CN101995466A

CN101995466A - 新城疫病毒抗体诊断试剂盒

Info

Publication number: CN101995466A
Application number: CN2010105134273A
Authority: CN
Inventors: 吴红云; 范金红; 李建正
Original assignee: Zhengzhou Houyi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Henan Hou Yi bioengineering Limited by Share Ltd
Priority date: 2010-10-21
Filing date: 2010-10-21
Publication date: 2011-03-30
Anticipated expiration: 2030-10-21
Also published as: CN101995466B

Abstract

本发明涉及一种鸡新城疫病毒抗体诊断试剂盒，包括10倍浓缩洗涤液，血清稀释液，标准血清，抗鸡IgG酶标抗体，酶标抗体稀释液，显色剂A，显色剂B和终止液。采用本发明可以对鸡新城疫病毒抗体检测的ELISA方法试剂盒，所建立的方法具有特异性、灵敏度及可操作性。在敏感度试验方面，与免疫荧光技术方法符合率为86%，且比免疫荧光技术方法更敏感，在其他病原的检出率为零，该方法较HI更具有快速、成本低廉，结果易于判定的优点，可用于鸡新城疫病毒的诊断和监测。

Description

新城疫病毒抗体诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及一种鸡新城疫病毒抗体的诊断试剂盒，属于动物传染病的诊断技术领域。

背景技术

鸡新城疫(Newcastle Disease，ND)是由副粘病毒科(paramyxovirus)副粘病毒属鸡新城疫病毒引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病，常呈败血性经过。主要特征是呼吸困难、下痢、神经紊乱、粘膜和浆膜出血。本病传播快、死亡率高，被列为第一类严重的传染病。

回顾历史，新城疫在世界上曾造成过巨大的经济损失。一般认为鸡新城疫于1926年首次暴发于印度尼西亚的爪哇和英国的纽卡斯尔艾佛顿1935年我国河南首次报道鸡新城疫，20世纪50年代本病在全国各地广泛流行，本病为高度接触性传染性疫病，发病急，感染率和死亡率均高，有时可高达100%，给养禽业特别是养鸡业造成了不可估量的经济损失，因此被国际兽医局定为A类烈性传染病。

新城疫实验室检测技术包括常规的分离鉴定是目前诊断新城疫最确切的方法，并且可以给感染的毒株定性。血清学方法有血凝(HA)和血凝抑制实验(HI)、琼脂扩散实验(AGP)、荧光抗体技术(FA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、中和试验(NT)、乳胶凝集试验(LAT)、神经氨酸酶试验(NIT)、放射免疫试验(RIA)等。其中HA和HI是目前最常用的方法。分子生物学方法：RNA指纹图谱巷国、核酸探针技术、RT-PCR技术以及抗多肤抗体技术等大量报道用于NDV检测，分子生物学方法因为灵敏度高、性好、能够区分强弱毒株，在NDv的诊断和流行病学的普查方面颇具潜力。

而Hl效价水平的监测对认识鸡群新城疫的免疫水平和确定免疫时机有重要的指导作用，但还必须正确对待抗体效价监测的诊断学意义。赵虎等研究发现HI效价在6以上的个体仍能感染并排出强毒，究其原因可能是Hl抗体水平与ND保护力两者之间的不一致，应该看到，Hl抗体滴度只是衡量鸡抵抗力强弱的一个比较容易检测到的、具有参考价值的指标，但它只能检测到循环抗体水平(IgG)，而不能检测到呼吸道的抗体水平(IgA)，所以它不是一个绝对安全的指标。在生产中，HI抗体水平的监测结果只能是作为参考，千万不能认为HI抗体水平高，ND就不会发生。选用ND抗体检测的常规血清技术对于了解免疫效果，制定免疫程序和诊断，防治该病具有十分重要的意义。虽然HI法用于检测ND抗体至今仍被广泛使用,但是由于ELISA具有快速、准确、简便的优点，加之酶标读数仪一体化技术在ELISA中的应用,使其更加完善，ELISA已越来越多的被实验室采用。鉴于新城疫对养禽业的危害，控制新城疫具有重大的经济意义。免疫接种已成为控制新城疫最主要的手段，但免疫鸡群却依然经常发生新城疫，其中最主要原因是免疫程序不合理、缺乏免疫抗体监测条件，不能根据疫情和疫区发病特点适时调整免疫程序。合理的免疫程序的制定、良好的抗体监测是目前预防和控制鸡新城疫最关键的环节，这有赖于敏感、特异、快速的抗体检测技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新城疫病毒抗体诊断试剂盒。

