CN106520962B - 杀鲑气单胞菌的SYBR Green I实时定量PCR检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了杀鲑气单胞菌的SYBR Green I实时定量PCR检测方法。本发明以杀鲑气单胞菌fstA基因为靶基因，建立了杀鲑气单胞菌的SYBR Green I实时定量PCR检测方法。通过实验证明：本发明的方法不仅具有特异性强、灵敏度高和重复性好的特点，还具有操作方便、鉴定快速和结果客观等优点，可用于杀鲑气单胞菌的快速诊断及定量检测，为鲑鳟鱼疖疮病的诊断及防控提供技术手段。

Description

杀鲑气单胞菌的SYBR Green I实时定量PCR检测方法及其 应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及杀鲑气单胞菌的SYBR Green I实时定量PCR检测方法及其应用。

背景技术

杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)最早由Emmerich和Weible在1890年从鳟鱼中分离出并进行了描述。现已经确定杀鲑气单胞菌是气单胞菌科(Aeromonadacea)气单胞菌属(Aeromonas)的非运动性气单胞菌(non-motile aeromonads)。该菌可引起鲑鳟鱼类如大西洋鲑(Salmo salar)、褐鳟(Salmo trutta)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)等发生疖疮病或溃疡病，患病鱼表现出体侧或尾部形成特征性脓肿，严重脓肿时可出现溃烂并形成溃疡；剖检可观察到肝脏及脂肪组织有点状出血。该菌还可与气单胞菌属的其它菌如豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和温和气单胞菌(Aeromonas sobria)等混合感染，给鲑科鱼类养殖带来严重损失。此外，该菌也是一些其他水生动物疾病的原发性病原菌，可经皮肤、鳃、口及血液等途径感染除了鲑科外的其他鱼类如大菱鲆(Psetta maxima)、石鲽(Platichthys bicoloratus)、刺参(Oplopanax elatusNakai)、鲤鱼(Cyprinus carpio)等。

由杀鲑气单胞菌感染引起的鲑鳟鱼类疖疮病严重制约了养殖业的健康发展，而我国尚未研制出针对该菌的商业化疫苗，使得养殖鱼类受到杀鲑气单胞菌感染的潜在威胁更为严峻。目前，国内对杀鲑气单胞菌的检测主要依赖于传统的微生物分离、培养和鉴定方法，其操作过程费时、繁琐，且很难得到准确结果，常常延误病情诊断。随着现代分子生物学方法的不断发展，许多分子生物学诊断技术如16S rRNA PCR方法、ELISA快速检测法、LAMP检测方法、RAPD方法等均可快速检测病原。但由于杀鲑气单胞菌及其亚种的复杂性，普通PCR技术很难达到检测要求的高特异性和稳定重复性，使得在实际应用中难以推广。TaqMan探针法、SYBR GreenⅠ染料法和分子信标技术等是实时荧光定量PCR检测技术的常用方法。相比于常规PCR，实时荧光定量PCR技术的优点在于高灵敏度、可重复、易于标准化和高通量等，还可以检测常规PCR无法检测的样品，扩增和检测在同一块96孔板内完成，不需要电泳检测PCR产物，减少了污染的可能性，具有优点。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种检测或辅助检测杀鲑气单胞菌的引物。

本发明提供的检测或辅助检测杀鲑气单胞菌的引物由SEQ ID No.1所示的单链DNA分子和SEQ ID No.2所示的单链DNA分子组成。

上述引物中，所述引物1和所述引物2的摩尔量比为1:1。

本发明的第二个目的是提供一种检测或辅助检测杀鲑气单胞菌的实时荧光PCR试剂。

本发明提供的检测或辅助检测杀鲑气单胞菌的实时荧光PCR试剂包括上述引物。

上述实时荧光PCR试剂中，所述引物1和所述引物2在所述实时荧光PCR试剂中的终浓度均为0.25μmol/L。

本发明的第三个目的是提供一种检测或辅助检测杀鲑气单胞菌的试剂盒。

本发明提供的检测或辅助检测杀鲑气单胞菌的试剂盒包括上述引物或上述实时荧光PCR试剂。

本发明的第四个目的是提供上述引物或上述实时荧光PCR试剂或上述试剂盒的新用途。

本发明提供了上述引物或上述实时荧光PCR试剂或上述试剂盒在如下1)-6)中任一种中的应用：

1)检测或辅助检测杀鲑气单胞菌；

2)制备检测或辅助检测杀鲑气单胞菌的产品；

3)检测或辅助检测待测样品是否感染杀鲑气单胞菌；

4)制备检测或辅助检测待测样品是否感染杀鲑气单胞菌的产品；

5)检测或辅助检测待测样品中杀鲑气单胞菌fstA基因的拷贝数；

6)制备检测或辅助检测待测样品中杀鲑气单胞菌fstA基因的拷贝数的产品。

本发明的第五个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品是否感染杀鲑气单胞菌的方法。

本发明提供的检测或辅助检测待测样品是否感染杀鲑气单胞菌的方法包括如下步骤：

用上述引物对待测样品进行实时荧光PCR，得到PCR扩增产物；

若PCR扩增产物满足如下条件：产生扩增曲线，且Ct值为0-38，则说明待测样品感染或候选感染杀鲑气单胞菌；若PCR扩增产物不满足上述条件，则说明待测样品中不含有或候选不含有杀鲑气单胞菌。

