CN102012433A - 禽流感病毒h9亚型阳性血清和阴性血清标准物质及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及禽流感病毒H9亚型阳性血清和阴性血清标准物质及制备方法。本标准物质阳性血清系用青年或成年SPF鸡，经肌肉注射禽流感病毒H9亚型油乳剂灭活疫苗后，采集SPF鸡血清并进行半成品检验，加入适宜稳定剂后冻干；阴性血清系采自SPF鸡血，分离血清并进行半成品检验，冻干；经成品检验、均一性检验及稳定性检验及标准物质的标定、定值等一系列的工艺过程而制成。该标准物质是禽流感H9亚型准确诊断、免疫监测及对其疫苗免疫效果进行正确评价的根本保障，提高禽流感的防控水平。对禽流感H9亚型进行诊断和相关产品检验工作进行评价和质量控制的基本保障。
Description
技术领域
本发明涉及一种禽流感病毒H9亚型阳性血清合阴性血清标准物质及制备方法，属于兽用生物制品领域。
背景技术
英国药典(BP)的化学对照物质是从1963年才开始提出，由于WHO在英国建立了国际生物标准物质中心，所以英国一直沿用国际标准物质，而其本国标准物质建立较晚，至1970年后，欧洲药典问世，英国除引用国际标准物质外，也用欧洲药典标准物质，少量使用本国的标准物质。即使如此，BP1968年版及其增补本再加英国药典(1968年)收载的数量已超过260个，1980年版已超过300个，BP1993版收载了371个。美国药典委员会可提供约1805多种药品标准物质；欧洲药典委员会有2098种，其中生物制品标准物质有319种。
目前，我国已研制出国家一级标准物质1262种，二级标准物质1739种，涉及钢铁、地质、石油、核材料、环境、食品以及临床检验等领域。兽用生物制品的标准物质研究较滞后，目前只有192种，而兽用生物制品检验用标准物质几乎为零。
兽用生物制品标准物质是控制和确定兽用生物制品产品质量、校准验证检验仪器和方法是否准确的物质标准，是正确诊断传染病、准确监测免疫情况的物质基础。
禽流感(AI)是我国重点防控的重大动物疫病，禽流感病毒(AIV)H9亚型流行很广泛。目前禽流感诊断、免疫监测及其疫苗免疫效果评价中应用最广泛的方法是HI试验，这是2006年我国农业部批准通过的方法，但是目前我国尚无禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验用标准物质及其相关研究的报道，国外国际动物卫生组织(OIE)等参考实验室也没有，严重影响了前后不同时期检测数据的一致性和不同实验室数据的可比性。近年各级实验室对禽流感标准物质的需求越来越多，特别是H9亚型和H5亚型相关的诊断试剂标准物质，因此研制禽流感病毒H9亚型血凝抑制抗原标准物质尤为迫切，该标准物质是禽流感H9亚型准确诊断、免疫监测及对其疫苗免疫效果进行正确评价的根本保障，提高禽流感的防控水平。
目前我国标准物质的研制主要参考和遵循1987年7月10日国家计量局发布实施的《标准物质管理办法》以及一级标准物质技术规范(JJG 1006-94)，但是这个技术规范是适用于化学成分、物理化学特性及工程技术特性一级标准物质的研制，对于生物制品标准物质，特别是兽用生物制品标准物质研制目前尚无技术规范可循。因此兽用生物制品标准物质研制是一项无基础的研究，填补了该项研究领域的空白。
发明内容
本发明涉及禽流感病毒H9亚型阳性血清和阴性血清标准物质及制备方法。本标准物质的阳性血清标准物质有强阳性血清标准物质和弱阳性血清标准物质，此两种阳性血清标准物质只与禽流感病毒H9亚型抗原呈阳性反应，其HI分别为≥7log2和4log2～5log2；此两种阳性血清与H7和H5亚型禽流感、鸡新城疫、减蛋综合征病毒抗原均应为阴性反应；阴性血清标准物质在同一条件下，分别与禽流感、鸡新城疫、减蛋综合征病毒抗原进行红细胞凝集抑制试验，血清对禽流感H5、H7、H9亚型、鸡新城疫、减蛋综合征病毒抗原均为阴性反应。
