CN102329890B - 用于检测小鼠腺病毒的引物、探针及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测小鼠腺病毒的引物、探针及其方法，所述引物是由具有序列表中的SEQ ID NO：1的上游引物与具有序列表中的SEQ ID NO：2的下游引物组成的一对寡核苷酸，与所述引物配合使用的探针具有序列表中的SEQ ID NO：3的核苷酸序列。用本发明的方法及试剂盒检测小鼠腺病毒具有快速简单、灵敏度高、特异性强且回收率高的优点，解决了现有检测手段复杂费时，周期长，且对操作的实验室有一定要求的不足，具有很好的应用前景。

Description

用于检测小鼠腺病毒的引物、探针及其方法

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种用于检测小鼠腺病毒的引物、探针及其方法。

背景技术

自然感染实验动物的病毒很多，根据对人类的危害性，可将其分为三类；一类为人兽共患病病毒，能够感染人与灵长类动物；二类目前尚无迹象表明感染人，但能在体外培养的人、猿和猴源性细胞中进行复制，对人类有潜在危险性；三类病毒在自然条件下仅感染动物本身，目前尚无迹象表明能够感染人，因此对人类威胁不大。

现今，小鼠作为单克隆抗体、蛋白类药物等生物制品的一个主要来源，具有潜在的病毒污染。在《中华人民共和国药典(2010年版)》三部中，规定了鼠源性生物制品需质检的8种鼠源病毒，其中小鼠腺病毒属于II类，目前尚无迹象表明感染人，但能在体外培养的人、猿和猴源性细胞中进行复制，对人类有潜在危险性。鼠源性病毒检测标准的制定对客观评价生物制品质量，确保人民健康必将起到积极的作用。

小鼠腺病毒(Murine adenoviruses，简称MADV)在小鼠群中多呈隐性感染，但也可引起致死性疾病。这类病毒的带毒期和排毒期均较长，严重影响小鼠健康。小鼠是小鼠腺病毒的自然宿主，实验小鼠在笼内主要经粪便和尿液接触传播。不同毒株MADV，其毒力差异很大，MADV对不同年龄小鼠的易感性也不相同，临床表现多种多样。自然流行多由于感染FL株引起，病鼠表现弓背、被毛粗糙、食欲下降等症状，新生乳鼠可死亡。K87株感染新生乳鼠和成年鼠均不发病，只是经粪便不断向外排毒并产生高滴度的抗体。裸鼠也可自然发生MADV感染，但株型未定。用FL株接种乳裸鼠，可造成十二指肠出血和致死性消耗性疾病。

药典规定的鼠源病毒检测方法有：细胞试验、动物抗体产生实验和鸡胚感染实验。这些方法从生物效应角度来检测鼠源病毒的潜在污染，检测手段复杂费时，周期长，且对操作的实验室有一定要求，不宜作为一种常规的指导生产的质控手段。

而目前发展十分成熟的实时荧光定量PCR技术(Real-time FluorenceQuantitative Polymerase Chain Reaction简称Real Time PCR)检测灵敏度高，简单方便，且对实验室要求也很低。Real Time PCR于1996年由美国Applied biosystems公司推出，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(or cDNA)的起始浓度进行定量分析的方法。该方法自产生以来，不断发展完善，特别是随着Taqman荧光探针的广泛应用，到目前为止该技术已经非常成熟。Taqman荧光探针的PCR检测是指进行PCR扩增时，在反应体系中加入一对引物的同时还加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基因和一个淬灭荧光基团。当探针完整时，报告基因所发射的荧光信号被淬灭基因吸收，扩增时随着Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5’-3’外切核酸酶活性将探针酶切降解，报告荧光基团与淬灭荧光基团分离，从而荧光检测系统可以监测到荧光信号，模板每复制一次，就有一个探针被切断伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一关系，所以信号累积与PCR产物完全同步。整个反应结束后，便可得到一条扩增曲线，由已知浓度标准样品的扩增曲线可以得到一条标准曲线，根据该标准曲线以及样品中的扩增曲线可对样品进行定量分析。

实时荧光定量PCR技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，该已被广泛用于免疫分析、细菌、病毒检测等多个领域。迄今为止，实时荧光定量PCR技术检测小鼠腺病毒方面还未见有报道，无疑有着很广阔的发展空间。

