CN113832241A

CN113832241A - 一种rpa-lfs快速检测杀鲑气单胞菌的探针及引物组、试剂盒、检测方法

Info

Publication number: CN113832241A
Application number: CN202110998379.XA
Authority: CN
Inventors: 司鑫鑫; 谷庆花; 高嵩; 李铭远; 张晓�; 赵陈洁
Original assignee: Jiangsu Ocean University
Current assignee: Jiangsu Ocean University
Priority date: 2021-08-27
Filing date: 2021-08-27
Publication date: 2021-12-24

Abstract

本发明涉及生物检测领域，特别涉及一种RPA‑LFS快速检测杀鲑气单胞菌的探针及引物组、试剂盒、检测方法。本发明公开的一种RPA‑LFS快速检测杀鲑气单胞菌的探针及引物组中所述探针序列如SEQID NO.1所示，所述引物组序列分别为SEQID NO.2和SEQID NO.3，本发明还公开了一种检测杀鲑气单胞菌检测方法，反应快速灵敏，操作简单。

Description

一种RPA-LFS快速检测杀鲑气单胞菌的探针及引物组、试剂盒、检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及一种RPA-LFS快速检测杀鲑气单胞菌的探针及引物组、试剂盒、检测方法。

背景技术

现有技术中对杀鲑气单胞菌的检测主要有传统的培养法，免疫诊断和核酸检测。培养法主要依靠常规的微生物生理生化鉴定方法，操作过程繁琐、费时，常常延误病情诊断。免疫诊断主要有童裳亮等利用ELISA技术建立了快速检测水样中杀鲑气单胞菌的方法，其方法原理是结合抗原抗体免疫反应和酶的高效催化反应，可实现对结果的可视化观察，但该技术操作过程较为繁琐，灵敏度低并容易出现交叉反应。

针对该菌的特异性核酸检测技术已陆续被开发出来，包括PCR、qPCR和LAMP。Beaz-Hidalgo等人评估建立的PCR方案，旨在检测鱼组织中的杀鲑气单胞菌；刘宗晓等利用vapA基因建立了杀鲑气单胞菌的TaqMan探针实时定量检测方法。基于PCR扩增技术特异性强、灵敏度高但需依赖昂贵的仪器和专业的操作人员，且不适用于现场检测。随着检测技术的进一步发展，恒温扩增被开发出来，Savan等根据gyrB基因设计了特异性引物并应用环介导等温扩增技术LAMP来检测大西洋鳕鱼非典型疖病的病原杀鲑气单胞菌，结果显示其灵敏度高出普通PCR 10倍。该方法操作简便，结果根据肉眼观察即可，无需特殊的PCR仪器及电泳步骤，在生产实践上应用前景广阔。但环介导等温扩增技术也存在诸多不足，如引物设计复杂，一旦发生非特异性扩增结果难以鉴别。因此，寻找更加有效的检测技术是养殖业的重要任务。

发明内容

本发明旨在提供一种反应快速灵敏，操作简单的检测杀鲑气单胞菌的探针及引物组，并进一步探索了检测所需最佳扩增温度和时间。

为了实现上述目的，本发明具体采用如下技术方案：

一种RPA-LFS快速检测杀鲑气单胞菌的引物组，所述引物组的正向引物和反向引物序列分别为SEQID NO.2和SEQID NO.3。

一种RPA-LFS快速检测杀鲑气单胞菌的探针，所述探针序列如SEQID NO.1所示。

优选的，所述探针的5’端用FITC或DIG标记，所述探针的序列第31位碱基由THF进行替换，所述探针的3'用C3-spacer进行末端封闭。

优选的，所述引物的反向引物5'端用生物素进行标记。

一种试剂盒，其含有前述任一项所述的RPA-LFS快速检测杀鲑气单胞菌的探针及引物组。

一种RPA-LFS快速检测杀鲑气单胞菌的方法，包括如下步骤：

采用前述所述的引物组和探针使用TwistAmp nfo试剂盒对杀鲑气单胞菌基因进行扩增，扩增温度为30～40℃，扩增时间为10min～30min。

具体的操作为：TwistAmp^TM DNA Amplication nfo Kit反应体系以50μL计，其中包括29.5μL试剂盒中的反应缓冲液，2.1μL前述所述的正向引物、2.1μL前述所述的反向引物，0.6μL前述所述的探针，ddH2O 12.2μL、1μL待检测的模板(基因组DNA)，2.5μL醋酸镁，所述添加的正向引物、反向引物、探针的浓度均为10μmol/L，所述添加的醋酸镁的浓度为280mmol/L；离心同时启动反应。短暂离心后，立即将反应混合物在37℃下孵育30min，反应结束后，取8-10μL扩增产物滴加到样品垫上，将试纸条的样品垫向下插入含有100μL缓冲溶液中判读结果。

