CN102426258A - 鸡新城疫血凝抑制试验用阳性血清国家标准品及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鸡新城疫血凝抑制试验用阳性血清国家标准品及其制备方法。本发明所涉及的鸡新城疫血凝抑制试验用阳性血清国家标准品是利用鸡新城疫La Sota株病毒(NDV)和灭活疫苗免疫SPF鸡制备高免血清作为候选物,通过候选物检验、标准品制备和检验、分装、冻干等工艺过程,并以NIBSC获得的鸡新城疫血凝抑制试验用阳性血清国际标准品为参比进行红细胞凝集抑制试验测定其效价,经过均一性检验、稳定性试验、协作标定,数据统计,保证效价定值准确而制备出鸡新城疫血凝抑制试验用阳性血清国家标准品。本发明的方法按照标准品制备程序使标准品制备更加科学、严谨、完善。
Description
技术领域
本发明涉及鸡新城疫血凝抑制试验用阳性血清国家标准品及其制备方法,属于标准物质技术和兽用生物制品技术领域。
背景技术
鸡新城疫(ND)又称亚洲鸡瘟,是由禽副流感病毒型新城疫病毒(NDV)引起的一种主要侵害鸡、火鸡、野禽及观赏鸟类的高度接触传染性、致死性疾病,其感染呈全球趋势,给世界上很多国家和地区带来了严重的经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物疫病,我国将其列为一类动物疫病。目前,红细胞凝集抑制(HI)试验是鸡新城疫诊断的常用方法,为了促进鸡新城疫诊断试验的国际一体化和抗原标准化,英国卫桥Veterinary Laboratories Agency(VLA)于1966年研制出国际标准血清(可从National Institute for Biological Standards and Control(NIBSC)获得),也称之为基准标准品,各国实验室用国际标准品溯源制备各自的国家标准品,用于标定鸡新城疫HI试验。目前,可从NIBSC获得的鸡新城疫血凝抑制试验阳性血清国际标准品是通过鸡新城疫嗜内脏型强毒Herts33株病毒免疫SPF鸡后制备完成的(WHO International Standard:The 1stInternational Reference Preparation for anti-Newcastle disease serum.NIBSC code:NDS,Instructions foruse(Version 3.0,Dated 18/03/2008))。本发明是通过鸡新城疫弱毒La Sota株病毒和灭活疫苗免疫SPF鸡后制备完成的,使得安全性更好。而且,标准品的质量要求高,制备方法和检验或标定方法严格,有关的制备程序和标定方法至今未见报道。
发明内容
本发明的目的是以NIBSC获得的鸡新城疫血凝抑制试验用阳性血清国际标准品为溯源,建立一批国家级鸡新城疫血凝抑制试验用阳性血清标准品,用于标定我国的鸡新城疫红细胞凝集抑制试验。
本发明是通过以下技术路线来实现的:
(1)是通过鸡La Sota株新城疫病毒和新城疫灭活疫苗免疫SPF鸡制备高免血清当抗体水体满足要求时采用无菌心脏采血法取血、分离血清、加入抗生素,备用;
(2)阳性血清国家标准品候选物的选择和制备
用红细胞凝集抑制试验的方法,对被检阳性血清分别进行测定,若连续重复测定3次以上,试验结果完全一致,且阳性血清的HI效价达1∶5120倍以上则该阳性血清即可作为;
以鸡新城疫阴性血清将鸡新城疫阳性血清国家标准品的候选物稀释成与鸡新城疫血凝抑制试验用阳性血清国际标准品的效价一致;
