CN111286491A - 猪塞内卡病毒核酸标准物及其应用 - Google Patents

猪塞内卡病毒核酸标准物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及猪塞内卡病毒核酸标准物及其应用，属于病毒标准物质制备技术领域。本发明以保藏编号为CCTCC NO:V201767的塞内卡病毒株经过连续传代和驯化，获得了一株病毒含量高的SVA毒株，命名为SVA YRQ/2016，保藏编号为CCTCC NO:V202013。该SVA毒株的每毫升病毒含量≥1012.5TCID50，将其制备猪塞内卡病毒液，灭活、添加稳定剂和保护剂后，通过均匀性评估、稳定性评估和定值，得到猪塞内卡病毒核酸标准物，该标准物定值准确，具有可溯源性，稳定性和均匀性良好，可用于SVA病原微生物核酸检测，以及检验检测机构评价和控制测试方法，质量控制，质量仲裁，应用价值巨大。

Description

猪塞内卡病毒核酸标准物及其应用
技术领域
本发明涉及病毒标准品制备技术领域，具体涉及猪塞内卡病毒核酸标准物及其应用。
背景技术
猪塞内卡病毒病是由塞内卡病毒A(Senecavirus A，SVA)引起的一种猪的传染性疾病，可引起仔猪、育肥猪、经产母猪和公猪鼻、唇部、蹄部、腹部、背部等部位出现水泡、脓包、溃疡等，并伴有跛行、站立困难，病猪死亡率可达30％-70％，并且引起发病猪生产性能大幅下降。对SVA的有效检测是防制猪塞内卡病毒病的基础，而SVA的准确检测有赖于优质的SVA标准物质。目前，国内外尚无机构或企业生产SVA 相关的标准物质，为了保证检测结果的准确性、可比性和溯源性，SVA 标准物质的研制极具现实意义。
目前国际上医学及生物学检测标准物质约有一千余种，其中能溯源至SI单位的一级标准物质和高准确度基质标准物质多数由美国国家标准和技术研究所(NIST)、德国临床化学会(DGKC)和欧共体参考物质与测量研究所(IRMM)建立和保持。国际上也有一些大学、医院、研究机构和生产厂家的专业实验室建立了自己的参考测量过程，多年从事标准测量工作，达到了很高的计量学水平。不能溯源至SI单位的参考物质主要来自世界卫生组织(WHO)、国际临床化学联合会(IFCC)等有关国际组织。目前，我国已研制出国家一级标准物质1200多种，二级标准物质1700多种，涉及钢铁、地质、石油、核材料、环境、食品以及临床检验等领域，这些标准物质在生产质量控制、维护市场秩序、促进科技进步中发挥了重要的作用。但是，在生物医学检测领域，特别是对于动物病原微生物的标准物质研究相当滞后。发达国家对重要动物疫病控制进行了长期研究，逐渐统一了重大动物疫病预防疫苗、诊断制剂和试验技术的评价方法，建立了相关的标准物质。我国动物病原微生物检测标准物质的研究尚处于起步阶段，仅有针对少数几种病原的标准血清、标准抗原和菌毒种标准物质。检测标准物质是验证检测方法、检测试剂是否可靠的关键，也是实验室质量认证体系的重要因素，因此检测标准物质的使用可为精准化疫病防控提供技术保障。
目前针对猪塞内卡的检测试剂盒研究是百花齐放，兽医检测实验室在选择方面偏重于血清检测试剂盒以进口为主，核酸检测试剂盒以国产为主，但是，国内针对这些检测方法的标准物质却十分匮乏，各级检测机构缺少核酸标准物质。尽管各有关科研单位或多或少拥有一部分类似材料，但往往其来源背景不清、制备工艺不完善、没有经过标定，因此，必须通过系统的研究、检验和标定，并制定相应的技术规程和质量标准，才能达到标准物质的基本要求。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种靶值定值准确，具有可溯源性、稳定性和均匀性良好的猪塞内卡病毒标准物质，以满足科研、临床使用。
本发明的第二个目的是提供一种猪塞内卡病毒标准物质的制备方法。
本发明的第三个目的是提供上述猪塞内卡病毒标准物质在猪塞内卡病毒检测中作为标准物质的应用。
猪塞内卡病毒的不同毒株之间抗原差异不大。但猪塞内卡病毒存在多个基因型，申请人采集了具有典型症状的32份病料进行猪塞内卡病毒的分离，对分离到的病毒进行全基因组测序，并与GenBank中已公布的 SVA毒株进行对比，核苷酸同源性分析表明分离的SVA毒株全基因组核苷酸序列与GenBank中已公布的SVA毒株核苷酸同源性高达98.5％，命名为SVA-HeNXX/swine/2017株。申请人将其在BHK21细胞上连续传代，并进行蚀斑克隆纯化，筛选出一株病毒含量高、免疫原性好的病毒，命名为SVA-YRQ/2016，该病毒株于2020年1月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，中国典型培养物保藏中心，邮编430072)，保藏编号为CCTCC NO:V202013。随后申请人对该病毒建立了种子批，并按照《中国人民共和国农业部公告第683号》要求进行鉴定，各项检验均符合标准，可以用于核酸标准物质。
