趋势，选择其保守位点；通过收集不同地区新城疫HN基因序列与疫苗株的序列进行同源性比较分析，结果表明，存在弱毒株毒力返强，强毒株变异趋势，如在33、35、41位氨基酸的变化，毒株氨基酸位点有T突变成M、V突变成M、V突变成A的趋势，根据流行趋势的保守性原则进行相应的调整。同时根据家蚕密码子的偏嗜性、序列的GC含量、限制性内切酶位点等对获得的鸡新城疫HN基因原始序列进行调整和优化，得到适宜在家蚕中表达的基因序列NDV-HN-O，并且含有干扰素原始信号肽序列。原始序列中含有串联的稀有密码子，这减少了翻译序列或者甚至解除翻译装置，优化后序列CAI值由0.72提高为0.79，调整了GC含量及不宜峰以延长mRNA的半衰期。优化后序列NDV-HN-O核苷酸序列为SEQIDNO.7所示，所编码的氨基酸序列为SEQIDNO.8所示。
直接合成实施例2中优化后的NDV-F-O序列及优化的NDV-HN-O序列并克隆到载体pUC57上，获得pUC57-NDV-F-O和pUC57-NDV-HN-O。NDV-F-O序列5′端加入pstI，EcoRI，BamHI位点和Kozak序列；3′端加入XbaI，PstI位点；NDV-HN-O序列5′端加入BamHI位点和Kozak序列；3′端加入NotI位点。
3重组杆状病毒转移载体pVL1393-NDV-F-IRES-HN-O的构建
用蟋蟀麻痹病毒(Cricketparalysisvirus，CrPV)的内部核糖体进入位点(Internalribosomeentrysite，IRES)序列将调整优化和经密码子优化的鸡新城基因序列NDV-F-O和NDV-HN-O串联，来实现鸡新城疫NDV-F-O和NDV-HN-O的同时表达。pBm035-IRES质粒为中国农业科学院生物技术研究所分子微生物实验室保存。
3.1pBm035-IRES-F-O的构建
3.1.1质粒酶切
质粒pUC57-NDV-F-O的酶切体系：
质粒载体酶切体系：
37℃反应2h，取5μL电泳检测是否酶切完全，向反应体系中加入1/10体积的3MNaAc，2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min，4℃，12000rpm离心10min，用预冷的70％乙醇洗沉淀一次，4℃，12000rpm离心5min，真空干燥沉淀，加入35μLddH2O溶解，加入4μLBufferE，XbaI1μL，37℃反应3h，65℃灭活15min，保存于-20℃备用。
3.1.2目的片段与载体连接
16℃反应8-12h，转化大肠杆菌感受态细胞。
3.1.3重组质粒的抽提及鉴定
提取重组质粒，进行酶切鉴定；37℃酶切3h，经酶切测序鉴定正确的命名为pBm035-IRES-F-O。
3.2pBm035-F-IRES-HN-O的构建
3.2.1质粒的酶切
质粒pUC57-NDV-HN-O的酶切体系：
质粒载体酶切体系：
37℃反应2h，取5μL电泳检测是否酶切完全，向反应体系中加入1/10体积的3MNaAc，2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min，4℃，12000rpm离心10min，用预冷的70％乙醇洗沉淀一次，4℃，12000rpm离心5min，真空干燥沉淀，加入35μLddH2O溶解，加入4μLBufferE，NOtI1μL，37℃反应3h，65℃灭活15min，保存于-20℃备用。
3.2.2目的片段与载体连接
连接体系：
16℃反应8-12h，转化大肠杆菌感受态细胞。
3.2.3重组质粒的抽提及鉴定
提取重组质粒，进行酶切；37℃酶切3h，经酶切测序鉴定正确的重组质粒命名为pBm035-F-IRES-HN-O。
3.3pVL1393-F-IRES-HN-O的构建
3.3.1质粒的酶切
质粒pBm035-F-IRES-HN-O的酶切体系：
质粒载体酶切体系：
37℃反应2h，取5μL电泳检测是否酶切完全，向反应体系中加入1/10体积的3MNaAc，2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min，4℃，12000rpm离心10min，用预冷的70％乙醇洗沉淀一次，4℃，12000rpm离心5min，真空干燥沉淀，加入35μLddH2O溶解，加入4μLBufferE，NOtI1μL，37℃反应3h，65℃灭活15min，保存于-20℃备用。
3.3.2目的片段与载体连接
连接体系：
16℃反应8-12h，转化大肠杆菌感受态细胞。
3.3.3重组质粒的抽提及鉴定