其制备方法主要为：(1)按常规方法用禽流感病毒H9亚型CKSH01株病毒制备的油乳剂灭活疫苗；(2)阳性血清标准物质候选物系用青年或成年SPF鸡，经肌肉注射禽流感病毒H9亚型油乳剂灭活疫苗，制备强阳性血清候选物需经2次免疫，制备弱阳性血清候选物仅1次免疫，选取HI抗体效价≥8log2和5log2的免疫鸡只，分别采集SPF鸡血清并进行半成品检验，并分别加入适宜稳定剂后冻干；(3)阴性血清系采自SPF鸡血，分离血清并进行半成品检验，冻干；(4)以上制备的强阳性血清、弱阳性血清和阴性血清标准物质候选物经检验、均一性检验及稳定性检验及标准物质的标定、定值而成为强阳性血清、弱阳性血清和阴性血清标准物质。
本发明的技术方案：
一、禽流感病毒H9亚型阳性血清、弱阳性血清和阴性血清标准物质的制备
1.免疫用疫苗的制备
(1)病毒液的制备及检验用禽流感病毒H9亚型CKSH01株病毒(由中国国家禽流感参考实验室(中国哈尔滨市中国农业科学院哈尔滨兽医研究所内)鉴定、保管和供应)按照常规方法制备病毒液，并对病毒液进行检验：
1)无菌检验每瓶鸡胚液分别取样，按《中华人民共和国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○○五年版三部.中国农业出版社，2006，本发明以下简称《中国兽药典》)规定的方法进行检验，应无细菌或霉菌或支原体生长也无外源病毒。
2)HA价测定每瓶鸡胚液分别取样，按本说明书附录进行(下称《附录》)，样品对鸡红细胞凝集价均≥7log2。
(2)病毒液的灭活及检验
1)灭活将上述检验合格的胚液以灭菌多层纱布滤过，混合于一个大容器内，按最终浓度为0.2％的量加入甲醛溶液；加甲醛溶液后最好倾倒于另一瓶中，以避免瓶颈附近粘附的病毒未能接触灭活剂。然后置于37℃灭活24h(以瓶内温度达到37℃开始计时，期间振摇1次)。灭活后将胚液置于2～8℃条件下保存。
2)灭活检验取10～11日龄SPF鸡胚5个，各尿囊腔内接种灭活胚液0.1ml，37℃孵育72h，收获鸡胚液，测定血凝性为阴性，并盲传1代，测定血凝性，也无血凝现象，判为灭活完全。
(3)佐剂的选择选用符合生物制品规定的进口佐剂，如德国产的Marcol52白油、新加坡产的80和司盘80等为乳化佐剂。
(4)保护剂的处理将司盘和白油按6∶94的比例混合后加热至130℃30min，无菌冷却后备用；吐温经高压灭菌后备用。
(5)疫苗的制备先将灭菌后的吐温按8％的比例加入灭活检验合格的病毒液中，将其混匀；将冷却的白油佐剂定量加入组织捣碎机内，低速开启组织捣碎机，将混匀吐温的病毒液按白油佐剂1/2的量缓慢加入组织捣碎机内，然后将组织捣碎机的转速提高至8000r/min工作10min。将获得油包水型疫苗分装于疫苗瓶内备用。
2.阳性血清制备
(1)免疫选用3～4月龄SPF鸡饲养于负压隔离器内，用制备的禽流感灭活疫苗以胸部肌肉注射方式2次接种疫苗，第一次接种剂量为1.0ml/只，间隔21日后进行第二次接种，剂量为1.5ml/只，且分点注射。
(2)试血于第2次免疫接种后28日，用翅下静脉采血方式采集血清，采血同时对鸡和血清对应编号，分别测定HI抗体效价(《附录》)，挑选HI抗体效价≥8log2的SPF鸡备用。
(3)血清的分离选HI抗体效价≥8log2的SPF鸡用20ml无菌注射器在负压隔离器内进行心脏采血，血液采集完毕后先置于37℃4h，然后再置于4℃冰箱内过夜，在无菌室超净工作台内提取血清，若血清中混有红血球，应对其进行无菌离心后混合于同一灭菌后的容器内。
(4)血清半成品的检验
1)无菌检验对混合后的血清取样，按《中国兽药典》进行检验，应无细菌或霉菌生长。
2)HI抗体价的测定按附录进行测定，结果应≥8log2。
3)特异性鉴定将待检血清在同一条件下分别与H5、H7和H9亚型禽流感、鸡新城疫、减蛋综合征病毒抗原进行红细胞凝集抑制试验(按《附录》进行)，仅与禽流感病毒H9亚型抗原呈阳性反应(HI≥7log2)，与H7和H5亚型禽流感、鸡新城疫、减蛋综合征病毒抗原均应为阴性反应(HI≤4log2)。
(5)血清的配制经检验合格的血清按总量的3％加入海藻糖(由北京拜尔迪生物公司生产)和0.5％的甘氨酸(由天津市科密欧化学试剂有限公司生产)作为冻干保护剂并充分搅拌均匀，并按照《中国兽药典》无菌检验法进行检验，应无菌生长。
(6)分装与冻干将配好的抗原液用安瓿进行分装，每瓶1ml，分装后迅速放入冻干机内进行冷冻真空干燥。冻干后扎铝盖、标号后放置-20℃保存。