候选物经0.4μm和0.22μm无菌滤膜过滤、精确分装至1mL灭菌长安瓿,分装精度为±0.01mL,按常规方法冻干后抽真空、熔封;
(3)标准品的检验
1)物理性状、无菌检验、真空度测定、剩余水分测定按《中华人民共和国兽用生物制品规程》(中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程二○○○年版.化学工业出版社,2001,本发明以下简称《规程》)和《中华人民共和国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典2005年版三部,中国农业出版社,2005,本发明以下简称《中国兽药典》)规定方法进行,并符合其规定;
2)效价测定随机抽取规定数量的样品用阳性血清国际标准品为参比进行HI试验测定其效价;
3)均一性检验随机抽取规定数量的样品,用阳性血清国际标准品作参比进行HI试验测定其效价,试验结果应一致;
4)稳定性试验检查在37℃下,样品放置的时间,并以此数据作为依据,为下一批稳定性试验作基础;
5)协作标定定值选择3个以上具有对鸡新城疫HI试验富有经验的实验室,每个实验室用3个样品,每个样品重复2次,同时用国际标准品做参比,各协作标定单位按照协作标定方案的要求进行标定;
并将实验结果交给组织单位进行整理后确定协作标定数值;
通过协作标定结果,计算出1mL鸡新城疫血凝抑制试验用阳性血清国家标准品的国际单位含量,以此作为国家标准品的确定值。
本发明的详细描述
一、鸡新城疫血凝抑制试验用阳性血清国家标准品候选物的制备
选取鸡新城疫HI抗体为阴性的SPF鸡后,以La Sota株鸡新城疫病毒和鸡新城疫灭活疫苗作为免疫抗原对鸡进行免疫,第一次用病毒抗原,第二次和第三次用灭活疫苗按照表1免疫程序进行免疫。
每次免疫后每隔一天翅静脉采血1mL监测免疫后抗体水平的变化情况。当抗体水体满足要求时采用无菌心脏采血法取血,10000r/m离心分离血清。每1mL血清加入各1000个单位的青霉素和链霉素。-20℃冷冻保存,备用。
二、鸡新城疫血凝抑制试验(HI试验)用阳性血清国家标准品候选物的鉴定
1、无菌检验
按《规程》规定方法进行。
2、效价测定:
按《中国兽药典》规定红细胞凝集抑制(HI)试验的方法对被检阳性血清分别进行HI试验测定效价,在2次以上重复测定效价均相同的基础上,根据效价测定试验结果确定被检阳性血清的HI效价。
3、候选物的选择
若连续重复测定3次以上,试验结果完全一致,且阳性血清的HI效价达1∶5120倍以上则该阳性血清即可作为鸡新城疫阳性血清国家标准品的候选物。
三、鸡新城疫血凝抑制试验用阳性血清国家标准品的制备
将检验后符合要求的标准血清候选物以鸡新城疫阴性血清按照鸡新城疫血凝抑制试验用阳性血清国际标准品的国际单位进行稀释,即使稀释后的血清与鸡新城疫血凝抑制试验用阳性血清国际标准品的效价一致。
候选物经0.4μm和0.22μm无菌滤膜过滤、精确分装至1mL灭菌长安瓿,分装精度为±0.01mL,按常规方法冻干后抽真空、熔封制备成阳性血清国家标准品。
四、鸡新城疫血凝抑制试验用阳性血清国家标准品的检验
1、物理性状冻干阳性血清国家标准品为淡黄色疏松团块,易与瓶壁脱离,加稀释液后迅速溶解。
2、无菌检验按照《规程》规定的方法进行无菌检验或纯粹检验,应无菌生长。
3、真空度测定按照《规程》规定的方法进行真空度检验,应符合规定。
4、剩余水分测定依据《中国兽药典》规定,以真空烘干法进行测定,应不超过4%。
5、效价测定随机抽取规定数量的样品按《中国兽药典》规定鸡新城疫血凝抑制试验方法用阳性血清国际标准品为参比进行HI试验测定其效价。
