CN110735004A - 一种冻干型猪瘟病毒核酸标准物质的制备方法及其检测方法 - Google Patents

一种冻干型猪瘟病毒核酸标准物质的制备方法及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种冻干型猪瘟病毒核酸标准物质的制备方法及其检测方法，包括如下步骤：制备猪瘟病毒C株的病毒液，灭活，得到灭活的病毒液；然后将灭活的病毒液和保护剂混合，冻干，得到猪瘟病毒核酸标准物质。其检测方法以推进猪瘟病毒核酸分子检测标准化及我国猪瘟病毒体外诊断试剂的量值溯源和检测结果一致化。猪瘟病毒核酸标准物质不仅可为兽医实验室开展量值溯源、能力验证、质量控制、方法评价、试剂选择等工作提供技术支撑，还能提高全国不同类型兽医检测实验室的检测能力和技术水平，更为动物疫病净化和畜产品质量安全评价、身份验证、国内监管、进出口检验、企业自控和国际贸易互认提供有力保障。

Description

一种冻干型猪瘟病毒核酸标准物质的制备方法及其检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪瘟病毒核酸标准物质的制备方法及其检测方法，猪瘟病毒核酸标准物质即猪瘟病毒核酸标准样品。
背景技术
猪瘟(classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fevervirus, CSFV)感染引起的一种高致死性的烈性传染病，以接触性传染，急性呈败血性变化，实质器官出血、坏死和梗死，慢性呈纤维素性坏死性肠炎为主要特征。是严重威胁养猪业的传染病之一，被世界动物卫生组织(office international des epizooties,OIE)列入OIE疫病名目，也是我国农业农村部规定的一类传染病。本病在世界各地相继发生，其中以欧洲和亚洲最为严重，近年来我国流行的猪瘟以非典型性临床症状和病理剖检为主，其病原属黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)，其RNA为单股正链，病毒粒子呈圆形，大小为38～44nm，核衣壳是立体对称二十面体，氯化铯中浮密度1.15～1.17g/ml，有包膜，该病毒对乙醚敏感，对温度、紫外线、化学消毒剂等抵抗力较强。
当前国内外针对猪瘟病毒的检测试剂盒研究是百花齐放，兽医检测实验室在选择方面偏重于血清检测试剂盒以进口为主，核酸检测试剂盒以国产为主，但是，国内针对这些检测方法的标准物质却十分匮乏，各级检测机构缺少阳性血清、抗原、核酸标准物质。尽管各有关科研单位或多或少拥有一部分类似材料，但往往其来源背景不清、制备工艺不完善、没有经过标定，仍达不到国家级标准物质的要求。自上世纪90年代以来，动物及动物产品质量安全已成为全世界关注的焦点。美国、欧盟等发达国家早在70年代就全面开展了动物产品质量检测工作，并形成了一整套质量评价程序和控制体系，有关标准物质的研究开发工作也处于领先地位，并逐渐系统化。我国80年代以来也开始研制临床检验标准物质，主要是以血、尿、发为机体的提供无机成分和微量元素标准值的分析标准物质和纯品试剂标准物质。90年代以来，我国逐步建立了动物疫病和动物产品质量安全检测体系，陆续发布了一系列动物疫病检测标准，但是与之配套的检测标准物质研究与开发严重滞后。
发明内容
本发明的目的旨在克服现有技术缺陷，提供一种冻干型猪瘟病毒核酸标准物质，以推进猪瘟病毒核酸分子检测标准化及我国猪瘟病毒体外诊断试剂的量值溯源和检测结果一致化。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种冻干型猪瘟核酸标准物质的制备方法，包括如下步骤：
(1)猪瘟病毒液的制备；
(2)取步骤(1)制备的病毒液热灭活，得到灭活的病毒液；
(3)取步骤(2)得到的灭活病毒液和保护剂混合，冻干，获得猪瘟病毒核酸标准物质。
所述步骤(1)依次可包括如下步骤：
(1-1)培养PK-15细胞；
(1-2)接种猪瘟病毒并培养；
(1-3)反复冻融；
(1-4)离心，收集上清液，即为含有猪瘟病毒的病毒液。
步骤(1-1)中，所述PK-15细胞具体可为ATCC的产品。
步骤(1-1)中，所述细胞培养方法可为37℃、5％CO2培养，培养24h～48h。
步骤(1-1)中，所述培养的培养体系细胞培养结束浓度可为1×104～1×106cells/mL。
步骤(1-2)中，所述接种的猪瘟病毒初始浓度为106TCID50/mL，所述培养的时间可为24h～72h直至细胞病变(CPE)达到70％～80％结束培养；
进一步的，所述培养的时间具体为72h。
步骤(1-3)中，所述反复冻融的次数为3次。
步骤(1-4)中，所述离心具体可为3000r/min离心。
所述步骤(2)中，所述灭活可为热灭活或化学灭活。
所述热灭活的条件具体为56℃水浴处理4h。
所述步骤(3)中，所述保护剂中含有明胶和蔗糖。
进一步地，所述保护剂含有质量分数为5％的明胶和25％的蔗糖的水溶液，使用前需高温高压灭菌(116℃)20min。
所述“将灭活的病毒液和保护剂混合”为1体积份灭活的病毒液和1体积份保护剂混合。
所述冻干的参数可为：-10℃～-40℃冷冻4h～10h。所述冻干的参数具体可为： -10℃冻干10h。
上述的制备方法，优选地，其还包括对按如上所述制备方法获得的猪瘟病毒核酸标准物质进行病毒灭活检验和/或支原体检验和/或其他病毒检验。
所述病毒灭活检验可使用细胞病变检验。
所述支原体检验可使用支原体培养实验。
所述其他病毒检验可使用荧光PCR检测试剂盒，其他病毒检验包括对猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲变异株(PRRSV JXA1)、猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株(PRRSV LV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的检测。
