CN110488011B - 新城疫病毒抗体检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新城疫病毒抗体检测试剂盒。本发明的检测试剂盒包括一个或多个固体载体，以及独立地连接于所述一个或多个固体载体上的特定多肽或多肽组合。
Description
技术领域
本发明主要涉及禽用试剂盒及诊断方法。具体而言，本发明涉及可用于对新城疫抗体检测的试剂盒以及检测方法。
背景技术
新城疫(ND)是由NDV(Newcastle disease virus,新城疫病毒)引起的一种极易传染的毁灭性疾病，其死亡率常高达100％，广泛分布于许多国家,OIE将其列为A类疫病。本病的典型特征是呼吸道、消化道粘膜出血，人也有易感性。本病在1926年最早发现于印度尼西亚的巴塔维亚，同年发现于英国新城，因此而得名。
NDV为副黏病毒科副黏病毒属(Avulavirus)的禽副黏病毒I型(APMV-1)。该病毒具有囊膜结构，基因组为单股负链不分节段的RNA病毒，由6种结构蛋白组成，分别为NP、P、M、F、HN和L蛋白。NP蛋白为核衣壳蛋白，氨基酸保守性较高，大部分NDV病毒在NP蛋白443-460位置都具有一高度保守的B细胞表位；P蛋白是病毒RNA合成的必需因子；M、F和HN蛋白与病毒囊膜的形成相关；F蛋白(融合蛋白)和HN蛋白(血凝素神经氨酸酶蛋白)是病毒的主要免疫原性蛋白，可以诱导机体产生中和抗体。F蛋白介导病毒与宿主细胞的膜融合，其蛋白裂解位点与病毒毒力有关。HN蛋白具有神经氨酸酶及促进融合等作用；此外，该蛋白还与病毒毒力相关。L蛋白为病毒最大的蛋白，它在NDV6种结构蛋白中最为保守，具有RNA聚合酶、转录后修饰等生物学活性，可与NP和P蛋白共同构成病毒复制复合体，该复合体参与病毒基因组的转录和复制。
目前，新城疫的实验室检测技术主要包括：常规分离鉴定，血清学方法(血凝试验(HA)、血凝抑制试验(HI)、琼脂扩散实验(AGP)、荧光抗体技术(FA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、病毒中和试验(VNT)、乳胶凝集试验(LAT)、神经氨酸酶试验(NIT)、放射免疫试验(RIA)，分子生物学方法(RNA指纹图谱、核酸探针技术、RT-PCR技术)等。这其中，酶联免疫测定的特异性和敏感性较高且适合检测大量样品，因此，被广泛应用于新城疫病毒抗体的检测。
用于新城疫病毒抗体检测的酶联免疫测定方法主要包括竞争酶联免疫测定(c-ELISA)、阻断酶联免疫测定(b-ELISA)和间接阻断酶联免疫测定。c-ELISA和b-ELISA的特异性和敏感性都比较高，是被临床普遍接受的新城疫病毒抗体检测方法。但是，c-ELISA和b-ELISA均需使用单克隆抗体，这造成检测成本大幅提高；而且，c-ELISA和b-ELISA的操作繁琐、检测时间长、判据复杂。另一方面，传统的间接ELISA使用源自新城疫病毒的完整蛋白或重组蛋白作为包被抗原来检测血清中的抗体，其成本低于c-ELISA和b-ELISA；但是，由于该方法使用完整蛋白作为抗原，容易发生抗体的错误识别和非特异性识别，因此，其特异性和敏感性都不及c-ELISA和b-ELISA。
因此，需要开发出检测成本低、检测时间短、操作简便、特异性和敏感性高的新城疫病毒抗体检测试剂盒。
发明内容
鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种检测成本低、检测时间短、操作简便、特异性和敏感性高的新城疫病毒抗体检测试剂盒，以及能够用于制备该试剂盒的多肽或多肽组合。
发明人为解决上述技术问题进行了深入研究，结果发现，当用SEQ ID NO：1～5所示的多肽组合检测新城疫病毒抗体时，敏感性为86％、特异性为100％，完全可以与c-ELISA方法和b-ELISA方法媲美。
因此，本发明包括：
1.一种新城疫病毒抗体(IgY)检测试剂盒，其包括一个或多个固体载体，以及独立地连接于所述一个或多个固体载体上的下述多肽组合1；
多肽组合1
SEQ ID NO：1所示的多肽，
SEQ ID NO：2所示的多肽，
SEQ ID NO：3所示的多肽，
SEQ ID NO：4所示的多肽，以及
SEQ ID NO：5所示的多肽。
2.根据项1所述的检测试剂盒，其用于检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗新城疫病毒的抗体(IgY)。
3.根据项2所述的检测试剂盒，其中，所述对象生物是禽类。
4.根据项2所述的检测试剂盒，其中，所述对象生物是鸡。
5.根据项2所述的检测试剂盒，其中，所述生物样本是全血、血浆或血清。
6.下述多肽组合1在制备用于检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗新城疫病毒的抗体(IgY)的试剂盒中的用途；
多肽组合1
SEQ ID NO：1所示的多肽，
SEQ ID NO：2所示的多肽，
SEQ ID NO：3所示的多肽，