(7)成品检验
1)物理性状呈微黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁分离，加稀释液后迅速溶解，溶解后的外观应与液体血清相同。
2)无菌检验按《中国兽药典》规定方法进行，应无菌生长。
3)效价测定按《附录》进行，HI抗体效价应≥7log2。
4)pH测定将血清按规格稀释后，用pH仪测定其pH值，应为7.9～8.2。
5)特异性检验同半成品，应符合规定。
6)剩余水分测定按《中国兽药典》剩余水分测定法进行，应低于4％。
7)真空度测定按《中国兽药典》真空度测定法进行，符合规定。
8)血清HI抗体效价的定值
①定值方法红细胞凝集抑制试验96孔微量板法进行测定。
②定值单位由6～8家具有资质且事先经过比对确认其定值能力相同的试验室，采用同一方法进行协作标定。
③定值要求
(a)应对每个被测标准样品分别做6到8次独立的测定，分两个单元，每个单元做3次独立测定；两个单元之间相隔不少于3天。所获得的6个数据应按统计学方法检验异常值，如发现有异常值，应予标明，并补做一次测定。然后报出全部结果。
(b)所有用于定值测量的计量器具/测量仪器需经检定或校准合格，并在有效期内。
④数据处理
(a)汇总全部原始数据，考察全部测量数据分布的正态性。
(b)在数据服从正态分布或近似正态分布的情况下，将每个实验室的所测数据的平均值视为单次测量值，构成一组新的测量数据。用统计学方法从统计上剔除可疑值。计算出总平均值和标准偏差。
(c)当全部数据服从正态分布或近似正态分布情况下，也可视其为一组新的测量数据。用统计学方法从统计上剔除可疑值，再计算全部原始数据的总平均值和标准偏差。
9)均一性检验
①抽样数量冻干数量在500支以上时取样25支；冻干数量在500只以下时取样15支。
②测量分别称量每支内容物的净重量，用统计学方法分析其均一性。
③稳定性检验血清分别在-20℃、4℃、37℃条件下保存，并定期进行HA价测定，每一时间均要进行数次重复测量，用统计学方法剔除可疑值，再计算每次的平均值，该值与定值的偏差应不大于标准偏差。
3.弱阳性血清制备
(1)免疫 选用3～4月龄SPF鸡饲养于负压隔离器内，用制备的禽流感灭活疫苗以胸部肌肉注射方式接种疫苗，接种剂量为0.5ml/只。
(2)试血 于免疫接种后14～21日，用翅下静脉采血方式采集血清，采血同时对鸡和血清对应编号，分别测定HI抗体效价(按《附录》进行)，挑选HI抗体效价为5log2的SPF鸡备用。
(3)血清的分离 选HI抗体效价5log2的SPF鸡用20ml无菌注射器在负压隔离器内进行心脏采血，血液采集完毕后先置于37℃4h，然后再置于4℃冰箱内过夜，在无菌室超净工作台内提取血清，若血清中混有红血球，应对其进行无菌离心后混合于同一灭菌后的容器内。
(4)血清半成品的检验
1)无菌检验对混合后的血清取样，按《中国兽药典》进行检验，应无细菌或霉菌生长。若有杂菌污染，应用0.22μ的滤膜对其进行过滤除菌。
2)HI抗体价的测定 按《附录》进行测定，结果应为5log2。
3)特异性鉴定 将待检血清在同一条件下分别与H5、H7和H9亚型禽流感、鸡新城疫、减蛋综合征病毒抗原进行红细胞凝集抑制试验(按《附录》进行)，仅与禽流感病毒H9亚型抗原呈阳性反应(HI为5log2)，与H7和H5亚型禽流感、鸡新城疫、减蛋综合征病毒抗原均应为阴性反应。
(5)血清的配制 经检验合格的血清按总量的3％加入海藻糖(由北京拜尔迪生物公司生产)和0.5％的甘氨酸(由天津市科密欧化学试剂有限公司生产)作为冻干保护剂并充分搅拌均匀，并按照《中国兽药典》无菌检验法进行检验，应无菌生长。
(6)分装与冻干 将配好的抗原液用安瓿进行分装，每瓶1ml，分装后迅速放入冻干机内进行冷冻真空干燥。冻干后扎铝盖、标号后放置-20℃保存。
(7)成品检验
1)物理性状 同阳性血清。
2)无菌检验 同阳性血清。
3)效价测定 按《附录》进行，HI抗体效价应4log2或5log2。
4)pH测定 将血清按规格稀释后，用pH计测定其pH值，应为7.6～8.2
5)特异性检验 同阳性血清。
6)剩余水分测定 同阳性血清。
7)真空度测定 同阳性血清。
8)血清HI抗体效价的定值 同阳性血清。