提取重组质粒，进行酶切；37℃酶切3h，经酶切测序鉴定正确的命名为pVL1393-F-IRES-HN-O。
3.4重组家蚕杆状病毒rBmNPV-NDV-F-IRES-HN-O的构建和获得
具体方法同实施例1。
3.5重组病毒rBmNPV-NDV-F-IRES-HN-O在家蚕细胞中的扩增
具体方法同实施例1。
3.6重组病毒的鉴定
利用PCR方法分析外源基因整合。
游离病毒基因组DNA的提取方法同实施例1。
寡核苷酸引物为：按优化的NDV-F-IRES-HN-O基因序列跨IRES设计引物，扩增片段长度为727bp，能够扩增出目的片段的说明转移载体杆状病毒已重组成功。
上游引物：5'-AAATTGGAGAAAGTGAATGT-3'；
下游引物：5'-GATGATAGATTCCGTGTTCA-3'；
取上述病毒基因组DNA1μl进行PCR扩增，反应条件为：94℃变性5min、94℃50sec、58℃50sec、72℃50sec，30个循环，最后72℃延伸5min。
取15μl反应产物电泳分析，结果，扩增出长度为727bp的片段，证明获得了重组病毒rBmNPV-NDV-F-IRES-HN-O。
3.7NDV-F-IRES-HN-O在家蚕蛹和蚕体中高效表达
所用的家蚕蛹为高表达品种为JY1(同实施例1)。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。饷食后48h选择平均体重相同的家蚕及结茧七天后平均体重相同的15粒蚕蛹，每头蚕蛹和蚕接种约1.0×105pfu/头rBmNPV-NDV-F-IRES-HN-O，4-5天后收集发病蚕蛹和取蚕血，-20℃冻存。
3.7.1NDV-F-IRES-HN-O病毒样颗粒的收集与纯化
将表达NDV-F-IRES-HN-O的蚕蛹用预冷的PBS(料液比为1：9)在匀浆器中研磨后，用0.45um滤器过滤；在30％蔗糖溶液中，1.5×105g超高速离心2h；用含0.1MNaCl的Tris-HCl(PH7.0)的溶液把沉淀复溶到原体积，过阳离子交换层析填料SP(GE公司)，0.5MNaCl的Tris-HCl(PH7.0)洗脱，再通过分子筛层析S200(GE公司)，纯度可达95％，得率可达40％以上。同时证明，在家蚕中表达的目的蛋白是可溶的。
3.7.2鸡新城疫病毒检测抗体的制备
3.7.2.1引物设计
设计三对特异引物将优化后的血凝素神经氨酸酶序列HN-O分三段进行原核表达，引物设计如下：
NDV-F1：5'-CGGATCCGCTATCACAAGTCTGTCATACC-3'；
NDV-R1：5'-CAAGCTTCTAAACCCAATCCTTGAAGAGC-3'；
NDV-F2：5'-CGGATCCGCTCCCACCTCAATGGTACATG-3'；
NDV-R2：5'-CAAGCTTCTAACGTGTAAATGCGTTGAAC-3'；
NDV-F3：5'-CGGATCCGGCAGAATTTTGACAGTTGGTA-3'；
NDV-R3：5'-CAAGCTTCTAGTCATCCTTCAAAATCTCC-3'。
3.7.2.2含新城疫HN-O基因的重组质粒的构建
以质粒pUC57-NDV-HN-O为模板，分别用上述三对引物扩增目的片段NDV-FR1、NDV-FR2、NDV-FR3；玻璃奶法纯化回收PCR产物，PCR纯化产物与克隆载体pEASY-T3连接，连接产物转化已制备的大肠杆菌热击感受态细胞，挑斑培养进行重组质粒的鉴定，细胞破碎法快速鉴定后挑取质粒带退后的菌株，碱裂解法提取重组质粒pT3-NDV-HN-FR1、pT3-NDV-HN-FR2、pT3-NDV-HN-FR3，用BamHI/HindIII进行双酶切鉴定，并将酶切鉴定正确的重组菌菌液送北京擎科生物技术有限公司进行DNA测序验证。将测序结果与先前质粒pUC57-NDV-HN-O的序列进行核酸序列比对，结果表明，三个重组质粒中的目的序列与先前质粒序列结果一致，没有发生移码突变并含有设计的酶切位点。
3.7.2.3重组质粒pET28a-NDV-FR1、pET28a-NDV-FR2和pET28a-NDV-FR3的构建
测序正确的重组质粒pT3-NDV-HN-FR1、pT3-NDV-HN-FR2、pT3-NDV-HN-FR3经BamHI/HindIII双酶切消化后，玻璃奶法纯化回收酶切产物，将其连接到已被BamHI/HindIII双酶切消化的表达载体pET-28a+上，连接产物转化Top10感受态细胞，挑斑后先进行细胞破碎法快速鉴定，而后碱法少量快速抽提重组质粒pET28a-NDV-HN-FR1、pET28a-NDV-HN-FR2、pET28a-NDV-HN-FR3用BamHI/HindIII双酶切鉴定。