优选的，所述扩增温度为37℃，扩增时间为25min。

有益效果

本发明检测方法快速灵敏，操作简单，可通过肉眼观察实验结果，且特异性好，不受其他杂质的干扰，不需要借助其他仪器设备，可实现现场快速检测。

附图说明

图1三组引物和探针对杀鲑气单胞菌扩增的琼脂糖凝胶电泳的检测结果图。

图2使用引物组1分别检测上述12中菌种的扩增的琼脂糖凝胶电泳检测结果图。

图3使用引物组2分别检测上述12中菌种的扩增的琼脂糖凝胶电泳检测结果图。

图4使用引物组3分别检测上述12中菌种的扩增的琼脂糖凝胶电泳检测结果图。

图5使用引物组1在不同温度下扩增检测结果图。

图6使用引物组1在不同扩增时间的检测结果图。

图7使用引物组1特异性检测结果图。

图8使用引物组1的灵敏度检测结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

下面结合附图对本发明进行详细说明，以方便本领域技术人员理解本发明。

1、下述实施例所用菌种来源以及模板制备

细菌菌株包括温和气单胞菌(ATCC 43979)，豚鼠气单胞菌(ATCC 15468)，维氏气单胞菌(ATCC 35624)，哈维氏弧菌(ATCC 14126)，灿烂弧菌(ATCC 33125)和荧光假单胞菌(ATCC 13525)购自ATCC菌种保藏中心，并用于本研究。杀鲑气单胞菌(ATCC 33658)，嗜水气单胞菌(ATCC 13040)，溶藻弧菌(ATCC 17749)，副溶血弧菌(ATCC 17802)，迟缓爱德华氏菌(CICC 10630)，小肠耶尔森氏菌(ATCC 23715)由本实验室保存。上述所有菌均通过16SrRNA测序验证，即所有菌通过PCR使用16SrRNA通用引物进行扩增，将产物送测序，并使用NCBI-Blast进行确认。

将上述保存的杀鲑气单胞菌菌株在琼脂培养基上划线培养，挑取单菌落，接种于液体LB培养基中，28℃，200r/min震荡培养12h，至OD＝0.6，取1ml菌液进行平板计数，将菌液稀释至10⁶cfu/mL，并加热至100℃裂解10min，获得杀鲑气单胞菌的基因组DNA(10⁶cfu/mL)，-20℃冷冻保存备用。

2、主要试剂及仪器

TwistAmp^TM DNAAmplication nfo Kit购自英国TwistDx公司；快速检测试纸条及缓冲液购自杭州优思达生物技术有限公司；第三代升级组织研磨器购自天根生化科技(北京)有限公司。

3、引物和探针设计

根据杀鲑气单胞菌的铁载受体(fstA)基因的保守序列设计探针和三组引物，然后由人工合成。

探针和三组引物序列如下：

表1探针和三组引物序列

上表中的扩增长度指的是引物组正反引物扩增的长度。

4、引物筛选

利用普通PCR进行引物筛选，配置反应体系：Taq-HS PCR Master Mix(2×)10μL，10μmol/L的正反引物各1μL，ddH₂O 7μL，DNA模板1μL；PCR反应条件：95℃预变性2min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸20s，共30个循环；最后72℃延伸5min。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后由凝胶成像系统分析结果。

利用上述表格1中设计好的引物，以杀鲑气单胞菌基因组DNA为模板进行常规PCR扩增，以ddH₂O为阴性对照，验证所设计引物组的扩增性能。

分别采用上述表格1中的三组引物使用上述体系对12种菌种基因进行扩增，12种菌种分别为：1：杀鲑气单胞菌；2：嗜水气单胞菌；3：温和气单胞菌；4：豚鼠气单胞菌5：维氏气单胞菌；6：哈维氏弧菌；7：灿烂弧菌；8：溶藻弧菌；9：副溶血弧菌；10：迟缓爱德华氏菌；11：小肠耶尔森氏菌；12：荧光假单胞菌。采用ddH₂O作为空白对照组，也即N组。