SEQ ID NO：4所示的多肽，以及
SEQ ID NO：5所示的多肽。
7.根据项6所述的用途，其中，所述对象生物是禽类。
8.根据项6所述的用途，其中，所述对象生物是鸡。
9.根据项6所述的用途，其中，所述生物样本是全血、血浆或血清。
上述多肽及试剂盒可以用于检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗新城疫病毒的抗体(IgY)。通常，生物样本中的新城疫病毒抗体是由于对象生物被新城疫病毒感染或被新城疫疫苗免疫而产生的，因此，上述多肽及试剂盒可以用于诊断对象生物是否被新城疫病毒感染或新城疫疫苗免疫。
发明的具体实施方式
本说明书中，敏感性是指：用“金标准”方法确认的阳性样本中，被其他方法测定为阳性样本的比例。特异性是指：用“金标准”方法确认的阴性样本中，被其他方法测定为阴性样本的比例。对于新城疫病毒抗体的检测而言，本技术领域的“金标准”是血凝抑制试验(HI)。
发明人还发现，当用SEQ ID NO：1～5所示的多肽组合检测新城疫病毒抗体时，敏感性为86％、特异性为100％，完全可以与c-ELISA方法和b-ELISA方法媲美。因此，本发明还提供下述多肽组合1。
多肽组合1
SEQ ID NO：1所示的多肽，
SEQ ID NO：2所示的多肽，
SEQ ID NO：3所示的多肽，
SEQ ID NO：4所示的多肽，以及
SEQ ID NO：5所示的多肽。
上述多肽组合可以作为检测探针用于制备检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗新城疫病毒的抗体的试剂盒。
因此，本发明还提供一种新城疫病毒抗体检测试剂盒，其包括一个或多个固体载体，以及独立地连接于所述一个或多个固体载体上的上述多肽组合1。
在本说明书中，固体载体可以是一个，也可以是多个，但优选为一个，即全部多肽独立地连接于同一固体载体上。在本发明中，对固体载体没有特殊限制，只要是作为固体或不溶性材料的载体即可。多肽与固体载体的连接可以采用本领域技术人员公知的多肽与固体载体的连接方法来进行。
在本说明书中，所述对象生物优选为禽类，更优选为鸡。
在本说明书中，所述生物样本可以是全血、血浆或血清。
在使用上述试剂盒检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗新城疫病毒的抗体的情况下，当所述多肽组合1中的任意一条或多条多肽对对象生物来源的生物样本有响应时，判定为该对象生物来源的生物样本中存在抗新城疫病毒的抗体(即阳性)；反之，当所述多肽组合1中没有任何一条多肽对对象生物来源的生物样本有响应时，判定为该对象生物来源的生物样本中不存在抗新城疫病毒的抗体(即阴性)。
在本说明书中，“响应”是指：信噪比(SNR)大于或等于2，其中，信噪比＝(多肽点信号值-阴性对照点信号值)/阴性对照点信号值。
实施例
1.多肽的制备与确认
实施例中使用的多肽由吉尔生化(上海)有限公司合成，并通过质谱对其进行了确认。其中，
SEQ ID NO：1：DYIGGIGKELIVDDASDVTS。
SEQ ID NO：2：IANCKMTTCRCVNPPGIISQ。
SEQ ID NO：3：NHTLRGVFGTMLDGVQARLN。
SEQ ID NO：4：CSKVTETEEEDYNSAVPTRM。
SEQ ID NO：5：KVTFDKLEKKIRSLDLSVGL。
2.试剂盒(检测芯片)的制备
试剂盒1
采用常规方法在常规的ELISA用固相载体上分别点样上述SEQ ID NO：1～5所示的多肽的溶液，另外点样一个鸡IgY点作为阳性质控点以及一个PB点作为阴性质控点，制备了检测芯片。
3.用试剂盒进行检测
将多肽芯片置于室温20min，肉眼观察芯片表面，将有缺损的多肽芯片淘汰，同时确定多肽芯片的正确方向，夹于凸槽，按照血清的数量进行芯片的编号，然后在合格的多肽芯片内注满TBST(0.4M Tris-HCl，2.74M NaCl，2％Tween20，pH7.2±0.2)，室温放置2-4min，检查有无漏夜，将漏液的多肽芯片弃去。填补空缺的多肽芯片，操作同上。将检验合格的多肽芯片夹于凸槽上，每8个芯片为一组，用TBST润洗2次，喷壶淋洗，一孔进一孔出，形成流动，最后在纱布上轻轻拍打，再一个一个取盖甩干，但要注意保持多肽芯片表面湿润，备用。
在超净台内将血清稀释50倍(5ul血清样本+245ul血清稀释液)分别做编号，震荡混匀，使芯片编号与血清编号互相一致，在已经润洗的芯片上上样，200ul/孔，避免产生气泡，加入血清稀释液200ul，室温，摇床150rpm，孵育30min。
弃液，淋洗4次(方法同上)，甩干，加入二抗(羊抗鸡IgY)，室温，摇床150rpm，孵育30min
弃液，弃盖，淋洗4次，甩干，每8个芯片为一组，加20ul/孔的发光液(Thermo，Prod#37074)，曝光2min。使用GenePix Pro6.0采集数据。
对于每一份血清，分别统计该试剂盒中的每一条多肽是否有响应(即，信噪比(SNR)大于等于2)，并进行判定。