为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种鸡新城疫病毒抗体诊断试剂盒，包括10倍浓缩洗涤液，血清稀释液，标准血清，抗鸡IgG酶标抗体，酶标抗体稀释液，显色剂A ，显色剂B和终止液。

所述的浓缩洗涤液为PBST，其含0.05%Tween-20的PBS溶液。

所述的血清稀释液为1％的BSA溶液。

所述的标准阳性血清为用LaSota疫苗株免疫后得到完全保护的鸡血清，标准阴性血清为从未用过疫苗且抗体水平接近阴性血清平均值的鸡血清。

所述的酶标抗体稀释液为PBS 缓冲液。

所述的显色剂A组成为：底物OPD一片、底物缓冲液。

所述的显色剂B为H₂O₂。

所述的终止液：2M 的H₂SO₄。

本发明的试剂盒是将检测血清样品进行预处理后，与包被好的抗原相结合，利用酶标记的抗体与待检血清样品中的抗原或抗体特异性结合后，在底物溶液参与下显色进行检测，其中，抗原包被液为纯化的鸡新城疫病毒。

本发明在于提供一种灵敏的、特异的用于鸡新城疫病毒抗体临床诊断及疫苗免疫后的监测工作服务的试剂盒。本发明的试剂盒设计的方法由包被抗原酶标板和ELISA工作条件的确定组成，包括运用醛化的鸡红细胞经吸附释放方法纯化病毒和方阵法滴定选择包被抗原、酶标抗体等反应物的最佳工作浓度。采用本发明可以对鸡新城疫病毒抗体检测的ELISA方法试剂盒，所建立的方法具有特异性、灵敏度及可操作性。在敏感度试验方面，与免疫荧光技术方法符合率为86%，且比免疫荧光技术方法更敏感，在其他病原的检出率为零，该方法较HI更具有快速、成本低廉，结果易于判定的优点，可用于鸡新城疫病毒的诊断和监测。

具体实施方式

本发明的试剂盒具体组成如下：

1 材料：

1.1参考血清标准阳性血清为用LaSota疫苗株免疫6周龄的小鸡，2周后采血分离血清，用HI实验测定HI效价为1:1024～1:2048，分装后-80℃保存。阴性血清为从未用过疫苗且抗体水平接近阴性血清平均值的鸡血清。

1.2 ELISA反应板为丹麦Nunc公司产品，兔抗鸡的酶标抗体、底物OPD为Sigma公司产品。

1.3 实验动物 SPF鸡及鸡胚，均为梅里亚公司产品。

2 抗原的制备：

2.1病毒的复壮与增殖将Lasota疫苗株进行100倍稀释，接种于9-11日龄SPF鸡胚复壮，每胚0.1ml，38℃孵育，每日照蛋两次连续5日，弃去24小时内死亡的鸡胚，收获死亡的鸡胚，无菌收获尿囊液，连续传代3代测定HA值，-20℃保存作为提纯病毒用。

