CN105861751B - 一种用于检测小鼠腺病毒的引物对、荧光定量pcr试剂盒及其应用 - Google Patents

一种用于检测小鼠腺病毒的引物对、荧光定量pcr试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105861751B
CN105861751B CN201610324075.4A CN201610324075A CN105861751B CN 105861751 B CN105861751 B CN 105861751B CN 201610324075 A CN201610324075 A CN 201610324075A CN 105861751 B CN105861751 B CN 105861751B
Authority
CN
China
Prior art keywords
pcr
adenovirus
primer pair
fluorescence
primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610324075.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105861751A (zh
Inventor
戴方伟
杜江涛
周莎桑
宋晓明
吕宇
萨晓婴
褚晓峰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Academy of Medical Sciences
Original Assignee
Zhejiang Academy of Medical Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Academy of Medical Sciences filed Critical Zhejiang Academy of Medical Sciences
Priority to CN201610324075.4A priority Critical patent/CN105861751B/zh
Publication of CN105861751A publication Critical patent/CN105861751A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105861751B publication Critical patent/CN105861751B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于检测小鼠腺病毒的引物对、荧光定量PCR试剂盒及其应用。所述引物对包括上游引物和下游引物，核苷酸序列为：上游引物：5’‑TGAAGAAYCCYKSMGCTTTTCG‑3’；下游引物：5’‑RGGCAACACAGCCTCCAR‑3’。本发明针对小鼠腺病毒的NC_012584.1Murine adenovirus 3pIIIa序列，设计了小鼠腺病毒特异性的引物对，利用该引物对结合荧光探针的荧光定量PCR检测方法对小鼠腺病毒的检测下限为4.5copies/μL DNA，大大提高了检测灵敏性。