3.7.2.4重组质粒在大肠杆菌中诱导融合表达
具体方法同实施例2。
3.7.2.5融合蛋白的纯化及其抗体的制备
具体方法同实施例2。
3.7.2.6多克隆抗体效价检测
纯化的NDV-HN-FR1蛋白及实施例2制备的纯化的NDV-F-FR2蛋白免疫豚鼠4次后获得多克隆抗体。用纯化的融合蛋白作包被抗原，用PBS稀释不同倍数100、200、400、800、1600、3200、6400、12800、25600、51200的多克隆抗血清作一抗，夹心ELISA检测法测抗体效价图，免疫前鸡血清作阴性对照，在A492nm处吸光值，以各个稀释倍数为X轴，各稀释倍数下的吸光值平均值为Y轴。通常大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性(以空白对照孔调零后计算)。结果显示：自制的抗体在抗原蛋白浓度为10μg/ml时抗体的效价可达1：3200。
3.7.3表达产物的检测
3.7.3.1ELISA检测
注射病毒后的家蚕，待发病时收集蚕血。ELISA法检测NDV-F-IRES-HN-O抗原蛋白表达量的高低，包被液作为空白对照，以正常蚕血作为阴性对照，原核表达的NDV-F-FR2、NDV-HN-FR1蛋白免疫小鼠之后的鼠血清为第一抗体，HRP标记的羊抗鼠抗体为第二抗体。任取所收蚕血中样品，用包被液做梯度稀释，从100×两倍倍比稀释到6400倍。每个梯度处做双孔检测，各取100μL包被到酶标板上。结果表明在3200倍稀释甚至更高稀释度下仍能检测到抗原与抗体的特异性反应。
表3ELISA检测家蚕生物反应器中表达的NDV-F-IRES-HN-O基因
3.7.3.2Westernblotting检测
Westernblotting结果表明在重组病毒感染后家蚕的血淋巴样品的上清液中可检测到F、HN蛋白大小约为59kD、64kD的特异性条带(图4、图5)。
3.7.4动物免疫实验
按国家标准(中华人民共和国兽药典)将收集的纯化抗原NDV病毒F、F-I-HN抗原经肌肉注射试验组(分为100支苗/组：3mlNDV蛋白抗原母液与等体积油佐剂混合试制疫苗；200支疫苗/组：1.5mlNDV蛋白抗原母液+1.5mlPBS+3ml油佐剂混合试制疫苗)，每组均为12羽，0.5ml/只在鸡上进行动物实验，另设12羽鸡只注射佐剂的为对照组。在免疫后14天后取血，进行ELISA抗体效价检测，结果表明，实验组全部产生针对NDV的抗体，200支疫苗/组实验组检测效价可达3200倍以上；而对照组没有检测到抗体；在免疫后21-28d进行攻毒实验，免疫组的没有鸡死亡，而对照组攻毒后3天内全部死亡，表现典型的鸡新城疫症状。
实施例4鸡新城疫优化后基因F-O的表达和基因呈递
1优化后序列F-O的获得
具体方法同实施例2。
2重组杆状病毒转移载体pVL1393-CAG-NDV-F-O的构建
具体方法参考实施例2。
将优化后的序列NDV-F-O并克隆到载体pUC57上获得重组质粒pUC57-F-O；将测序鉴定过的重组质粒pUC57-NDV-F-O双酶切，使其线性化。将酶切后得到的目的片段与载体(pVL1393-CAG)连接；16℃反应8-12h，转化大肠杆菌感受态细胞，得到重组质粒，抽提重组质粒及酶切鉴定重组质粒；
重组质粒的测序鉴定以及分析
将鉴定为阳性克隆(命名为pVL1393-CAG-NDV-F-O)的菌种测序。测序结果用DNAStar、DNAMAN软件对序列进行分析。分析结果显示，pVL1393-CAG-NDV-F-O载体已正确构建。
3鸡新城疫F-O基因重组到BmNPVDNA上得到F-O基因的呈递载体
接种约0.5～1×106Bm-N细胞于15cm2培养瓶中，贴壁培养过夜(即细胞密度约为80％)。除去含FBS的培养基，用无血清培养基洗细胞二次，再加1mL无血清培养基。在50μL反应体系中加入上述BmNPV的DNA1μg，pVL1393-CAG-NDV-F-O质粒DNA2ug，脂质体5μL混合，加水补足体积，轻轻混匀，27℃温育15min，逐滴加入培养瓶中，边加边摇匀。27℃培养4～6h后倾去含转染液的无血清培养基，补加4.5mL无血清培养基并加入500μL的FBS，使其终浓度为10％，封口，27℃培养4～5d，至细胞浮起后，收集上清液用于重组呈递载体的筛选和表达。
4重组载体BmNPV-CAG-NDV-F-O的筛选、纯化和扩增