第一方面，本申请首先提供一种猪塞内卡病毒毒株，其为SVA YRQ/2016，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V202013。
本发明提供了上述猪塞内卡病毒毒株的以下任一种应用，
(1)制备猪塞内卡病毒核酸标准物；
(2)制备疫苗；
(3)制备诊断试剂。
第二方面，本发明提供一种猪塞内卡病毒核酸标准物，该标准物含有本发明所述的塞内卡病毒毒株(保藏编号为CCTCC NO:V202013)的核酸。
本发明提供的猪塞内卡病毒核酸标准物，其定量值为(1.7±0.3)×104 copies/μl。
本发明提供了含有所述的猪塞内卡病毒核酸标准物的检测试剂盒。
第三方面，本发明提供了猪塞内卡病毒核酸标准物的制备方法，通过以下方法制备得到：利用保藏编号为CCTCC NO:V202013的猪塞内卡病毒毒株制备猪塞内卡病毒毒株的病毒液，将所述病毒液灭活，添加稳定剂和保护剂。
本发明标准物的制备方法，还包括对猪塞内卡病毒核酸标准物进行病毒灭活检验、支原体检验、和/或病毒检验。
所述病毒灭活检验可食用细胞病变检验。所述支原体检验可使用支原体检测试剂盒。所述病毒检验可使用荧光PCR检测试剂盒。
进一步地，本发明的制备方法还包括对猪塞内卡病毒核酸标准物进行均匀性检测、稳定性检测，进行定值和不确定度评估。
本发明的制备方法中，所述均匀性检测是分别随机抽取冻干的猪塞内卡病毒核酸标准物上、中、下不同部位6个以上的取样，每个样品采用数字PCR的方法检测，3次，得到差异性在正常范围内的标准物质进行混匀分装，然后对各个单元的标准物质进行采用数字PCR方法进行定值，确定标准值。
本发明实施例数字PCR所用的引物和探针的序列分别是：上游引物 F：5’-TGCACCCCTTCGCTGACTACGGT-3′；下游引物R：5’ -GAGTTCTCCCAGAATCGCCG-3；探针P：5’ -FAM-GCCTTGTTCGACTGACCTGG-MGB-3。
所述均匀性检测可根据抽样方法和检测次数，使用单因素方差分析方法进行均匀性检测。
所述的稳定性检测是对猪塞内卡病毒核酸标准物质进行抽样，对样品提取核酸，并使用数字PCR方法进行检测，计算平均值，进行稳定性评估。所述稳定性评估可为根据抽样方法和检测次数，使用回归或T检验进行稳定性评估。
将均匀性高且稳定的猪塞内卡病毒核酸标准物质进行定值；定值表示为标准值±扩展不确定度。
由若干个独立实验室使用数字PCR方法分别检测2个以上均匀且稳定的猪塞内卡病毒病毒核酸标准物质，得到特征值；然后对各个特征值进行统计处理，确定标准值；使用统计学方法计算扩展不确定度，包括均匀性评估中引起的不确定度、稳定性评估中引起的不确定度和定值中引起的不确定度。多个实验室合作定值，参与实验室的最小数目通常为6-8个。当采用同一种方法时，独立定值组数一般不少于8个。统计处理时，需有4-6次独立重复的测量数据。
第四方面，本发明提供了本发明制得的猪塞内卡病毒核酸标准物、或上述制备方法制得的猪塞内卡病毒核酸标准物在猪塞内卡病毒检测、疫苗质控控制、含有猪塞内卡病毒的生物制品质量检定中的应用。
本发明提供的猪塞内卡病毒核酸标准物质用绝对定量方法，通过8 家实验室联合标定，确定该标准物靶值定值准确，具有可溯源性，且稳定性和均匀性良好，能够完全满足动物及动物产品质量安全检测领域对标准物质的需求。同时，克服全国各级检测体系因检测结果不一致、不稳定而影响实验室结果判定的问题，有效保障猪塞内卡防治措施的顺利开展。本发明通过猪塞内卡病毒核酸检测标准物质的研制，为兽医实验室开展量值溯源、能力验证、质量控制、方法评价、试剂选择等工作提供技术支撑，提升动物及其产品的质量安全检测能力，是国家中长期动物疫病防治规划有效实施的技术保障。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别说明，本发明实施例所用的生物材料、化学试剂均为市售可得。
本发明所述的塞内卡谷病毒SVV-HeNXX/swine/2017保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:V201767，已公开于中国专利CN109182278A中。