Description

一种用于检测小鼠腺病毒的引物对、荧光定量PCR试剂盒及其 应用
技术领域
本发明涉及动物病毒检验检疫技术领域，特别是涉及一种用于检测小鼠腺病毒的引物对、荧光定量PCR试剂盒及其应用。
背景技术
自然感染实验动物的病毒很多，根据对人类的危害性，可将其分为三类；一类为人兽共患病病毒，能够感染人与灵长类动物；二类目前尚无迹象表明感染人，但能在体外培养的人、猿和猴源性细胞中进行复制，对人类有潜在危险性；三类病毒在自然条件下仅感染动物本身，目前尚无迹象表明能够感染人，因此对人类威胁不大。
现今，小鼠作为单克隆抗体、蛋白类药物等生物制品的一个主要来源，具有潜在的病毒污染。在《中华人民共和国药典(2010年版)》三部中，规定了鼠源性生物制品需质检的8种鼠源病毒，其中小鼠腺病毒(Mouse Adenovirus，MAdV)属于II类，目前尚无迹象表明感染人，但能在体外培养的人、猿和猴源性细胞中进行复制，对人类有潜在危险性。鼠源性病毒检测标准的制定对客观评价生物制品质量，确保人民健康必将起到积极的作用。
小鼠腺病毒是20世纪60年代从小鼠体内分离出的一种双链DNA病毒，为腺病毒科哺乳动物腺病毒属的成员。MAdV已被确定分类地位的株型有2个血清型：Ⅰ型FL株和Ⅱ型K87株。小鼠腺病毒感染常呈隐性，病毒侵入棕色脂肪、肾上腺、心肌和肾等处，对裸鼠致病性较强，可以引起死亡。小鼠腺病毒也可损害人类心血管组织，被怀疑为人类心脏损害的一种病原。
药典规定的鼠源病毒检测方法有：细胞试验、动物抗体产生实验和鸡胚感染实验。这些方法从生物效应角度来检测鼠源病毒的潜在污染，检测手段复杂费时，周期长，且对操作的实验室有一定要求，不宜作为一种常规的指导生产的质控手段。
目前小鼠腺病毒的检测方法主要有病毒分离鉴定、血清学方法：免疫荧光(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、酶免疫分析法(EIA)等。传统的检测方法存在成本高、耗时长、假阳性等问题。随着分子生物学的快速发展，越来越多的分子检测技术应用到腺病毒检测中。王吉等(王吉、付瑞、卫礼等，小鼠腺病毒PCR检测方法的建立及初步应用，实验动物与比较医学，2014，34(1)：35-41)针对小鼠腺病毒建立PCR检测法，检测敏感性为1.67pg/μLMAdV DNA。姚新华等(姚新华、郭英飞，实时荧光定量PCR快速检测腺病毒方法的建立与评价，解放军预防医学杂志，2015，33(2)：127-129)针对人腺病毒Hexon基因建立荧光定量TaqMan PCR检测法，最低可检测到10copies/μL。
而目前发展十分成熟的实时荧光定量PCR技术(Real Time PCR)检测灵敏度高，简单方便，且对实验室要求也很低。Real Time PCR于1996年由美国Applied biosystems公司推出，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(或cDNA)的起始浓度进行定量分析的方法。该方法自产生以来，不断发展完善，特别是随着Taqman荧光探针的广泛应用，到目前为止该技术已经非常成熟。Taqman荧光探针的PCR检测是指进行PCR扩增时，在反应体系中加入一对引物的同时还加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基因和一个淬灭荧光基团。当探针完整时，报告基因所发射的荧光信号被淬灭基因吸收，扩增时随着Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5’-3’外切核酸酶活性将探针酶切降解，报告荧光基团与淬灭荧光基团分离，从而荧光检测系统可以监测到荧光信号，模板每复制一次，就有一个探针被切断伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一关系，所以信号累积与PCR产物完全同步。整个反应结束后，便可得到一条扩增曲线，由已知浓度标准样品的扩增曲线可以得到一条标准曲线，根据该标准曲线以及样品中的扩增曲线可对样品进行定量分析。
实时荧光定量PCR技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，该已被广泛用于免疫分析、细菌、病毒检测等多个领域。
发明内容
本发明提供了一种小鼠腺病毒特异性的引物对，利用该引物对结合荧光探针可以对小鼠腺病毒进行荧光定量PCR检测，该检测方法能特异、灵敏地检测出小鼠腺病毒。
引物对，包括上游引物和下游引物，核苷酸序列为：
上游引物：5’-TGAAGAAYCCYKSMGCTTTTCG-3’；
下游引物：5’-RGGCAACACAGCCTCCAR-3’。
该引物对是根据小鼠腺病毒的NC_012584.1Murine adenovirus 3pIIIa序列设计的，扩增目的片段大小为74bp。该引物对的上下游引物序列具有一定的简并性，序列中的Y为C或T；K为G或T；S为C或G；M为A或C；R为A或G。
本发明又提供了所述的引物对在制备检测小鼠腺病毒试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种用于检测小鼠腺病毒的荧光定量PCR试剂盒，包含所述的引物对。
所述一种用于检测小鼠腺病毒的荧光定量PCR试剂盒，其探针为：5’-R-ACCRTGGTTTACTAGACGMGAYGCMA-Q-3’，其中，5’端的R为荧光报告基团；3’端的Q为荧光淬灭基团。探针的核苷酸序列具有一定的简并性，其中核苷酸序列中的R为A或G；M为A或C；Y为C或T。所述探针中荧光报告基团可选自FAM、JOE、HEX中的任意一种，优选为FAM；所述荧光淬灭基团选自TAMRA或Eclipse，优选为TAMRA。
所述一种用于检测小鼠腺病毒的荧光定量PCR试剂盒，包含阳性对照DNA。
优选的，所述阳性对照DNA为包含如SEQ ID No.4所示核苷酸序列的重组质粒。该核苷酸序列为使用本发明引物对扩增单一的小鼠腺病毒株所获得的扩增产物，大小为74bp。
优选的，所述阳性对照DNA为包含如SEQ ID No.4所示核苷酸序列的重组pMD18-T载体。pMD18-T载体为常用的商业化的克隆载体。
本发明还提供了所述的荧光定量PCR试剂盒在检测动物制品或动物实验废弃物中小鼠腺病毒残留中的应用。
本发明还提供了一种检测小鼠腺病毒的荧光定量PCR方法，以待检测样品的DNA为模板，利用所述的引物对进行荧光定量PCR反应。
所述荧光定量PCR的反应体系为：