如图1所示，为分别使用上述表格中的三组引物对杀鲑气单胞菌扩增的琼脂糖凝胶电泳的检测结果。从图中可以看出，三组引物均可检测出杀鲑气单胞菌。

如图2所示，为使用引物组1分别检测上述12中菌种的扩增检测结果，图中的1～12分别依次对应上述12种菌种，NTC为空白对照组，M为D2000 Plus DNA Ladder，从图中可以看出，引物组1只可以扩增1号菌种，也即杀鲑气单胞菌，对于其他菌则无扩增效果。

如图3所示，为使用引物组2分别检测上述12中菌种的扩增检测结果，图中的1～12分别依次对应上述12种菌种，NTC为空白对照组，M为Marker Ⅳ，从图中可以看出，引物组2对1～6号菌、9号菌均有明显的扩增效果。

如图4所示，为使用引物组3分别检测上述12中菌种的扩增检测结果，图中的1～12分别依次对应上述12种菌种，NTC为空白对照组，M为D2000 Plus DNA Ladder，从图中可以看出，引物组3对2号菌有明显的非特异性扩增。

因此选取引物组1和探针的组合作为杀鲑气单胞菌的引物和探针组。

将上述引物组1的反向引物5'端用生物素进行标记；探针的5’端用FITC标记，探针的序列第31位碱基由THF进行替换，探针的3'用C3-spacer进行末端封闭。也即合成如下的探针和引物以进行后续实验步骤：

表2修饰后的探针和引物组序列

5、RPA扩增条件筛选

TwistAmp^TM DNA Amplication nfo Kit反应体系以50μL计，包括29.5μL反应缓冲液，2.1μL正向引物、2.1μL反向引物，0.6μL探针，ddH₂O 12.2μL、1μL基因组DNA，2.5μL醋酸镁，所述添加的正向引物、反向引物、探针的浓度均为10μmol/L，所述添加的醋酸镁的浓度为280mmol/L；离心同时启动反应。短暂离心后，立即将反应混合物在37℃下孵育30min，反应结束后，取8-10μL扩增产物滴加到样品垫上，将试纸条的样品垫向下插入含有100μL缓冲溶液中判读结果。

使用上述扩增体系，采用表格2中的引物组1和探针，分别测试30℃、35℃、37℃、40℃和45℃温度下扩增的结果，并设置一组空白对照组NTC组，即37℃，模板为ddH₂O，反应时间均为30min，所得扩增产物取8-10μL扩增产物滴加到样品垫上，将试纸条的样品垫向下插入含有100μL缓冲溶液中，5min左右读取结果。最终结果如图5所示，图5的每个温度下试纸条的上方条带为质控线，下方条带为检测线，检测线是抗FITC抗体结合的扩增产物迁移至链霉亲和素标记的检测线时被捕获形成的信号带，质控线是未与扩增产物结合的抗体分子继续迁移到质控线形成信号带。可以看出，在30～40℃条件下，均能扩增，37℃下扩增效果最佳。

使用上述扩增体系，采用引物组1和探针，在37℃下，分别扩增10、15、20、25、30分钟，并设置一组空白对照组NTC组，即25min，模板为ddH₂O，扩增效果如图6所示，可以看出，在20～30min内均有明显扩增，在25min时，扩增效果最佳。

6、引物特异性验证

使用前述扩增体系，在37℃下，采用引物组1和探针，分别对12种菌的基因组进行试纸条检测，12种菌分别为：1：杀鲑气单胞菌；2：嗜水气单胞菌；3：温和气单胞菌；4：豚鼠气单胞菌5：维氏气单胞菌；6：哈维氏弧菌；7：灿烂弧菌；8：溶藻弧菌；9：副溶血弧菌；10：迟缓爱德华氏菌；11：小肠耶尔森氏菌；12：荧光假单胞菌，设置空白对照组NTC组，试纸条检测如图7所示。可以看出本发明的引物组1和探针针对多种菌具有很好的特异性。

