CN114540513A

CN114540513A - 一种rpa-lfs快速检测嗜水气单胞菌的引物和探针组合物及方法

Info

Publication number: CN114540513A
Application number: CN202111675084.5A
Authority: CN
Inventors: 高嵩; 曾丽媚; 余泓; 张迪; 王昱
Original assignee: Jiangsu Ocean University
Current assignee: Jiangsu Ocean University
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2022-05-27

Abstract

本发明涉及分子诊断技术领域，特别涉及一种RPA‑LFS快速检测嗜水气单胞菌的引物和探针组合物及方法。所述组合物包括SEDQ ID NO.1所述的正向引物、SEDQ ID NO.2所述的反向引物以及SEDQ ID NO.3所述的探针。本发明的引物和探针组合物和检测方法，能准确检测出嗜水气单胞菌，且无假阳性结果，特异性强，灵敏度高，且检测快速。

Description

一种RPA-LFS快速检测嗜水气单胞菌的引物和探针组合物及方法

技术领域

本发明涉及分子诊断技术领域，特别涉及一种RPA-LFS快速检测嗜水气单胞菌的引物和探针组合物及方法。

背景技术

现有技术中生化培养法是嗜水气单胞菌检测的国家标准，该方法操作复杂，首先需要进行菌株培养，然后通过生化试验鉴定嗜水气单胞菌及其致病性，检测时间在五天以上，往往导致疾病的恶化和蔓延。

Pollard等根据嗜水气单胞菌的aer基因，建立了PCR方法。Griffin等建立了检测嗜水气单胞菌的qPCR方法。PCR与qPCR是快速、特异、灵敏的核酸扩增技术，然而均需要昂贵的热循环设备和专业人员，一般在实验室适用，不适合现场或资源有限的地区的应用。蔡怡等根据嗜水气单胞菌的gyrB基因建立了LAMP-LFD检测方法，该方法操作简单，实现了结果可视化，但是由于需要引物较多，引物设计上较为困难，且容易出现假阳性问题。Meng等建立了嗜水气单胞菌的CPA检测方法，结果根据荧光进行主观判断,人为因素干扰较大；Yang等根据嗜水气单胞菌的Hly基因，建立了荧光定量RPA检测方法，该方法无需热循环仪、特异性强、灵敏度高，然而需要能够激发和检测荧光团的恒温装置。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是现有技术中检测嗜水气单胞菌时间长，操作不便，容易出现假阳性且受其他因素干扰大的问题。

为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：

一种RPA-LFS快速检测嗜水气单胞菌的引物和探针组合物，所述引物和探针组合物包括SEDQ ID NO.1所述的正向引物、SEDQ ID NO.2所述的反向引物以及SEDQ ID NO.3所述的探针。

优选的，所述反向引物的5’端标记有生物素，所述探针第31位碱基替换为THF，所述探针的5’端标记有荧光基团，所述SEDQ ID NO.3所述的探针的3’端具有SpC3修饰。

优选的，所述的探针的5’端荧光基团为FITC。

一种RPA-LFS快速检测嗜水气单胞菌的方法，采用前述任一项所述的引物和探针组合物检测嗜水气单胞菌。

优选的，所述方法包括如下步骤：

模板1μL，浓度为10μM正向、反向引物各2.1μL，浓度为10μM探针0.6μL，缓冲液29.5μL，去离子无菌水12.2μL，混匀，添加浓度为280μM的2.5μL醋酸镁启动反应，并在37℃孵育20min。

有益效果

本发明根据嗜水气单胞菌的aerA基因，建立一种嗜水气单胞菌的RPA-LFS检测方法，构建出合适的的引物探针组，能准确检测出嗜水气单胞菌，且无假阳性结果；

本发明的引物和探针组合物及检测方法特异性强，与其他水产养殖与食品安全致病菌无交叉反应；

本发明的引物和探针组合物及检测方法灵敏度高，检测限为单次反应10CFU；

本发明检测快速，在25min内即可完成；

本发明利用人体温度进行反应及用试纸条呈现结果，摆脱了仪器依赖，操作更简便，更加适用于嗜水气单胞菌的现场检测。

附图说明

图1本发明所有引物组的扩增性能结果图。

图2本发明引物组F2+R1的扩增特异性结果图。

图3本发明引物组F3+R1的扩增特异性结果图。

图4本发明RPA-LFS反应体系检测结果图。

图5本发明RPA-LFS检测方法的特异性结果图。

图6本发明RPA-LFS检测方法的灵敏度结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

表1本发明所涉及核酸序列

表2修饰后的核酸序列

步骤1.菌株来源

温和气单胞菌(ATCC 43979)、豚鼠气单胞菌(ATCC 15468)、维氏气单胞菌(ATCC35624)、异常嗜糖气单胞菌(ATCC 51208)购自美国American Type CultureCollection(ATCC)菌种保藏中心。

嗜水气单胞菌(ATCC 13040)、杀鲑气单胞菌(ATCC 33658)、副溶血弧菌(ATCC17802)、迟缓爱德华氏菌(CICC 10630)、小肠耶尔森氏菌(ATCC 23715)、铜绿假单胞菌(ATCC9027)、单增李斯特菌(ATCC 19115)、金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)由本实验室保存。以上菌株均经过了16S rRNA测序确认。

上述菌株编号ATCC的购自美国American Type Culture Collection(ATCC)菌种保藏中心，编号CICC的购自中国菌种资源库。

步骤2.主要试剂

PCR试剂

Taq-HS PCRMaster Mix购自江苏愚公生命科技有限公司；RPA试剂盒TwistAmp nfo Kit购自英国TwistDx Inc公司；一次性核酸检测试纸条购自杭州优思达生物技术有限公司。

