CN108717124A - 新城疫病毒抗体检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新城疫病毒抗体检测试剂盒。本发明的检测试剂盒包括一个或多个固体载体，以及独立地连接于所述一个或多个固体载体上的特定多肽或多肽集合。

Description

新城疫病毒抗体检测试剂盒

技术领域

本发明主要涉及禽用试剂盒及诊断方法。具体而言，本发明涉及可用于对新城疫抗体检测的试剂盒以及检测方法。

背景技术

新城疫(ND)是由NDV(Newcastle disease virus,新城疫病毒)引起的一种极易传染的毁灭性疾病，其死亡率常高达100％，广泛分布于许多国家,OIE将其列为A类疫病。本病的典型特征是呼吸道、消化道粘膜出血，人也有易感性。本病在1926年最早发现于印度尼西亚的巴塔维亚，同年发现于英国新城，因此而得名。

NDV为副黏病毒科副黏病毒属(Avulavirus)的禽副黏病毒I型(APMV-1)。该病毒具有囊膜结构，基因组为单股负链不分节段的RNA病毒，由6种结构蛋白组成，分别为NP、P、M、F、HN和L蛋白。NP蛋白为核衣壳蛋白，氨基酸保守性较高，大部分NDV病毒在NP蛋白443-460位置都具有一高度保守的B细胞表位；P蛋白是病毒RNA合成的必需因子；M、F和HN蛋白与病毒囊膜的形成相关；F蛋白(融合蛋白)和HN蛋白(血凝素神经氨酸酶蛋白)是病毒的主要免疫原性蛋白，可以诱导机体产生中和抗体。F蛋白介导病毒与宿主细胞的膜融合，其蛋白裂解位点与病毒毒力有关。HN蛋白具有神经氨酸酶及促进融合等作用；此外，该蛋白还与病毒毒力相关。L蛋白为病毒最大的蛋白，它在NDV6种结构蛋白中最为保守，具有RNA聚合酶、转录后修饰等生物学活性，可与NP和P蛋白共同构成病毒复制复合体，该复合体参与病毒基因组的转录和复制。

目前，新城疫的实验室检测技术主要包括：常规分离鉴定，血清学方法(血凝试验(HA)、血凝抑制试验(HI)、琼脂扩散实验(AGP)、荧光抗体技术(FA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、病毒中和试验(VNT)、乳胶凝集试验(LAT)、神经氨酸酶试验(NIT)、放射免疫试验(RIA)，分子生物学方法(RNA指纹图谱、核酸探针技术、RT-PCR技术)等。这其中，酶联免疫测定的特异性和敏感性较高且适合检测大量样品，因此，被广泛应用于新城疫病毒抗体的检测。

用于新城疫病毒抗体检测的酶联免疫测定方法主要包括竞争酶联免疫测定(c-ELISA)、阻断酶联免疫测定(b-ELISA)和间接阻断酶联免疫测定。c-ELISA和b-ELISA的特异性和敏感性都比较高，是被临床普遍接受的新城疫病毒抗体检测方法。但是，c-ELISA和b-ELISA均需使用单克隆抗体，这造成检测成本大幅提高；而且，c-ELISA和b-ELISA的操作繁琐、检测时间长、判据复杂。另一方面，传统的间接ELISA使用源自新城疫病毒的完整蛋白或重组蛋白作为包被抗原来检测血清中的抗体，其成本低于c-ELISA和b-ELISA；但是，由于该方法使用完整蛋白作为抗原，容易发生抗体的错误识别和非特异性识别，因此，其特异性和敏感性都不及c-ELISA和b-ELISA。

因此，需要开发出检测成本低、检测时间短、操作简便、特异性和敏感性高的新城疫病毒抗体检测试剂盒。

发明内容

鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种检测成本低、检测时间短、操作简便、特异性和敏感性高的新城疫病毒抗体检测试剂盒，以及能够用于制备该试剂盒的多肽或多肽组合。

发明人发现：基于抗原表位多肽的间接ELISA方法由于使用抗原表位多肽(20个氨基酸左右的单条多肽通常只包含一个抗原表位)作为包被抗原，因此，特异性很高；但该方法的敏感性往往偏低，单条多肽的敏感性一般不会超过50％。如果能够找到敏感性高的抗原表位多肽，就可以克服传统的间接ELISA的缺点，开发出特异性和敏感性均可媲美c-ELISA和b-ELISA、甚至更高的新城疫病毒抗体检测试剂盒。

发明人为解决上述技术问题进行了深入研究，结果发现：SEQ ID NO：1所示的多肽，用该多肽单独检测新城疫病毒抗体的敏感性为90.5％、特异性为97％，单独使用即可达到作为检测试剂盒的标准；当用SEQ ID NO：1所示的多肽和SEQ ID NO：2所示的多肽组合检测新城疫病毒抗体时，敏感性为95％，特异性为96％，是目前综合性能最优异的新城疫病毒抗体检测试剂盒。