2.2病毒纯化应用醛化的鸡红细胞经吸附释放方法获得纯化的病毒：将SPF鸡新鲜抗凝红细胞用 PBS液洗涤 3次 ,配制成 25%的红细胞悬液 200 mL,置于锥形瓶中 ,然后将含有 50mL 38%甲醛溶液 (pH 5.5～6.0)的透析袋放入锥形瓶 ,室温下缓慢搅拌 2 h;刺穿透析袋使甲醛溶液混入细胞悬液 ,继续搅拌 12 h;细胞悬液用 100目铜网过滤 ,滤液用 PBS洗涤 3次 ,加入 0.2 mol /L的 Tris -甘氨酸缓冲液悬浮沉淀细胞 ,再加入硼氢化钠溶液至 1 mmol /L;用 PBS洗涤 3次 ,配成 25%的细胞悬液 ,加入 0 . 01%硫柳汞防腐 , 并与8 000 ×g离心 10 min,病毒上清液配成终浓度 5% , 4 ℃ 磁力搅拌 1 h，1 000 ×g离心 10 min后 ,分别收集上清和沉淀: ①沉淀中加入 5%NaCl溶液 (pH 6. 8)作用 30 min,离心后收集上清; ②上清用 HA检测血凝价,如果病毒吸附量低于 90%,可进行再次吸附,按步骤 ① 重复 1次。将两次所得上清合并 ,加入 1% Triton X 100作用 30min,透析除盐即为 ELISA抗原。测定蛋白含量为3.01mg/ml。

3 ELISA工作条件的确定

3.1 抗原最佳稀释度的测定将不同稀释倍数的抗原包被酶标板，将标准阴、阳性血清各一份梯度稀释后进行ELISA实验，测得不同条件下的P／N值。结果表明，当抗原做40倍稀释，血清作1倍、5倍、10倍稀释时P／N值均较大(P／N值分别为5.1、5.32、5.53)，因此选择40倍稀释做为抗原的最佳稀释度。

3.2 血清与酶标二抗稀释倍数的选择将标准阴阳性血清分别作1倍、5倍、10倍及20倍梯度稀释，将酶标二抗从2500倍开始做倍比稀释进行方阵实验，当酶标二抗稀释倍数为l：2500～1：5000时。阳性血清的OD值为1.0左右，阴性血清的OD值在0.2左右，因此选择酶标二抗的工作浓度定为l：2500，血清做5倍稀释。

3..3 封闭剂的选择用不同浓度的明胶、BSA及脱脂奶粉的PBS溶液作为封闭液的检测结果表明：BSA溶液的封闭效果好于不同浓度的脱脂奶粉溶液和明胶溶液。随着所试BSA溶液浓度的提高，阴阳性血清的OD值均下降，但P／N值不断升高。当以1％BSA溶液封闭时P／N最高(P／N为7.76)；明胶溶液作为封闭剂时阴阳性血清OD值均较高，存在非特异性反，故确定1％BSA溶液作为封闭剂。

3.4 血清稀释液的选择实验比较了5％脱脂奶粉溶液、10％脱脂奶粉溶液以及浓度分别为0.5％BSA溶液、1％BSA溶液作为血清稀释液的作用效果，结果表明．BSA溶液做为血清稀释液效果好于脱脂奶粉溶液，随脱BSA液浓度的提高P／N值升高．当BSA溶液浓度为1％时P／N值为8.27，实验确定以1％BSA溶液作为血清稀释液。

3.5 阴阳性血清临界值的确定用间接ELISA对120份阴性血清进行检测，用SPSS软件统计分析，阴性血清的OD490值呈正态分布，平均值(X)为0.126，标准差(SD)为0.037，最小值为0.057，最大值为0.19。

X+3×SD=0.237即为阴阳性血清的临界值，为了降低假阳性或假阴性结果，在此基础上再加上和减去一个标准差作为可疑值区间，得到ELISA的可疑值范围为0.2～0.274。

3.6 抗原包被板的保存期确定将抗原包被板分别在4℃保存0月、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月，取不同保存时间的抗原板，对16份不同OD值的血清样品进行ELISA检测，比较判定结果的变化来确定保存时间对试剂盒稳定性的影响。结果显示，阴阳性血清的OD值虽略有变化，但样本血清的阴阳性判定结果变化不明显。