所述荧光定量PCR的反应条件为：50℃培育2min；95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，共40个循环。
本发明针对小鼠腺病毒的NC_012584.1Murine adenovirus 3pIIIa序列，设计了小鼠腺病毒特异性的引物对，利用该引物对结合荧光探针的荧光定量PCR检测方法对小鼠腺病毒的检测下限为4.5copies/μL DNA，大大提高了检测灵敏性。
附图说明
图1为MAD-3引物对和探针特异性检测扩增曲线图；
图2为MAD-3引物对和探针扩增目的基因标准曲线图；
图3为MAD-3引物对和探针标准曲线的扩增曲线图；
图4为MAD-3引物对和探针灵敏性检测扩增曲线图，扩增曲线从左到右依次为：4.5×107copies/μL、4.5×106copies/μL、4.5×105copies/μL、4.5×104copies/μL、4.5×103copies/μL、4.5×102copies/μL、4.5×101copies/μL、4.5×100copies/μL；
图5为MAD-3引物对和探针实际检测应用扩增曲线图。
具体实施方式
实施例1引物对及探针的设计与筛选
从NCBI下载小鼠腺病毒(Murine adenovirus A和Murine adenovirus 3)基因组序列，进行比对后，发现有三个基因有较好的相似性，其中，IVa2的一致性(identities)为75％；Hexon一致性为75％；pIIIa一致性为71％，因此选择此三个基因作为候选的检测基因。
分别针对上述三个基因设计引物和探针，引物和探针如表1所示。其中，引物和探针序列均具有一定的简并性，序列中的Y为C或T；K为G或T；S为C或G；M为A或C；R为A或G；W为A或T。
表1
用表1所设计的三组引物对，不使用探针，进行普通PCR扩增。PCR反应体系为：
反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火20s，72℃延伸30s，共40个循环；72℃延伸7min。PCR产物经电泳检测，三组引物对均能扩出相应目的片段。
使用三组引物对和探针(MAD-1～3)，对小鼠腺病毒标准株DNA进行荧光定量PCR扩增。其荧光定量PCR反应体系为：
反应条件为：50℃培育2min；95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火延伸1min，共40个循环。荧光定量PCR结果显示MAD-1引物对和探针效率不佳，检测不到目的基因。MAD-2和MAD-3引物对和探针扩增效果较好。
将使用MAD-2和MAD-3引物对进行普通PCR扩增的产物割胶回收并纯化后，连接18-T质粒载体制备标准品，并进行标准曲线的扩增。两组引物对所建立的标准曲线相关系数均为0.999；扩增效率分别为：95％和94％。
将MAD-2(5.5×109copies/μL)和MAD-3(4.5×109copies/μL)对应的标准品克隆质粒依次稀释直到5.5×100copies/μL和4.5×100copies/μL，在40个PCR循环内，MAD-2可以检测到5.5×100copies/μL，MAD-3可以检测到4.5×100copies/μL，灵敏性均较好。
综上所述，本发明采用扩增效率及灵敏性均较好的MAD-3引物对及探针来检测小鼠腺病毒。
实施例2MAD-3引物对及探针的特异性检测
使用MAD-3引物对及探针，以不含任何病毒株的水为阴性对照，以稀释至4.5×104copies/μL的质粒标准品为阳性对照，分别对猴腺病毒-1、猴腺病毒-20、小鼠腺病毒、禽腺病毒Ⅰ型、禽腺病毒Ⅲ型、树鼩呼肠孤病毒、犬疱疹病毒、猫疱疹病毒、伪狂犬病毒、猴巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒、树鼩腺病毒、小鼠巨细胞病毒、人单纯疱疹病毒Ⅰ型、人单纯疱疹病毒Ⅱ型、小鼠肝炎病毒A59、小鼠肝炎病毒JHM、脑心肌炎病毒、淋巴脉络丛脑膜炎病毒、仙台病毒、汉坦病毒等21个病毒种类的样品DNA或者cDNA进行荧光定量PCR检测(样本编号1～21)。
反应体系和条件同实施例1。结果如图1和表2所示。通过检测，小鼠腺病毒阳性样本中可以检测到目的基因，3号鼠腺病毒中检测到腺病毒目的基因，空白对照和其他样品中未检测到腺病毒目的基因。证明MAD-3引物对及探针特异性较好。
表2
注：N/A表示未检测到，即低于检测下限。
实施例3MAD-3引物对及探针的灵敏性检测
(1)标准曲线的建立
将MAD-3引物对扩增基因重组质粒进行10倍梯度稀释，即从4.5×109copies/μL稀释至4.5×100copies/μL，从中选取4.5×107copies/μL至4.5×101copies/μL的质粒标准品，进行Taqman探针荧光定量检测，用于制作标准曲线。横坐标是以10为底的质粒拷贝数的对数值，纵坐标是循环阈值Ct，从标准曲线得出重组质粒拷贝数(Copy number)与循环阈值(Ct)之间的线性关系表达式为：y＝-3.47logx+42.18；相关系数R2为0.999；扩增效率为94％。标准曲线见图2，标准曲线扩增曲线见图3。
(2)探针灵敏性检测
将MAD-3引物对扩增基因重组质粒进行10倍梯度稀释，从4.5×109copies/μL稀释至4.5×100copies/μL，从中选取4.5×107copies/μL至4.5×100copies/μL的质粒标准品进行灵敏性检测。结果见表3和图4，在40个循环内，MAD-3最小可以检测到100，探针灵敏性较好。
表3
注：N/A表示未检测到，即低于检测下限。
实施例4稳定性和重复性实验
取DNA及同一批PCR检测试剂保存于-20℃冰箱，每隔一段时间取检测样品和检测试剂，利用MAD-3引物对和探针进行qPCR检测，连续测3次。每次试验各做3个重复，PCR扩增体系和反应程序实施例1，扩增结果见表4，说明本发明检测试剂和检测方法稳定性和重复性均较好。
表4
实施例5实际检测应用
应用MAD-3引物对及探针，以不含任何病毒的水作为阴性对照，以小鼠腺病毒DNA为阳性对照，分别对6个沙鼠肝脏(G1～G6)、6个沙鼠肺脏(F1～F6)、27个沙鼠粪便(FB-61～87)、5个野鼠肝脏(HZ-c-1，HZ-c-2，HZ-d-1，HZ-6-1，SH3-d-1)、3个野鼠粪便(HN-a-1，SH2-a-1，SH3-a-1)DNA样本进行TaqMan探针荧光定量检测，结果见表5和图5，这些动物样本中均未检测到小鼠腺病毒。
表5
注：N/A表示未检测到，即低于检测下限。