6、均一性检验随机抽取规定数量的样品,用NIBSC鸡新城疫血凝抑制试验用阳性血清国际标准品作参比进行HI试验测定其效价,试验结果应一致。
7、稳定性试验用热加速稳定性试验测定,检查在高温(37℃)条件下,样品放置的时间,并以此数据作为依据,为下一批稳定性试验作基础。
8、定值(协作标定)中国兽医药品监察所相关部门作为组织单位负责协作标定工作,制定方案后,选择3个以上具有对鸡新城疫HI试验富有经验的实验室,每个实验室用3个样品,每个样品重复2次,同时用国际标准品做参比,各协作标定单位按照协作标定方案的要求进行标定,并将实验结果交给组织单位。
(1)组织单位将实验结果进行整理后,确定协作标定数值。
(2)国际单位确定通过协作标定结果,计算出1mL鸡新城疫血凝抑制试验用阳性血清国家标准品的国际单位含量,以此作为国家标准品的确定值。
本发明的积极意义
本发明涉及一种鸡新城疫血凝抑制试验用阳性血清国家标准品及其制备方法。本发明所涉及的鸡新城疫血凝抑制试验用阳性血清国家标准品是利用La Sota株鸡新城疫病毒(NDV)和鸡新城疫灭活疫苗免疫SPF鸡制备高免血清作为候选物,通过候选物检验、标准品制备和检验、分装、冻干等工艺过程,并以NIBSC获得的鸡新城疫血凝抑制试验用阳性血清国际标准品为参比进行红细胞凝集抑制试验测定其效价,经过均一性检验、稳定性试验、协作标定,数据统计,保证效价定值准确而制备出鸡新城疫血凝抑制试验用阳性血清国家标准品。本发明的方法按照标准品制备程序使标准品制备更加科学、严谨、完善。
实施例
实施例1
鸡新城疫血凝抑制试验用阳性血清国家标准品的制备
1候选物的制备
从北京实验动物中心采购12周龄的SPF鸡(全部为公鸡)20只,以HI试验确定20只鸡确为阴性后,以鸡新城疫La Sota株病毒(乾元浩生物股份有限公司2007年02月05日制备的新城疫La Sota株生产用种毒(湿毒)病毒)和鸡新城疫灭活疫苗(北京市兽医生物药品厂2007年06月05日制备的新城疫La sota株油剂灭活疫苗,批号为0704)表1进行免疫后试验鸡均未出现局部和全身不良反应。
表1 免疫程序
每次免疫后每隔一天翅静脉采血1mL监测免疫后抗体水平的变化情况。当抗体水体满足要求时采用无菌心脏采血法取血,10000r/m离心分离血清。每1mL血清加入各1000个单位的青霉素和链霉素。-20℃冷冻保存,备用。
血清中新城疫HI抗体效价都呈递增的趋势,三次免疫后效价均达到14log2以上(试验结果见表2),可用于制备标准品的候选物。
表2 鸡新城疫抗体水平监测结果(血清滴度log2
2候选物筛选
2.1无菌检验按照《规程》规定的方法进行无菌检验或纯粹检验,无菌生长。
2.2效价测定
以NIBSC国际标准阳性血清为参比测定HI效价均达到14log2以上,可用于制备鸡新城疫阳性血清国家标准品。
3国家标准品的制备
混合均匀的20只鸡的血清取小样以鸡新城疫阴性血清分别进行1∶250、1∶300、1∶350倍稀释,再以NIBSC鸡新城疫血凝抑制试验用阳性血清国际标准品为参比,测定HI效价结果见表3。
表3 稀释后阳性血清HI效价测定
试验结果表明,1∶300倍稀释的阳性血清与NIBSC国际标准品的HI效价一致,所以将混合均匀的候选物以鸡阴性血清稀释300倍用于制备国家标准品。
4分装、冻干、熔封
将符合要求的候选物先经0.4μm无菌滤膜加压过滤,再经0.22μm无菌滤膜加压过滤;随后用瓶颈分液器(Calibrex digital 520,分装精度为±0.01mL,购自瑞士SOCOREX公司)无菌分装至1mL灭菌长安瓿,按常规方法冻干后抽真空、熔封。
实施例2