本发明的第六个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品中杀鲑气单胞菌fstA基因的拷贝数的方法。

本发明提供的检测或辅助检测待测样品中杀鲑气单胞菌fstA基因的拷贝数的方法包括如下步骤：

用上述引物对待测样品进行实时荧光PCR，得到PCR扩增产物的Ct值；根据所述Ct值，计算所述待测样品中杀鲑气单胞菌fstA基因的拷贝数。

上述方法中，所述根据所述Ct值，计算所述待测样品中杀鲑气单胞菌fstA基因的拷贝数的方法为将Ct值代入标准曲线方程y＝-4.2552x+39.644(其中，x为lg^{fstA基因拷贝数}，y为Ct值)，计算得到fstA基因的拷贝数。所述标准曲线方程y＝-4.2552x+39.644是以lg^{fstA 基因拷贝数}为x轴，Ct值为y轴建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线。

上述方法中，所述实时荧光PCR反应的退火温度为60℃。

上述方法中，所述实时荧光PCR的模板为待测样品的基因组DNA。

本发明根据GenBank中杀鲑气单胞菌铁载受体(ferric siderophore receptor，fstA)基因序列设计并合成一对特异性引物，经过反应体系优化后建立了检测杀鲑气单胞菌的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。将fstA基因克隆到pMD18T载体上构建重组质粒pMD18T-fstA并制备标准曲线，结果显示该标准曲线的线性关系良好，扩增所得标准曲线为y＝-4.2552x+39.644，相关系数R²为0.988；熔解曲线分析显示产物为单一的特异峰。特异性检测结果表明，该方法对杀鲑气单胞菌及其亚种具有良好的特异性，与其他细菌不发生交叉反应；最低检测限为33拷贝/μL，较常规PCR的灵敏度高出约100倍。应用本发明建立的方法对人工感染的虹鳟病样进行了检测，待检样品均呈阳性反应，表明本发明的方法准确、可靠。通过上述实验证明：本发明建立的杀鲑气单胞菌的SYBR Green I实时定量PCR检测方法不仅具有特异性强、灵敏度高和重复性好的特点，相比于现有技术中的Taqman探针法，本发明不需要设计和合成有荧光标记的探针，还具有操作方便、鉴定快速和结果客观等优点，可用于杀鲑气单胞菌的快速诊断及定量检测，为鲑鳟鱼疖疮病的诊断及防控提供技术手段。

附图说明

图1为引物特异性检测结果。M：分子量标准DL2000；1-11：杀鲑气单胞菌杀鲑亚种、无色亚种、杀日本鲑亚种、史氏亚种、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌、鲁氏耶尔森菌、迟缓爱德华氏菌、金黄色葡萄球菌。

图2为SYBR Green I实时荧光定量PCR熔解曲线。

图3为用pMD18-fstA构建的实时荧光定量PCR标准曲线。其中，横坐标代表的质粒标准品浓度梯度为10²至10⁷拷贝/μL。

图4为SYBR Green I实时荧光定量PCR灵敏度检测结果。注：1-6：质粒稀释为10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹拷贝/μL。

图5为普通PCR灵敏度检测结果。注：1-8：质粒稀释为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹拷贝/μL。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、一种用于检测杀鲑气单胞菌的引物的设计及其检测方法

一、用于检测杀鲑气单胞菌的引物的设计

根据GenBank上杀鲑气单胞菌fstA基因(登录号：AM712656.1)序列，利用引物设计软件PrimerExplorer设计1对特异性引物，由苏州金唯智生物科技有限公司合成，引物序列：

AsF-F：5’-TTGTCGGCGAACCTTGTAG-3’(序列1)；

AsF-R：5’-CAAGAGCAAGACGCAGACG-3’(序列2)。

二、检测杀鲑气单胞菌的方法

以待测鱼体组织样品的基因组DNA为模板，采用步骤一的AsF-F/AsF-R引物进行荧光定量PCR，得到PCR扩增产物。

若PCR扩增产物满足如下条件：产生扩增曲线，且Ct值为0-38，则说明待测样品感染或候选感染杀鲑气单胞菌；若PCR扩增产物不满足上述条件，则说明待测样品中不含有或候选不含有杀鲑气单胞菌。

