CN108374058A - 一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质及其制备方法 - Google Patents

一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108374058A
CN108374058A CN201810148859.5A CN201810148859A CN108374058A CN 108374058 A CN108374058 A CN 108374058A CN 201810148859 A CN201810148859 A CN 201810148859A CN 108374058 A CN108374058 A CN 108374058A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
standard substance
highly pathogenic
acid standard
pathogenic prrsv
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810148859.5A
Other languages
English (en)
Inventor
原霖
王传彬
杨林
宋晓晖
吴佳俊
周智
刘颖昳
韩焘
董浩
张硕
倪建强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Animal Disease Prevention And Control Center (ministry Of Agriculture Slaughtering Technology Center)
Original Assignee
China Animal Disease Prevention And Control Center (ministry Of Agriculture Slaughtering Technology Center)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Animal Disease Prevention And Control Center (ministry Of Agriculture Slaughtering Technology Center) filed Critical China Animal Disease Prevention And Control Center (ministry Of Agriculture Slaughtering Technology Center)
Priority to CN201810148859.5A priority Critical patent/CN108374058A/zh
Publication of CN108374058A publication Critical patent/CN108374058A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质及其制备方法。该方法包括如下步骤：制备高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的病毒液，灭活，得到灭活的病毒液；然后将灭活的病毒液和保护剂混合，冻干或真空干燥；保护剂中含有甘露醇、BSA、海藻糖、蔗糖和甘氨酸；最后通过均匀性评估、稳定性评估和定值，得到高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质。高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质不仅可用于评价检测试剂和控制检测质量，还为检测研究、医药研究、应用研究提供了核酸标准物质的需求，同时为检验检疫机构技术指导、服务出口企业提供技术上的支持。本发明具有重大的应用价值。

Description

一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质及其制 备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质及其制备方法，高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质即高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准样品。
背景技术
WHO于1997年发布了丙型肝炎核酸国际标准物质，到目前为止已发布同类标准物质16种。我国核酸标准物质研制起步较晚，在国家标准物质资源共享平台可查询到的核酸标准物质仅有5种，涉及微生物及转基因植物。近年来，研制动物病原核酸标准物质也有报道，主要为禽流感、新城疫和亚洲I型口蹄疫病毒核酸等。
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)引起的一种以怀孕母猪繁殖障碍、尤其哺乳仔猪呼吸困难为特征的高度接触性传染病。PRRSV分为欧洲型和美洲型两种基因型，美洲型又分为经典美洲株和高致病性美洲株两种基因亚型，三种亚型毒株在基因序列上存在一定差异。我国国内主要流行的是美洲型毒株，欧洲型毒株也偶有发现。PRRS在1987年首次暴发于美国，随后在加拿大、欧洲与亚洲相继出现，目前已经在世界范围内流行，每年造成养殖业巨大的经济损失。我国在1995年首次出现PRRS，随后迅速蔓延。2006年在我国猪群全面暴发了体温高、发病率高、死亡率高为主要临床特征的猪“高热病”，而导致该病的病原是较之前在国内流行的经典PRRSV发生变异的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(highly pathogenic PRRS，HP-PRRSV)。我国农业部发布“一二三类动物疫病病种名录”将HP-PRRS列为一类动物疫病。猪繁殖与呼吸综合征诊断方法(GB/T 18090-2008)中规定采用RT-PCR方法对HP-PRRSV进行检测，但目前尚无相应的核酸标准物质可用，无法评价检测试剂和控制检测质量。
发明内容
本发明的目的是提供一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质。
本发明提供了一种制备高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质的方法，可包括如下步骤：
(1)制备高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的病毒液；
(2)取步骤(1)制备的病毒液，灭活，得到灭活的病毒液；