9)均一性检验 同阳性血清。
10)稳定性检验 同阳性血清。
4.阴性血清
(1)血清分离 青年SPF鸡饲养于生物安全动物实验室内的负压隔离器内，以无菌注射器在生物安全动物实验室内的负压隔离器内进行心脏采血，血液采集完毕后先置于37℃4h，然后再置于4℃冰箱内过夜，在无菌室超净工作台内提取血清，然后混合于同一灭菌后的容器内。
(2)血清半成品的检验
1)无菌检验 对混合后的血清取样，按《中国兽药典》进行检验，应无细菌或霉菌生长。
2)效价测定 按附录进行，HI抗体效价应为阴性。
3)特异性 将血清在同一条件下(按《附录》进行)，分别与禽流感、鸡新城疫、减蛋综合征病毒抗原进行红细胞凝集抑制试验，血清对禽流感H5、H7、H9亚型、鸡新城疫、减蛋综合征病毒抗原均为阴性反应。
(3)血清的配制 按总量的3％加入海藻糖(由北京拜尔迪生物公司生产)和0.5％的甘氨酸(由天津市科密欧化学试剂有限公司生产)作为冻干保护剂并充分搅拌均匀，并按照二○○五年版《中国兽药典》无菌检验法进行检验，应无菌生长。
(4)分装与冻干 按2ml/瓶进行定量分装，分装后迅速冷冻真空干燥冻干，按《中华人民共和国兽用生物制品规程》(中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程二○○○年版，化学工业出版社，2001，本发明简称《规程》)规定方法进行。
(5)成品检验
1)物理性状 呈微黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁分离，加稀释液后迅速溶解，溶解后的外观应与液体血清相同。
2)无菌检验 按《中国兽药典》无菌检验法进行，应无菌生长。
3)效价测定 同阳性血清。
4)特异性 同阳性血清。
5)剩余水分测定 按《中国兽药典》剩余水分测定法进行，应低于4％。
6)真空度测定 按《中国兽药典》真空度测定法进行，符合规定。
二、H9亚型阳性血清、弱阳性血清和阴性血清标准物质的使用
阳性、弱阳性血清系用青年或成年SPF鸡，经肌肉注射禽流感病毒H9亚型油乳剂灭活疫苗后，采集SPF鸡血清并加入适宜稳定剂后冻干制成；阴性血清系采自SPF鸡血，分离血清，冻干制成。
主要用于：禽流感病毒H9亚型HI试验对照。
1.标准抗原的稀释：取禽流感H9亚型抗原冻干安瓿1支，启封后加1ml生理盐水恢复原量；先做10倍、20倍、80倍稀释。然后依次进行1/320、1/400、1/480、1/560、1/640倍稀释。
2.红细胞凝集试验
(1)取96孔V型微量血凝板，每一稀释度分别取25μL加入到孔中，加入生理盐水25μL，再加入1％鸡红细胞悬液25μL。
(2)对照：50μL生理盐水+25μL 1％鸡红细胞悬液。
(3)微量振荡器振荡1min～2min。
(4)室温(24～26℃)放置30min，判定结果。将血凝板倾斜70°且静置10min左右开始记录，凡反应孔底部有红细胞沉积且沿倾斜面向下呈泪珠状流淌，呈现与红细胞对照孔一样者为完全不凝集孔(-)；反应孔底部有红细胞沉积且沿倾斜面缓慢向下呈泪珠状流淌者为不完全凝集孔(+)；反应孔底部有红细胞沉积但不沿倾斜面流淌者为50％凝集孔(++)；除底部有少许红细胞外，反应孔其他部位几乎为完全凝集孔者(+++)；反应孔底部无红细胞，整个反应孔完全凝集者为完全凝集孔(#)。
(5)结论：完全凝集孔对应的最高稀释度应为1/400倍稀释。
3.微量血凝抑制试验
(1)4HA100抗原的配制与验证
1)抗原稀释方法将含有400个血凝单位的抗原先进行10倍稀释，再进行100倍稀释，即100倍稀释液为4HA100血凝素。将配制的4HA100U血凝素用生理盐水进行1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6和1∶7稀释。
2)取96孔V型微量血凝板，每一稀释度分别取25μL加入到孔中，加入生理盐水25μL，再加入1％鸡红细胞悬液25μL。
3)对照50μL生理盐水+25μL 1％鸡红细胞悬液。
4)以上试验做2个平行重复。
5)在微量振荡器振荡1min～2min。
6)室温(24～26℃)放置30min，判定结果。