Claims (7)

1.一种用于检测小鼠腺病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包含引物对和探针，
所述引物对包括上游引物和下游引物，核苷酸序列为：
上游引物：5’-TGAAGAAYCCYKSMGCTTTTCG-3’；
下游引物：5’-RGGCAACACAGCCTCCAR-3’，
探针为：5’-R-ACCRTGGTTTACTAGACGMGAYGCMA-Q-3’，其中，5’端的R为荧光报告基团；3’端的Q为荧光淬灭基团。
2.如权利要求1所述的用于检测小鼠腺病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包含阳性对照DNA。
3.如权利要求2所述的用于检测小鼠腺病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述阳性对照DNA为包含如SEQ ID No.4所示核苷酸序列的重组质粒。
4.如权利要求1～3任一所述的荧光定量PCR试剂盒在检测动物制品或动物实验废弃物中小鼠腺病毒残留中的应用。
5.一种非疾病诊断为目的的检测小鼠腺病毒的荧光定量PCR方法，其特征在于，以待检测样品的DNA为模板，利用如权利要求1所述的荧光定量PCR试剂盒中的引物对和探针进行荧光定量PCR反应。
6.如权利要求5所述的荧光定量PCR方法，其特征在于，荧光定量PCR的反应体系为：
7.如权利要求5所述的荧光定量PCR方法，其特征在于，荧光定量PCR的反应条件为：50℃培育2min；95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，共40个循环。
CN201610324075.4A 2016-05-16 2016-05-16 一种用于检测小鼠腺病毒的引物对、荧光定量pcr试剂盒及其应用 Active CN105861751B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610324075.4A CN105861751B (zh) 2016-05-16 2016-05-16 一种用于检测小鼠腺病毒的引物对、荧光定量pcr试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610324075.4A CN105861751B (zh) 2016-05-16 2016-05-16 一种用于检测小鼠腺病毒的引物对、荧光定量pcr试剂盒及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105861751A CN105861751A (zh) 2016-08-17
CN105861751B true CN105861751B (zh) 2019-04-09

Family

ID=56635029

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610324075.4A Active CN105861751B (zh) 2016-05-16 2016-05-16 一种用于检测小鼠腺病毒的引物对、荧光定量pcr试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105861751B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106566897B (zh) * 2016-11-10 2018-07-24 广东省实验动物监测所 一种快速区分ect、mad、mcmv、poly的多重荧光基因检测方法
CN106755582B (zh) * 2017-01-04 2019-08-20 中国人民解放军西部战区总医院 一种腺病毒检测、测序的引物组合及应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102140549A (zh) * 2011-03-21 2011-08-03 武汉大学 腺病毒实时荧光定量pcr试剂盒
CN102329890A (zh) * 2011-08-16 2012-01-25 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 用于检测小鼠腺病毒的引物、探针及其方法
CN102399907A (zh) * 2011-11-25 2012-04-04 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 用于同时检测小鼠腺病毒和脱脚病病毒的多重实时荧光pcr引物、探针及其试剂盒
CN103160619A (zh) * 2013-04-10 2013-06-19 北京博海通达生物科技有限公司 一种腺病毒多重荧光定量pcr检测试剂盒及其使用方法
CN103642936A (zh) * 2013-11-04 2014-03-19 江苏和创生物科技有限公司 55型腺病毒的特异性检测用引物探针组合和试剂盒