(3)取步骤(2)得到的灭活的病毒液，保存，得到高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质。
所述步骤(1)依次可包括如下步骤：
(1-1)培养Marc-145细胞或PAM细胞；
(1-2)接种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒，培养；
(1-3)反复冻融；
(1-4)离心，收集上清液；
步骤(1-4)中收集的上清液即为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的病毒液。
步骤(1-1)中，所述Marc-145细胞具体可为ATCC的产品。
步骤(1-1)中，所述培养具体可为37℃、5％CO2培养。
步骤(1-1)中，所述培养的培养体系细胞初始浓度可为2×104-2×106CELLS/mL。
步骤(1-1)中，所述培养的培养体系细胞初始浓度具体可为2×105CELLS/mL。
步骤(1-2)中，所述培养的时间可为24h-72h(如24h-48h、48h-72h、24h、48h或72h)。
步骤(1-2)中，所述接种的初始浓度为105TCID50/mL。
步骤(1-2)中，所述培养直至CPE达到70％-80％(如70％或80％)。
步骤(1-3)中，所述反复冻融的次数可为2-4次。
步骤(1-3)中，所述反复冻融的次数具体可为3次。
步骤(1-4)中，所述离心具体可为1000r/min离心。
所述步骤(2)中，所述灭活可为热灭活或化学灭活。
所述热灭活的条件可为50-60℃处理0.5-4h。
所述热灭活的条件具体可为56℃处理4h。
所述步骤(3)中，所述保存的方式可为A1)或A2)：
A1)将灭活的病毒液和保护剂混合，然后冻干或真空干燥；所述保护剂中含有甘露醇、BSA、海藻糖、蔗糖和甘氨酸；
A2)将灭活的病毒液、RNA酶抑制剂、TE缓冲液和BSA混合。
所述保护剂中可含有15-25％(15-25mg/100mL)甘露醇、4-6％(4-6mg/100mL)BSA、1-3％(1-3mg/100mL)海藻糖、3-5％(3-5mg/100mL)蔗糖和1-3％(1-3mg/100mL)甘氨酸。
所述保护剂可为含15-25％(15-25mg/100mL)甘露醇、4-6％(4-6mg/100mL)BSA、1-3％(1-3mg/100mL)海藻糖、3-5％(3-5mg/100mL)蔗糖和1-3％(1-3mg/100mL)甘氨酸的水溶液。
所述保护剂具体可为含20％(20mg/100mL)甘露醇、5％(5mg/100mL)BSA、2％(2mg/100mL)海藻糖、4％(4mg/100mL)蔗糖和2％(2mg/100mL)甘氨酸的水溶液。
所述TE缓冲液可为含0.5-1.5mM EDTA的pH7.5-8.5、8-12mM的Tris-HCl缓冲液。
所述TE缓冲液具体可为含1mM EDTA的pH8.0、10mM的Tris-HCl缓冲液。
所述“将灭活的病毒液和保护剂混合”可为1体积份灭活的病毒液和0.5-1.5体积份保护剂混合。
所述“将灭活的病毒液和保护剂混合”具体可为1体积份灭活的病毒液和1体积份保护剂混合。
所述冻干的参数可为：-20℃－-40℃冷冻4h－10h。
所述真空干燥的参数可为：0.025mbar－0.1mbar条件下，4℃－20℃干燥2h－6h。
所述冻干的参数具体可为a1)或a2)或a3)：a1)-40℃冷冻10h；a2)-30℃冷冻8h；a3)-20℃冷冻4h。
所述真空干燥的参数具体可为b1)或b2)：b1)0.025mbar条件下，4℃干燥6h；b2)0.1mbar条件下，20℃干燥2h。
所述A2)中，灭活的病毒液、RNA酶抑制剂、TE缓冲液和BSA的配比可为1mL灭活的病毒液、150-250U RNA酶抑制剂、0.5-1.5mL TE缓冲液和0.03-0.07g BSA。
所述A2)中，灭活的病毒液、RNA酶抑制剂、TE缓冲液和BSA的配比具体可为1mL灭活的病毒液、200U RNA酶抑制剂、1mL TE缓冲液和0.05g BSA。
上述任一所述的方法还可包括步骤(4)：将步骤(3)得到的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质进行病毒灭活检验和/或支原体检验和/或病毒检验。
所述病毒灭活检验可使用细胞病变检验。
所述支原体检验可使用支原体检测试剂盒。
所述病毒检验可使用荧光PCR检测试剂盒。
所述支原体检测试剂盒和所述荧光PCR检测试剂盒均可为北京世纪元亨动物防疫技术有限公司的产品。
上述任一所述的方法还可包括步骤(5)：将步骤(3)得到的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质进行均匀性评估和/或稳定性评估。
所述进行均匀性评估的步骤为：将步骤(3)得到的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质进行抽样，对样品提取核酸，并使用数字PCR方法进行检测，结果进行均匀性评估。
进行均匀性评估的抽样方法可为抽取10-30个(如30个)高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质。每个样品检测次数具体可为3次。
所述均匀性评估可为根据抽样方法和检测次数，使用单因素方差分析方法进行均匀性评估。
所述进行稳定性评估的步骤为：将步骤(3)得到的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质进行抽样，对样品提取核酸，并使用数字PCR方法进行检测，计算平均值，进行稳定性评估。
所述稳定性评估可为长期稳定性评估或短期稳定性评估。
进行长期稳定性评估的抽样方法可为：将核酸标准物质在-20℃保存N1个月、N2个月、N3个月、N4个月或N5个月(N1-N5均为自然数且0≤N1-N5≤14)，抽取不少于2瓶的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质，每个样品检测次数具体可为1次。
进行短期稳定性评估的抽样方法可为：将核酸标准物质在4℃、25℃或37℃保存2个月、7天或1天，抽取不少于2瓶的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质，每个样品检测次数具体可为1次。
所述稳定性评估可为根据抽样方法和检测次数，使用回归或T检验进行稳定性评估。
上述任一所述提取核酸可采用全自动核酸提取仪进行。
上述任一所述的方法还可包括步骤(6)：将均匀性高且稳定的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质进行定值；定值表示为标准值±扩展不确定度；
由若干个独立实验室使用数字PCR方法分别检测2个以上均匀且稳定的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质，得到特征值；然后对各个特征值进行统计处理，确定标准值；