接种适量Bm细胞(平皿底部面积的80％)于35mm小dish中，27℃培养16h至细胞贴壁后，吸去培养基，将共转染上清液按10-3～10-5作适当稀释后，取1mL稀释液加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1h，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与等体积经40℃预热的2xTC-100培养基(含20％FBS)混合均匀，添加X-gal使其终浓度达150μg/mL，沿小dish边缘将胶慢慢倒入，凝固后用Parafilm封口，27℃倒置培养4～7d。显微镜下选取无多角体重组病毒空斑，超净台内用Tip头挑取重组病毒斑，溶于400μLTC-100培养基中，4℃放置4h使病毒粒子释放出来。
取100μL病毒液感染24孔板中的细胞，27℃培养3d后，取150μL感染细胞上清按碱变性法快速制备病毒基因组DNA，进行PCR扩增分析，发现30个斑的病毒都为含F-O基因的重组病毒BmNPV。将能扩增出目的片段的病毒上清液铺斑进行第一次筛选，最终获得含目的基因的纯重组病毒。
分别取100μL纯重组病毒感染正常生长的Bm-5贴壁细胞，在感染后约5d待细胞浮起后，4℃保存，用以感染。
5基因呈递骨架载体BmNPV-CAG-NDV-F-O在家蚕中的扩增
将上述重组病毒BmNPV-CAG-NDV-F-O培养液按105pfu/头注射五龄幼蚕，待家蚕发病后，剪掉足，收集蚕血，-20℃冻存，得到含有F基因的家蚕杆状病毒呈递载体。
6荧光定量PCR
6.1样品的处理
取50μL前述的血淋巴样品，加入等体积的1.0MNaOH轻轻混匀，室温作用5min，然后每管加10μL的10MNH4Ac，室温作用5min，轻轻摇匀以中和碱液，作用完毕后，用饱和酚，氯仿：异戊醇(24：1)去除蛋白，用2.5倍体积的乙醇沉淀总核酸，沉淀经75％酒精洗后真空抽去残余的酒精，沉淀溶于20μLTE。取5μL上述DNA作为PCR的模板。
6.2引物设计
F-O基因上游引物：5'-GGACTCGCAGGTCATTGTAA-3'；
F-O基因下游引物：5'-CATCAGGTAGCAGGCCAACA-3'；
荧光定量PCR程序如下：95℃3min；95℃40sec，60℃40sec，72℃40sec，40个循环。
标准曲线的制作：根据F-O基因设计引物进行荧光定量PCR后克隆到pGEM-T载体上，测定重组T载体浓度并进行10倍梯度稀释，对每个稀释样品用F-O基因引物进行3次qPCR，生成标准曲线。对每组提取DNA用F-O基因特异引物进行3次qPCR。
结果显示，每毫升蚕体血淋巴中分别含有约1010个F-O基因的DNA拷贝。
7动物免疫实验
按国家标准(中华人民共和国兽药典)将含BmNPV-CAG-NDV-F-O重组病毒(即外源基因NDV-F-O可由哺乳动物启动子驱动表达的重组BmNPV病毒)初步纯化，用含初步纯化的108pfu重组病毒注射或口服实验鸡，在免疫后21天后取血，进行ELISA抗体效价检测。结果表明，实验组全部产生针对NDV的抗体，抗体滴度达到1600左右，而对照组检测到的抗体滴度在20左右；在免疫后30-35d进行攻毒实验，免疫组的没有鸡死亡，而对照组攻毒后3天内全部死亡，表现典型的鸡新城疫症状。
实施例5鸡新城疫优化后基因F-IRES-HN-O的联合表达和基因呈递
1优化后序列F-O、HN-O的获得
具体方法同实施例3。
2重组杆状病毒转移载体pVL1393-CAG-NDV-F-IRES-HN-O的构建
具体构建方法参考实施例3和4。
用蟋蟀麻痹病毒(Cricketparalysisvirus，CrPV)的内部核糖体进入位点(Internalribosomeentrysite,IRES)序列将鸡新城F-O和HN-O串联，来实现鸡新城疫F-O和HN-O的同时表达。首先构建含有IRES-F-O序列的pBm035-IRES-F-O，然后构建含有F-IRES-HN-O序列的pBm035-F-IRES-HN-O，最后构建含F-IRES-HN-O序列的pVL1393-CAG-NDV-F-IRES-HN-O质粒。
pBm035-IRES-F-O的构建：
测序鉴定过的重组质粒pUC57-NDV-F双酶切，使其线性化。酶切体系如下：
质粒载体酶切体系：
37℃反应2h，取5μL电泳检测是否酶切完全。
目的片段与载体连接
连接体系：
16℃反应8-12h，转化大肠杆菌感受态细胞，得到重组质粒。
将酶切鉴定正确的质粒命名为pBm035-IRES-F-O，将该质粒进行测序，测序结果证明质粒构建正确。