如上所述的制备方法，还包括对猪瘟病毒核酸标准物质进行均匀性评估和/ 或稳定性评估。
进一步地，所述均匀性评估的步骤为：将所述猪瘟病毒核酸标准物质进行抽样，对样品提取核酸，并使用数字PCR方法进行检测，结果进行均匀性评估。
优选地，所述均匀性评估的抽样方法可为抽取10～30个(如15个)猪瘟病毒核酸标准物质，每个取样3次。
所述均匀性评估可为根据抽样方法和检测次数，使用单因素方差分析方法进行均匀性评估。
所述数字PCR方法采用的引物对如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，探针如SEQID NO.3所示，扩增体系采用的引物对浓度各10μM，探针10μM；扩增程序为45℃15min；95℃2min；95℃15s，55℃1min，40个循环；98℃ 10min；12℃60min。所述稳定性评估的步骤为：将猪瘟病毒核酸标准物质进行抽样，对样品提取核酸，并使用数字PCR方法进行检测，计算平均值，进行稳定性评估。
所述稳定性评估可为长期稳定性评估和短期稳定性评估。进行长期稳定性评估的抽样方法可为：将核酸标准物质在-20℃保存N1个月、N2个月、N3个月、 N4个月或N5个月(N1-N5均为自然数且0≤N1-N5≤14)，抽取不少于2瓶的猪瘟病毒核酸标准物质，每个样品检测次数不少于1次。进行短期稳定性评估的抽样方法可为：将核酸标准物质在4℃、25℃、60℃保存1周、2周、4周，抽取不少于2瓶的猪瘟病毒核酸标准物质，每个样品检测次数不少于1次。
所述稳定性评估可为根据抽样方法和检测次数，使用回归或T检验进行稳定性评估。
如上所述的制备方法还包括将猪瘟病毒核酸标准物质进行定值；定值表示为标准值±扩展不确定度；由若干个独立实验室使用数字PCR方法分别检测2个以上均匀且稳定的猪瘟病毒核酸标准物质，得到特征值；然后对各个特征值进行统计处理，确定标准值；
使用统计学方法计算扩展不确定度，包括均匀性评估中引起的不确定度、稳定性评估中引起的不确定度和定值中引起的不确定度。
多个实验室合作定值，参与实验室的最小数目通常为6-8个。
本发明采用的猪瘟病毒具体为猪瘟病毒C株。目前，我国动物病原微生物检测标准物质的研究尚处于起步阶段，仅有针对少数几种病原的标准血清、标准抗原和菌毒种标准物质。采用本发明提供的方法制备的猪瘟病毒核酸标准物质，一方面可用于评价检测试剂和实验室质量控制，另一方面可大幅提升疫病监测和诊断的效率，对于提升动物及动物产品的质量安全检测能力，确保消费者健康与安全、促进畜牧业健康发展、提高产品国际竞争力具有十分重要的意义，可见本发明具有重大的应用价值。
有益效果
1、本发明的有益效果是制备了一种猪瘟病毒核酸标准物质。标准物质是验证检测方法、检测试剂是否可靠的关键，也是实验室质量认证体系的重要因素，它的使用可为动物疫病检测实验室带来可靠的检测保证，从而获得准确的数据，为精准化疫病防控提供技术保障。
2、本发明使用猪瘟病毒C株，通过病毒液的制备、灭活和冻干等系列试验，最终获得了易于保存和运输的猪瘟病毒核酸标准物质，为提高全国不同类型兽医检测实验室的检测能力和技术水平，验证检测方法、检测试剂的可靠性提供了一种关键的标准试剂。
附图说明
图1：不同冻干保护剂冻干效果比对。
图2：本发明猪瘟病毒RT-qPCR方法扩增曲线。
图3：本发明猪瘟病毒RT-qPCR方法扩增标准曲线。
图4：本发明猪瘟病毒数字PCR方法退火温度优化结果。
图5：本发明CSFV RT-ddPCR方法线性关系图谱。
具体实施方式
本发明建立了一种冻干方法，将混有冻干保护剂的猪瘟病毒核酸标准物质预先冷冻，再放入冻干机中进行冻干至少10小时以上。冻干结束后取出冻干瓶，压好胶塞并盖紧外盖，放入-20℃冰箱保存。通过摸索冻干工艺有效保证了猪瘟病毒核酸标准物质的最佳性状，有利于标准物质的保存与运输。
本批猪瘟病毒核酸标准物质研制过程中的定量检测均利用了微滴式数字 PCR平台，与传统的荧光定量PCR技术相比，数字PCR的精确度和灵敏度更佳。利用微滴式数字PCR技术，可以检测稀有突变，精确测定拷贝数变异，并对基因表达进行绝对定量。本发明通过猪瘟病毒微滴式数字PCR反应的优化，包括反转录条件的优化、核酸提取试剂盒的选择与性能评估、反应条件优化(引物探针浓度、退火温度)、方法的线性及最低检测限测定，可以更加准确、灵敏地对猪瘟病毒核酸标准物质的均匀性和稳定性进行评估与考察，大大提高了实验结果的可信度。
利用单因素方差分析方法对猪瘟核酸标准物质进行评估。猪瘟核酸标准物质定值过程中采用狄克逊法和格拉布斯法对实验室内数据可疑值进行检验；采用科克伦法检验实验室间数据是否等精度；根据均匀性引入的不确定度、稳定性引入的不确定度以及定值过程带来的不确定度计算制备的猪瘟核酸标准物质的扩展不确定度，其中定值过程带来的不确定度对天平称量、移液器和数字PCR仪等多个环节进行计算。采用生物统计学方法对制备的猪瘟核酸标准物质进行评估和定值，使制备的标准物质定值更准确。
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所做的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1猪瘟病毒的病毒液制备
1.细胞的培养
将长满2×106viable cells/mL的PK-15细胞用胰酶消化传代，置于5％CO2培养箱37℃静置培养。
2.猪瘟病毒接种和培养
待步骤1中的PK-15细胞生长至70％以上单层时弃去细胞培养液，按培养液量的10％接种猪瘟病毒，该培养体系中，猪瘟病毒C株的浓度为105TCID50/mL，将培养体系置于37℃5％CO2培养箱孵育1h，弃上清，加含2％FBS的DMEM 培养液，置37℃5％CO2培养箱静置培养。每次接种样品设正常细胞对照，逐日观察细胞病变。
3.猪瘟病毒液收获