因此，本发明包括：

1.SEQ ID NO：1所示的多肽。

2.SEQ ID NO：1所示的多肽与SEQ ID NO：2所示的多肽的组合。

3.上述多肽或多肽组合在制备用于检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗新城疫病毒的抗体(IgY)的试剂盒中的用途。

4.一种新城疫病毒抗体(IgY)检测试剂盒，其包括一个或多个固体载体，以及独立地连接于所述一个或多个固体载体上的下述多肽组合1；

多肽组合1

SEQ ID NO：1所示的多肽，以及

SEQ ID NO：2所示的多肽。

5.一种新城疫病毒抗体(IgY)检测试剂盒，其包括一个或多个固体载体，以及独立地连接于所述一个或多个固体载体上的SEQ ID NO：1所示的多肽。

6.根据权利要求4或5所述的新城疫病毒抗体(IgY)检测试剂盒，其不包含其它用于检测新城疫病毒抗体(IgY)的探针分子(例如多肽、蛋白或核酸)。

7.下述多肽组合1在制备用于检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗新城疫病毒的抗体(IgY)的试剂盒中的用途；

多肽组合1

SEQ ID NO：1所示的多肽，以及

SEQ ID NO：2所示的多肽。

在本说明书中，所述对象生物优选为禽类，更优选为鸡。

在本说明书中，所述生物样本可以是全血、血浆或血清。

上述多肽及试剂盒可以用于检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗新城疫病毒的抗体(IgY)。通常，生物样本中的新城疫病毒抗体是由于对象生物被新城疫病毒感染或被新城疫疫苗免疫而产生的，因此，上述多肽及试剂盒可以用于诊断对象生物是否被新城疫病毒感染或新城疫疫苗免疫。

发明的具体实施方式

首先，本发明提供SEQ ID NO：1所示的多肽。发明人发现，用该多肽单独检测新城疫病毒抗体的敏感性为90.5％、特异性为97％。与基于抗原表位多肽的间接ELISA方法中，单条多肽的一般不超过50％的敏感性相比，SEQ ID NO：1所示的多肽的敏感性是惊人的，单独使用该多肽检测新城疫病毒抗体的敏感性甚至可以与传统的ELISA方法检测试剂盒媲美！而且，其还具有高达97％的特异性。因此，其取得了预料不到的技术效果。

本说明书中，敏感性是指：用“金标准”方法确认的阳性样本中，被其他方法测定为阳性样本的比例。特异性是指：用“金标准”方法确认的阴性样本中，被其他方法测定为阴性样本的比例。对于新城疫病毒抗体的检测而言，本技术领域的“金标准”是血凝抑制试验(HI)。

所述SEQ ID NO：1所示的多肽可以作为检测探针用于制备检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗新城疫病毒的抗体的试剂盒。

发明人还发现，当用SEQ ID NO：1所示的多肽与SEQ ID NO：2所示的多肽组合检测新城疫病毒抗体时，敏感性为95％、特异性为97％，完全可以与c-ELISA方法和b-ELISA方法媲美。因此，本发明还提供下述多肽组合1。

多肽组合1

SEQ ID NO：1所示的多肽，以及

SEQ ID NO：2所示的多肽。

上述多肽组合可以作为检测探针用于制备检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗新城疫病毒的抗体的试剂盒。

因此，本发明还提供一种新城疫病毒抗体检测试剂盒，其包括一个或多个固体载体，以及独立地连接于所述一个或多个固体载体上的上述多肽组合1。

在本说明书中，固体载体可以是一个，也可以是多个，但优选为一个，即全部多肽独立地连接于同一固体载体上。在本发明中，对固体载体没有特殊限制，只要是作为固体或不溶性材料的载体即可。多肽与固体载体的连接可以采用本领域技术人员公知的多肽与固体载体的连接方法来进行。

在本说明书中，所述对象生物优选为禽类，更优选为鸡。

在本说明书中，所述生物样本可以是全血、血浆或血清。

在使用上述试剂盒检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗新城疫病毒的抗体的情况下，当所述多肽组合1中的任意一条或多条多肽对对象生物来源的生物样本有响应时，判定为该对象生物来源的生物样本中存在抗新城疫病毒的抗体(即阳性)；反之，当所述多肽组合1中没有任何一条多肽对对象生物来源的生物样本有响应时，判定为该对象生物来源的生物样本中不存在抗新城疫病毒的抗体(即阴性)。

在本说明书中，“响应”是指：TMB显色试验中，肉眼可见强于阴性对照点的蓝紫色信号。

实施例

1.多肽的制备与确认

实施例中使用的多肽由吉尔生化(上海)有限公司合成，并通过质谱对其进行了确认。其中，

SEQ ID NO：1：SGPPPTPGPSQDNDTDWGY。

SEQ ID NO：2：NDTCPDEQDYQIRMAKSSYK。

2.试剂盒(检测芯片)的制备

试剂盒1

采用常规方法在常规的ELISA用固相载体上分别点样上述SEQ ID NO：1所示的多肽的溶液，另外点样一个鸡IgY点作为阳性质控点以及一个PB点作为阴性质控点，制备了检测芯片。