步骤3.引物及探针的设计与合成

根据嗜水气单胞菌aerA基因(GenBank accession no.MF315078.1)的序列，利用NCBI Primer-BLAST设计特异性引物。然后使用Geneious软件在正反引物定义的扩增子区域设计探针。根据TwistAmp nfo Kit说明书的要求并配合LFS显色需求，探针的5’端修饰FITC基团，第31位碱基以四氢呋喃(THF)基团取代，3’端修饰SpC3基团；反向引物的5’端修饰生物素基团；所设计的引物和探针序列见表1。引物和探针由通用生物系统(安徽)有限公司合成。

步骤4.模板制备

取嗜水气单胞菌标准菌株划线至LB固体培养基，30℃过夜培养，挑取LB固体培养基中的单菌落接种至LB液体培养基中，LB液体培养基在30℃，200r/min培养至OD600＝0.6，取1ml菌液进行平板计数，将菌液稀释至10⁶CFU/mL,在100℃中煮沸裂解10min，获得基因组模板，-20℃保存备用。

步骤5.PCR反应体系及电泳检测

PCR实验根据

Taq-HS PCRMaster Mix说明书进行。在50μL反应体系中，添加了上述步骤制备的基因组模板1μL，正向、反向引物(10μM)各1μL，Taq-HS PCRMaster Mix(2X)25μL，去离子水22μL。反应条件为预变性94℃,2min；变性94℃,30sec；退火59℃,30sec；延伸72℃,12sec；变性、退火与延伸进行30个循环。PCR反应的扩增产物使用2％琼脂糖凝胶电泳进行分析。应用PCR方法，测试了表1中设计的几个引物组的扩增性能与扩增特异性。结果如图1-3所示，图1表明，引物组F2+R1与F3+R1扩增出目的片段，F1+R1扩增产生了2条扩增条带，其中1条为非特异扩增条带，说明F1+R1的扩增特异性有问题，不宜选择。扩增性能良好。图2和图3显示，在扩增特异性方面，F2+R1引物组与杀鲑气单胞菌有交叉反应，F3+R1引物组只在有嗜水气单胞菌模板下有扩增，与其他致病菌无交叉反应。

步骤6.RPA-LFS反应体系

RPA反应体系按照TwistAmp DNAAmplification nfo Kit说明书进行。在冻干粉管中，添加上述步骤制备的模板1μL，正向、反向引物(10μM)各2.1μL，探针(10μM)0.6μL，nfo配套缓冲液29.5μL，去离子无菌水12.2μL，混匀。添加2.5μL醋酸镁(280mM)启动反应，并在37℃孵育20min。

RPA扩增完成后，取5μL扩增产物滴加到核酸检测试纸条(LFS)的样品垫上，然后将试纸条的样品垫向下插入含有100μL侧向流缓冲液(主要成分为PBS和Tween-20)的离心管中，5min后观察试纸条检测结果。检测结果如图4所示，结果表明，利用F3+P+R1引物探针组检测嗜水气单胞菌的RPA-LFS反应体系性能良好，无假阳性信号产生。

步骤7.RPA-LFS特异性检测

将温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌、异常嗜糖气单胞菌、杀鲑气单胞菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌、小肠耶尔森氏菌、铜绿假单胞菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌均进行培养，取10⁶CFU/mL各菌液，100℃中煮沸裂解10min，以其为模板，同时设置嗜水气单胞菌和无模板对照组，按照步骤6中反应体系进行RPA-LFS反应，检测嗜水气单胞菌的RPA-LFS的特异性。结果如图5所示，结果表明，除嗜水气单胞菌模板外，其他致病菌模板的RPA-LFS检测结果均为阴性。

步骤8.RPA-LFS灵敏度检测

按照步骤4的方法，将嗜水气单胞菌培养至OD600＝0.6，取1ml培养菌液进行平板涂布计数，并用蒸馏水进行稀释，得到100CFU/μL、10¹CFU/μL、10²CFU/μL、10³CFU/μL，并将菌液加热至100℃裂解10min，以其为模板。取1μL不同浓度的基因组DNA为模板，同时设置无模板对照组(NTC组)，按照步骤6中反应体系进行RPA-LFS反应，检测嗜水气单胞菌的RPA-LFS的灵敏度。结果如图6所示，结果表明，所建立的RPA-LFS检测嗜水气单胞菌的最低检出限为10CFU/反应。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 江苏海洋大学

<120> 一种RPA-LFS快速检测嗜水气单胞菌的引物和探针组合物及方法

<130> 20211231

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

cttctcgctc agcccatagg tatcggt 27

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

aaacatggtg atgtgacgca gaagaatcgc cag 33

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

cttctcgctc agcccatagg tatcggtgtt 30

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

acttgaactt gttgttggtg gtctcattat cgc 33

<210> 5

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

gaccagttgg tgtcggtaga gtaacgcagg gtgacagcat agcagga 47

Claims

1.一种RPA-LFS快速检测嗜水气单胞菌的引物和探针组合物，其特征在于，所述引物和探针组合物包括SEDQ ID NO.1所述的正向引物、SEDQ ID NO.2所述的反向引物以及SEDQID NO.3所述的探针。

2.根据权利要求1所述的引物和探针组合物，其特征在于，所述反向引物的5’端标记有生物素，所述SEDQ ID NO.3所述的探针第31位碱基替换为THF，所述探针的5’端标记有荧光基团，所述SEDQ ID NO.3所述的探针的3’端具有SpC3修饰。

3.根据权利要求1所述的引物和探针组合物，其特征在于，所述的探针的5’端荧光基团选自FITC。

4.一种RPA-LFS快速检测嗜水气单胞菌的方法，其特征在于，采用权利要求1-3任一项所述的引物和探针组合物检测嗜水气单胞菌。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：