MEM培养基：BHK21细胞的推荐生长培养基。购自武汉博士德生物工程有限公司。物理外观检测合格，试剂名称正确、批号、规格、生产日期明确，液态。4℃避光贮存。
胎牛血清：选择原则是用于能够配制细胞生长液和维持液，为细胞生长提供营养物质。胎牛血清购自Sera公司。物理外观检测合格，试剂名称正确、批号、规格、生产日期、效期明确，液体；经PCR检测无 SVA病毒。-20℃贮存。配制：胎牛血清平衡至室温后，于56℃水浴中灭活30min，然后用15mL已灭菌的离心管分装成10mL每管，于-20℃保存。
EDTA-胰酶消化液：选择原则是能够消化细胞，用于细胞传代，将贴壁细胞消化成单个细胞。购自索莱宝公司公司。物理外观检测合格。配制：将EDTA-胰酶消化液用15mL已灭菌离心管分装成10mL每管，-20℃保存备用。
PBS：PBS购自gibco公司。物理外观检测合格，粉末，18～25℃贮存。配制：在无菌环境中将PBS用50mL已灭菌离心管分装成40mL每管，于4℃保存备用。
本申请文件中所述的数字PCR方法，所用的引物和探针的序列分别是：上游引物F：5’-TGCACCCCTTCGCTGACTACGGT-3′；下游引物R： 5’-GAGTTCTCCCAGAATCGCCG-3；探针P：5’ -FAM-GCCTTGTTCGACTGACCTGG-MGB-3。
实施例1病毒含量高的猪塞内卡病毒株的获得
1、毒种来源制造本品用毒种为塞尼卡谷病毒 SVV-HeNXX/swine/2017株【由于塞尼卡谷病毒(Senecavalley virus,SVV) 也称为塞内卡病毒A(SenecavirusA,SVA)，故本申请中SVV与SVA均指代相同的病毒】；效检用毒种为S-SVV株，均由河南省动物疫病预防控制中心分离、鉴定、保管和供应。
2、细胞制备从工作细胞库中取出冻存的BHK21细胞，置37℃水浴中解冻，1000r/min离心15分钟，弃掉上清，用无血清全悬浮培养基重悬后，接种生物反应器中，设置温度为37℃、pH值7.2、溶氧50％、搅拌转速为100r/min、灌流速度为60r/min，培养24～72小时。
3、病毒培养及收获将生物反应器中已长成良好单层的BHK21细胞，按1％(V/V)的比例加入生产种毒塞内卡谷病毒SVV-HeNXX/swine/2017 株，重新设置温度为37℃、pH值7.5、溶氧50％、搅拌转速为100r/min、灌流速度为60r/min的生物反应器中培养，每天观察细胞病变，培养18～ 30小时收获病毒液，置-15℃以下保存。
4、病毒含量用MEM培养基将传至16代～18代的SVA毒种作10 倍系列稀释，取10-9～10-13 5个稀释度，分别接种已长成良好单层的 BHK21细胞96孔细胞培养板，每个稀释度接种8孔，100μl/孔，置37℃作用1小时，弃液，加入含1％新生牛血清的MEM培养基，100μl/孔，同时设正常细胞对照，置37℃、含5％CO2的培养箱中培养3日～4日，逐日观察并记录细胞病变(CPE)，按Reed-Muench法计算TCID50。
本发明在平行传代过程中，偶然得到了病毒含量高达≥1012.5TCID50的毒株(母源毒株SVV-HeNXX/swine/2017株的病毒含量为1010.0TCID50)，实验发现该毒株病毒含量高、免疫原性好，命名为SVA YRQ/2016，重复实验发现SVA YRQ/2016连续传代至40代，病毒含量维持在1012.5TCID50以上不降低。该病毒株于2020年1月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国武汉大学，中国典型培养物保藏中心，邮编430072)，保藏编号为CCTCC NO:V202013。随后对该病毒建立了种子批，并按照《中国人民共和国农业部公告第683号》要求进行鉴定，各项检验均符合标准,其他病毒及支原体检验均为阴性；无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。可以作为核酸标准物质候选物。
采用中国农业科学院兰州兽医研究所提供的口蹄疫与塞尼卡谷病毒直接扩增RT-qPCR抗原鉴别检测试剂盒(批号：20190425433)对上述标准物质候选物(保藏编号为CCTCCNO:V202013)核酸进行比对检测试验，结果呈阳性。
实施例2猪塞内卡病毒核酸标准物的制备
1、病毒液的制备