4 试剂盒的组成的制备：

4.1 10倍浓缩洗涤液：PBST（含0.05%Tween-20的PBS溶液）

4.2 血清稀释液：1％BSA溶液

4.3 标准血清：自制的标准阴阳性血清

4.4 抗鸡IgG酶标抗体：购置Sigma公司产品

4.5 酶标抗体稀释液：PBS 缓冲液

4.6 显色剂A：底物OPD一片、底物缓冲液

4.7 显色剂B：H₂O₂

4.8 终止液：2M 的H₂SO₄

5 操作步骤：

从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30分钟。

加标准品和待测样本：分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置，在标准品孔中加入标准阴阳性血清各50μL；待测样本孔中先加入待测血清10μL，再加血清稀释液40μL（即稀释5倍）；空白对照孔不加。

温育：37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

洗板：将孔中的液体用力甩净，在吸水纸上拍干，每孔加洗涤液200μl，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机按说明书操作洗板）。

加酶标工作液：每孔加入酶标工作液50μL，空白对照孔不加。

温育：37℃水浴锅或恒温箱温育30min。

洗板：同上洗板步骤。

显色：每孔先加入显色剂A 液50μL，再加入显色剂B液 50μL，平板混匀器混匀30s（或用手轻轻震荡混匀30s），37℃避光显色15min。

终止：取出酶标板，每孔加终止液50μL，终止反应（颜色由蓝色立转黄色）。

测定：以空白孔调零，在终止后15分钟内，用450nm波长测量各孔的吸光值（OD值）。

6 结果判定

根据OD₄₉₀值计算P/N值。 P/N = （P为阳性对照血清及待检血清的OD值，N为阴性对照血清的OD值）当P/N值≥4时实验成立。然后，根据S/N值对待检血清进行判定（S为待检血清的OD₄₉₀值）。

结果：阴性：S/N≤1.3；可疑：1.3＜S/N≤1.9；阳性：S/N＞1.9。

Claims

1.一种鸡新城疫病毒抗体诊断试剂盒，其特征在于：包括10倍浓缩洗涤液，血清稀释液，标准血清，抗鸡IgG酶标抗体，酶标抗体稀释液，显色剂A ，显色剂B和终止液。

2.根据权利要求1所述的鸡新城疫病毒抗体诊断试剂盒，其特征在于：所述的浓缩洗涤液为PBST，其含0.05%Tween-20的PBS溶液。

3.根据权利要求1所述的鸡新城疫病毒抗体诊断试剂盒，其特征在于：所述的血清稀释液为1％的BSA溶液。

4.根据权利要求1所述的鸡新城疫病毒抗体诊断试剂盒，其特征在于：所述的标准阳性血清为用LaSota疫苗株免疫后得到完全保护的鸡血清，标准阴性血清为从未用过疫苗且抗体水平接近阴性血清平均值的鸡血清。

5.根据权利要求1所述的鸡新城疫病毒抗体诊断试剂盒，其特征在于：所述的酶标抗体稀释液为PBS 缓冲液。

6.根据权利要求1所述的鸡新城疫病毒抗体诊断试剂盒，其特征在于：所述的显色剂A组成为：底物OPD一片、底物缓冲液。

7.根据权利要求1所述的鸡新城疫病毒抗体诊断试剂盒，其特征在于：所述的显色剂B为H₂O₂。

8.根据权利要求1所述的鸡新城疫病毒抗体诊断试剂盒，其特征在于：所述的终止液：2M 的H₂SO₄。

9.根据权利要求1所述的鸡新城疫病毒抗体诊断试剂盒，其特征在于：试剂盒为将检测血清样品进行预处理后，与包被好的抗原相结合，利用酶标记的抗体与待检血清样品中的抗原或抗体特异性结合后，在底物溶液参与下显色进行检测，其中，抗原包被液为纯化的鸡新城疫病毒。