7、灵敏度测试

将杀鲑气单胞菌按照如下五种培养方式进行培养：

纯培养(A)：取1ml杀鲑气单胞菌培养菌液进行平板涂布计数，并用蒸馏水进行稀释，得到5×10²～5×10⁶CFU/ml和4×10³～1×10³CFU/mL的菌液，并将菌液加热至100℃裂解10min。取1μL不同浓度的基因组DNA为模板，即每个反应中加入5×10^-1～5×10³CFU和4×10⁰～1×10⁰CFU的模板；

肠道组织(B)、肾脏组织(C)、脾脏组织(D)、肌肉组织(E)培养方式为：

当地市场购买健康鲤鱼，经国标培养法(GB/T 15805.6-2008)检测无杀鲑气单胞菌污染。用手持式组织研磨器将肠，肾，脾和肌肉组织分别匀浆。每种匀浆进行如下操作：取1g匀浆悬浮在10mL PBS中，并掺入所需量的杀鲑气单胞菌。将悬浮液加热至100℃孵育10分钟，5,000g离心5分钟，取1μL上清液用作模板进行本研究所建立的方法反应，每个扩增反应初始加入的模板分别为1×10²CFU、1×10¹CFU、1×10⁰CFU、1×10^-1CFU。

然后针对五种方式培养出来的菌各自检测其灵敏度，按照上述扩增体系优化后的最佳反应条件，进行检测杀鲑气单胞菌的RPA-LFS的灵敏度。

结果如图8所示，图8中A～E结果分别对应上述五种培养方式，从图中可以看出，无论是何种培养方式，本发明的引物组1和探针对杀鲑气单胞菌的最低检出限为1CFU/反应。也即，即使对采用动物组织培养的方式所得到的DNA检测时，即便模板DNA中存在大量杂质，也不影响本发明的检测的准确性和灵敏度。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏海洋大学

<120> 一种RPA-LFS快速检测杀鲑气单胞菌的探针及引物组、试剂盒、检测方法

<130> 202108

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

atcctgaatg ttaaagcccc atctgttgca tcctgcagcg ctcgcc 46

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

gacaatcaat cacctcctcg aatagaa 27

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

cagccgggat actgaggctt tttgtg 26

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 4

cggaaaacag aaggagacaa tcaatcacct c 31

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 5

cagagagcca gccgggatac tgaggctttt 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 6

tcggaaaaca gaaggagaca atcaatcacc 30

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 7

agagagccag ccgggatact gaggctttt 29

Claims

1.一种RPA-LFS快速检测杀鲑气单胞菌的引物组，其特征在于，所述引物组的正向引物和反向引物的序列分别为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。

2.一种RPA-LFS快速检测杀鲑气单胞菌的探针，其特征在于，所述探针序列如SEQ IDNO.1所示。

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针的5’端用FITC或DIG标记，所述探针的序列第31位碱基由THF进行替换，所述探针的3'用C3-spacer进行末端封闭。

4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的引物组和权利要求2～3任一项所述的探针。

5.一种RPA-LFS快速检测杀鲑气单胞菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

采用权利要求1所述的引物组和权利要求2～3任一项所述的探针使用TwistAmp nfo试剂盒对杀鲑气单胞菌基因进行扩增，扩增温度为30～40℃，扩增时间为10min～30min。

6.根据权利要求5所述的RPA-LFS快速检测杀鲑气单胞菌的方法，其特征在于，所述TwistAmp nfo试剂盒具体操作为，以50μL计：

29.5μL试剂盒反应缓冲液，2.1μL权利要求1所述的正向引物、2.1μL权利要求1所述的反向引物，0.6μL权利要求2或3所述的探针，ddH₂O 12.2μL、1μL基因组DNA、2.5μL醋酸镁，所述添加的正向引物、反向引物、探针的浓度均为10μmol/L，所述添加的醋酸镁的浓度为280mmol/L；

将上述体系离心后在30℃～40℃下孵育10min～30min后得到扩增产物；

检测扩增产物。

7.根据权利要求5所述的RPA-LFS快速检测杀鲑气单胞菌的方法，其特征在于，所述扩增温度为37℃，扩增时间为25min。