pBm035-F-IRES-HN-O的构建
测序鉴定过的重组质粒pUC57-NDV-HN-O双酶切，使其线性化。酶切体系如下：
质粒载体酶切体系：
37℃反应2h，取5μL电泳检测是否酶切完全。
目的片段与载体连接：16℃反应8-12h，转化大肠杆菌感受态细胞，得到重组质粒；抽提重组质粒及并进行酶切鉴定；将酶切鉴定正确的质粒命名为pBm035-F-IRES-HN-O。测序结果证明，质粒得到成功构建。
目的片段与载体的连接
测序鉴定过的重组质粒pBm035-F-IRES-HN-O双酶切，使其线性化。酶切体系如下：
质粒载体酶切体系：
37℃反应2h，取5μL电泳检测是否酶切完全。
目的片段与载体连接
连接体系：
16℃反应8-12h，转化大肠杆菌感受态细胞得到重组质粒。抽提重组质粒并进行酶切鉴定；将酶切鉴定为阳性克隆命名为pVL1393-CAG-NDV-F-IRES-HN-O的菌种进行测序，测序结果证明构建正确。
3鸡新城疫F-IRES-HN-O基因重组到BmNPVDNA上得到F-IRES-HN-O基因的呈递载体
接种约0.5～1×106Bm-N细胞于15cm2培养瓶中，贴壁培养过夜(即细胞密度约为80％)。除去含FBS的培养基，用无血清培养基洗细胞二次，再加1mL无血清培养基。在50μL反应体系中加入上述BmNPV的DNA1μg，pVL1393-CAG-NDV-F-IRES-HN-O质粒DNA2μg，脂质体5μL混合，加水补足体积，轻轻混匀，27℃温育15min，逐滴加入培养瓶中，边加边摇匀。27℃培养4～6h后倾去含转染液的无血清培养基，补加4.5mL无血清培养基并加入500μL的FBS，使其终浓度为10％，封口，27℃培养4～5d，至细胞浮起后，收集上清液用于重组呈递载体的筛选和表达。
4重组载体BmNPV-CAG-F-IRES-HN-O的筛选、纯化和扩增
接种适量Bm细胞(平皿底部面积的80％)于35mm小dish中，27℃培养16h至细胞贴壁后，吸去培养基，将共转染上清液按10-3～10-5作适当稀释后，取1mL稀释液加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1h，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与等体积经40℃预热的2xTC-100培养基(含20％FBS)混合均匀，添加X-gal使其终浓度达150μg/mL，沿小dish边缘将胶慢慢倒入，凝固后用Parafilm封口，27℃倒置培养4～7d。显微镜下选取无多角体重组病毒空斑，超净台内用Tip头挑取重组病毒斑，溶于400μLTC-100培养基中，4℃放置4h使病毒粒子释放出来。
取100μL病毒液感染24孔板中的细胞，27℃培养3d后，取150μL感染细胞上清按碱变性法快速制备病毒基因组DNA，进行PCR扩增分析，发现33个斑的病毒都为含F-O、HN-O基因的重组病毒BmNPV，将能扩增出目的片段的病毒上清液铺斑进行第一次筛选，最终获得含目的基因的纯重组病毒。
分别取100μL纯重组病毒感染正常生长的Bm-5贴壁细胞，在感染后约5d待细胞浮起后，4℃保存，用以感染。
5基因呈递骨架载体BmNPV-CAG-F-IRES-HN-O在家蚕中的扩增
将上述重组病毒BmNPV-CAG-F-IRES-HN-O培养液按105pfu/头注射五龄幼蚕，待家蚕发病后，剪掉足，收集蚕血，-20℃冻存，得到含有F-O、HN-O基因的家蚕杆状病毒呈递载体。
6荧光定量PCR
6.1样品的处理
取50μL前述的血淋巴样品，加入等体积的1.0MNaOH轻轻混匀，室温作用5min，然后每管加10μL的10MNH4Ac，室温作用5min，轻轻摇匀以中和碱液，作用完毕后，用饱和酚，氯仿：异戊醇(24:1)去除蛋白，用2.5倍体积的乙醇沉淀总核酸，沉淀经75％酒精洗后真空抽去残余的酒精，沉淀溶于20μLTE。取5μL上述DNA作为PCR的模板。
6.2引物设计
F-IRES-HN-O上下游引物：
NDVF-F4：5'-TGTGGCTCGGAAATAACACTC-3'；
NDVH-R1：5'-CAGCACGACCCTATTGACTG-3'；
荧光定量PCR程序如下：95℃3min；95℃40sec，60℃40sec，72℃40sec，40个循环。
标准曲线的制作：根据BmNPV-CAG-F-IRES-HN-O中F-IRES-HN-O基因设计引物进行荧光定量PCR，F-IRES-HN-O通过PCR扩增后克隆到pGEM-T载体上，测定重组T载体浓度并进行10倍梯度稀释，对每个稀释样品用F-IRES-HN-O特异引物进行3次qPCR，生成标准曲线。对每组提取DNA用F-IRES-HN-O特异引物进行3次qPCR。