接种猪瘟病毒后72-96h，当细胞病变达到80％以上时收获细胞培养物，-80℃下保存。
4.病毒的灭活和分装
取完成步骤2的培养体系，放入-20℃冰箱，反复冻融3次，在每次冻融过程中剧烈晃动培养瓶，使细胞瓶底部培养物脱落。取完成以上步骤的培养体系，混合收获的病毒液，4℃、5000r/min离心10min，收集上清液，分装1mL灭菌冻存管，-80℃下保存。收集的上清液即为制备的猪瘟病毒液。
实施例2猪瘟病毒C株核酸标准物质的制备
1.猪瘟病毒液的灭活和验证
取制备的猪瘟病毒液，于56℃水浴4h，得到灭活的病毒液。取1mL制备的病毒液接种至单层宿主细胞，经培养观察，没有出现细胞病变；经PCR定量检测，培养后的病毒量没有增加，可认为病毒已灭活。
2.猪瘟病毒液的冻干
1)不同冻干保护剂试验
本发明人对三种不同冻干保护剂(分别命名为P1、P2和P3)进行了冻干效果试验，
三种保护剂组成分别为：
P1：5％的明胶(g/mL)和25％的蔗糖(g/mL)；
P2：5％蔗糖、95％脱脂乳粉；
P3：20％甘露醇、2％海藻糖、4％蔗糖和2％甘氨酸；
将病毒液与三种不同的保护剂分别等体积混合，分装后在同一条件下进行预冻和冻干，结果发现，使用冻干保护剂P1(即明胶蔗糖保护剂)冻干后的猪瘟病毒核酸标准物质呈干粉状，物理状态良好，外观较为饱满，偶有裂隙；使用冻干保护剂P2冻干后的猪瘟病毒核酸标准物质外观虽然较饱满，但裂隙较多；使用冻干保护剂P3冻干后的猪瘟病毒核酸标准物质不仅裂隙较多，还有拉丝疏松等现象，故最终选择明胶蔗糖保护剂进行大批量冻干。三种冻干保护剂的冻干效果见图1。
明胶和蔗糖含量对冻干效果比较试验表明冻干保护剂含质量分数为5％的明胶(g/mL)和25％的蔗糖(g/mL)对猪瘟病毒C株核酸含量基本无影响，因此选择含5％明胶和25％蔗糖的冻干保护剂。
2)冻干前准备
吸取猪瘟病毒C株原液(定量值约为4.5×105copies/mg)500mL，吸取冻干保护剂500mL，病毒液与保护剂比例为1：1充分混匀，每瓶1mL分装于冻干瓶内，盖好冻干瓶胶塞，放入超低温冰箱内预冻24小时，保证预冻为固体状态，取出准备冻干。
3)冻干程序
打开EYELA FDU-1200冻干机主开关，将“AUTO”指示灯熄灭，按下制冷控制按钮“Refrigerator RUN/STOP”，制冷启动，“Refrigerator RUN/STOP”指示灯点亮，当温度指示“TRAP TEMP”为-40℃时，将预先冷冻好的样品迅速放入干燥仓内并罩好干燥仓外罩，按下“VAC PUMP”按钮，“VAC PUMP”按钮指示灯点亮，真空泵启动，开始抽真空，当真空度指示“VACCUM GUARGE”为 20Pa以下后进入正常工作状态开始冻干，冻干10小时。冻干结束后取出冻干瓶，压好胶塞并盖紧外盖，放入4℃冰箱保存。
实施例3猪瘟病毒核酸标准物质数字PCR方法的建立
1.猪瘟病毒引物探针的设计
根据CSFV C株5’UTR基因保守区，设计引物探针序列。
CSFV C株上游引物：5’-GTCAGTAGTTCGACGTGAGCA-3’；
CSFV C株下游引物：5’-AGCACCCTATCAGGTCGTAC-3’；
CSFV C株探针：5′-FAM-ATGCCCAAGACACACCTTAACCCTRGC– BHQ-1’。扩增产物长度139bp。
目标序列如下：
GTCAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAGCCCACCTCGAGATGCTACGTGGACG AGGGCATGCCAAGACAC ACCTTAACCCTAGCGGGGGTCGCTAGGGTGAAA TCACACCACGTGATGGGAGTACGACCTGATAGGGCGC
其中“-”引物位置，“＝”探针位置。
2.猪瘟病毒RT-qPCR方法验证引物和探针
采用设计好的引物和探针建立RT-qPCR方法，RT-qPCR的反应体系为2*
Figure BDA0002216000050000081
Probe qPCR dUTP Master Mix 10μL，GoScript RT Mix for1-step RT-QPCR 0.5μL，10μM引物1.2μL，10μM探针0.6μL，水5.7μL，模板2μL。扩增条件为45℃15min；95℃2min；95℃15s，55℃1min，40个循环。对实施例2所制备的标准物质进行核酸提取，将提取的核酸进行10倍梯度稀释用于绘制 RT-qPCR标准曲线，标准曲线为:y＝37.24-3.255x，标准曲线的R2值为0.995，扩增效率为102.9％，根据所设计引物和探针建立的RT-qPCR方法线性关系较好。猪瘟病毒RT-qPCR方法扩增曲线见附图2，扩增标准曲线见附图3。
3.猪瘟病毒数字PCR方法条件的建立
1)主要仪器及试剂
QX200微滴式数字PCR仪由伯乐公司生产，伯乐CFX96荧光PCR仪、核酸自动提取仪由天隆公司生产。磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒购自西安天隆科技有限公司，One-StepRT-ddPCR Kit for Probes、2×ddPCR supermix for Probes 购自伯乐公司，
Figure BDA0002216000050000091
Probe 1-step RT-qPCR System、AMV购自TAKARA公司，SuperScriptTM III Enzyme Mix、引物探针由英潍捷基有限公司合成。
2)病毒核酸的提取
使用磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒对猪瘟病毒C株的核酸进行提取。
3)微滴式数字PCR反应的优化
微滴式数字PCR反应包括四个步骤：反应体系配制、微滴生成、PCR扩增、微滴读取。本研究建立的猪瘟病毒C株微滴式数字PCR的反应体系及反应程序如表和表。通过比较数字PCR的微滴生成数，微滴分布状态、微滴荧光信号的强度等来确定优化的结果。条件优化过程中，摸索了退火温度、引物浓度、探针浓度、反转录温度。