鸡新城疫血凝抑制试验用阳性血清国家标准物质的成品检验、协作标定及定值
1国家标准品的检验
1.1物理性状:所有冻干阳性血清为淡黄色疏松团块,易与瓶壁脱离,加稀释液后迅速溶解,溶解后为淡黄色澄明液体。
1.2无菌检验、真空度测定和剩余水分测定
无菌检验和真空度测定结果均符合规定,剩余水分测定结果分别为1.6%、1.4%、1.2%和2.6%,均低于4%,符合要求。
1.3效价测定:随机选取5支冻干血清以NIBSC鸡新城疫血凝抑制试验用阳性血清国际标准血清为参比测定其HI效价分别为1∶160。
1.4均匀性检验
随机选取15支冻干血清以NIBSC鸡新城疫血凝抑制试验用阳性血清国际标准血清为参比测定其HI效价分别为1∶160,说明该冻干血清的均匀性良好。
1.5稳定性试验
稳定性试验结果表明,4支冻干血清37℃温箱保存,每周取1支测定HI效价,保存4周时效价未发生变化;4支冻干血清25℃温箱保存,每隔一周取1支测定HI效价,保存9周时效价未发生变化。
2协作标定
汇总四家协作标定单位的试验结果表明,以国际标准品为参比测得该鸡新城疫血凝抑制试验用阳性血清国家标准品的HI效价均为1∶160,该标定结果与研制该国家标准品时标定的结果一致。
3定值
以国际标准品为溯源标化待检鸡新城疫血凝抑制试验用阳性血清国家标准品的HI效价为1∶160,根据国际标准计算其国际单位含量为320IU/mL。
Claims (2)
1.一种鸡新城疫血凝抑制试验用阳性血清国家标准品,其特征在于本发明所涉及的鸡新城疫血凝抑制试验用阳性血清国家标准品是以NIBSC获得的鸡新城疫血凝抑制试验用红细胞凝集抑制效价为1∶160,国际单位含量为320IU/mL的阳性血清国际标准品为溯源测定其红细胞凝集抑制效价为1∶160,根据国际标准,计算其国际单位含量为320IU/mL。
2.一种鸡新城疫血凝抑制试验用阳性血清国家标准品的制备方法,其特征在于:
(1)是通过鸡La Sota株新城疫病毒和新城疫灭活疫苗免疫SPF鸡制备高免血清。当抗体水体满足要求时采用无菌心脏采血法取血、分离血清、加入抗生素,备用;
(2)阳性血清国家标准品候选物的选择和制备
红细胞凝集抑制试验的方法对被检阳性血清分别进行测定,若连续重复测定3次以上,试验结果完全一致,且阳性血清的HI效价达1∶5120倍以上则该阳性血清即可作为;
以鸡新城疫阴性血清将鸡新城疫阳性血清国家标准品的候选物稀释成与鸡新城疫血凝抑制试验用阳性血清国际标准品的效价一致;
候选物经0.4μm和0.22μm无菌滤膜过滤、精确分装至1mL灭菌长安瓿,分装精度为±0.01mL,按常规方法冻干后抽真空、熔封;
(3)标准品的检验
1)物理性状、无菌检验、真空度测定、剩余水分测定按《中华人民共和国兽用生物制品规程》和《中华人民共和国兽药典》规定方法进行检验;
2)效价测定随机抽取规定数量的样品用阳性血清国际标准品为参比进行HI试验测定其效价;
3)均一性检验随机抽取规定数量的样品,作参比进行HI试验测定其效价,试验结果应一致;
4)稳定性试验检查在37℃下,样品放置的时间,并以此数据作为依据,为下一批稳定性试验作基础;
5)协作标定定值选择3个以上具有对鸡新城疫HI试验富有经验的实验室,每个实验室用3个样品,每个样品重复2次,同时用国际标准品做参比,各协作标定单位按照协作标定方案的要求进行标定;
并将实验结果交给组织单位进行整理后确定协作标定数值;
通过协作标定结果,计算出1mL鸡新城疫血凝抑制试验用阳性血清国家标准品的国际单位含量,以此作为国家标准品的确定值。
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