结果显示，每毫升蚕体血淋巴中分别含有约1010个F-IRES-HN-O基因的DNA拷贝。
7动物免疫实验
按国家标准(中华人民共和国兽药典)将含BmNPV-CAG-NDV-F-IRES-HN-O的重组病毒(即外源基因NDV-F-IRES-HN-O基因可由哺乳动物启动子驱动表达的重组BmNPV病毒)初步纯化，用含初步纯化的108pfu重组病毒注射或口服育成鸡，在免疫后21天后取血，进行ELISA抗体效价检测。结果表明，实验组全部产生针对NDV的抗体，抗体滴度达到3200左右，而对照组检测到的抗体滴度在20以下；在免疫后30-35d进行攻毒实验，免疫组的没有鸡死亡，而对照组攻毒后3天内全部死亡，表现典型的鸡新城疫症状。

Claims (9)

1.预测后优化的鸡新城疫血凝素神经氨酸酶基因HN-O，其特征在于：其核苷酸序列为SEQIDNO.7所示。
2.含有权利要求2所述优化的鸡新城疫血凝素神经氨酸酶基因HN-O的表达载体；优选的，所述的表达载体是杆状病毒表达载体。
3.一种鸡新城疫糖蛋白病毒抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将权利要求1所述的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN-O克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达载体；或者将鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F或优化后的鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F-O与鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN或权利要求1所述的优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN-O串联在一起的序列克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达载体；
(2)将构建得到的转移表达载体与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞获得重组杆状病毒；
(3)将重组杆状病毒感染昆虫宿主或昆虫细胞；培养被感染的昆虫宿主或昆虫细胞，诱导表达相应的鸡新城疫病毒抗原；收获并纯化所表达的抗原。
4.一种鸡新城疫病毒抗原基因家蚕杆状病毒呈递载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将权利要求1所述的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN-O与哺乳动物细胞启动子一起克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达载体；或者将优化后的鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F-O与优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN-O串联在一起的序列与哺乳动物细胞启动子一起克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达载体；
(2)将构建得到的转移表达载体与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞获得重组杆状病毒；
(3)将重组杆状病毒感染昆虫宿主，扩增重组杆状病毒，即得。
5.按照权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于：所述优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN-O为SEQIDNO.7所示；所述优化后的鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F-O与优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN-O串联在一起的序列为SEQIDNO.9所示。