①退火温度优化
将退火温度分别设置为50℃，52℃，55℃，60℃，62℃；反应体系： Supermix 5.0μL，Reverse transcriptase 2.0μL，300mM DTT 1μL，10μM引物1.8 μL，10μM探针0.5μL，水7.5μL，模板2.2μL。反应条件：42℃60min；95℃ 10min；95℃30s，50-65℃1min，40个循环；98℃10min；4℃60min。升降温速率2℃/s。实验结果表明，当退火温度设置在60℃时，信号强度有所下降，拷贝数降低。因此，将退火温度定为55℃。退火温度优化结果见附图4。
②引物和探针浓度优化
用磁珠法自动提取试剂提取猪瘟灭活病毒液核酸，梯度稀释5-4为体系摸索优化的模板，ddPCR实验体系的配制见表1，其中第一组引物和探针浓度分别为 600nM、150nM；第二组引物和探针浓度分别为900nM、250nM；第三组引物和探针浓度分别为1200nM、350nM。
表1.ddPCR实验体系的配制
Figure BDA0002216000050000092
反应程序：45℃15min；95℃2min；95℃15s，55℃45s，40个循环； 98℃10min；12℃60min。升降温速率2℃/s。结果见表2：三组的RSD值均小于5％，但是第一组，第三组，拷贝数明显低于第二组，因此，引物浓度定为第二组900nM，探针浓度250nM。
表2.不同引物和探针浓度扩增拷贝数分析
Figure BDA0002216000050000102
4)猪瘟病毒数字PCR方法的线性关系及最低检测限的测定
提取猪瘟病毒C株核酸，进行10倍倍比稀释，分别稀释至10-0，10-1，10-2， 10-3，10-4，每个浓度进行3次重复检测，按照优化后反应体系和反应程序进行微滴式数字PCR试验。实验结果表明，当检测浓度低到10拷贝以下时能稳定检出且CV值为5.1％小于25％，当检测浓度低到1copy/μL时，也能稳定性检测出，且CV值为25.5％接近25％。最终确定该方法最低检测下限为3copies/μL。倍比稀释样本检测结果如表3。
表3.10倍倍比稀释样本检测结果
检测1 检测2 检测3 平均 标准差 CV％
3040.00 3110.00 3070.00 3073.30 28.67 0.93％
289.00 310.00 303.00 300.70 8.73 2.90％
32.40 28.90 31.30 30.90 1.46 4.73％
3.40 3.00 3.20 3.20 0.16 5.10％
0.34 0.20 0.21 0.30 0.06 25.51％
通过梯度稀释建立线性图谱，如附图5，计算出R2＝0.9999>0.99,线性关系良好。
4.猪瘟病毒数字PCR方法的特异性试验
用本发明建立的微滴式数字PCR方法对几种常见猪病病毒进行特异性试验，包括猪瘟病毒C株(CSFV C)、猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲变异株(PRRSV JXA1)、猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株(PRRSV LV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)。结果见表4，除了CSFV C株出现特异性扩增，其他检测均为阴性，说明该方法特异性较好。
表4.CSFV特异性检测
病毒名称 缩写 检测结果
猪瘟病毒C株 CSFV C 阳性
猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲变异株 PRRSV JXA1 阴性
猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株 PRRSV LV 阴性
猪圆环病毒2型 PCV2 阴性
猪伪狂犬病毒 PRV 阴性
猪细小病毒 PPV 阴性
猪流行性腹泻病毒 PEDV 阴性
猪传染性胃肠炎病毒 TGEV 阴性
5.猪瘟病毒数字PCR方法的重复性试验
选取猪瘟病毒C株样品进行微滴式数字PCR试验，重复测定10次，并计算标准偏差(SD)及变异系数(CV％)，实验结果表明，变异系数为2.4％，说明本发明建立的数字PCR方法重复性好，检测结果稳定、可靠，结果见表5。
表5.批内重复性试验
Figure BDA0002216000050000111
Figure BDA0002216000050000121
实施例4猪瘟病毒核酸标准物质的分装
在一万级工作区内的Ⅱ级生物安全柜内进行。分装瓶为棕色10mL玻璃瓶，经过高压灭菌，分装前填充氮气，分装量每管500mg/瓶。将实施例2制备的标准物质分装完毕后加橡胶软盖密封，最后加铝盖加固密封。最后置于(-20±2)℃环境中保存。
取样送检。合格后方可进入下道工序。在十万级车间内进行。成品按照说明书进行组装，完毕后(-20±2)℃环境中保存，避免反复冻融。
实施例5猪瘟病毒核酸标准物质的检验
1.猪瘟病毒核酸标准物质物理性状检验
猪瘟病毒核酸标准物质呈白色均一粉末状。
2.猪瘟病毒核酸标准物质灭活检验
将猪瘟病毒核酸标准物质100mg用1mL无核酸酶水溶解，吸取200uL接种于培养好的PK-15细胞，每天观察细胞病变，连续观察3-7d，无论有无细胞病变，一律将培养物收获，冻融后再进行传代，每个样品至少盲传三代，盲传三代后，观察各代次细胞均无细胞病变，说明标准物质已经灭活。
3.猪瘟病毒核酸标准物质支原体检验
利用支原体培养方式检测是否存在支原体污染。检测结果记录如表6，支原体检验为阴性。
表6.支原体检测结果记录
Figure BDA0002216000050000131
4.猪瘟病毒核酸标准物质其他病毒检验试验