7)判定标准：如果配制的抗原液为4HA，则1∶4稀释度将给出100％凝集点，即反应孔底部无红细胞，整个反应孔完全凝集；如果4HA100高于4个单位，可能1∶5或1∶6为100％凝集点；如果较低，则可能1∶2或1∶3为100％凝集点。应根据测定结果适当调整，其准确稀释倍数＝使100％红细胞凝集终点的稀释倍数×400/4，使抗原工作液确为4HA100。
(2)血清的稀释
1)标准阳性血清的的稀释血清恢复原量后，依次进行10倍、20倍和120倍稀释；然后进行720、840、960、1080和1200倍稀释。将稀释好的阳性血清每一稀释倍数取0.025ml，分别加入到V型微量反应板对应孔中。
2)阴性血清的稀释在V型微量反应板中，每孔加0.025ml生理盐水；第1孔加入恢复原量后的阴性血清0.025ml，反复抽打3～5次混匀；从第1孔吸取0.025ml血清加入第2孔，混匀后吸取0.025ml加入第3孔，如此进行对倍稀释至第6孔，从第6孔吸取0.025ml弃去。
3)被标定血清的稀释血清恢复原量后，依次进行10倍、20倍和120倍稀释；然后进行480、600、720、840、960、1080…依次递增120倍进行稀释。将稀释好的阳性血清每一稀释倍数取0.025ml，分别加入到V型微量反应板对应孔中。
(3)V型微量反应板上所有血清孔加入4HA100的抗原液25μL。最后1排设50μL生理盐水和25μL生理盐水+25μL4HA100抗原(各4个孔)做对照。
(4)充分振荡后，室温(24～26℃)下静置30min。每孔再加入1％鸡红细胞悬液25μL，充分振荡。
(5)室温(24～26℃)放置30min后判定结果。将血凝板倾斜70°且静置10min左右开始记录，凡反应孔底部有红细胞沉积且沿倾斜面向下呈泪珠状流淌，呈现与红细胞对照孔一样者为完全不凝集孔(-)；反应孔底部有红细胞沉积且沿倾斜面缓慢向下呈泪珠状流淌者为不完全凝集孔(+)；反应孔底部有红细胞沉积但不沿倾斜面流淌者为50％凝集孔(++)；除底部有少许红细胞外，反应孔其他部位几乎为完全凝集孔者(+++)；反应孔底部无红细胞，整个反应孔完全凝集者为完全凝集孔(#)。
(6)结论
标准阳性血清840倍稀释孔为(-)，960、1080和1200倍稀释孔和阴性血清所有稀释孔为(+)、(++)、(+++)或(#)；50μL生理盐水对照孔为(-)，25μL生理盐水+25μL 4HA100抗原孔为(#)，此时试验方可判为成立。
被标定血清的完全不凝集孔对应的最高稀释度即为该血清的红细胞凝集抑制价。
本发明的优点
本发明涉及禽流感病毒H9亚型阳性血清和阴性血清标准物质及制备方法。本标准物质阳性血清系用青年或成年SPF鸡，经肌肉注射禽流感病毒H9亚型油乳剂灭活疫苗后，采集SPF鸡血清并进行半成品检验，加入适宜稳定剂后冻干；阴性血清系采自SPF鸡血，分离血清并进行半成品检验，冻干；经成品检验、均一性检验及稳定性检验及标准物质的标定、定值等一系列的工艺过程而制成。该标准物质是禽流感H9亚型准确诊断、免疫监测及对其疫苗免疫效果进行正确评价的根本保障，提高禽流感的防控水平。对禽流感H9亚型进行诊断和相关产品检验工作进行评价和质量控制的基本保障。
实施例1
阳性血清制造及半成品检验
1.阳性血清制造
(1)免疫 选用3～4月龄SPF鸡饲养于负压隔离器内，用制备的禽流感灭活疫苗以胸部肌肉注射方式2次接种疫苗，第一次接种剂量为1.0ml/只，间隔21日后进行第二次接种，剂量为1.5ml/只，且分点注射。
(2)试血 于第2次免疫接种后28日，用翅下静脉采血方式采集血清，采血同时对鸡和血清对应编号，分别测定HI抗体效价(按《附录》进行)，挑选HI抗体效价≥8log2的SPF鸡备用。
(3)血清的分离 选HI抗体效价≥8log2的SPF鸡用20ml无菌注射器在负压隔离器内进行心脏采血，血液采集完毕后先置于37℃4h，然后再置于4℃冰箱内过夜，在无菌室超净工作台内提取血清，若血清中混有红血球，应对其进行无菌离心后混合于同一灭菌后的容器内。
2.阳性血清半成品的检验
(1)无菌检验 对混合后的血清取样，按《中国兽药典》进行检验，应无细菌或霉菌生长。
(2)HI抗体价的测定 按附录进行HI抗体价的测定，结果应≥8log2。