使用统计学方法计算扩展不确定度，包括均匀性评估中引起的不确定度、稳定性评估中引起的不确定度和定值中引起的不确定度。
多个实验室合作定值，参与实验室的最小数目通常为6-8个。当采用同一种方法时，独立定值组数一般不少于8个。统计处理时，需有4-6次独立重复的测量数据。
本发明所提供了一种制备高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质的方法，具体可包括如下步骤：
(1)制备高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的病毒液；
(2)取步骤(1)制备的病毒液，灭活，得到灭活的病毒液；
(3)取步骤(2)得到的灭活的病毒液，加保护剂保存，进行病毒灭活检验和/或支原体检验和/或病毒检验，进行均匀性评估和/或稳定性评估，进行标准物质定值测定、计算扩展不确定度，得到高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质。
上述任一所述方法制备的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质也属于本发明的保护范围。
本发明还保护上述任一所述保护剂。
上述任一所述保护剂在保存高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒具体可为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA1株。
采用本发明提供的方法制备的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质，不仅可用于评价检测试剂和实验室质量控制，还为科学研究、疫苗研究、应用研究提供了核酸标准物质的需求，同时为检验检疫机构技术指导、服务出口企业提供技术上的支持。本发明具有重大的应用价值。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质的制备
一、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的病毒液制备
1、将50mL含2×105CELLS/mL的Marc-145细胞(ATCC的产品)的培养液置于培养箱，37℃、5％CO2静置培养24h。
2、完成步骤1后，接种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA1株，得到培养体系。该培养体系中，高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA1株的浓度为105TCID50/mL。
3、将步骤2得到的培养体系置于培养箱，37℃、5％CO2静置培养至CPE达到70％。
4、取完成步骤3的培养体系，反复冻融3次。
5、取完成步骤4的培养体系，1000r/min离心10min，收集上清液。
步骤5收集的上清液即为制备的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的病毒液。
将上清液分装至无菌冻存管，-80℃下保存。
二、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质的制备
1、取步骤一制备的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的病毒液，56℃水浴4h，得到灭活的病毒液。
2、将1mL灭活的病毒液、200U RNA酶抑制剂、1mL TE缓冲液和0.05g BSA混合，得到猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质甲(以下简称核酸标准物质甲)。核酸标准物质甲呈液体状态。
TE缓冲液为含1mM EDTA的pH8.0、10mM的Tris-HCl缓冲液。
3、将1体积份灭活的病毒液和1体积份保护剂混合，然后进行冻干(-40℃冷冻10h)或真空干燥(0.025mbar条件下，4℃干燥6h)，得到猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质乙(以下简称核酸标准物质乙)。核酸标准物质乙呈干粉状态。
保护剂为含20％(20mg/100mL)甘露醇、5％(5mg/100mL)BSA、2％(2mg/100mL)海藻糖、4％(4mg/100mL)蔗糖和2％(2mg/100mL)甘氨酸的水溶液。
三、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质的检验
高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质为核酸标准物质甲或核酸标准物质乙。
1、取高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质，进行物理性状检验。
实验结果表明，核酸标准物质甲呈无色均一液体，无絮状沉淀物或大块沉淀；核酸标准物质乙为乳白色饼状。
2、取高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质，进行病毒灭活检验。
病毒灭活检验使用细胞病变进行检验。
检测结果：核酸标准物质甲和核酸标准物质乙均无病变。
3、取高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质，进行支原体检验。
支原体检验使用支原体检测试剂盒(北京世纪元亨动物防疫技术有限公司的产品)进行检测。
检测结果：核酸标准物质甲和核酸标准物质乙均无条带；无支原体感染。
4、取高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质，进行其它病毒检验。
其它病毒检验使用荧光PCR检测试剂盒(北京世纪元亨动物防疫技术有限公司的产品)进行检测。
检测结果：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒产生“S”型扩增曲线，其它病毒均不产生“S”型扩增曲线；无其它病毒感染。
四、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质的评估
高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质为核酸标准物质甲或核酸标准物质乙。
1、均匀性评估
(1)抽取30个高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质。
(2)采用全自动核酸提取仪提取样品的核酸。
(3)使用数字PCR方法进行检测，每个样品检测3次，计算平均值。