将CSFV标准物质100mg用1mL无核酸酶水溶解后，取200μL进行核酸提取，并采用其它病毒的商品化荧光定量检测试剂盒进行猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲变异株(PRRSVJXA1)、猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株(PRRSV LV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的核酸检测，检测方法依据每种试剂盒的说明书进行。结果见表7，以上病毒均不产生“S”型扩增曲线，表明猪瘟病毒核酸标准物质无其他病毒感染。
表7.猪瘟病毒核酸标准物质其他病毒检验
Figure BDA0002216000050000161
实施例6猪瘟病毒核酸标准物质的评估
1.均匀性评估
1)先将实施例4制备的样品顺序编码，采用随机数表决定抽取15瓶样品的号码，作3次重复测定。
重复测定1：
90-70-91-43-61-13-59-54-3-15-69-36-11-48-38
重复测定2：
13-59-48-38-70-90-43-3-61-15-36-91-54-11-69
重复测定3：
36-43-3-90-70-48-38-11-13-59-91-61-15-54-69
2)每次每瓶样品取100mg，1mL无核酸酶水溶解后，使用全自动核酸提取仪提取样品核酸。
3)使用实施例3建立的猪瘟病毒RT-ddPCR方法进行检测。
4)计算15瓶猪瘟核酸标准物质检测3次的结果均值，采用单因素方差分析法 (F检验)对猪瘟核酸标准物质进行均匀性检验。
上述步骤4)中所述使用单因素方差分析方法即：
Figure BDA0002216000050000179
Figure BDA00022160000500001710
.
.
.
设：
Figure BDA0002216000050000171
Figure BDA0002216000050000172
组间差方和：
Figure BDA0002216000050000173
组内差方和：
Figure BDA0002216000050000174
组间自由度：v1＝m-1
组内自由度：v2＝N-m
组间方差为：
Figure BDA0002216000050000175
组内方差为：
Figure BDA0002216000050000176
作统计量F：
Figure BDA0002216000050000177
由此可见，该统计量是自由度(v1,v2)的F分布变量。
5)根据自由度(v1,v2)及给定的显著性水平α，可由F表查的临界的Fα值。若按公式算得的F值满足F<Fα，则认为数据组间无明显差异。样品是均匀的，若F≥Fα，则怀疑各组件有系统差异，即样品之间存在差异。
式中：
Figure BDA0002216000050000178
-------------------为总平均值
Q1------------------组间差方和
Q2-----------------组内差方和
v1-------------------组间自由度
v2-------------------组内自由度
s1 2-------------------组间方差
s2 2-------------------组内方差
瓶间均匀性标准偏差sbb可以用公式计算：
Figure 1
在这种情况下，sbb等同于瓶间不均匀性导致的不确定度分量ubb
ubb＝sbb
式中：
sbb--------------瓶间标准偏差
n----------------组内测量次数
ubb--------------瓶间不均匀性导致的不确定度分量
如果均匀性评估的测量方法重复性较差，有可能导致
Figure BDA0002216000050000182
时，或者当估计得到的瓶间标，准偏差sbb小于重复性标准偏差sr对sbb的影响不能采用公式
Figure BDA0002216000050000183
时。这时，重复性方差对sbb的影响可以用公式
Figure BDA0002216000050000184
式中：
Figure BDA0002216000050000185
的自由度
根据猪瘟病毒核酸标准物质均匀性评估测量数值(表8)及所测样品的平均值、方差和测量次数(表9)进行单因素方差分析(表10)。
表8.CSFV的标准物质均匀性评估的测量数据(copies/mg)
Figure BDA0002216000050000186
表9.样品的平均值、差方和测量次数(copies/mg)
Figure BDA0002216000050000192
表10.方差分析
Figure BDA0002216000050000193
根据自由度(v1,v2)及给定的显著性水平α，可由表8查临界值的F值算得 F<Fα(F(0.05,14,30)＝2.04)，说明组内与组间无统计学差异，因此本发明制得的猪瘟病毒核酸标准物质是均匀的。
2.稳定性评估
1)短期稳定性评估(即样品运输过程中的稳定性)
随机抽取3瓶实施例4制备的猪瘟病毒核酸标准物质，分别置于4℃、25℃、60℃保存1周、2周、4周，如表11安排实验计划。使用全自动核酸提取仪提取样品核酸。使用实施例3建立的猪瘟病毒RT-ddPCR方法进行检测，每瓶样品做3个重复检测。根据抽样方法和检测次数，使用T检验对猪瘟病毒核酸标准物质进行短期稳定性评估。
表11.实验计划表
Figure BDA0002216000050000201
注：4℃同步稳定性考察，即将样品定期(满足稳定性考察取样数量)保存在-80℃环境下，最后将所有取出的样本在重复性条件下完成测试。样品放置数量应足够检测至实验计划表时间或更长时间。25℃、 60℃稳定性实验采用定时间检测观测结果。
1-1)4℃短期稳定性考察结果
猪瘟病毒核酸标准物质4℃短期稳定性检测结果见表12。