实施例2、用于检测杀鲑气单胞菌的引物的特异性检测

1、基因组DNA的提取

采用细菌基因组DNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)分别提取如下各菌株的基因组DNA：杀鲑气单胞菌杀鲑亚种、杀鲑气单胞菌无色亚种、杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种、杀鲑气单胞菌史氏亚种、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌、鲁氏耶尔森菌、迟缓爱德华氏菌、荧光假单胞菌、金黄色葡萄球菌和溶壁微球菌。各菌株的编号、拉丁名和来源见表1。

表1菌株及其来源

2、常规PCR扩增和荧光定量PCR扩增

以步骤1获得的各个菌株的基因组DNA为模板，采用步骤一中设计的引物分别进行常规PCR扩增和荧光定量PCR扩增。同时以灭菌去离子水为阴性对照。

(1)普通PCR反应体系：灭菌去离子水7μL，2×PCR premix 10μL，10μmol/L的引物AsF-F/AsF-R各1μL，DNA模板1μL；PCR反应条件为94℃预变性3min；94℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，共30个循环；最后72℃延伸5min。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，凝胶成像系统分析结果，然后采用胶回收试剂盒(购自天根生化科技有限公司)将扩增得到的电泳条带进行切胶回收并纯化；再将纯化后的PCR产物直接与pMD18-T Vector(宝生物工程有限公司)于16℃连接3h，得到重组质粒pMD18T-fstA；将pMD18T-fstA重组质粒转化到DH5α感受态细胞中，并涂布于含有Amp的LB平板上37℃过夜培养；挑取单菌落，转于含有Amp的LB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养12h后提取重组质粒进行PCR鉴定及测序。

(2)荧光定量PCR反应体系：thunderbird qPCR mix(日本toyobo公司)10.5μL，上下游引物AsF-F/AsF-R(0.25μmol/L)各0.5μL，DNA模板1μL，灭菌去离子水7.5μL，总体积为20μL。反应条件为95℃预变性30sec；95℃变性10sec；60℃退火30sec；72℃延伸30sec，共40个循环。PCR循环结束后，样品加热到95℃后马上降至60℃并保持15sec，然后按照1.75℃·s^-1递增到95℃，在60℃时收集荧光信号，建立熔解曲线。

3、检测结果

常规PCR检测结果显示，AsF-F/AsF-R引物的特异性表现良好，以杀鲑气单胞菌杀鲑亚种、无色亚种、杀日本鲑亚种和史氏亚种的基因组DNA为模板进行PCR均扩增出大小为170bp的目的条带，而供试其他病原菌：嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌、鲁氏耶尔森菌、迟缓爱德华氏菌、荧光假单胞菌、金黄色葡萄球菌、溶壁微球菌的结果均为阴性(图1)。

SYBR Green I Real-time PCR检测结果同样证明了引物具有良好的特异性，从SYBR Green I实时荧光定量PCR熔解曲线可以看出：只有杀鲑气单胞菌杀鲑亚种、无色亚种、杀日本鲑亚种和史氏亚种有单一的产物吸收峰，而供试其他病原菌：嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌、鲁氏耶尔森菌、迟缓爱德华氏菌、荧光假单胞菌、金黄色葡萄球菌和溶壁微球菌均未检测到特异的产物吸收峰(图2)。由熔解曲线可知，Tm值在86.5-86.9℃范围内，表明反应过程中未出现非特异性扩增和引物二聚体。

实施例3、一种用于检测杀鲑气单胞菌的引物的灵敏度检测

一、制备质粒标准品

用微量紫外可见分光光度计测定实施例2步骤二的2中的(1)获得的含有pMD18T-fstA重组质粒的溶液的浓度和纯度，根据摩尔定律计算出单位体积pMD18T-fstA重组质粒所含的DNA拷贝数，并将该重组质粒作为标准品，计算公式如下：

其中，质粒浓度为105ng/μL；质粒体积为1μL；载体长度：2692bp；片段长度为170bp。最终计算结果：每μL重组质粒所含的DNA拷贝数为3.3×10¹⁰。

二、荧光定量PCR的灵敏度

将含有pMD18T-fstA重组质粒的溶液进行10倍梯度稀释，稀释成10⁹拷贝/μL至10¹拷贝/μL。取10⁶至10¹拷贝/μL共6个稀释度的质粒标准品作为模板，采用引物AsF-F/AsF-R进行荧光定量PCR扩增，扩增体系和方法同实施例2步骤二的2中的(2)，并以lg^{质粒拷贝数(fstA基因拷贝数)}为x轴，以Ct值为y轴，构建SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线，所能检出的最低起始模板浓度即为SYBR Green I实时荧光定量PCR的灵敏度。

SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线方程为y＝-4.2552x+39.644，相关系数R²为0.988，由标准曲线可以看出(图3)，质粒拷贝数与PCR的Ct值之间呈现良好的线性关系。且SYBR Green I实时荧光定量PCR方法对重组质粒进行扩增最低检测限为33拷贝/μL(图4)。

三、常规PCR的灵敏度

取10⁸至10¹拷贝/μL共8个稀释度的质粒标准品为模板，利用AsF-F/AsF-R引物进行常规PCR，扩增体系和方法同实施例2步骤二的2中的(1)。

常规PCR在模板浓度为3.3×10⁴拷贝/μL时能观察到目的条带(图5)，在浓度为3.3×10³时的条带亮度很弱比较模糊，由此可以看出荧光定量PCR的灵敏度比常规PCR高100倍。

四、标准曲线的重复性检测

选取构建好的pMD18T-fstA重组质粒稀释6个梯度，每个梯度设3个重复，比较在同一次实验中3个重复间的均一性，并通过组内的Ct值变异系数(标准偏差/重复值平均数)评价该方法的重复性。具体步骤如下：

分别以10²至10⁷拷贝/μL共6个稀释度的质粒标准品为模板，采用引物AsF-F/AsF-R进行荧光定量PCR扩增，扩增体系和方法同实施例2步骤二的2中的(2)，每个梯度选取3个重复管，进行组内SYBR Green I荧光PCR重复性分析，计算其Ct均值、标准差和变异系数。

结果如表2所示，标准品浓度在10²至10⁷拷贝/μL之间的3个重复的Ct值基本一致，标准差在0.073-0.454之间，变异系数在0.25-2.92％之间。统计结果表明，本发明所建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法重复性好，可进行稳定、可靠的检测。

表2以pMD18-fstA重组质粒为标准模板的实时荧光定量PCR重复试验

实施例4、SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的应用

为评价杀鲑气单胞菌SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的有效性，利用杀鲑气单胞菌人工感染健康虹鳟鱼，于攻毒后1d、3d和7d，采集感染杀鲑气单胞菌的虹鳟鱼的鳃、肝和肠组织进行研磨作为待测样品，并提取基因组DNA，按实施例2步骤二的2中的(2)的方法进行SYBR Green I实时荧光定量PCR检测，并通过待测样品的扩增曲线图及Ct值进行结果判断。

结果显示，待测样品均产生扩增曲线，且Ct值均为0-38范围内，均呈阳性反应。不同待测样品的PCR对应的Ct值见表3。将Ct值代入实施例3中已建立的标准曲线y＝-4.2552x+39.644(其中，x为lg^{fstA基因拷贝数}，y为Ct值)，计算出对应fstA基因的拷贝数。计算结果如表4所示。

表3待检样品实时荧光定量PCR检测的Ct值

表4待检样品Ct值所对应基因的拷贝数

因此可以通过如下方法检测或辅助检测待测样品中杀鲑气单胞菌fstA基因的拷贝数：用AsF-F/AsF-R引物对待测样品进行实时荧光PCR，得到PCR扩增产物的Ct值；然后将Ct值代入标准曲线y＝-4.2552x+39.644(其中，x为lg^{fstA基因拷贝数}，y为Ct值)，计算待测样品中杀鲑气单胞菌fstA基因的拷贝数。

序列表

<110> 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所

<120> 杀鲑气单胞菌的SYBR Green I实时定量PCR检测方法及其应用

<160> 2

<210> 1

<211> 19bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

ttgtcggcga accttgtag 19

<210> 2

<211> 19bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

caagagcaag acgcagacg 19

Claims (6)

1.一种检测或辅助检测杀鲑气单胞菌的引物，由SEQ ID No.1所示的单链DNA分子和SEQ ID No.2所示的单链DNA分子组成；所述SEQ ID No.1所示的单链DNA分子为引物1，所述SEQ ID No.2所示的单链DNA分子为引物2。

2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：所述引物1和所述引物2的摩尔量比为1:1。

3.一种检测或辅助检测杀鲑气单胞菌的实时荧光PCR试剂，包括权利要求1或2所述的引物。

4.根据权利要求3所述的实时荧光PCR试剂，其特征在于：所述引物1和所述引物2在所述实时荧光PCR试剂中的终浓度均为0.25 μmol/L。

5.一种检测或辅助检测杀鲑气单胞菌的试剂盒，包括权利要求1或2所述的引物或权利要求3或4所述的实时荧光PCR试剂。

6.权利要求1或2所述的引物或权利要求3或4所述的实时荧光PCR试剂或权利要求5所述的试剂盒在如下1）-3）中任一种中的应用：

1）制备检测或辅助检测杀鲑气单胞菌的产品；

2）制备检测或辅助检测待测样品是否感染杀鲑气单胞菌的产品；

3）制备检测或辅助检测待测样品中杀鲑气单胞菌fstA基因的拷贝数的产品。