试剂盒2

除了在固相载体上分别点样上述SEQ ID NO：1和2所示的多肽的溶液外，按照与上述试剂盒1相同的制备方法制备了检测芯片，即为试剂盒2。

3.用试剂盒进行检测

检验步骤

1)平衡试剂：将所有试剂从冰箱取出后，平衡放置至室温备用。

2)配制洗液：用纯化水或蒸馏水按1:9稀释浓缩洗液，例：50mL浓缩洗液用纯化水或蒸馏水配置成500mL的洗液，并充分混匀。未用完的洗液放4℃冰箱保存，3个月内用完。

3)稀释样品：取待测样品，用血清稀释液，按1:100稀释，例：198uL血清稀释液中加入2uL待测样本，并充分混匀。一次样本检测需使用200uL稀释后的样品。

4)润湿芯片：取出检测所需的检测芯片。加入1mL洗液浸润芯片表面，3min，随后弃去洗液。

5)加样：在本实施案例中，使用单面生物孵育反应器。将稀释完成的样品用移液枪通过加液通气孔加到反应器中，用量为200uL。加样完毕后，用密封帖封闭加液通气孔。

6)样品孵育：将加好样的反应器置于水平摇床上，室温下以150rpm孵育30min。

7)清洗：将反应柱从反应腔中取出，弃去反应液，用洗液冲洗芯片表面和反应腔内部，重复3次(每次用量约12mL，时间1-2min)。

8)酶标二抗孵育：将反应柱与反应腔重新组合并卡紧。揭去密封帖，通过加液通气孔加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgY溶液200uL。再次封闭加液通气孔。随后置于水平摇床上，室温下以150rpm孵育30min。

9)再清洗：将反应柱从反应腔中取出，弃去反应液，用洗液冲洗芯片表面和反应腔内部，重复3次(每次用量约12mL，时间1-2min)。

10)显色：分别在每个反应柱芯片表面加TMB显色液100uL，显色液需均匀的铺于芯片表面。

结果判定：通过肉眼观察，统计每份血清作用下多肽的响应情况(肉眼可见强于阴性对照点的蓝紫色信号，判读为有响应)。即，

对于上述试剂盒1，当检测到SEQ ID NO：1所示的多肽有响应时，判定为新城疫病毒抗体阳性；反之，判定为阴性。

对于上述试剂盒2，当检测到SEQ ID NO：1和/或2所示的多肽有响应时，判定为新城疫病毒抗体阳性；反之，判定为阴性。

对于566份来自中国各地区的鸡血清样本，分别采用上述步骤2中制备的试剂盒(按上述3的步骤)以及常规的血凝抑制试验(HI)进行检测，检测结果如下所示。

表1

敏感性＝362/400*100％＝90.5％

特异性＝161/166＝97％

表2

敏感性＝380/400*100％＝95％

特异性＝159/166＝96％

由以上可知，上述试剂盒1、2仅仅使用了一条或两条多肽作为检测探针即实现了90％或95％以上的检测敏感性，且特异性均为95％以上(而且是采用HI方法验证，不是采用对照试剂盒方法验证)，足以媲美采用c-ELISA方法或b-ELISA方法的试剂盒。需要说明的是，通常认为临床上有应用价值的诊断试剂盒的敏感性和特异性都应在85％以上。

以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但并不是对本发明技术范围的限定。通过本说明书的记载，本领域技术人员可以容易的对本发明进行修饰/改变，这些包含在本发明的技术范围内。

序列表

<110> 苏州艾比拓生物技术有限公司

<120> 新城疫病毒抗体检测试剂盒

<130> PB00190

<141> 2018-05-24

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Gly Pro Pro Pro Thr Pro Gly Pro Ser Gln Asp Asn Asp Thr Asp

1 5 10 15

Trp Gly Tyr

<210> 2

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asn Asp Thr Cys Pro Asp Glu Gln Asp Tyr Gln Ile Arg Met Ala Lys

1 5 10 15

Ser Ser Tyr Lys

20

Claims (8)

1.SEQ ID NO：1所示的多肽。

2.SEQ ID NO：1所示的多肽在制备用于检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗新城疫病毒的抗体(IgY)的试剂盒中的用途。

3.一种新城疫病毒抗体(IgY)检测试剂盒，其包括一个或多个固体载体，以及独立地连接于所述一个或多个固体载体上的下述多肽组合1；

多肽组合1

SEQ ID NO：1所示的多肽，以及

SEQ ID NO：2所示的多肽。

4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其用于检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗新城疫病毒的抗体(IgY)。

5.下述多肽组合1在制备用于检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗新城疫病毒的抗体(IgY)的试剂盒中的用途；

多肽组合1

SEQ ID NO：1所示的多肽，以及

SEQ ID NO：2所示的多肽。

6.根据权利要求2或5所述的用途或根据权利要求4所述的检测试剂盒，其中，所述对象生物是禽类。

7.根据权利要求2或5所述的用途或根据权利要求4所述的检测试剂盒，其中，所述对象生物是鸡。

8.根据权利要求2或5所述的用途或根据权利要求4所述的检测试剂盒，其中，所述生物样本是全血、血浆或血清。