表12.CSFV 4℃标准物质的拷贝数表(copies/mg)
Figure BDA0002216000050000202
Figure BDA0002216000050000211
Figure BDA0002216000050000212
Figure BDA0002216000050000213
Figure BDA0002216000050000214
Figure BDA0002216000050000215
T(0.95,2)*s(β1)＝4.3*5.43E+01＝8.81E+02
结果与分析：对CSFV标准物质的4℃贮存条件下稳定性结果进行分析，结果小于T(0.95,2)*，故认为斜率无显著差异，未观测到不稳定性，能满足实际测量的需要。可认为本标准物质在4℃环境下可稳定4周。
1-2)25℃短期稳定性考察结果
猪瘟病毒核酸标准物质25℃短期稳定性检测结果见表13，配对T检验结果见表14。
表13.CSFV 25℃标准物质的拷贝数表(copies/mg)
Figure BDA0002216000050000216
表14.CSFV标准物质25℃短期稳定性配对T检验结果
由表14可知，CSFV标准物质在25℃环境下存放1-2周与存放在-80℃环境中的检测结果分别进行了T检验统计分析，其中，存放7天时P值大于>0.05，因此认为CSFV标准物质在25℃环境下存放1周的检测值与对照组标准物质的检测值不存在显著性差异，可认为本标准物质在25℃环境下可稳定1周。另外存放14天时P值小于0.05，因此认为CSFV标准物质在25℃环境下存放2周的检测值与对照组标准物质的检测值存在显著性差异，可认为本标准物质在25℃环境下不能稳定2周。
1-3)60℃短期稳定性考察结果
猪瘟病毒核酸标准物质60℃短期稳定性检测结果见表15，配对T检验结果见表16。
表15.CSFV 60℃标准物质的拷贝数表(copies/mg)
表16.CSFV标准物质60℃短期稳定性配对T检验结果
Figure BDA0002216000050000222
由表16可知，CSFV标准物质在60℃环境下存放7天与存放在-80℃环境中的检测结果进行了T检验统计分析，其中P值均小于0.05，因此认为CSFV 标准物质在60℃环境下存放1周的检测值与对照组标准物质的检测值存在显著性差异，可认为本标准物质不能置于60℃环境下。
综上所述，CSFV标准物质在4℃环境可稳定4周，在25℃环境可稳定7 天。但考虑到运输条件等因素对标准物质稳定性的影响，因此本标准物质在4℃环境可稳定4周，建议冷链运输。
2)长期稳定性评估(即特定贮存条件下的稳定性)
随机抽取3瓶的猪瘟病毒核酸标准物质，分别置于-20℃保存1，2，4，6，8， 11个月。使用全自动核酸提取仪提取样品核酸，使用实施例3建立的猪瘟病毒 RT-ddPCR方法进行检测，每瓶样品做3个重复检测，根据抽样方法和检测次数，使用T检验对猪瘟病毒核酸标准物质进行长期稳定性评估。结果见表17。
表17.CSFV-20℃标准物质的拷贝数表(copies/mg)
Figure BDA0002216000050000231
根据数据所得：
Figure BDA0002216000050000232
Figure BDA0002216000050000233
T(0.95,5)查表得：2.57。
T(0.95,3)*＝4.82E+03
结果与分析：对CSFV标准物质的-20℃贮存条件下稳定性结果进行分析，结果小于T(0.95,5)*，故认为斜率无显著差异，未观测到不稳定性，能满足实际测量的需要。可认为本标准物质在-20℃环境下可稳定11个月。
实施例7猪瘟病毒核酸标准物质的定值
将实施例4中得到的均匀性高且稳定的猪瘟病毒核酸标准物质进行定值，定值表示为标准值±扩展不确定度。选择具有一定技术权威性，在测定标准物质特性量方面具有必备条件以及同等的技术能力和经验的8家实验室各自独立使用数字PCR方法对标准物质的特性值进行测量。
1.猪瘟病毒核酸标准物质的标准值
1)标准物质特征值测量
选择具备资质的8家实验室，编号依次为：A—H，8家实验室各自独立使用数字PCR方法对实施例4制备的4瓶均匀性高且稳定的猪瘟病毒核酸标准物质进行测量。测量特征值见表18。
2)实验室内数据可疑值检验
用狄克逊法和格拉布斯法分别检验8家实验室的8组数据的可疑值，结合技术上的判断，剔除可疑值。
表18.CSFV核酸标准物质合作定值试验数据汇总(copies/mg)
Figure BDA0002216000050000241
其中狄克逊法：将测定数据按从小到大的顺序排列，分别计算r1值和rn值， r1＝(X(2)-X(1))/(X(n)-X(1))，rn＝(X(n)-X(n-1))/(X(n)-X(1))。若r1>rn，且r1>f(a,n)，则判定X(1)为异常值；若r1<rn且rn>f(a,n)，则判定X(n)为异常值；若r1和rn值均小于f(a,n)，则所有数据保留，结果见表19。
表19.狄克逊法对每个操作者的数据处理及结论
Figure BDA0002216000050000242
Figure BDA0002216000050000251
格拉布斯法中，残差
Figure BDA0002216000050000252
当|vi|>λ(a,n)*s时，则xi应被踢除。本次联合定值中实验室内NDV的所有数据均保留，结果见表20。
表20.格拉布斯法对每个操作者的数据处理及结论
Figure BDA0002216000050000253
3)组间数据等精度检验
对各组数据的标准偏差用科克伦法进行等精度检验，对有显著性差异的数据组在进行技术审查后再决定是否予以剔除。
采用科克伦法检验平均值间是否等精度，先计算m组数据的各组n个数据的方差，再计算其中的最大方差与m个方差和之比：
Figure BDA0002216000050000254
根据所取显著性性水平α，数据组数m，重复测定次数n，查科克伦检验临界值表得到： C(5％,8,8)＝0.3043，计算得C(NDV)＝0.2396，C<C(5％,8,8)，表明各组数据平均值间为等精度。