(4)根据抽样方法和检测次数，使用单因素方差分析方法对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质进行均匀性评估。
2、长期稳定性评估(即在规定贮存条件下的稳定性)
(1)抽取不少于2瓶的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质，在-20℃保存0-14个月。
(2)采用全自动核酸提取仪提取样品的核酸。
(3)使用数字PCR方法进行检测，每个样品检测2次，计算平均值。
(4)根据抽样方法和检测次数，使用回归对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质进行长期稳定性评估。
3、短期稳定性评估(即在运输过程中的稳定性)
(1)抽取不少于2瓶的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质，分别在4℃、25℃或37℃保存2个月、7天或1天。
(2)采用全自动核酸提取仪提取样品的核酸。
(3)使用数字PCR方法进行检测，每个样品检测1次。
(4)根据抽样方法和检测次数，使用回归对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质进行短期稳定性评估。
五、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质的定值
将步骤四中均匀性高且稳定的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质进行定值；定值表示为标准值±扩展不确定度。
1、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质的标准值
取步骤四中均匀性高且稳定的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质，由多个独立实验室使用数字PCR方法提供一系列核酸标准物质的特征值，对数据进行统计处理，合作确定标准值。
多个实验室合作定值，参与实验室的最小数目通常为6-8个。当采用同一种方法时，独立定值组数一般不少于8个。
所述核酸标准物质的特征值，是指对于5个核酸标准物质，每个物质重复2次，提供10个特征值。
组内可疑值检验：对每组独立测量结果，用适当的统计学方法，如格拉布斯法、狄克逊法、t检验法等，结合技术上的判断，剔除可疑值。
组间数据等精度检验：对各组数据的标准偏差用科克伦法或F检验法进行等精度检验，对有显著性差异的数据组在进行技术审查后再决定是否予以剔除。
当各组数据等精度时，检验各组数据平均值是否有显著性差异。如平均值无显著性差异，先合并数据再用适当的方法检验数据分布的正态性，在符合正态分布的情况下，可将两个或多个平均值再次计算平均值，求出总平均值，即为标准值。
2、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质的扩展不确定度
使用统计学方法计算高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质的扩展不确定度，包括步骤四中1均匀性评估中引起的不确定度、步骤四中2或3稳定性评估中引起的不确定度和定值过程中引起的不确定度。
(1)均匀性评估引入的不确定度的评定
均匀性评估引入的不确定度包括试剂盒的精密度、仪器的精密度和人员操作所引入的不确定度，为A类不确定度。其中由核酸标准物质均匀性产生的标准偏差sbb为：
所以均匀性评估引入的不确定度为：ubb＝sbb
(2)稳定性评估引入的不确定度的评定
稳定性评估引入的不确定度也涵盖了储存温度的变动性对核酸标准物质的影响、试剂盒稳定性引入的不确定度和人员操作引入的不确定度，为A类不确定度。
在产品进行稳定性评估时，对保存在(-20±5)℃环境中的样本，每个月检测一次。每次检测结束后，对数据进行处理，计算其斜率、截距和不确定度。暂定产品有效期为12个月，则有效期t＝12个月的稳定性不确定度贡献为：
us＝s(β1)·X
(3)定值过程引入的不确定度的评定
不确定度A类评定通过测量数据的标准偏差、测量次数及所要求的置信水平按统计学计算方法进行。由定值测量重复性引入的不确定度u(A)由测量的相对标准偏差计算：
(4)标准值的不确定度的评定
合成上述核酸标准物质的不确定度分量，取扩展因子k＝2，计算扩展不确定度。核酸标准物质合成标准不确定度计算公式如下：
标准值的扩展不确定度：UCRM＝k×uCRM。

Claims (10)

1.一种制备高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质的方法，包括如下步骤：
(1)制备高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的病毒液；
(2)取步骤(1)制备的病毒液，灭活，得到灭活的病毒液；
(3)取步骤(2)得到的灭活的病毒液，保存，得到高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述灭活为热灭活或化学灭活。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述保存的方式为A1)或A2)：
A1)将灭活的病毒液和保护剂混合，然后冻干或真空干燥；所述保护剂中含有甘露醇、BSA、海藻糖、蔗糖和甘氨酸；
A2)将灭活的病毒液、RNA酶抑制剂、TE缓冲液和BSA混合。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述A1)中，“将灭活的病毒液和保护剂混合”为1体积份灭活的病毒液和0.5-1.5体积份保护剂混合。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于：
所述冻干的参数为：-20℃－-40℃冷冻4h－10h；
所述真空干燥的参数为：0.025mbar－0.1mbar条件下，4℃－20℃干燥2h－6h。
6.如权利要求1至5任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括步骤(4)：将步骤(3)得到的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质进行病毒灭活检验和/或支原体检验和/或病毒检验。
7.如权利要求1至6任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括步骤(5)：将步骤(3)得到的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质进行均匀性评估和/或稳定性评估。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法还包括步骤(6)：将均匀性高且稳定的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质进行定值；定值表示为标准值±扩展不确定度；