1.1细胞制备从工作细胞库中取出冻存的BHK21细胞，置37℃水浴中解冻，1000r/min离心15分钟，弃掉上清，用无血清全悬浮培养基重悬后，接种生物反应器中，设置温度为37℃、pH值7.2、溶氧50％、搅拌转速为100r/min、灌流速度为60r/min，培养24小时～72小时。将长满的BHK21细胞用胰酶进行消化，并进行传代，细胞的浓度为 2×105viablecells/mL，置5％CO2培养箱静置培养。
1.2病毒培养及收获将生物反应器中已长成良好单层的BHK21细胞，按1％(V/V)的比例加入保藏编号为CCTCC NO:V202013的生产种毒SVA YRQ/2016，重新设置温度为37℃、pH值7.5、溶氧50％、搅拌转速为100r/min、灌流速度为60r/min的生物反应器中培养，每天观察细胞病变，当80％的细胞出现病变时收获病毒液，置-20℃以下冻融两次后，收获病毒悬浮液。
2、病毒的灭活
将检验合格的SVA YRQ/2016株病毒液中加入终浓度为0.003mol/L 的BEI，30℃以100r/min搅拌灭活28h。灭活后按2％的体积比加入硫代硫酸钠，继续搅拌30min以中和BEI。灭活后的病毒液置2～8℃保存。取1mL灭活后的病毒液置接种至单层宿主细胞，培养后，未出现病毒病变，经PCR定量鉴定，培养后的病毒量没有增加，连续盲传3代，未出现病毒病变，经qPCR定量鉴定无扩增曲线，可认为病毒已灭活。得到猪塞内卡病毒标准物溶液。
3、标准物质的定值
标准物质通过初步定值后，有8家具有资质的实验室对其进行合作定值，定量值为(1.7±0.3)×104copies/μl拷贝/μL。
实施例3猪塞内卡病毒核酸标准物的检验
对实施例2制得的猪塞内卡病毒核酸标准物进行以下检验：
1、物理性质检验
SVA标准物质应呈无色透明液体。
2、病毒灭活检验
取1mL实施例2制得的标准物溶液接种至单层宿主细胞，培养后，未出现病毒病变，经PCR定量鉴定，培养后的病毒量没有增加，连续盲传3代，未出现病毒病变，经qPCR定量鉴定无扩增曲线，可认为病毒已灭活。
3、支原体检验
将SVA标准物质溶解后，利用支原体支原体培养方式检测是否存在支原体污染。检测结果记录如表1，制备的标准物质支原体检验为阴性。
表1 支原体检测结果记录
Figure BDA0002379548280000091
Figure BDA0002379548280000101
4、其他病毒检验
将实施例2制得的SVA标准物质，取200μl进行核酸提取，并进行 FMDV、PRRSV、PCV1、PCV2、PRV、PPV、PEDV和TGEV核酸检测。结果表明，除SVA有扩增片段外，其他均无扩增。结果见表2。
表2 其他病毒检验
病毒名称 缩写 检测结果
猪塞内卡病毒 SVA 阳性
猪口蹄疫病毒 FMDV 阴性
猪繁殖与呼吸综合征病毒 PRRSV 阴性
猪圆环病毒1型 PCV1 阴性
猪圆环病毒2型 PCV2 阴性
猪伪狂犬病毒 PRV 阴性
猪细小病毒 PPV 阴性
猪流行性腹泻病毒 PEDV 阴性
猪传染性胃肠炎病毒 TGEV 阴性
5、均匀性检验
选择实施例2制得的SVA标准物质上中下不同的部位取样6份，每份取样200μl。提取样品基因组RNA，采用数字PCR方法进行PCR扩增。
每份样品分析3次，考察这6份样品SVA基因组含量上的差异。待测样品SVA基因PCR扩增的拷贝数与计算结果如表3所示。检验结果表明，不同部位抽取的SVA核酸含量无显著差异，均匀性良好，将混匀后的样品装入1.5ml螺口EP管中。
表3 待测样品SVA基因PCR扩增的拷贝数与计算结果
Figure BDA0002379548280000111
6、稳定性检验
(1)长期稳定性检验
长期稳定性检验关注的是在特定贮存条件下标准物质的稳定性状况。本验证实验贮存条件为-20±2℃，样品放置数量应足够检测至第6个月或更长时间，检测时间为第1，2，4，6……月，每次抽取3管标准物质，每管样品重复检测3次，用数字PCR进行检测，计算均值，进行长期稳定性分析，实验计划具体见表4。
表4 长期稳定性实验计划表
Figure BDA0002379548280000112
Figure BDA0002379548280000121
注：-20℃稳定性实验采用经典稳定性考察，即在相同的条件下随着时间的延续进行测量。
结果与分析：对SVA标准物质的-20℃贮存条件下稳定性结果进行分析，结果小于T(0.95,5)*S(β1)，故认为斜率无显著差异，未观测到不稳定性，能满足实际测量的需要。可认为本标准物质在-20℃环境下可稳定6个月。
表5 SVA-20℃标准物质的长期稳定性考察
Figure BDA0002379548280000122
Figure BDA0002379548280000131
(2)短期稳定性检验