4)整体数据正态分布检验
本次数据为64个，适合用达戈斯提诺(D’Agostoon)法检验数据的正态性。
根据数据计算Y值为-0.5055，当n＝64，置信概率为95％时，Y值落入区间 (-2.64～1.19)范围内，接受数据为正态分布。
5)猪瘟病毒核酸标准物质标准值计算
根据步骤表18中得到的8个平均值再次计算平均值，得到的总平均值即为猪瘟病毒核酸标准物质标准值。
Figure BDA0002216000050000261
8＝469457copies/mg
2.猪瘟病毒核酸标准物质的扩展不确定度
猪瘟病毒核酸标准物质定值结果的不确定度由均匀性引入的不确定度、稳定性引入的不确定度以及定值过程带来的不确定度。
1)均匀性引入的不确定度的评定
均匀性引入的不确定度由实施例6步骤1中计算得出均匀性引入的不确定度 ubb＝sbb＝1.08E+04copies/mg，相对标准不确定度urel(bb)为0.024。
2)稳定性引入的不确定度的评定
稳定性的不确定度贡献由实施例6步骤2中数据及结合采用公式： us＝s(β1)·X计算。此标准物质存储在-20℃条件下11个月的长期稳定性的不确定 度为：
us＝2.06E+04copies/mg
相对标准不确定度urel(s)＝0.044
3)定值过程引入的不确定度的评定
定值过程引入的不确定度包括不确定度的A类评定u(A)和不确定度的B类评定u(B)。
由定值测量重复性引入的不确定度u(A)可由测量的相对标准偏差计算。
Figure BDA0002216000050000271
u(A)＝1.49+04copies/mg
Figure BDA0002216000050000272
相对标准不确定度urel(A)＝0.032
B类评定包含两部分：一部分是天平称量引入的不确定度，一部分是检测仪器引入的不确定度。其中检测仪器包括移液器和数字PCR。
3-1)天平不确定度的评定
天平不确定度是参考本次所用的电子天平，型号为：ML104/02，制造厂： METTLER，其校准证书编号为：JA18J-AD000347。其计量性能要求，MPE：±0.5mg；试验载荷：0.0100g；其不确定度U＝0.5(mg)。需称量的重量为100mg，计算其不确定度
Figure BDA0002216000050000273
3-2)移液器不确定度的评定
在联合定值过程中，第一步用100-1000μL的移液器取200μL的洗脱液将核酸洗脱到离心管中(移液器相对不确定度2％)并使RNA溶液混合均匀。第二步稀释是用10-100μL的移液器取100μL的RNA溶液到离心管中(移液器相对不确定度2％)，然后用100-1000μL的移液器吸取900μLddH2O(移液器相对不确定度1％)与RNA 溶液混合均匀，将溶液体积定到1000μL，实现10倍的稀释。计算梯度稀释RNA 标准溶液引入的不确定度，稀释标准溶液的合成相对标准不确定度uc(C)为：
Figure BDA0002216000050000274
式中：
vr(V1)-吸取的核酸洗脱液体积200μL的相对不确定度
vr(V2)-吸取的核酸样品溶液体积100μL的相对不确定度
vr(V3)-吸取的ddH2O体积的相对不确定度(900μL，进行10倍稀释)
用100-1000μL移液器移取200μL溶液的相对不确定度：
V1的相对标准不确定度：
式中：2％是用移液器移取200μL水的相对不确定度；Δv代表不同温度下溶液体积的变化，0.0008为不同温度下溶液体积的补正值。
用10-100μL移液器移取100μL溶液的相对不确定度：
V2的相对标准不确定度：
Figure BDA0002216000050000282
式中：2％是用移液器移取100μL原液的相对不确定度；Δv代表不同温度下溶液体积的变化，0.0008为不同温度下溶液体积的补正值。
用10-1000μL移液器移取900μL水的相对不确定度：
式中：1％是用移液器移取900μL水的相对不确定度；Δv代表不同温度下溶液体积的变化，0.0008为不同温度下溶液体积的补正值。
因此，合成相对不确定度：
梯度稀释RNA标准溶液引入的不确定度为：
Figure BDA0002216000050000284
3-3)数字PCR仪不确定度的评定
本试验中使用了QX100、QX200和QuantStudio 3D三种型号的数字PCR仪，由于后两种仪器为最新型号仪器，故尚无不确定度方面的相关资料报道，故本试验中统一使用QX100的相对不确定度为本试验的B类相对不确定度。
根据数字PCR仪器测量过程中产生的相对不确定度由两部分组成：精确性引入的相对标准不确定度为1.6％和微滴体积引入的相对标准不确定度为0.8％。因此，由数字PCR仪引起B类相对不确定度为：
Figure BDA0002216000050000285
3-4)核酸回收率的不确定度的评定
对整个联合定值的过程进行核酸回收率带来的不确定度进行评定。
样品：PRRSV-JAX1国家二级标准标准物质，其编号为GBW(E)090929，量值为【标准值±不确定度(1.13±0.18)×104copies/ul】；内标(人工合成的RNA 片段)。
主要仪器：YOSE-S32天根，QX200伯乐。
试剂：病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒，货号：DP315(天根生化科技北京有限公司)。One-Step RT-ddPCR Kit for Probes。
方法：将内标物和PRRSV-JAX1按1：1混合后提取的核酸进行检测，内标拷贝数为A，未经提取的即直接检测内标物的拷贝数为B；两倍的A比上B为核酸回收率率用C标记，即：C＝2×A/B。做6个重复。结果见表21。
表21.核酸回收率结果
由以上实验数据可知：核酸回收率带来的不确定度为u回收＝0.012。