发明内容

为了解决现有小鼠腺病毒检测方法的不足，本发明提供了一种实时荧光定量PCR检测小鼠腺病毒的引物、探针及其方法，该方法简单方便、灵敏度高且检测时间短。

本发明的一个目的是提供一对用于检测小鼠腺病毒的引物。

本发明提供的引物，是由具有序列表中的SEQ ID NO：1的上游引物与具有序列表中的SEQ ID NO：2的下游引物组成的一对寡核苷酸。

序列表中的SEQ ID NO：1由21个碱基组成；序列表中的SEQ IDNO：2由17个碱基组成。

本发明人设计了多对PCR引物，经过长期大量的实验从众多引物对中筛选出了由上述上游引物和下游引物组成的引物对。其扩增片断大小为131bp。该引物对小鼠腺病毒具有高度的保守性，且与小鼠基因组不具有显著的同源性，使用该引物进行PCR扩增，可实现准确定性、定量检测。

本发明的另一个目的是提供一种用于检测小鼠腺病毒的探针，所述探针具有序列表中的SEQ ID NO：3的核苷酸序列，所述探针5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。

所述探针中荧光报告基团可选自FAM、JOE、HEX中的任意一种，优选为FAM；所述荧光淬灭基团选自TAMRA或Eclipse，优选为TAMRA。

所述序列表中的SEQ ID NO：3由24个碱基组成。

本发明的再一个目的是提供一种用于检测小鼠腺病毒的方法，所述方法以样品DNA为模板，使用上述提及引物及探针进行实时荧光定量PCR检测。

优选地，所述实时荧光定量PCR的反应体系还包括腺病毒核酸PCR扩增试剂、阳性定量标准品、阴性质控品、空白对照。

优选地，所述实时荧光定量PCR的退火温度为60℃。

优选地，所述实时荧光定量PCR的反应条件为：50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s，60℃，1min，共40个循环。

优选地，所述方法还包括标准曲线的建立，方法为：用含序列表中SEQ ID NO：4所示的碱基同源序列的pMD18-T重组质粒作为阳性定量标准品，将其十倍稀释成不同浓度的阳性定量标准品，以所述阳性定量标准品作为模板进行实时荧光定量PCR检测，得到用于检测小鼠腺病毒的标准曲线。

本发明的又一个目的是提供一种用于检测小鼠腺病毒的试剂盒，所述试剂盒含上述提及的引物及探针。

优选地，所述试剂盒的反应体系还包括腺病毒核酸PCR扩增试剂、阳性定量标准品、阴性质控品、空白对照。

优选地，所述PCR扩增试剂为2×Taqman PCR Mix。

优选地，所述阳性定量标准品为含序列表中SEQ ID NO：4所示的碱基同源序列的pMD18-T重组质粒。

本发明的还一个目的是提供上述提及的引物或探针在检测鼠源生物制品中腺病毒残留时的应用。

与现有检测方法相比，本发明提供的荧光定量PCR方法检测小鼠腺病毒具有以下优点：

1、简单快速：现有的药典小鼠腺病毒检测方法为：细胞试验、动物抗体产生实验和鸡胚感染实验，从生物学效应角度检测生物制品中小鼠腺病毒的潜在感染，需时长(1-4周时间)，而本发明从核酸角度对腺病毒进行检测，只需要6小时左右即可出结果，且对操作实验室环境要求不高，规避了以前抽检产品可能产生的漏洞，可在企业实现批批检测，进一步提高了生物制品质控质量。

2、灵敏度高：现有检测方法是从生物学效应角度检测生物制品中小鼠腺病毒的潜在感染，其中因制剂在制备过程中经过了多个工艺步骤的处理，残留鼠源病毒的活病毒抗原及病毒抗体存在的可能性极小，而本发明从病毒核酸角度进行检测，相对前述药典规定方法而言，提高了检测的灵敏度。利用本发明中的实时荧光定量PCR检测鼠源生物制品中腺病毒时，可以准确定量，目标DNA在10²-10⁷浓度范围内，都有很好的线性关系，灵敏度高可达到100copies/μl。

3、重复性、准确性和特异性：本发明中的引物和探针根据小鼠MADV-1、MADV-2、MADV-3的同源性序列设计，且与小鼠基因组无同源性，检测特异性强，重复性好；

4、回收率高：行业内通用标准要求检测方法的回收率要达到50％以上，本发明实时荧光定量PCR方法回收率均达到了80％以上，是一种理想的可替代现有药典规定的检测方法。

附图说明

图1为阳性定量标准品质粒的结构示意图；

图2为实时荧光定量PCR定量曲线；

图3为实时荧光定量PCR标准曲线。

具体实施方式

以下所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的保护范围。

下述实施例中所述试剂原料除特别注明来源外，均为市售的常见原料，试剂的配制采用常规方法。实施例中未详述的方法均为本领域常规操作，详见《分子克隆》第三版。

实施例1小鼠腺病毒专用引物和探针的设计

从genbank中查到MADV-1、MADV-2、MADV-3的全长基因组序列，它们的genbank号分别为NC_000942/AC_000012、NC_014899/HM049560和NC_012584/EU835513。进行序列比对，找出具有其保守序列区的同源序列：即SEQ ID NO：4所示核苷酸序列。