短期稳定性实验关注的是在特定运输条件下标准物质的稳定性。根据目前我国的运输条件，使用快递运输，货物7天内可以运送到我国主要城市。抽取合适量的标准物质样品，做好标记，分别放入指定环境中，按指定周期进行检验，实验计划具体见表6。
表6 短期稳定实验计划表
检测日期 时间/温度 4℃ 25℃ 60℃ 总数
2019-03-25 0d 3 / / 3
2019-03-26 1d 3 4 4 11
2019-03-28 3d 3 4 / 7
2019-03-31 6d 3 / / 3
2019-04-03 9d 3 / / 3
1)SVA标准物质4℃短期稳定性考察结果
表7 SVA 4℃标准物质的短期稳定性考察
Figure BDA0002379548280000132
Figure BDA0002379548280000141
结果与分析：对SVA标准物质的4℃贮存条件下稳定性结果进行分析，结果小于T(0.95,3)*s(β1)，故认为斜率无显著差异，未观测到不稳定性，能满足实际测量的需要。可认为本发明制得的标准物质在4℃环境下可稳定9天。
2)SVA标准物质25℃短期稳定性考察
表8 SVA标准物质25℃短期稳定性考察
Figure BDA0002379548280000142
Figure BDA0002379548280000151
表9 SVA标准物质25℃短期稳定性配对T检验结果
Figure BDA0002379548280000152
SVA标准物质在25℃环境下存放1-2天与存放在-60℃环境中的检测结果分别进行了T检验统计分析，其中，存放1d时P值大于>0.05，因此认为SVA标准物质在25℃环境下存放1d的检测值与对照组标准物质的检测值不存在显著性差异，可认为本标准物质在25℃环境下可稳定1d。 3)SVA标准物质60℃短期稳定性考察
表10 SVA标准物质60℃短期稳定性考察
Figure BDA0002379548280000153
Figure BDA0002379548280000161
表11 SVA标准物质60℃短期稳定性配对T检验结果
Figure BDA0002379548280000162
SVA标准物质在60℃环境下存放1d与存放在-80℃环境中的检测结果进行了T检验统计分析，其中P值均小于0.05，因此认为SVA标准物质在60℃环境下存放1d的检测值与对照组标准物质的检测值存在显著性差异，可认为本标准物质不能置于60℃环境下。
综上所述，SVA标准物质在4℃环境可稳定9d，在25℃环境可稳定1d。但考虑到运输条件等因素对标准物质稳定性的影响，因此本标准物质在4℃环境可稳定9d，建议冷链运输，运输时间不能超过9d。
实施例4猪塞内卡病毒核酸标准物的定值
1、猪塞内卡病毒核酸标准物的标准值
1.1特性值定值方式
由河南省动物预防控制中心牵头并组织，对SVA标准物质进行了多家实验室合作定值工作。共邀请了8家国内较为权威的核酸定量测量实验室参加此次标准物质合作定值。实验室序号、名称，地点、资质认证类别见表12，其中SVA经8家实验室定值(A、B、C、D、E、F、G、H)。
表12 标准物质合作测试实验室
Figure BDA0002379548280000163
Figure BDA0002379548280000171
参与合作定值实验室均为资质认证(CMA)和/或实验室认可(CNAS) 检测中心。定值过程中，使用的仪器均通过计量部门校准鉴定或者实验室间仪器比对，符合认证认可要求；使用的试剂耗材均进行过性能评价，保障了标准物质合作定值的量值准确、可靠。
1.2特性值联合定值实验结果
表13 SVA核酸标准物质合作定值试验数据汇总
Figure BDA0002379548280000172
注：定值原始结果报告见附件5
1.3定值数据的统计处理
根据我国的国情与国际测试分析先进经验，实验结果的处理主要参考《JJF 1343-2012标准物质定值的通用原则及统计学原理》的要求。对于每一个待测标准物质，一般应有m(≥8)家实验室(组)数据。将SVA 数据整理后，进行下述步骤处理：
(1)实验室内数据可疑值检验
用狄克逊法和格拉布朗法分别检验8家实验室9组数据的可疑值。狄克逊法中，将测定数据按从小到大的顺序排列，分别计算r1值和rn值， r1＝(X(2)-X(1))/(X(n)-X(1))，rn＝(X(n)-X(n-1))/(X(n)-X(1))。若r1>rn，且r1>f(a,n)，则判定X(1)为异常值；若r1<rn且rn>f(a,n)，则判定X(n)为异常值；若r1和rn值均小于f(a,n)，则所有数据保留，结果见表5-5。经狄克逊检验，本次联合定值中实验室内的所有数据无异常，均保留。格拉布斯法中，残差。当> 时，则应被剔除。本次联合定值中实验室内SVA的所有数据均保留，结果见表14。