由若干个独立实验室使用数字PCR方法分别检测2个以上均匀且稳定的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质，得到特征值；然后对各个特征值进行统计处理，确定标准值；
使用统计学方法计算扩展不确定度，包括均匀性评估中引起的不确定度、稳定性评估中引起的不确定度和定值中引起的不确定度。
9.采用权利要求1至8任一所述的方法制备的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质。
10.权利要求3或4中所述的保护剂。
CN201810148859.5A 2018-02-13 2018-02-13 一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质及其制备方法 Pending CN108374058A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810148859.5A CN108374058A (zh) 2018-02-13 2018-02-13 一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810148859.5A CN108374058A (zh) 2018-02-13 2018-02-13 一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108374058A true CN108374058A (zh) 2018-08-07

Family

ID=63017946

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810148859.5A Pending CN108374058A (zh) 2018-02-13 2018-02-13 一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108374058A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109082481A (zh) * 2018-08-16 2018-12-25 广州邦德盛生物科技有限公司 一种dna核酸类定值质控物及其制备方法
CN109097453A (zh) * 2018-08-16 2018-12-28 广州邦德盛生物科技有限公司 一种rna核酸类定值质控物及其制备方法
CN110684746A (zh) * 2019-09-26 2020-01-14 北京市动物疫病预防控制中心 一种冻干型新城疫病毒核酸标准物质的制备方法及其检测方法
CN110735004A (zh) * 2019-09-26 2020-01-31 北京市动物疫病预防控制中心 一种冻干型猪瘟病毒核酸标准物质的制备方法及其检测方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102012433A (zh) * 2010-11-05 2011-04-13 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 禽流感病毒h9亚型阳性血清和阴性血清标准物质及制备方法
CN102716479A (zh) * 2012-07-04 2012-10-10 广东大华农动物保健品股份有限公司 一种猪繁殖与呼吸综合征nvdc-jxa1株-猪细小病毒病二联灭活疫苗及其制备方法和应用
CN102727903A (zh) * 2012-07-04 2012-10-17 中国动物疫病预防控制中心 一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗jxa1-r株耐热冻干保护剂及制备方法
CN102727878A (zh) * 2012-07-04 2012-10-17 中国动物疫病预防控制中心 一种生物反应器制备猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗（nvdc-jxa1株）的方法及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102012433A (zh) * 2010-11-05 2011-04-13 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 禽流感病毒h9亚型阳性血清和阴性血清标准物质及制备方法
CN102716479A (zh) * 2012-07-04 2012-10-10 广东大华农动物保健品股份有限公司 一种猪繁殖与呼吸综合征nvdc-jxa1株-猪细小病毒病二联灭活疫苗及其制备方法和应用
CN102727903A (zh) * 2012-07-04 2012-10-17 中国动物疫病预防控制中心 一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗jxa1-r株耐热冻干保护剂及制备方法
CN102727878A (zh) * 2012-07-04 2012-10-17 中国动物疫病预防控制中心 一种生物反应器制备猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗（nvdc-jxa1株）的方法及其应用

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GOURAPURA J. RENUKARADHYA 等: "Inactivated and subunit vaccines against porcine reproductive and respiratory syndrome: Current status and future direction", 《VACCINE》 *
乔彩霞 等: "五种重要猪病集成检测技术及标准物质的研究和应用", 《中国科技成果》 *
原霖 等: "核酸标准物质研究现状", 《中国畜牧兽医》 *
宋宗明 等: "乙型脑炎灭活疫苗效力参考品的制备及稳定性", 《中国生物制品学杂志》 *
王晓卉: "猪圆环病毒2型灭活苗参考品的研制及定值方法研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *
赵燕 等: "浅谈动物疫苗耐热保护剂的种类及作用机理", 《猪病防控》 *