(3)特异性鉴定 将待检血清在同一条件下分别与H5、H7和H9亚型禽流感、鸡新城疫、减蛋综合征病毒抗原进行红细胞凝集抑制试验(按《附录》进行)，仅与禽流感病毒H9亚型抗原呈阳性反应(HI≥7log2)，与H7和H5亚型禽流感、鸡新城疫、减蛋综合征病毒抗原均应为阴性反应(HI≤4log2)。
(4)血清的配制 经检验合格的血清按总量的3％加入海藻糖(由北京拜尔迪生物公司生产)和0.5％的甘氨酸(由天津市科密欧化学试剂有限公司生产)作为冻干保护剂并充分搅拌均匀，并按《中国兽药典》无菌检验法进行检验，应无菌生长。
(5)分装与冻干 将配好的抗原液用安瓿进行分装，每瓶1ml，分装后迅速放入冻干机内进行冷冻真空干燥。冻干后扎铝盖、标号后放置-20℃保存。
实施例2
弱阳性血清制造及半成品检验
1.弱阳性血清制造
(1)免疫 选用3～4月龄SPF鸡饲养于负压隔离器内，用制备的禽流感灭活疫苗以胸部肌肉注射方式接种疫苗，接种剂量为0.5ml/只。
(2)试血 于免疫接种后14～21日，用翅下静脉采血方式采集血清，采血同时对鸡和血清对应编号，分别测定HI抗体效价(按《附录》进行)，挑选HI抗体效价为5log2的SPF鸡备用。
(3)血清的分离 选HI抗体效价5log2的SPF鸡用20ml无菌注射器在负压隔离器内进行心脏采血，血液采集完毕后先置于37℃4h，然后再置于4℃冰箱内过夜，在无菌室超净工作台内提取血清，若血清中混有红血球，应对其进行无菌离心后混合于同一灭菌后的容器内。
2.弱阳性血清半成品的检验
(1)无菌检验 对混合后的血清取样，按《中国兽药典》进行检验，应无细菌或霉菌生长。若有杂菌污染，应用0.22μ的滤膜对其进行过滤除菌。
(2)HI抗体价的测定 按附录进行HI抗体价的测定，结果应为5log2。
(3)特异性鉴定 将待检血清在同一条件下分别与H5、H7和H9亚型禽流感、鸡新城疫、减蛋综合征病毒抗原进行红细胞凝集抑制试验(按《附录》进行)，仅与禽流感病毒H9亚型抗原呈阳性反应(HI为5log2)，与H7和H5亚型禽流感、鸡新城疫、减蛋综合征病毒抗原均应为阴性反应。
(4)血清的配制 经检验合格的血清按总量的3％加入海藻糖(由北京拜尔迪生物公司生产)和0.5％的甘氨酸(由天津市科密欧化学试剂有限公司生产)作为冻干保护剂并充分搅拌均匀，并按照二○○五年版《中国兽药典》无菌检验法进行检验，应无菌生长。
(5)分装与冻干 将配好的抗原液用安瓿进行分装，每瓶1ml，分装后迅速放入冻干机内进行冷冻真空干燥。冻干后扎铝盖、标号后放置-20℃保存。
实施例3
阴性血清制造及半成品检验
1.阴性血清制造
青年SPF鸡饲养于生物安全动物实验室内的负压隔离器内，以无菌注射器在生物安全动物实验室内的负压隔离器内进行心脏采血，血液采集完毕后先置于37℃4h，然后再置于4℃冰箱内过夜，在无菌室超净工作台内提取血清，然后混合于同一灭菌后的容器内。
2.阴性血清半成品的检验
(1)无菌检验 对混合后的血清取样，按《中国兽药典》进行检验，应无细菌或霉菌生长。
(2)效价测定 按附录测定HI抗体效价，应为阴性。
(3)特异性 将血清在同一条件下(按《附录》进行)，分别与禽流感、鸡新城疫、减蛋综合征病毒抗原进行红细胞凝集抑制试验，血清对禽流感H5、H7、H9亚型、鸡新城疫、减蛋综合征病毒抗原均为阴性反应。
(4)血清的配制 按总量的3％加入海藻糖(由北京拜尔迪生物公司生产)和0.5％的甘氨酸(由天津市科密欧化学试剂有限公司生产)作为冻干保护剂并充分搅拌均匀，并按照二○○五年版《中国兽药典》无菌检验法进行检验，应无菌生长。
(5)分装与冻干 按2ml/瓶进行定量分装，分装后迅速冷冻真空干燥冻干，按照《规程》规定方法进行。
实施例4
血清成品检验
1.物理性状检验结果 均为微黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。
2.无菌检验结果 检验结果见表1，所有冻干制品全部呈阴性。
表1 无菌检验统计表
3.效价测定结果测定结果见表2、3、4。结果表明，禽流感H9亚型阳性血清效价为9log2，弱阳性血清效价为7log2，阴性血清效价为0。
表2 阳性血清效价检测结果
注：表中“#”表示全部凝集，“++”表示部分全部凝集，“-”表示不凝集。