3-5)合成B类不确定度
合成B类不确定度：
Figure BDA0002216000050000292
4)合成定值过程中引入的相对确定度
标准物质定值过程中引入的相对不确定度为：
Figure BDA0002216000050000293
3.猪瘟病毒核酸标准物质的量值和扩展不确定度
猪瘟病毒核酸标准物质的量值和扩展不确定度计算结果见表22。
表22.CSFV标准物质量值和扩展不确定度
Figure BDA0002216000050000301
4.猪瘟病毒核酸标准物质量值结果
研制的CSFV标准物质，由有一定资质的8家实验室各自独立使用数字PCR 方法对标准物质的特性值进行测量。把8家实验室的检测结果计算出均值，并计算扩展不确定度，最后得到本标准物质的认定值为4.7×105copies/mg除以核酸回收率92％等于5.1×105copies/mg，扩展不确定度为0.7×105copies/mg，结果见表23。
表23.CSFV标准物质量值结果
Figure BDA0002216000050000302
序 列 表
<110> 北京市动物疫病预防控制中心
<120> 一种冻干型猪瘟病毒核酸标准物质的制备方法及其检测方法
<130> 8.15
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtcagtagtt cgacgtgagc a 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agcaccctat caggtcgtac 20
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgcccaaga cacaccttaa ccctrgc 27
<210> 4
<211> 137
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtcagtagtt cgacgtgagc agaagcccac ctcgagatgc tacgtggacg agggcatgcc 60
aagacacacc ttaaccctag cgggggtcgc tagggtgaaa tcacaccacg tgatgggagt 120
acgacctgat agggcgc 137

Claims (10)

1.一种猪瘟病毒核酸标准物质的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)猪瘟病毒液的制备；
(2)取步骤(1)制备的病毒液热灭活，得到灭活的病毒液；
(3)取步骤(2)得到的灭活病毒液和保护剂混合，冻干，获得猪瘟病毒核酸标准物质。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述热灭活为56℃处理4h。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述保护剂含有明胶和蔗糖。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述保护剂为含有质量分数为5％的明胶和25％的蔗糖的水溶液，使用前需灭菌。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述“将灭活的病毒液和保护剂混合”为1体积份灭活的病毒液和1体积份保护剂混合。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述冻干的参数为：-10℃～-40℃冷冻干燥4h～10h。
7.如权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对猪瘟病毒核酸标准物质进行病毒灭活检验和/或支原体检验和/或其他病毒检验。
8.如权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：将步骤(3)得到的猪瘟核酸标准物质进行均匀性评估和/或稳定性评估。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述均匀性评估的步骤为：将步骤(3)得到的猪瘟病毒核酸标准物质进行抽样，对样品提取核酸，并使用数字PCR方法进行检测，结果进行均匀性评估。
所述稳定性评估包括短期稳定性评估和长期稳定性评估，所述短期稳定性评估的抽样方法可为：将核酸标准物质在4℃、25℃或60℃保存1周，2周或4周，每种条件下随机抽取不少于2瓶的猪瘟病毒核酸标准物质，每个样品检测次数不少于1次；
所述长期稳定性评估的抽样方法可为：将核酸标准物质在-20℃保存N1个月、N2个月、N3个月、N4个月或N5个月(N1-N5均为自然数且0≤N1-N5≤14)，抽取不少于2瓶猪瘟病毒核酸标准物质，每个样品检测次数不少于1次；
所述数字PCR方法采用的引物对如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，探针如SEQ IDNO.3所示，扩增体系采用的引物对浓度各900nM，探针250nM；扩增程序为45℃15min；95℃2min；95℃15s，55℃45s，40个循环；98℃10min；12℃60min。
10.如权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于：所述方法还包括将猪瘟病毒核酸标准物质进行定值；所述定值表示为标准值±不确定度；由若干个独立实验室使用数字PCR方法分别检测2个以上均匀且稳定的猪瘟病毒核酸标准物质，得到特征值；然后对各个特征值进行统计处理，确定标准值；使用统计学方法计算不确定度，包括均匀性评估中引起的不确定度、稳定性评估中引起的不确定度和定值中引起的不确定度。
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