阚莹 等: "JJF1343—2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》的使用", 《中国计量》 *
魏津: "高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（JXA1-R株）国家参考品的研制及定值方法的建立", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109082481A (zh) * 2018-08-16 2018-12-25 广州邦德盛生物科技有限公司 一种dna核酸类定值质控物及其制备方法
CN109097453A (zh) * 2018-08-16 2018-12-28 广州邦德盛生物科技有限公司 一种rna核酸类定值质控物及其制备方法
CN110684746A (zh) * 2019-09-26 2020-01-14 北京市动物疫病预防控制中心 一种冻干型新城疫病毒核酸标准物质的制备方法及其检测方法
CN110735004A (zh) * 2019-09-26 2020-01-31 北京市动物疫病预防控制中心 一种冻干型猪瘟病毒核酸标准物质的制备方法及其检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108374058A (zh) 一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质及其制备方法
Zani et al. Deletion at the 5’-end of Estonian ASFV strains associated with an attenuated phenotype
Wasilk et al. Detection of US, Lelystad, and European-like porcine reproductive and respiratory syndrome viruses and relative quantitation in boar semen and serum samples by real-time PCR
Li et al. African swine fever virus MGF-110-9L-deficient mutant has attenuated virulence in pigs
Tian et al. Emergence of fatal PRRSV variants: unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark
Awad et al. Detection of reticuloendotheliosis virus as a contaminant of fowl pox vaccines
Kim et al. Detection and genetic characterization of porcine circovirus 3 from aborted fetuses and pigs with respiratory disease in Korea
KR20070105965A (ko) 돼지 생식기 호흡기 증후군 분리물 및 사용 방법
Yan et al. Pathogenicity of a TW-like strain of infectious bronchitis virus and evaluation of the protection induced against it by a QX-like strain
CN106521036B (zh) 一种鉴别犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四重pcr检测方法
Wang et al. Molecular evolution and characterization of novel Seneca Valley virus (SVV) strains in South China
Floegel-Niesmann et al. Virulence of classical swine fever virus isolates from Europe and other areas during 1996 until 2007
CN106957924A (zh) 一种能同时检测和鉴别猪繁殖呼吸综合征和猪流感的检测试剂盒及引物和探针
Liu et al. Prevalence of porcine circovirus 2 throughout China in 2015–2019: A systematic review and meta-analysis
Weesendorp et al. The effect of tissue degradation on detection of infectious virus and viral RNA to diagnose classical swine fever virus
CN109735499B (zh) 新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系及其建立方法和应用
Legione et al. Safety and vaccine efficacy of a glycoprotein G deficient strain of infectious laryngotracheitis virus delivered in ovo
CN112391501B (zh) 鉴别水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒、水貂阿留申病毒及伪狂犬病毒的四重pcr引物组
CN105238765A (zh) 大肠杆菌噬菌体ms2内标质控品的制备、应用和试剂盒
Zhou et al. Duck hepatitis A virus prevalence in mainland China between 2009 and 2021: A systematic review and meta-analysis
Nielsen et al. Saffold virus infection associated with human myocarditis
CN105219737A (zh) 大肠杆菌噬菌体m13内标质控品的制备、应用和试剂盒
Literák et al. Papillomatosis in a European bison
CN112609023A (zh) 一种用于检测呼吸道病原体核酸的质控物及其制备方法
CN107686865A (zh) 检测i型牛疱疹病毒的引物对、探针、试剂盒及方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180807