表3 弱阳性血清效价检测结果
注：表中“#”表示全部凝集，“++”表示部分全部凝集，“-”表示不凝集。
表4 阴性血清效价检测结果
注：表中“#”表示全部凝集，“++”表示部分全部凝集，“-”表示不凝集。
4.特异性检验结果
结果见表5，结果表明阳性血清和弱阳性血清只能被H9亚型抗原所抑制，而对其它抗原均呈阴性反应；阴性血清对所有抗原均呈阴性反应。
表5 抗原特异性检验统计表
注：表中“#”表示全部凝集，即抗原与血清未产生抑制反应；“-”表示不凝集，即抗原与血清产生抑制反应。
5.剩余水分测定结果
检验结果见表6，结果显示，所有样品的剩余水份的含量均小于3％，符合标准物质的要求。
表6 剩余水份检验结果
6.真空度测定结果
所有安瓶真空度均符合要求。
实施例5
1.标准物质的效价定值
(1)定值方法 红细胞凝集抑制试验96孔微量板法进行测定。
(2)定值单位 由6～8家具有资质且事先经过比对确认其定值能力相同的试验室，采用同一方法进行协作标定。
(3)定值要求
1)应对每个被测标准样品分别做6到8次独立的测定，分两个单元，每个单元做3次独立测定；两个单元之间相隔不少于3天。所获得的6个数据应按统计学方法检验异常值，如发现有异常值，应予标明，并补做一次测定。然后报出全部结果。
2)所有用于定值测量的计量器具/测量仪器需经检定或校准合格，并在有效期内。
(4)数据处理
1)汇总全部原始数据，考察全部测量数据分布的正态性。
2)在数据服从正态分布或近似正态分布的情况下，将每个实验室的所测数据的平均值视为单次测量值，构成一组新的测量数据。用统计学方法从统计上剔除可疑值。计算出总平均值和标准偏差。
3)当全部数据服从正态分布或近似正态分布情况下，也可视其为一组新的测量数据。用统计学方法从统计上剔除可疑值，再计算全部原始数据的总平均值和标准偏差。
(5)血清效价的定值结果
协作标定结果见表7、8、9。汇总全部原始数据，考察全部测量数据分布的正态性。经描述性统计学分析，该批阳性血凝抑制效价为840±80，最终定值为840；该批弱阳性血凝抑制效价为160±60，最终定值为160；该批阴性血凝抑制效价为0。
表7 协作标定结果
注：表中数值为抗原全部凝集的最高稀释倍数。
表8 协作标定结果
注：表中数值为抗原全部凝集的最高稀释倍数。
表9 协作标定结果
2.均一性检验
随机抽取阳性血清、弱阳性血清和阴性血清样品各15支，用电子分析天平分别称量其净重量，结果见表10。描述性生物统计分析得出：阳性血清样品重量均在0.096～0.114g之间，平均数为0.103g，CV为4.8％，均在95％正常值范围内；弱阳性血清样品重量均在0.095～0.107g之间，平均数为0.100g，CV为4.0％，均在95％正常值范围内；阴性血清样品重量在0.105～0.123g之间，平均数为0.114g，CV为4.4％，均在95％正常值范围内；结果表明阳性血清、弱阳性血清和阴性血清标准品装量均一。
表10 样品秤重分析结果
3.稳定性检验
结果见表11、12、13，结果表明阳性血清和弱阳性血清在37℃条件下保存2个月HI价未下降，3个月略有降低；4℃保存6个月和-20℃保存18个月时HI价未下降。
表11 稳定性检验结果(一)
表12 稳定性检验结果(二)
表13 稳定性检验结果(三)
附录
禽流感血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验
1材料
1.1 96孔V型(90度)微量反应板、单道及多道微量移液器(配有吸头)、加样槽、吸管、烧杯等。
1.2 0.85％生理盐水
1.2.1生理盐水配制量取8.5g NaCl，加蒸馏水至1000ml；
1.2.2以121℃灭菌30min，备用；
1.2.3生理盐水一经使用，于2～8℃保存不超过1周。
1.3阿氏(Alsevers)液称葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100ml，加热溶解后调pH值至6.1，69Kpa 15min高压灭菌，2～8℃保存备用。