6.按照权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于：所述的杆状病毒运载载体选自AcRP23-lacZ、AcRP6-SC、AcUWl-lacZ、BacPAK6、BactoPac、Bacmid、BlucBacII(pETL)、p2Bac、p2Blue、p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB4、PAcAS3、pAcC129、pAcC4、DZI、pAcGP67、pAcIEl、pAcJPl、pAcMLF2、pAcMLF7、pAcMLF8、pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP25、pAcRW4、pAcsMAG,pAcUWl、pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51、pAcVC2、pAcVC3、pAcYMl、pAcJcC5、pBacl、pBac2、pBlueBacIII、pBlueBacHis、pEV55、mXIV,pIEINeo、pJVETL、pJVNhel、pJVP10、pJVrsMAG、pMBac、pP10、pPAKl、pPBac、pSHONEX1.1、pSYNXIVVI+、pSYNVI+wp、pSYNXIVVI-、pVL1391、pVL1392、pVL1393、pVL941、pVL945、pVL985、pVTBac、pBM030或pUAC-5；优选为pVL1393；
所述的杆状病毒选自BmNPV、AcMNPV、ApNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SlMNPV、SeMNPV或SpltNPV；优选为BmNPV；
所述的昆虫宿主包括：家蚕(Bombyxmori)、野蚕(Bombyxmandarina)、蓖麻蚕(Philosamiacynthiaricim)、樟蚕(Dictyoplocajapanica)、樗蚕(Philosamiacynthiapryeri)、柞蚕(Antheraeapernyi)、日本柞蚕(Antheraeayamamai)、野天蚕(Antheraeapolyphymus)、苜蓿尺蠖(Atographacaliforica)、茶尺蠖(Ectropisobliqua)、甘兰夜蛾(Mamestrabrassicae)、斜纹夜蛾(Spodopteralittoralis)、秋粘虫(Spodopterafrugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusiani)、行军虫(Thaumetopoeawilkinsoni)、棉铃虫(Heliothisarmigera)、美国棉铃虫(Heliothiszea)、烟青虫(Heliothisassulta)、烟草夜蛾(Heliothisvirescens)、东方粘虫(Pseudaletiaseparata)或舞毒蛾(Lymantriadispar)及相应的昆虫细胞；优选为家蚕；
所述的感染是指重组杆状病毒通过吞食或透过表皮来感染1-5龄的昆虫幼虫或蛹体；优选为将重组家蚕杆状病毒感染家蚕细胞或穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫或蛹，在感染3-6天后收集含各种抗原的家蚕幼虫或蛹的体液或组织匀浆或在昆虫体内繁殖的重组病毒；最优蛹体为1-2天的早期嫩蛹。
7.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述的哺乳动物细胞启动子包括但不限于CAG启动子、PEC启动子、CMV启动子、人巨细胞病毒早期启动子、人延伸因子1-亚基启动子、Rous肉瘤长末端重复序列、人leukosialin基因启动子、鼠3-磷酸甘油激酶l基因启动子、人泛素蛋白C基因启动子、鸡β-肌动蛋白启动子和CMV增强子序列构成的杂合启动子、鼠乳房瘤病毒启动子；优选为CAG启动子。
8.由权利要求3-7任何一项制备方法制备得到的重组鸡新城疫病毒抗原或鸡新城疫病毒抗原基因家蚕杆状病毒基因呈递载体。
9.权利要求8的重组鸡新城疫病毒抗原或鸡新城疫病毒抗原基因家蚕杆状病毒基因呈递载体在制备预防、治疗或诊断鸡新城疫疫苗或试剂中的用途。
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