针对找出的保守的同源序列区域设计实时荧光定量PCR检测专用引物和探针序列，扩增出的目的片段大小为131碱基。其中优选的引物、探针序列为：

上游引物：5’-ACTTCCATCGTGTAGATTCGC-3’，即SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；

下游引物：5’-TTAGAGGGCAGCATTTG-3’，即SEQ ID NO：2所示核苷酸序列；

所述探针：5’-ACCGGTTAGGCGAGCACAATCCAG-3’，即SEQ IDNO：3所示核苷酸序列；

所述探针的5’端用荧光报告基团FAM标记，3’端用荧光淬灭基团TAMRA标记。

用设计的引物、探针进行同源性比对后发现其只对小鼠腺病毒具有高度保守型，与小鼠基因组/EST、及其他近缘病毒不同源，其特异性较高。

实施例2阳性定量标准品的制备

合成SEQ ID NO：4所示核苷酸序列，并将其插入pMD18-T载体中制备而成(由Invitrogen公司合成)，命名为pMD18T-MADV1，图谱如图1所示。pMD18T-MADV1质粒全长共3318bp，分子量2.19×10⁶Da。计算可得，1μg质粒＝2.74×10¹¹copies。。

将含pMD18T-MADV1质粒的甘油菌(Invitrogen公司提供)在LB培养基(含100ng/ml Amp)中37℃过夜震荡培养后，用质粒小提试剂盒(QIAgen公司提供)提取pMD18T-MADV1质粒，紫外吸光法定量并计算拷贝数，稀释至10⁸copies/μl作为阳性定量标准品，分装保存于-80℃备用。

实施例3实时荧光定量PCR扩增方法的建立

1、实时荧光定量PCR模板制备——总DNA提取：

根据使用说明，分别用Trizol/Trizol LS试剂盒(Invitrogen公司提供)提取样品DNA，具体方法如下：

1)向样品(如为组织需研磨匀浆)中加入适量TRIzol//Trizol LS，混匀，室温静置5min；

2)加入氯仿∶异戊醇(24∶1)溶液200ul，用vortex剧烈混匀10s。室温放置5min；

3)4℃15000prm离心15min。尽量吸尽上清，弃上清；

4)中间层和有机层加入0.5mlDNA回收液，混匀，室温静置10min；

5)4℃15000prm离心15min；

6)转移上清，加入等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，震荡混匀；

7)转移上清至新管，加入0.8倍体积异丙醇，室温静置5min；

8)4℃15000prm离心15min，弃上清，加入预冷的75％乙醇1ml洗DNA沉淀；

9)4℃15000prm离心10min；

10)用移液枪将上清尽量去除干净，真空干燥5～10min；

11)用100ulTE溶解沉淀。

2、实时荧光定量PCR反应体系

本发明人以阳性定量标准品pMD18T-MADV1为模板，对探针、引物的不同组合进行摸索，最终确定了探针和引物的最佳组合：20μl反应体系中10μM探针0.4μl、10μM上下游引物各0.6μl。

具体地，进行样品测定时，以总DNA为模板，进行实时荧光定量PCR，其中反应体系为：

反应体系(20μl)：

3、实时荧光定量PCR反应条件

以上述反应体系进行实时荧光定量PCR，对反应程序中的退火温度进行摸索，确定最佳退火温度为60℃。

具体反应条件为：

50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s，60℃，1min，共40个循环。每个循环结束后采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。

实施例4方法学验证

1、标准曲线的建立及实时荧光定量PCR的灵敏度

将实施例2备用的pMD18T-MADV1稀释至10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷copies/μl为模板，按照实施例3中的反应体系和反应条件进行实时荧光定量PCR反应，随着PCR体系的每一个循环结束后测定吸光值，就得到了以循环数为横坐标，吸光值为纵坐标的定量曲线和以标准品浓度的对数值为横坐标，Ct为纵坐标的标准曲线。其中，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

本发明实时荧光定量PCR的检测低限：在40个循环内出现可信Ct值的稀释低限，当每差10倍模板量，Ct值相差3.3的Ct值被认为是可信的Ct值，由图2所示的定量曲线可得出，该实时荧光定量PCR的灵敏度可达到100copies/μl。