1.4 1％鸡红细胞悬液采集2～3只SPF公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合，用0.85％生理盐水洗涤3次，每次均以3000rpm/min离心5min，洗涤后用生理盐水配成1％(V/V)红细胞悬液，2～8℃保存备用。
1.5抗原溶解冻干的抗原和血清均按瓶签上规格标注的量，用生理盐水溶解。
2操作术式
2.1血凝(HA)试验
2.1.1在V型微量反应板中，每孔加0.025ml生理盐水。
2.1.2第1孔加0.025ml抗原，反复抽打3～5次混匀。
2.1.3从第1孔吸取0.025ml抗原加入第2孔，混匀后吸取0.025ml加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025ml弃去。
2.1.4每孔加0.025ml生理盐水。
2.1.5每孔加入0.025ml 1％(V/V)鸡红细胞悬液。
2.1.6将反应板在振荡器上震荡1～2min或轻扣反应板混合反应物，在室温(20～25℃)下静置20～30min或2～8℃ 45～60min。在对照孔红细胞显著呈钮扣状时判定结果。
2.1.7结果判定将反应板倾斜60度，观察红细胞有无泪珠状流淌，完全无泪珠样流淌(100％凝集)的最高稀释倍数为血凝效价。
2.2血凝抑制(HI)试验
2.2.1根据HA试验测定的效价，计算配制4个血凝单位(4HAU)抗原。HA效价除以4即为含4HAU抗原的稀释倍数。例如，HA效价为1∶256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1∶64(256除以4)。
2.2.2第1～11孔加入0.025ml生理盐水，第12孔加入0.05ml生理盐水。
2.2.3第1孔加入0.025ml血清，充分混匀后吸0.025ml于第2孔，依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025ml弃去。
2.2.4第1～11孔均加入0.025ml的4HAU抗原，在室温(20～25℃)下静置30min或2～8℃50min。
2.2.5每孔加入0.025ml 1％(V/V)的鸡红细胞悬液，震荡混匀，在室温(20～25℃)下静置20～30min或2～8℃ 45～60min，对照红细胞将呈明显钮扣状沉于孔底。
3结果判定 以完全抑制4HAU抗原的最高血清稀释倍数判为该血清的HI效价。当阳性对照血清的HI效价与已知效价误差不超过1个滴度，阴性对照血清效价不高于2log2时，试验方可成立。被检血清HI效价≤3log2判为阴性；＝4log2判为可疑(可疑样品应重检，重检效价≥4log2判为阳性，≤3log2判为阴性)；≥5log2判为阳性。
Claims (2)
1.一种禽流感病毒H9亚型阳性血清和阴性血清标准物质，其特征在于阳性血清标准物质有强阳性血清标准物质和弱阳性血清标准物质，此两种阳性血清标准物质只与禽流感病毒H9亚型抗原呈阳性反应，其HI分别为≥7log2和4log2～5log2；此两种阳性血清与H7和H5亚型禽流感、鸡新城疫、减蛋综合征病毒抗原均应为阴性反应；阴性血清标准物质在同一条件下，分别与禽流感、鸡新城疫、减蛋综合征病毒抗原进行红细胞凝集抑制试验，血清对禽流感H5、H7、H9亚型、鸡新城疫、减蛋综合征病毒抗原均为阴性反应。
2.一种禽流感病毒H9亚型阳性血清和阴性血清标准物质及制备方法，其特征在于：
(1)按常规方法用禽流感病毒H9亚型CKSH01株病毒制备的油乳剂灭活疫苗；
(2)阳性血清标准物质候选物系用青年或成年SPF鸡，经肌肉注射禽流感病毒H9亚型油乳剂灭活疫苗，制备强阳性血清候选物需经2次免疫，制备弱阳性血清候选物仅1次免疫，选取HI抗体效价≥8log2和5log2的免疫鸡只，分别采集SPF鸡血清并进行半成品检验，并分别加入适宜稳定剂后冻干；
(3)阴性血清系采自SPF鸡血，分离血清并进行半成品检验，冻干；
(4)以上制备的强阳性血清、弱阳性血清和阴性血清标准物质候选物经检验、均一性检验及稳定性检验及标准物质的标定、定值而成为强阳性血清、弱阳性血清和阴性血清标准物质。
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