表14 狄克逊法对每个操作者的数据处理及结论
Figure BDA0002379548280000181
表15 格拉布斯法对每个操作者的数据处理及结论
Figure BDA0002379548280000191
(2)组间数据等精度检验
采用科克伦法检验平均值间是否等精度，先计算m组数据的各组n 个数据的方差，再计算其中的最大方差与m个方差和之比：
Figure BDA0002379548280000192
根据所取显著性性水平α，数据组数m，重复测定次数n，查科克伦检验临界值表得到：C(5％,8,8)＝0.3043，计算得C(SVA)＝0.1729，C< C(5％,8,8)，表明各组数据平均值间为等精度。
(3)整体数据正态分布检验
本次数据为64个，适合用达戈斯提诺(D’Agostoon)法检验数据的正态性。根据数据计算Y值＝1.02，当n＝64，置信概率为95％时，Y值落入区间(-2.64～1.19)范围内，接受数据为正态分布。
1.4定值结果
由统计结果可知，各组测量数据是等精度数据，并且组间平均值无显著性差异，故此，测量结果可用算术平均值表示。
表16 总平均值
Figure BDA0002379548280000201
2、猪塞内卡病毒核酸标准物不确定度的评定
对于标准物质来说，其定值结果的不确定度由3部分组成，分别为标准物质的均匀性引入的不确定度，标准物质的稳定性引入的不确定度以及标准物质的定值过程带来的不确定度。将定值不确定度与均匀性评估、稳定性考察引入的不确定度按照平方和开方的方法叠加就给出合成标准不确定度，记为uCRM。该合成标准不确定度乘以因子(该因子称为包含因子，记为k)得出的不确定度称为扩展不确定度或称总不确定度，记为U。
(1)均匀性引入的不确定度的评定
本研究中的均匀性验证试验已经在上述“均匀性评估结果”中已经进行过计算。其中由标准物质均匀性产生的相对不确定度为：
均匀性引入的不确定度为ubb：＝182.01copies/μl
Figure BDA0002379548280000202
相对标准不确定度urel(bb)＝0.012
(2)稳定性引入的不确定度的评定
稳定性的不确定度贡献采用公式：us＝s(β1)×X计算。
此标准物质存储在-20℃条件下6个月的长期稳定性的不确定度为:us长＝690.23copies/μl。
相对标准不确定度urel(s长)＝0.045。
(3)定值过程引入的不确定度的评定
1)不确定度的A类评定
不确定度A类评定通过测量数据的标准偏差、测量次数及所要求的置信水平按统计学计算方法进行。依据《一级标准物质》JJG1006-34技术规范，当全部原始数据服从正态分布的情况下，可视其为一组新的测量数据，按狄克逊或格拉布斯从统计上剔除可疑值，再计算全部的原始数据的总平均值和标准偏差。由定值测量重复性引入的不确定度由测量的相对标准偏差计算。
Figure BDA0002379548280000211
uA＝245.39copies/μl
Figure BDA0002379548280000212
相对标准不确定度urel(A)＝0.016。
2)不确定度的B类评定
本标准物质不确定度B类评定包含两部分：第一部分移液器引入的不确定度，第二部分是检测仪器引入的不确定度。
a.移液器的不确定度的评定
在联合定值过程中，第一步用100-1000μL的移液器取200μL的病毒悬浮液到提取试剂板中(移液器相对不确定度1％)。第二步是用10-100 μL的移液器取18μL的数字PCR反应液到离心管中(移液器相对不确定度4％)，第三步用0.1-10μL的移液器吸取2μL上述离心管中(移液器相对不确定度8％)，计算SVA数字PCR实验过程中，移液器移取标准溶液引入的不确定度，合成相对标准不确定度uc(C)为：
Figure BDA0002379548280000213
式中：vr(V1)-吸取的病毒悬浮液体积200μL的相对不确定度；
vr(V2)-吸取的PCR反应溶液体积18μL的相对不确定度；
vr(V3)-吸取的RNA体积2μL的相对不确定度。
①用100-1000μL吸取的病毒悬浮液体积200μL的相对不确定度
Figure BDA0002379548280000221
式中：1％是用移液器移取200μL水的相对不确定度；ΔV代表不同温度下溶液体积的变化，0.0008为不同温度下溶液体积的补正值。
②用10-100μL移液器移取18μL溶液的相对不确定度
V2的相对标准不确定度：
Figure BDA0002379548280000222
式中：3％是用移液器移取18μL原液的相对不确定度；ΔV代表不同温度下溶液体积的变化，0.0008为不同温度下溶液体积的补正值。
③用0.1-10μL移液器移取2μL水的相对不确定度
Figure BDA0002379548280000223
式中：8％是用移液器移取2μL水的相对不确定度；ΔV代表不同温度下溶液体积的变化，0.0008为不同温度下溶液体积的补正值。
④合成相对不确定度
梯度稀释DNA标准溶液引入的不确定度为：
Figure BDA0002379548280000231
b.数字PCR仪不确定度的评定
Alexandra
Figure BDA0002379548280000232
2&Carla Divieto3&Jernej
Figure BDA0002379548280000233
2& StefanoPavarelli3&David Dobnik1&Tanja Dreo1&Roberto Bellotti3& Maria Paola Sassi3&Jana
Figure BDA0002379548280000234
Droplet volume variability as a critical factor for accuracyofabsolute quantification using droplet digital PCR [J].CrossMark Anal BioanalChem(2017)409:6689–6697中报道的微滴体积引入的相对标准不确定度为1％。根据数字PCR仪器测量过程中产生的相对不确定度由微滴体积引入的相对标准不确定度为1％。因此，由数字PCR仪引起B类相对不确定度为：
urel(PCR仪)＝0.010
c.核酸回收率引入的不确定度评定
把内标物和待申请的核酸标准品，按体积1：1混合提取核酸，上绝对定量平台检测，内标和样本1：1混合提取的内标检测拷贝数为A，内标和水1：1混合直接检测贝数为B。两倍的A比上B为提取效率用C 标记，也为校正标准物的系数。即C％＝A/B×100％。所有的标准品检测结果都用C％校正后在去做统计学计算。
核酸回收率实验过程中引入的B类不确定度包含：移液器的不确定度的评定和数字PCR仪的不确定度评定。
移液器的不确定度的评定：在联合定值过程中，第一步用20-200μL 的移液器取100μL的病毒悬浮液到提取试剂板中(移液器相对不确定度 2％)。第二步用20-200μL的移液器取100μL的内标到提取试剂板中(移液器相对不确定度2％)。第三步是用10-100μL的移液器取18μL的数字 PCR反应液到离心管中(移液器相对不确定度4％)，第四步用0.1-10μL的移液器吸取2μL上述离心管中(移液器相对不确定度8％)，计算SVA 数字PCR实验过程中，移液器移取标准溶液引入的不确定度，合成相对标准不确定度u回收(C)为：
Figure BDA0002379548280000241
式中：
vr(V回收1)-吸取的病毒悬浮液体积100μL的相对不确定度；
vr(V回收2)-吸取的病毒悬浮液体积100μL的相对不确定度；
vr(V回收3)-吸取的PCR反应溶液体积18μL的相对不确定度；
vr(V回收4)-吸取的RNA体积2μL的相对不确定度。
①用20-200μL吸取的病毒悬浮液体积100μL的相对不确定度
Figure BDA0002379548280000242
式中：2％是用移液器移取100μL水的相对不确定度；ΔV代表不同温度下溶液体积的变化，0.0008为不同温度下溶液体积的补正值。
②用10-100μL移液器移取18μL溶液的相对不确定度
V2的相对标准不确定度：
Figure BDA0002379548280000243
式中：3％是用移液器移取18μL原液的相对不确定度；ΔV代表不同温度下溶液体积的变化，0.0008为不同温度下溶液体积的补正值。
③用0.1-10μL移液器移取2μL水的相对不确定度
Figure BDA0002379548280000244
式中：8％是用移液器移取2μL水的相对不确定度；ΔV代表不同温度下溶液体积的变化，0.0008为不同温度下溶液体积的补正值。
④合成相对不确定度
梯度稀释DNA标准溶液引入的不确定度为：
Figure BDA0002379548280000251
数字PCR仪器：根据数字PCR仪器测量过程中产生的相对不确定度由微滴体积引入的相对标准不确定度为1％。因此，由数字PCR仪引起B类相对不确定度为：
urel(PCR仪)＝0.010
最后合成回收率的不确定度由三部分组成：移液器，数字PCR仪，重复性。
Figure BDA0002379548280000252
d.合成B类不确定度
Figure BDA0002379548280000253
3)合成定值过程中引入的相对确定度
标准物质定值过程中引入的相对不确定度为：
Figure BDA0002379548280000254
(4)SVA标准物质量值和扩展不确定度
表17 SVA标准物质量值和扩展不确定度
Figure BDA0002379548280000261
3、SVA标准物质量值结果的表示
本发明研制的SVA标准物质，由有一定资质的8家实验室各自独立使用数字PCR方法对标准物质的特性值进行测量。把8家实验室的检测结果计算出均值为1.6×104copies/μl，除以核酸回收率0.97，得到标准值为1.7×104copies/μl，并计算扩展不确定度为0.3×104copies/μl。
表18 SVA标准物质量值结果
名称 结果(×10<sup>4</sup>copies/μl)
扩展不确定度U(k＝2) 0.3
标准值 1.7
标准值±扩展不确定度 1.7±0.3
结果：本标准物质由具备资质的8个实验室各自独立使用数字方法对标准物质的特性值进行测量，确定其标准值。综合考虑均匀性引入的不确定度、稳定性引入的不确定度以及标准物质的定值过程引入的不确定度等因素评定本标准物质的总不确定度。标准物质认定结果用标准值±扩展不确定度的方式表示为：(1.7±0.3)×104copies/μl，所以SVA标准的定量值为(1.7±0.3)×104copies/μl拷贝/μL。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 河南省动物疫病预防控制中心
<120> 猪塞内卡病毒核酸标准物及其应用
<130> KHP191117181.0
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgcacccctt cgctgactac ggt 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagttctccc agaatcgccg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gccttgttcg actgacctgg 20

Claims (10)

1.一种猪塞内卡病毒毒株，其特征在于，其为SVA YRQ/2016，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V202013。
2.权利要求1所述的猪塞内卡病毒毒株的以下任一种应用，
(1)制备猪塞内卡病毒核酸标准物；
(2)制备疫苗；
(3)制备诊断试剂。
3.一种猪塞内卡病毒核酸标准物，其特征在于，含有权利要求1所述的塞内卡病毒毒株的核酸。
4.根据权利要求2所述的猪塞内卡病毒核酸标准物，其特征在于，所述标准物的定量值为(1.7±0.3)×104拷贝/μL。
5.含有权利要求3或4所述的猪塞内卡病毒核酸标准物的检测试剂盒。
6.权利要求3或4所述的猪塞内卡病毒核酸标准物的制备方法，其特征在于，通过以下方法制备得到：制备权利要求1所述猪塞内卡病毒毒株的病毒液，将所述病毒液灭活，添加稳定剂和保护剂。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，还包括对猪塞内卡病毒核酸标准物进行病毒灭活检验、支原体检验、和/或病毒检验。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，还包括对猪塞内卡病毒核酸标准物进行均匀性检测、稳定性检测，进行定值和不确定度评估。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述均匀性检测是由若干独立实验室分别随机抽取猪塞内卡病毒核酸标准物不同部位6个以上的取样、或随机抽样30个标准物质，每个样品检测3次，采用数字PCR的方法检测，得到特征值，然后对各个特征值进行统计处理，确定标准值。
10.权利要求3或4所述的猪塞内卡病毒核酸标准物、或权利要求6-9任一所述的制备方法制得的猪塞内卡病毒核酸标准物在猪塞内卡病毒检测、疫苗质控控制、含有猪塞内卡病毒的生物制品质量检定中的应用。
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