研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的阳性定量标准品作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

标准曲线如图3所示，标准曲线R²＝0.996，线性相关性良好。

2、实时荧光定量PCR的重复性、准确性和特异性

将阳性定量标准品pMD18T-MADV1分别稀释至浓度为10⁶、10⁴、10²copies/μl作为为高中低值质控，以无病小鼠DNA为阴性对照即阴性质控品，以ddH2O为空白对照，进行实时荧光定量PCR，测量结果如下表1：

表1

由上述结果可知，

1)空白对照成立，实验结果有效；无病小鼠DNA检测结果为阴性；

阳性定量标准品检测结果均为阳性，故说明本检测方法具有很强的特异性；

2)3次实验标准偏差在15％以内，说明本发明重复性好，精密度符合要求；

3)准确度符合要求。

3、回收率实验

取4份小鼠肝脏组织(编号1-4)和4份市售苏肽生(编号4-8，溶解后的注射液)，将阳性定量标准品pMD 18T-MADV1稀释至浓度10⁸、10⁶、10⁴copies/μl，按下表2配比配制供试样品(模拟阳性样品)。

表2供试样品配制

按实施例3中的提取方法提取DNA，作为PCR反应的模板，然后按实施例3的反应体系和条件进行实时荧光定量PCR反应，其中空白对照以ddH₂O为模板，三次重复结果如表3所示，计算该方法的回收率。

表3

由上述结果可知，

空白对照成立，阴性对照无信号，阳性样品均为阳性，本实验成立，同时本检测方法回收率均在80％以上，比行业标准50％要高。

实施例5小鼠腺病毒的实时荧光检测试剂盒

将上述用于对小鼠腺病毒进行实时荧光定量PCR检测的上下游引物探针混合液500μl，Taqman Gene Expression Master MiX 10ml，阳性定量标准品(1×10⁷copies/μl)50μl及稀释液，阴性对照品25μl，无菌ddH₂O 10ml共同包装，得到小鼠腺病毒的实时荧光检测试剂盒。

该试剂盒使用方法：

以按实施例3-1中提取的样品总DNA作为模板，阳性定量标准品1×10⁷copies/μl作为阳性对照模板，同时使用阴性对照、ddH₂O空白对照，按照实施例3-2的反应体系和实施例3-3的反应条件进行实时荧光定量PCR，同时参照实施例4-1的方法将阳性定量标准品稀释为不同浓度进行实时荧光定量PCR制作标准曲线。

结果分析，当阳性对照、阴性对照、空白对照部正常时，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (13)

1.用于检测小鼠腺病毒的寡核苷酸组，所述寡核苷酸组包括用于检测小鼠腺病毒的引物和与所述引物配合使用的探针，其特征在于，所述引物是由序列表中的SEQ ID NO:1所示的上游引物与序列表中的SEQ ID NO:2所示的下游引物组成的一对寡核苷酸，所述探针为序列表中的SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的寡核苷酸组，其特征在于，所述探针5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。

3.根据权利要求2所述的寡核苷酸组，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、JOE、HEX中的任意一种，所述荧光淬灭基团选自TAMRA或Eclipse。

4.根据权利要求1至3中任一所述的寡核苷酸组，其特征在于，

所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为TAMRA。

5.一种用于检测鼠源生物制品中小鼠腺病毒残留的方法，其特征在于，所述方法以样品DNA为模板，使用权利要求1至4中任一所述的寡核苷酸组进行的实时荧光定量PCR检测方法。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应体系还包括腺病毒核酸PCR扩增试剂、阳性定量标准品、阴性质控品、空白对照。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的退火温度为60℃。

8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应条件为：50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s；60℃，1min，共40个循环。

9.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括标准曲线的建立，方法为：将序列表中SEQ ID NO:4所示序列插入pMD18-T载体制备而成的重组质粒作为阳性定量标准品，将其十倍稀释成不同浓度的阳性定量标准品，以所述阳性定量标准品作为模板进行实时荧光定量PCR检测，得到检测小鼠腺病毒的标准曲线。

10.一种检测小鼠腺病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1至4中任一所述的寡核苷酸组和试剂盒的反应体系；所述试剂盒的反应体系还包括腺病毒核酸PCR扩增试剂、阳性定量标准品、阴性质控品、空白对照。

11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂为2×Taqman PCR Mix。

12.根据权利要求10或11所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性定量标准品为将序列表中SEQ ID NO:4所示序列插入pMD18-T载体制备而成的重组质粒。

13.权利要求1至4中任一所述的寡核苷酸组在检测鼠源生物制品中腺病毒残留时的应用。

Images