对于上述试剂盒1，当检测到SEQ ID NO：1～5所示的多肽中的任意一条或两条以上有响应时，判定为小反刍兽疫阳性；反之，判定为阴性。
其中，信噪比＝(多肽点信号值-阴性对照点信号值)/阴性对照点信号值。多肽点信号值是指软件读取的多肽点的化学发光强度值，阴性对照点信号值是指软件读取的阴性对照点的化学发光强度值。
对于420份来自中国各地区的鸡血清样本，分别采用上述步骤2中制备的试剂盒(按上述3的步骤)以及常规的血凝抑制试验(HI)进行检测，检测结果如下所示。
表1
敏感性＝276/320*100％＝86％
特异性＝100/100＝100％
由以上可知，上述试剂盒1实现了86％以上的检测敏感性，且特异性高达100％(而且是采用HI方法验证，不是采用对照试剂盒方法验证)，足以媲美采用c-ELISA方法或b-ELISA方法的试剂盒。
以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但并不是对本发明技术范围的限定。通过本说明书的记载，本领域技术人员可以容易的对本发明进行修饰/改变，这些包含在本发明的技术范围内。
序列表
<110> 洛阳中科生物芯片技术有限公司
<120> 新城疫病毒抗体检测试剂盒
<130> PB00166
<141> 2018-04-26
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Tyr Ile Gly Gly Ile Gly Lys Glu Leu Ile Val Asp Asp Ala Ser
1 5 10 15
Asp Val Thr Ser
20
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ile Ala Asn Cys Lys Met Thr Thr Cys Arg Cys Val Asn Pro Pro Gly
1 5 10 15
Ile Ile Ser Gln
20
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asn His Thr Leu Arg Gly Val Phe Gly Thr Met Leu Asp Gly Val Gln
1 5 10 15
Ala Arg Leu Asn
20
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Cys Ser Lys Val Thr Glu Thr Glu Glu Glu Asp Tyr Asn Ser Ala Val
1 5 10 15
Pro Thr Arg Met
20
<210> 5
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Lys Val Thr Phe Asp Lys Leu Glu Lys Lys Ile Arg Ser Leu Asp Leu
1 5 10 15
Ser Val Gly Leu
20
Claims (9)
1.一种新城疫病毒抗体IgY检测试剂盒，其包括一个或多个固体载体，以及独立地连接于所述一个或多个固体载体上的下述多肽组合1；
多肽组合1
SEQ ID NO：1所示的多肽，
SEQ ID NO：2所示的多肽，
SEQ ID NO：3所示的多肽，
SEQ ID NO：4所示的多肽，以及
SEQ ID NO：5所示的多肽。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其用于检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗新城疫病毒的抗体IgY。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其中，所述对象生物是禽类。
4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其中，所述对象生物是鸡。
5.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其中，所述生物样本是全血、血浆或血清。
6.下述多肽组合1在制备用于检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗新城疫病毒的抗体IgY的试剂盒中的用途；
多肽组合1
SEQ ID NO：1所示的多肽，
SEQ ID NO：2所示的多肽，
SEQ ID NO：3所示的多肽，
SEQ ID NO：4所示的多肽，以及
SEQ ID NO：5所示的多肽。
7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述对象生物是禽类。
8.根据权利要求6所述的用途，其中，所述对象生物是鸡。
9.根据权利要求6所述的用途，其中，所述生物样本是全血、血浆或血清。
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