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102140549A (zh) * 2011-03-21 2011-08-03 武汉大学 腺病毒实时荧光定量pcr试剂盒
CN102329890A (zh) * 2011-08-16 2012-01-25 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 用于检测小鼠腺病毒的引物、探针及其方法
CN102399907A (zh) * 2011-11-25 2012-04-04 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 用于同时检测小鼠腺病毒和脱脚病病毒的多重实时荧光pcr引物、探针及其试剂盒
CN103160619A (zh) * 2013-04-10 2013-06-19 北京博海通达生物科技有限公司 一种腺病毒多重荧光定量pcr检测试剂盒及其使用方法
CN103642936A (zh) * 2013-11-04 2014-03-19 江苏和创生物科技有限公司 55型腺病毒的特异性检测用引物探针组合和试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
人3型腺病毒荧光定量PCR检测方法的建立;谭耀驹;《Journal of Tropical Medicine》;20091231;第9卷(第12期);第1380-1381、1390页 *
禽腺病毒hexon基因克隆表达及间接ELISA和荧光PCR检测方法的建立;文艳玲;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20100115(第1期);摘要、第29-30页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105861751A (zh) 2016-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106947838B (zh) 非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光lamp检测引物组、试剂盒及检测方法
CN107299155A (zh) 一种鹅星状病毒实时荧光定量pcr检测的引物和探针
CN105039586A (zh) 检测鸭2型腺病毒的引物及试剂盒
CN110872637A (zh) 一种鉴别非洲猪瘟基因缺失疫苗的试剂、检测方法及应用
Yun et al. Development of a one-step real-time RT-PCR assay using a minor-groove-binding probe for the detection of duck Tembusu virus
CN110358866A (zh) 新型鹅星状病毒SYBR Green染料法荧光定量PCR检测试剂盒
Wan et al. Specific detection of the novel goose astrovirus using a TaqMan real-time RT-PCR technology
Niu et al. Development of a TaqMan-based real-time PCR assay for the detection of Novel GPV
Liu et al. Development of a SYBR Green real-time RT-PCR assay for the detection of avian encephalomyelitis virus
Dong et al. Development and evaluation of a droplet digital PCR assay for the detection of fowl adenovirus serotypes 4 and 10 in attenuated vaccines
CN104745730A (zh) 非洲猪瘟病毒cp204l基因的荧光pcr检测试剂及其制备方法与用途
Ma et al. Establishment of a real-time recombinase polymerase amplification assay for the detection of avian reovirus
CN105861751B (zh) 一种用于检测小鼠腺病毒的引物对、荧光定量pcr试剂盒及其应用
Li et al. Rapid detection of porcine deltacoronavirus and porcine epidemic diarrhea virus using the duplex recombinase polymerase amplification method
CN108411041B (zh) 一种检测新型鸡呼肠孤病毒的荧光定量rt-pcr试剂盒及应用
Romanova et al. Detection and quantitation of fowl adenovirus genome by a real-time PCR assay
CN108588276A (zh) D型流感病毒荧光定量pcr引物对及试剂盒
CN110257561B (zh) 用于鹿流行性出血热病毒检测的试剂、检测方法及应用
Wang et al. Evidence of vertical transmission of novel duck orthoreovirus in ducks
CN106520962B (zh) 杀鲑气单胞菌的SYBR Green I实时定量PCR检测方法及其应用
CN106086238A (zh) 猪圆环病毒2型的pcr检测方法、所用引物及检测试剂盒
Kaffashi et al. Development of TaqMan real-time polymerase chain reaction assay for detection of chicken anemia virus in Newcastle disease vaccines
Davidson Biotic concerns in generating molecular diagnosis matrixes for 4 avian viruses with emphasis on Marek’s disease virus
CN102329889B (zh) 用于检测小鼠脱脚病病毒的引物、探针及其方法
CN106978496B (zh) 一种黄颡四锚虫的pcr检测引物及荧光定量pcr检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant