TWI658048B - 檢測美人魚發光桿菌殺魚亞種之特異性引子及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本發明係關於可直接且快速檢測樣品中美人魚發光桿菌殺魚亞種( Photobacterium damselaesubsp. piscicida)之特異性引子對以及該引子對之使用方法。本發明亦關於同時檢測美人魚發光桿菌殺魚亞種及美人魚發光桿菌美人魚亞種( P. damselaesubsp. damselae)之多套式聚合酶鏈鎖反應(multiplex PCR)之引子對組合及其使用方法。本發明中所使用的方法及引子可實際應用於生物樣品、食品或其他產品。

Description

檢測美人魚發光桿菌殺魚亞種之特異性引子及其使用方法

本發明關於快速檢測之領域。特定言之，本發明提供直接且快速檢測樣品中美人魚發光桿菌殺魚亞種( Photobacterium damselaesubsp. piscicida)之特異性引子對以及該引子對之使用方法，以及同時檢測美人魚發光桿菌美人魚亞種( P. damselaesubsp. damselae)之多套式聚合酶鏈鎖反應(multiplex PCR) 之引子對組合及其使用方法。

美人魚發光桿菌( Photobacterium damselae)為革蘭氏陰性的海洋細菌、短桿狀，大小介於1.8至2.4μm，適合生長溫度介於18至25℃，高於40℃會死亡，適合生長的酸鹼值範圍在6至8之間，最適生長鹽濃度為3%，屬於兼性厭氧菌。美人魚發光桿菌有兩個亞種，分別為美人魚發光桿菌美人魚亞種( P. damselaesubsp. damselae)與美人魚發光桿菌殺魚亞種( P. damselaesubsp . piscicida)，這兩個亞種在部分的生理生化特性上有所差異，如運動性、利用葡萄糖發酵產氣、硝酸鹽還原、尿素酶、脂肪酶、澱粉酶、溶血素等；雖然美人魚發光桿菌美人魚亞種與美人魚發光桿菌殺魚亞種 都是引起魚類疾病的病原體，但兩個亞種的致病機制不同；美人魚發光桿菌美人魚亞種除了會造成魚病，還具有還具有產組織胺的能力，且會感染人類受傷的皮膚而致病。 美人魚發光桿菌殺魚亞種是普遍存在於海洋環境的嗜鹽性細菌，會造成海魚巴斯德桿菌症 (pasteurellosis)，是台灣養殖海鱺最常見的細菌性疾病之一，尤其是好發於海上箱網，感染之魚隻魚體色變黑、消瘦，肝、腎、脾等臟器會出現白色結節，又稱為類結節症、假性結核病（pseudotuberculosis）或巴斯德桿菌症（pasteurellosis），發病率逾六成，致死率達五成以上。過去研究發顯示針對美人魚發光桿菌殺魚亞種進行分子生物學及生化特性分析，美人魚發光桿菌殺魚亞種與美人魚發光桿菌美人魚亞種具有80%以上的親緣性。 一般而言，以往鑑別美人魚發光桿菌之方法主要是運用外表型態學(諸如運動性測試(motility test))、傳統生化檢測(諸如氧化酶測試(oxidase test)、硝酸還原測試(nitrate reduction)、利用葡萄糖產氣(gas production form D-glucose)、甘油代謝測試(glycerol test)、纖維二糖測試(cellobiose)、肝糖測試(glycogen))及飛行時間質譜儀光譜分析。就生化測試而言，針對美人魚發光桿菌殺魚亞種，亦可藉由該亞種能利用葡萄糖、甘露糖、半乳糖及果糖產生酸，但不會產生氣體，無法生長於TCBS培養基之特性，及會產生脂解酶(lipase)及磷脂解酶(phospholipase)但無法產生脲酶(urease)、鹼性磷酸酶(phosphatase)及離胺酸脫羧酶(lysine decarboxylase)之特性進行鑑別；或是利用商業鑑定套組 API 20E，其標準鑑定結果碼為 2005004(Santos et al., 1993)。針對美人魚發光桿菌美人魚亞種，可藉由該亞種可發酵葡萄糖及甘露糖產生氣體、可生長於TCBS培養基、菌落型態(綠色、圓形光滑且上端微隆起)之特性及能夠產生脲酶、組胺酸脫羧酶、鹼性磷酸酶、DNase及精胺酸脫羧酶之特性進行鑑別；美人魚發光桿菌美人魚亞種之生化檢測亦可以利用商業鑑定套組API 20E進行，標準鑑定結果碼為 2015004。此外，亦可使用免疫方法檢測(諸如凝集試驗(agglutination)或酵素免疫分析(ELISA))及聚合酶鏈鎖反應(PCR)進行檢測。Osorio等學者曾利用美人魚發光桿菌美人魚亞種與美人魚發光桿菌殺魚亞種共有的16S rRNA片段設計Car1/Car2之引子對，同時配合檢測美人魚發光桿菌美人魚亞種尿素酶基因之Ure3/Ure5引子對，可直接偵測美人魚發光桿菌美人魚亞種。然而，但因Car1/Car2引子對並非專一性針對美人魚發光桿菌殺魚亞所設計，因此在檢測時若樣品同時存在兩種亞種將會造成檢測上的困擾。 事實上，發展物種之鑑別檢驗方法面臨眾多困難點，例如由於測試物(諸如微生物)之種類眾多，進行實驗測試時往往難以蒐集到數量龐大的微生物種類確實驗證所開發的測試方法；其次，標的基因種類的選定，因為物種演化的關係，如何能夠找到確定能區分同一物種或不同物種之鑑別標的基因所在，往往是發展鑑別方法最瓶頸之處；尤其針對具有高親緣性的物種間的亞種之鑑別之困難度更高。此外，考慮發展之鑑別檢驗方法應能符合操作簡便、快速及實用。以美人魚發光桿菌殺魚亞種而言，傳統生化檢測往往曠日費時；雖然PCR檢測具有快速、高靈敏度且準確之優點，然現今仍無針對美人魚發光桿菌殺魚亞種之專一性引子對。雖然亦可將PCR產物進行定序再行比對鑑別，然此項方法所需設備及技術要求非一般檢驗實驗室能夠勝任，且亦須耗費額外時間。 為避免經濟魚類(諸如海鱺之海上箱網養殖)因感染美人魚發光桿菌殺魚亞種及/或美人魚亞種而導致死亡之經濟損失，宜儘速建立美人魚發光桿菌殺魚亞種之直接且快速的鑑別檢驗方法。

本發明提供可直接且快速檢測樣品中美人魚發光桿菌殺魚亞種( Photobacterium damselaesubsp. piscicida)之異性引子對以及該引子對之使用方法；本發明亦提供同時檢測美人魚發光桿菌殺魚亞種及美人魚發光桿菌美人魚亞種( P. damselaesubsp. damselae)之多套式聚合酶鏈鎖反應(multiplex PCR)檢測方法。本發明中所使用的方法與引子對可實際應用於生物樣品、食品安全及其他產品之檢測，亦可應用於養殖漁業之魚病管理。 本發明之一目的為提供一種引子對，其分別包含或實質上由PDPf：5'－TTTCGAAAAGCGAAGAGATGCACGA－3'(SEQ ID NO：1)組成之寡核苷酸序列，及包含或實質上由PDPr：5'－CGCGCAACCTATTGGCGGTGT－3'(SEQ ID NO：2)組成之寡核苷酸序列。自待檢測檢體抽取DNA後或將該檢體進行前處理後，利用前述引子對其進行PCR檢測，可專一性檢測該檢體是否含有美人魚發光桿菌殺魚亞種或進一步對該種進行定量。 本發明之又一目的係提供一種引子對組合，其包含專一性雜交至美人魚發光桿菌殺魚亞種DNA片段之引子對以及專一性雜交至美人魚發光桿菌美人魚亞種的引子對；其中該可專一性雜交至美人魚發光桿菌殺魚亞種DNA片段之引子對分別為包含或實質上由SEQ ID NO：1組成之寡核苷酸序列，及為包含或實質上由SEQ ID NO：2組成之寡核苷酸序列；及/或該可專一性雜交至美人魚發光桿菌美人魚亞種的引子對分別為包含或實質上由PDDf：5'－GCAAGCCTTGCTCAACTTTCCG－3'(SEQ ID NO：3)組成之寡核苷酸序列，及為包含或實質上由PDDr：AATTGCGCCATCTTTGCCAGCC(SEQ ID NO：4)組成之寡核苷酸序列。根據本發明，該引子對組合用於多套式PCR(Multiplex PCR)。 本發明驚訝地發現，如本發明中所揭示之專一性雜交至美人魚發光桿菌殺魚亞種DNA片段之引子對(PDPf及PDPr)確實能夠藉由PCR，直接、快速且準確鑑別生物樣品中的美人魚發光桿菌殺魚亞種，且不會對諸如美人魚發光桿菌美人魚亞種的其他菌種產生非專一性的PCR擴增產物；且亦可與可專一性雜交至美人魚發光桿菌美人魚亞種的引子對(PDDf及PDDr)組合用於多套式PCR，同時直接、快速且準確鑑別美人魚發光桿菌殺魚亞種及美人魚發光桿菌美人魚亞種。本發明確實可解決現今無法直接對美人魚發光桿菌殺魚亞種進行快速鑑別檢測之問題。

下文呈現本發明之簡單概述，提供對本發明基本的理解。此發明內容並非本發明之詳盡論述，且其並非意欲限制本發明之關鍵元素或描述本發明之範圍。除非另有定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所瞭解相同之含義。應瞭解，以上一般描述及以下詳細描述僅為例示性及解釋性的且不限制所主張之任何主題。 在本文中，除非另外明確陳述，否則單數之使用包括複數。除非上下文另外清楚指定，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用之單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該」亦包括複數個指示物。在本申請案中，除非另外陳述，否則「或」之使用意謂「及/或」。 本文所用之章節標題僅係為便於組織編排，不應理解為限制所述主題。出於任何目的，本申請案中所引用之所有文獻或部分文獻包括但不限於，專利、專利申請案、文章、書籍、手冊及論文，其以全文引用的方式併入本文中。 本文所用之術語「約」當用在數值前時指示該值可在合理範圍內變化，諸如所述值之±20%、±15%、±10%、±5%、±4%、±3%、±2%或±1%內。技藝人士當能夠瞭解此變化僅係合理反映誤差存在之真實情況。 如本文所用，術語「包含」或其語法變體意指本文中所描述的態樣包括所述要素，但不排除其他。「實質由……組成」或其語法變體在用於界定本文中所描述的態樣時，不排除實質上不影響該態樣（諸如本發明的方法）之特徵的要素。「由……組成」或其語法變體意指排除未特別敍述之要素。上述用語的轉換所衍生的所有態樣皆在本發明之範疇內。舉例而言，當本發明所描述的方法包含步驟A、B及C時，「基本上由步驟A、B及C組成之方法」及「由A、B及C組成之方法」亦獨立地在被涵蓋在本發明之範疇內。 本發明係關於一種引子對，其中第一引子為包含SEQ ID NO：1之寡核苷酸序列及/或第二引子為包含SEQ ID NO：2之寡核苷酸序列。根據本發明，該引子對專一性雜交至美人魚發光桿菌殺魚亞種( Photobacterium damselaesubsp. piscicida)之DNA片段。 在本發明之一實施態樣中，其中該第一引子(實質上)由SEQ ID NO：1之寡核苷酸序列組成及/或第二引子(實質上)由SEQ ID NO：2之寡核苷酸序列組成。在本發明之一態樣中，該DNA片段係美人魚發光桿菌殺魚亞種的ATP-依賴性蛋白酶(ATP-dependent protease)基因或與其互補之序列。 在本發明之一實施態樣中，其中如前述之該第一引子具有25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45個核苷酸，及/或第二引子具有21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40及41個核苷酸。在本發明之一較佳實施態樣中，其中該第一引子具有25個核苷酸，及/或第二引子具有21個核苷酸。在本發明之一更佳實施態樣中，其中該第一引子具有25個核苷酸且第二引子具有21個核苷酸。 在本發明之一實施態樣中，本發明所提供之專一性雜交至美人魚發光桿菌殺魚亞種DNA片段之引子對之PCR擴增產物長度為465鹼基對(bp)。 在本發明之一實施態樣中，本發明所提供之專一性雜交至美人魚發光桿菌殺魚亞種DNA片段之引子對無法專一性雜交至美人魚發光桿菌美人魚亞種( P. damselaesubsp. damselae；BCRC 12906)之DNA片段或針對該菌種進行有效PCR擴增產生目標PCR產物。在另一本發明之實施態樣中，除美人魚發光桿菌美人魚亞種以外，本發明所提供之專一性雜交至美人魚發光桿菌殺魚亞種DNA片段之引子對無法專一性雜交至以下一或多種菌種之DNA片段或針對這些菌種進行有效PCR擴增產生目標PCR產物： P. angustum(BCRC 13805)、 P. leiognathi(BCRC 13806)、 P. phosphoreum(BCRC 13804)、 V. alginolyticus(BCRC 12829)、 V. harvev(BCRC 12907)、 V. parahaemolyticus(BCRC 10806)或 Vibrio vulnificus(BCRC 13864)。 本發明之一實施態樣係關於一種引子對組合，其包含： (i) 專一性雜交至美人魚發光桿菌殺魚亞種DNA片段之引子對；及 (ii) 專一性雜交至美人魚發光桿菌美人魚亞種DNA片段之引子對，其中該引子對之第一引子為包含SEQ ID NO：3之寡核苷酸序列且第二引子為包含SEQ ID NO：4之寡核苷酸序列。 根據本發明，該引子對可用於多套式聚合酶鏈鎖反應 (Multiplex PCR)，以同時鑑別美人魚發光桿菌殺魚亞種及美人魚發光桿菌美人魚亞種。在本發明之一實施態樣中，其中該專一性雜交至美人魚發光桿菌美人魚亞種DNA片段之引子對之第一引子(實質上)由SEQ ID NO：3之寡核苷酸序列組成及/或第二引子(實質上)由SEQ ID NO：4之寡核苷酸序列組成。 在本發明之一實施態樣中，如前所述之專一性雜交至美人魚發光桿菌殺魚亞種DNA片段之引子對與專一性雜交至美人魚發光桿菌美人魚亞種DNA片段之引子對於進行多套式PCR時所使用之莫耳比例為約1：2；在本發明更進一步之態樣中，前述引子於進行多套式PCR時所使用之最終濃度分別為約0.1mM及約0.2mM。 在本發明之一實施態樣中，如前所述之多套PCR之引子對組合中(ii)之引子對針對美人魚發光桿菌美人魚亞種進行PCR擴增之擴增產物長度為約189鹼基對(bp)。 在本發明之一實施態樣中，如前所述之多套PCR之引子對組合可進一步包含用於鑑別美人魚發光桿菌殺魚亞種及美人魚發光桿菌美人魚亞種以外之菌種之引子對。在本發明之進一步態樣中，前述美人魚發光桿菌殺魚亞種及美人魚發光桿菌美人魚亞種以外之菌種係關於水產養殖生物之病原菌；在本發明之更進一步態樣中，該病原菌為諸如海鱺之魚類病原菌。 本發明之一態係關於一種鑑別生物樣品中美人魚發光桿菌殺魚亞種之方法，其包含： (a) 取得生物樣品檢體； (b) 使用可專一性雜交至美人魚發光桿菌殺魚亞種之ATP-依賴性蛋白酶基因的引子對針對步驟(a)之生物樣品進行PCR擴增，其中該引子對無法專一性雜交至美人魚發光桿菌美人魚亞種之DNA片段或針對該菌種進行有效PCR擴增產生目標PCR產物；及 (c) 依據PCR結果鑑別美人魚發光桿菌殺魚亞種於該生物樣品中之存在及/或存在量之多寡。 在本發明之一實施態樣中，前述生物樣品檢體較佳為諸如水產養殖類生物之檢體；更佳為水產養殖類生物之肝臟、腎臟及脾臟；在本發明之一些實施態樣中，該生物患有魚類巴斯德桿菌症或具有罹患魚類巴斯德桿菌症之風險。 在本發明之一實施態樣中，除美人魚發光桿菌美人魚亞種以外，本發明所提供之專一性雜交至美人魚發光桿菌殺魚亞種DNA片段之引子對無法專一性雜交至以下一或多種菌種之DNA片段或針對這些菌種進行有效PCR擴增產生目標PCR產物： P. angustum(BCRC 13805)、 P. leiognathi(BCRC 13806)、 P. phosphoreum(BCRC 13804)、 V. alginolyticus(BCRC 12829)、 V. harvev(BCRC 12907)、 V. parahaemolyticus(BCRC 10806)或 Vibrio vulnificus(BCRC 13864)。 在本發明之一實施態樣中，前述(c)之步驟包含以洋菜膠電泳及分析軟體進行定量/半定量的步驟。 在本發明之一實施態樣中，如前所述之方法中之PCR為單套式PCR、多套式PCR、或即時聚合酶鏈鎖反應 (Real-time PCR)。在本發明之一些態樣中，該即時聚合酶鏈鎖反應使用SYBR Green作為偵測劑或為需要額外設計探針的Taqman PCR。 在本發明之一實施態樣中，如前所述之PCR中之引子黏合溫度為約66℃至70℃、67℃至69℃，較佳約68℃。 在本發明之一實施態樣中，如前所述之方法，其可進一步包含將(a)中所取得之生物樣品檢體進行預培養之步驟。在本發明之一態樣中，該預培養之步驟為約16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32小時，16小時至28小時，18小時至26小時，20至24小時，較佳為24小時。 在本發明之一實施態樣中，如如前所述之方法，其可進一步包含與已知DNA濃度的標準樣品進行比較並藉以定量目標DNA量之步驟。 在本發明之一實施態樣中，本文中所提供之單套式PCR系統或多套式PCR系統其檢測靈敏度可以達約0.1fg、1 fg或10fg之DNA；或達到約1.0×10 ⁰CFU/g、2.0×10 ⁰CFU/g、3.0×10 ⁰CFU/g、4.0×10 ⁰CFU/g、 5.0×10 ⁰CFU/g、6.0×10 ⁰CFU/g、7.0×10 ⁰CFU/g、8.0×10 ⁰CFU/g、 9.0×10 ⁰CFU/g、1.0×10 ¹CFU/g、2.0×10 ¹CFU/g、3.0×10 ¹CFU/g、 4.0×10 ¹CFU/g、5.0×10 ¹CFU/g、6.0×10 ¹CFU/g、7.0×10 ¹CFU/g、 8.0×10 ¹CFU/g、9.0×10 ¹CFU/g、1.0×10 ²CFU/g、2.0×10 ²CFU/g、 3.0×10 ²CFU/g、4.0×10 ²CFU/g、5.0×10 ²CFU/g、6.0×10 ²CFU/g、 7.0×10 ²CFU/g、8.0×10 ²CFU/g、9.0×10 ²CFU/g或、1.0×10 ³CFU/g之靈敏度；或1.0×10 ⁰CFU/g至1.0×10 ³CFU/g之範圍中之任一數值之靈敏度。 套組本發明之另一實施態樣提供一種套組，其包含如本文中所述之引子對。在特定實施態樣中，該引子對之第一引子為包含SEQ ID NO：1之寡核苷酸序列及/或第二引子為包含SEQ ID NO：2之寡核苷酸序列。 本發明所提供之套組可進一步包含第二引子對，其中該第二引子對之第一引子為包含SEQ ID NO：3之寡核苷酸序列且第二引子為包含SEQ ID NO：4之寡核苷酸序列。 本發明另外提供一種套組，其包含如本文中所述之引子對組合。 本發明所提供之套組可視情況進一步包含萃取生物樣品DNA之試劑、PCR所需之反應試劑緩衝液/試劑、DNA聚合酶及/或該套組之使用說明書。 實例 菌株來源本文中實例所使用之標準菌株來源如下表1所示(表中所列前二者為美人魚發光桿菌之標準菌株，其後為非美人魚發光桿菌之標準菌株)： 表1 菌株 來源 P. damselae subsp. damselae BCRC 12906 P. damselaesubsp. piscicida BCRC 17065 P. angustum BCRC 13805 P. leiognathi BCRC 13806 P. phosphoreum BCRC 13804 V. alginolyticus BCRC 12829 V. harvev BCRC 12907 V. parahaemolyticus BCRC 10806 V. vulnificus BCRC 13864 *BCRC：生物資源保存及研究中心(食品工業發展研究所) 本文中實例所使用之美人魚發光桿菌殺魚亞種之分離菌株來源如下表2所示： 表2 美人魚發光桿菌殺魚亞種菌株編號 來源 Pdp1及Pdp2 古鎮均教授實驗室 Pdp3至Pdp13 澎湖縣家畜疾病防治所 引子序列本文中實例所使用之引子序列如下表3所示，且彼等引子對之PCR條件及PCR擴增產物大小如表4所示： 表3 引子 序列(5'至3') 序列識別號 PDPf (正向，F) PDPr (反向，R) TTTCGAAAAGCGAAGAGATGCACGA CGCGCAACCTATTGGCGGTGT SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 PDDf (正向，F) PDDr (反向，R) GCAAGCCTTGCTCAACTTTCCG AATTGCGCCATCTTTGCCAGCC SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4 引子4 (正向，F) 引子5 (反向，R) AAGAGCCCGT AACGCGCAAC SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 Ure3 (正向，F) Ure5 (反向，R) CTTGAATATCCATCTCATCTGC TCCGGAATAGGTAAAGCGGG SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 表4 引子對 PCR條件 擴增產物大小(bp) Car1/Car2 94℃30秒，60℃30秒，72℃30秒 267 Ure3/Ure5 94℃30秒，60℃30秒，72℃30秒 448 引子4/引子5 94℃30秒，30℃30秒，72℃30秒 (隨機) PDDf/PDDr 94℃30秒，68℃30秒，72℃30秒 189 PDPf/PDPr 94℃30秒，68℃30秒，72℃30秒 465 *PCR循環數皆為35，且最終延長為於72℃反應5分鐘。 *若未特別說明，則本文中之PCR反應係使用上述PCR條件進行。 基因體 DNA 之萃取以下基因體DNA之萃取係使用Gene-spin-V3 ^TM基因體DNA分離套組(Protech Technology Eterprise CO., Ltd.，台灣)進行。平板培養基中勾取1白金耳菌量於3 mL 2216液態培養基(以市售Marine Broth 2216粉末配置)中，於25℃培養24小時，取1 ml菌液置於 1.7 ml微量離心管中，以高速微量離心機(Thermo Scientific)於10,000 rpm 離心2分鐘，倒掉上清液，再加入300μl 生理食鹽水混和均勻，於10,000 rpm 離心2分鐘，倒掉上清液(重複清洗兩次)，加入100 μl溶菌酶(20 mg/mL)混和均勻，於37℃下反應30至60 分鐘，再加入300 μl萃取緩衝液及4 μl 蛋白酶K(20 mg/mL)在56 ℃下反應1至3小時，加入300 μl結合緩衝液，將上述溶液置於套組所附離心管中以10,000 rpm離心1分鐘，倒掉下層離心管中溶液，加入700 μl清洗緩衝液以 10,000 rpm 離心1分鐘，倒掉下層離心管中溶液(重複兩次)，置於55℃烘箱5分鐘，加入70℃ 無菌水離心1分鐘，於-20℃存放備用。 DNA 分子鑑定之 PCR將下列總反應物加入0.2 ml之微量離心管內：25 mM引子-F及25 mM引子-R各0.5 μl、PCR Master Mix(2X)12.5 μl、10 ng DNA 1 μl、去離子水10.5 μl。而後將離心管置入PCR溫度循環器(Applied Biosystems 2720)，進行PCR(引子對黏合溫度及條件如表4所示)。之後取1 μl之PCR產物以2%洋菜膠(以0.5X TBE緩衝液配製；5X TBE緩衝液配製方式：Trise-base 54 g、硼酸27.25 g及EDTA 4.65 g以去離子水溶解，並調整pH至8.3，再以去離子水定量至1000 ml，並於121 ℃加熱滅菌15分鐘，置於室溫存放備用)進行電泳，並以溴化乙錠(EtBr)染色，經UV照射並以電腦影像分析系統記錄分析。 隨機擴增多形性 DNA(RAPD) 分析以引子4/引子5(引子序列及黏合溫度如表3及4所示)進行RAPD分析，將下列總反應物加入0.2 ml微量離心管內：1 μl之25 mM 引子4或引子5、PCR Master Mix(2X)12.5 μl、10 ng DNA 1 μl、去離子水10.5 μl。而後將離心管置入PCR溫度循環器(Applied Biosystems 2720)，進行PCR(引子對黏合溫度及條件如表4所示)，後取1 μl PCR產物以2%洋菜膠(0.5X TBE緩衝液) 進行電泳，並以溴化乙錠染色，經UV照射並以電腦影像分析系統記錄分析。 PCR 產物回收使用Gene-Spin™-V21-4-3 DNA萃取套組回收DNA回收，將含有目標DNA之膠體切下並秤重，置入1.7 ml微量離心管中，加入與膠體等量的結合溶液，在60 ℃乾浴器下作用5至15分鐘後，將液體置入製造商所附之離心管中，以10,000 rpm 離心1分鐘，倒掉下層液，加入清洗溶液，以10,000 rpm離心1分鐘，清洗步驟重複兩次，最後以去離子水溶出，於‑20℃存放備用。 RAPD/PCR 產物之選殖及定序利用引子5進行RAPD擴增後之PCR產物先以Gene-Spin™ 1-4-3 DNA萃取套組回收純化，再使用yT&A套組(益生生物科技，台灣)選殖載體，進行接合反應，送入勝任細胞ECOS(益生生物科技，台灣)中，於37℃培養24小時後，將培養基平板送至明欣生物科技股份有限公司定序DNA。其中，接合反應係於0.2 ml之微量離心管中分別加入適量PCR產物、2 μl yT&A選殖載體、1 μl yT4 DNA接合酶與1 μl接合緩衝液A及1 μl接合緩衝液B，並以無菌水加至反應總體積為10μl，混合均勻後置於 4℃反應隔夜；細胞轉型作用(Transformation)係將PCR產物與載體接合而成的重組DNA 2 μl與100 μl勝任細胞混合，冰浴5分鐘後於42 ℃水浴45秒，即可得到轉型株；轉型株之篩選係基於yT&A選殖載體上帶有抗安比西林(ampicilin)的基因，且選殖位即位於lacZ基因上，因此，成功轉型株將具備抗安比西林及不產生β-半乳糖苷酶的特性，所以利用含安比西林及X-Gal的LB培養基平板來進行篩選，培養後，挑選呈現白色的轉型株；PCR產物定序係將培養後之平板送至明欣生物科技股份有限公司進行 DNA 定序。 靈敏度分析將以前述步驟萃取之DNA以Quant-iT dsDNA BR分析套組定量後，進行序列稀釋(稀釋至模板DNA為1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg、0.1 fg)，以PDPf/PDPr引子對進行PCR擴增，將下列反應物加入0.2 ml微量離心管內：25 mM之PDPf引子及25 mM之PDPr引子各0.5 μl、PCR Master Mix(2X)12.5 μl、模板DNA 2 μl、去離子水9.5 μl。而後將離心管置入 PCR溫度循環器(Applied Biosystems 2720)，進行PCR (引子組黏合溫度及條件如表4所示)後取2 μlPCR產物以2%洋菜膠(0.5X TBE緩衝液)進行電泳，並以溴化乙錠染色，經UV照射並以電腦影像分析系統記錄分析。 多套式 PCR為檢測本發明所提供之PDPf/PDPr引子對(引子黏合溫度68℃)與申請人先前所設計對美人魚發光桿菌美人魚亞種具有特異性之引子對PDDf/PDDr(引子黏合溫度68℃)之多套式PCR之特異性，將下列反應物加入0.2 ml 微量離心管內：10 mM PDDf引子0.5 μl、10 mM PDDr引子0.5 μl、5 mM PDPf引子0.5 μl、5 mM PDPr引子0.5 μl、PCR Master Mix(2X)12.5 μl、DNA 1 μl、去離子水9.5 μl。而後將離心管置入PCR thermocycler (Applied Biosyst-ems 2720)，進行PCR(引子組黏合溫度及條件如表4所示)，之後取1 μlPCR產物以2%洋菜膠(0.5X TBE緩衝液)進行電泳，並以溴化乙錠染色，經UV照射並以電腦影像分析系統記錄分析。 魚體樣品之應用就單套式PCR而言，將海鱺肝臟25 g與225 ml之0.5X 2216液體培養基混合，使用鐵胃以230 rpm均質1分鐘，取1 ml序列稀釋，並以2216A平板培養基計數，取10 ml魚汁分裝至樣品瓶，分別接入1000 μl序列稀釋之美人魚發光桿菌殺魚亞種之標準菌(10 ⁰至10 ⁷CFU/ml)，於25℃預培養16至24小時後，取 1 ml以10,000 rpm離心5分鐘，以600 μl無菌生理食鹽水(0.85 % NaCl)清洗，離心(10,000 rpm)5分鐘，加入200 μl無菌水，100℃熱破碎15分鐘，10,000 rpm離心3分鐘，以引子組PDPf/PDPr進行PCR擴增，將下列反應物加入0.2 ml微量離心管內：25 mM PDPf引子0.5 μl、引子25 mM PDPr引子0.5 μl、2x Master Mix RED 15 μl、DNA10 μl及去離子水4μl。而後將離心管置入PCR熱循環器(Applied Biosystems 2720)，進行PCR(引子組黏合溫度及條件如表4所示)，取1μl PCR產物以2%洋菜膠(0.5X TBE緩衝液)進行電泳，並以溴化乙錠染色，經UV照射並以電腦影像分析系統記錄分析。 就多套式PCR而言，將海鱺肝臟25 g與225 ml之0.5X 2216液體培養基混合，使用鐵胃以230 rpm均質1分鐘，取1 ml序列稀釋，並以2216A平板培養基計數，取10 ml魚汁分裝至樣品瓶，分別接入1000 μl序列稀釋之美人魚發光桿菌殺魚亞種(BCRC 17065)及美人魚發光桿菌美人魚亞種(BCRC 12906)之標準菌(10 ⁰至10 ⁷CFU/ml)，於25℃預培養16至24小時後，取 1 ml以10,000 rpm離心5分鐘，以600 μl無菌生理食鹽水(0.85% NaCl)清洗，離心(10,000 rpm)5分鐘，加入200 μl無菌水，100℃熱破碎15分鐘，10,000 rpm離心3分鐘，以引子組PDPf/PDPr及PDDf/PDDr進行PCR擴增，將下列反應物加入0.2 ml微量離心管內：10 mM PDDf引子0.5 μl、10 mM PDDr引子0.5 μl、5 mM PDPf引子0.5 μl、5 mM PDPr引子0.5 μl、2x Master Mix RED 15 μl、DNA10 μl及去離子水3μl。而後將離心管置入PCR熱循環器(Applied Biosystems 2720)，進行PCR(引子組黏合溫度及條件如表4所示)，取1μl PCR產物以2%洋菜膠(0.5X TBE緩衝液)進行電泳，並以溴化乙錠染色，經UV照射並以電腦影像分析系統記錄分析。 實例 1 美人魚發光桿菌菌株之 PCR 鑑定與確認本文中所使用之美人魚發光桿菌菌株包括美人魚發光桿菌美人魚亞種標準菌株(BCRC 12906)、美人魚發光桿菌殺魚亞種標準菌株(BCRC 17065)及美人魚發光桿菌殺魚亞種分離株(即列於表2之Pdp1至Pdp13菌株)。為了確認Pdp1至Pdp13菌株分離株是否確實為美人魚發光桿菌殺魚亞種，利用Osorio等學者於2000年發展的多套式PCR系統，針對檢測美人魚發光桿菌美人魚亞種與美人魚發光桿菌殺魚亞種共有的16S rRNA片段設計之Car1/Car2引子組及針對美人魚發光桿菌美人魚亞種尿素酶基因之Ure3/Ure5引子組，對前述13株分離菌株進行鑑定。結果顯示所有的美人魚發光桿菌分離菌株以Car1/Car2引子組進行PCR擴增皆可產生267 bp之預期產物，顯示這些菌株都屬於美人魚發光桿菌。另外，由於尿素酶基因對於美人魚發光桿菌美人魚亞種具特異性(美人魚發光桿菌美人魚亞種具產尿素酶之能力，而美人魚發光桿菌殺魚亞種無此能力)，使用Ure3/Ure5 引子組進行PCR擴增，結果顯示，只有美人魚發光桿菌美人魚亞種標準菌株會產生448 bp的預期產物，其餘菌株則無。 實例 2 隨機擴增多型性 DNA 之分析以及設計針對美人魚發光桿菌殺魚亞種具特異性之引子序列本研究嘗試利用隨機擴增多型性DNA技術尋找對美人魚發光桿菌殺魚亞種具有特異性之引子，並藉以分析美人魚發光桿菌殺魚亞種與美人魚發光桿菌美人魚亞種具差異性之DNA。利用引子4或引子5，針對美人魚發光桿菌殺魚亞種與美人魚發光桿菌美人魚亞種進行隨機擴增多型性DNA分析，結果顯示以引子5進行擴增之差異性片段較引子4明顯，且產物的量也較多，因此進一步選擇引子5之差異性片段進行轉殖及定序分析並設計特異性引子序列。經設計及大量篩選及測試後，得到表3所列之對美人魚發光桿菌殺魚亞種具特異性之PDPf/PDPr之引子對，其黏合位置如圖1所示。 實例 3 PDPf/PDPr 引子對之特異性分析為了評估引子對PDPf/PDPr是否對美人魚發光桿菌殺魚亞種具有特異性，將實例1中已確認為美人魚發光桿菌殺魚亞種之13株分離菌株及美人魚發光桿菌殺魚亞種之標準菌株(BCRC 17065於2216液體培養基中於25 ℃培養24小時後，取1ml菌液進行DNA萃取，取 1 μl DNA溶液與PDPf/PDPr引子對進行PCR擴增，反應後進行電泳分析，並以溴化乙錠染色後經UV照射後以電腦影像分析系統記錄分析。結果顯示美人魚發光桿菌殺魚亞種之13株分離菌株及標準菌株(BCRC 17065)皆產生465 bp的預期產物(請參圖2A)，而美人魚發光桿菌美人魚亞種標準菌株 (BCRC12906)則無預期產物，且其他非美人魚發光桿菌殺魚亞種之菌株( P. angustum(BCRC 13805)、 P. leiognathi(BCRC 13806)、 P. phosphoreum(BCRC 13804)、 V. alginolyticus(BCRC 12829)、 V. harvev(BCRC 12907)、 V. parahaemolyticus(BCRC 10806)、 Vibrio vulnificus(BCRC 13864)(如表1所列)，亦無預期產物(圖2A)。上述結果顯示PDPf/PDPr引子對對於美人魚發光桿菌殺魚亞種確實具有高度之特異性。 實例 4 PDPf/PDPr 引子對之靈敏度分析為了評估 PDPf/PDPr引子對對美人魚發光桿菌殺魚亞種之PCR檢測靈敏度，將不同濃度的美人魚發光桿菌殺魚亞種(BCRC 17065)DNA溶液(1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg、0.1 fg)分別加入含有PDPf/PDPr引子對之PCR反應液中進行PCR靈敏度測試。結果如圖3所示，在DNA模板為1 ng至1 pg DNA時，產物皆明顯可見，到100 fg之DNA時，產物開始減少，於1 fg DNA依然可以判斷產物的存在。上述結果顯示PCR之檢測靈敏度可達到1 fgDNA。 實例 5 單套式 PCR ：魚體樣品之應用先前文獻已指出美人魚發光桿菌殺魚亞種會造成魚類巴斯德桿菌症，該菌可從受感染魚隻的肝臟、腎臟、脾臟分離出。本文中利用魚體樣品配合預增殖技術進行檢測。在預增殖增菌後，以100 ℃反應15 分鐘進行熱破碎萃取DNA；魚肉經100 ℃烹煮後產生許多懸浮物及油脂，以10,000 rpm離心3分鐘去除後，取 10 μl樣品液進行PCR擴增。結果顯示在預培養16小時後靈敏度達到2.3×10 ⁴CFU/g，預培養20及24小時後，檢測靈敏度皆能達到2.3×10 ¹CFU/g。本研究中發現以海鱺肝臟作為檢測樣品之檢測靈敏度，相較於使用腎臟作為樣品之檢測靈敏度較高。此外，本實驗中所使用之預增殖再進行PCR檢測之技術，目的則在於使低菌量感染的樣品，透過預增殖的步驟將菌量大幅增加，以確保結果正確性。預增殖之培養時間為24小時的優點在於檢驗者可以在上班時安排預增殖的起始時間，隔天即可進行檢測，較不會影響檢驗者的上班時間又可以達到檢測的目的。先前的研究告指出，對海鱺幼魚進行腹腔注射美人魚發光桿菌殺魚亞種之致病性試驗發現各菌株致死濃度(LD50)介於10 ³至10 ⁴CFU/g間(鄭，2007)；Sharma 等學者，對海鱺幼魚同樣進行腹腔注射毒力的測試，其菌株致死濃度(LD50)為4.1×10 ⁵CFU/g(Sharma et al.，2017)。而本發明所提供之PCR檢測系統應用於魚體檢測，其檢測靈敏度可以達到2.3×10 ¹CFU/g，證明此引子對確實具有應用於水產養殖魚病預防及治療上之潛力。 實例 6 多套式 PCR ： PDPf/PDPr 與 PDDf/PDDr 引子對組合特異性分析本發明之其中之一目的在於發展一套快速且明確鑑定樣品中是否含有美人魚發光桿菌美人魚亞種或美人魚發光桿菌殺魚亞種之PCR檢測系統。如先前研究文獻指出，美人魚發光桿菌美人魚亞種除了會使魚體致病以外，亦為具有產生組織胺能力的細菌，可能會導致組織胺中毒，在食品安全上造成危害；而美人魚發光桿菌殺魚亞種在養殖漁業則常發生造成魚體致病而死亡的案件。為能使用同一套PCR系統即能達到檢測這兩株亞種的方法，因此以PDPf/PDPr引子對結合對美人魚發光桿菌美人魚亞種具有特異性之PDDf/PDDr引子對進行多套式引子組之測試。 在建立多套式PCR系統時，必須先考慮兩組引子的黏合溫度以及引子濃度(不適當的引子濃度組合可能導致非特異性PCR擴增產物的產生，或是對欲檢測的不同基因有過大的靈敏度差距)，同時了解菌株的差異性及引子組之間是否會相互干擾。經大量嘗試後，實驗結果顯示當PDDf/PDDr引子對濃度為10 mM且PDPf/PDPr引子對濃度為5 mM(即，兩者濃度比為2:1；前述引子之最終濃度分別為0.2mM及0.1mM)時有最佳的反應結果。利用最適引子濃度進行多套式PCR檢測，結果顯示可針對美人魚發光桿菌美人魚亞種(BCRC12906)擴增出189 bp的預期產物且針對美人魚發光桿菌殺魚亞種(BCRC 17065)擴增出465 bp的預期產物(圖4)，且無非特異性片段產生，顯示其達到高度特異性之結果，亦更證實此系統的可行性。 實例 7 多套式 PCR ：魚體樣品之應用本研究亦針對本發明所提供之多套式PCR系統，利用實例6之檢測條件，以海鱺肝臟作為檢測樣品進行測試。將25 g海鱺肝臟與225 ml 0.5X 2216液體培養基混合均質後，取10 ml均質液分裝，添加不同濃度的美人魚發光桿菌菌液(10 ⁰至10 ⁷CFU/ml)，於25℃培養20至24小時，以100℃15分鐘進行熱破碎萃取DNA，接著以10,000 rpm離心3分鐘，去除懸浮物，再分別取10 μl上清液，添加至配製好之PCR反應液中，進行PCR擴增。結果顯示配合20及24小時的預增殖技術，檢測魚體樣品中的美人魚發光桿菌美人魚亞種之檢測靈敏度可達2.3×10 ⁰CFU/g；檢測美人魚發光桿菌殺魚亞種的靈敏度可達2.3×10 ¹CFU/g。當預培養樣品中含有美人魚發光桿菌美人魚亞種與美人魚發光桿菌殺魚亞種時，在預培養20小時檢測美人魚發光桿菌美人魚亞種之靈敏度可達2.3×10 ⁰CFU/g，檢測美人魚發光桿菌殺魚亞種之靈敏度達2.3×10 ¹CFU/g。在預培養24小時後，檢測美人魚發光桿菌美人魚亞種與美人魚發光桿菌殺魚亞種之檢測靈敏度皆可達2.3×10 ⁰CFU/g (圖5)。證實本發明之多套式PCR系統可成功做為檢測樣品中是否含有美人魚發光桿菌，並分辨出兩個亞種，且具有高靈敏度與專一性。

圖1：其係關於PDPf/PDPr引子對與美人魚發光桿菌殺魚亞種之RAPD片段DNA結合位置之圖。 圖2：(A)PDPf/PDPr引子對之特異性檢測結果；M：DNA標記(Marker)、道1：美人魚發光桿菌殺魚亞種標準菌株 (BCRC 17065)、道2至14：美人魚發光桿菌殺魚亞種分離菌株Pdp1至Pdp13、道15：空白組； (B)PDPf/PDPr引子對之特異性檢測結果；M：DNA標記(Marker)、道1：美人魚發光桿菌殺魚亞種標準菌株 (BCRC 17065)、道2至9：美人魚發光桿菌美人魚亞種標準菌株 (BCRC12906)則無預期產物，且其他非美人魚發光桿菌殺魚亞種之菌株( P. angustum(BCRC 13805)、 P. leiognathi(BCRC 13806)、 P. phosphoreum(BCRC 13804)、 V. alginolyticus(BCRC 12829)、 V. harvev(BCRC 12907)、 V. parahaemolyticus(BCRC 10806)、 Vibrio vulnificus(BCRC 13864)、道10：空白組。 圖3：PDPf/PDPr引子對之PCR靈敏度分析；M：DNA標記(Marker)、道1至8：1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg及0.1 fg之DNA模板、道9：空白組。 圖4：多套式 PCR之特異性檢測結果；M：DNA標記(Marker)、道1：美人魚發光桿菌美人魚亞種標準菌株 (BCRC12906)、道2：美人魚發光桿菌殺魚亞種標準菌株 (BCRC 17065)、道3：美人魚發光桿菌美人魚亞種標準菌株 (BCRC12906)及美人魚發光桿菌殺魚亞種標準菌株 (BCRC 17065)、道4：空白組。 圖5：多套式 PCR檢測靈敏度之分析(以2216液態培養基預培養24小時)。M：DNA標記(Marker)、道1：美人魚發光桿菌美人魚亞種標準菌株(BCRC12906)、道2：美人魚發光桿菌殺魚亞種標準菌株 (BCRC 17065)、道3：未額外添加美人魚發光桿菌、道4至11：2.3×10 ⁷至2.3×10 ⁰(CFU/g)、道2：空白組。

<110> 國立澎湖科技大學

<120> 檢測美人魚發光桿菌殺魚亞種之特異性引子及其使用方法

<140> 107112610

<160> 8

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 1

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 2

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 3

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 4

<210> 5

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 5

<210> 6

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 6

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 7

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 8

Claims (18)

1. 一種引子對，其中第一引子由SEQ ID NO：1之寡核苷酸序列組成，且第二引子由SEQ ID NO：2之寡核苷酸序列組成。
2. 如請求項1之引子對，其專一性雜交至美人魚發光桿菌殺魚亞種(Photobacterium damselae subsp.piscicida)之DNA片段。
3. 如請求項1之引子對，其中該DNA片段係美人魚發光桿菌殺魚亞種的ATP-依賴性蛋白酶(ATP-dependent protease)基因或與其互補之序列。
4. 如請求項1之引子對，其中該引子對針對美人魚發光桿菌殺魚亞種進行PCR擴增之擴增產物長度為約465鹼基對(bp)。
5. 如請求項1之引子對，其中該引子對無法專一性雜交至美人魚發光桿菌美人魚亞種(P.damselae subsp.damselae)之DNA片段或針對該菌種進行有效PCR擴增產生目標PCR產物。
6. 如請求項1至5中任一項之引子對，其中該引子對無法專一性雜交至以下一或多種菌種之DNA片段或針對這些菌種進行有效PCR擴增產生目標PCR產物：P.angustum、P.leiognathi、P.phosphoreum、V.alginolyticus、V.harvev、V.parahaemolyticus或Vibrio vulnificus。
7. 一種用於多套式聚合酶鏈鎖反應(Multiplex PCR)之引子對組合，其包含：(i)如請求項1之引子對；及(ii)專一性雜交至美人魚發光桿菌美人魚亞種DNA片段之引子對，其中該引子對之第一引子由SEQ ID NO：3之寡核苷酸序列組成且第二引子由SEQ ID NO：4之寡核苷酸序列組成。
8. 如請求項7之用於多套式PCR之引子對組合，其中該專一性雜交至美人魚發光桿菌殺魚亞種DNA片段之引子對與專一性雜交至美人魚發光桿菌美人魚亞種DNA片段之引子對之莫耳比例為1：2。
9. 如請求項7之用於多套式PCR之引子對組合，其中該專一性雜交至美人魚發光桿菌殺魚亞種DNA片段之引子對於PCR反應中之最終濃度為約0.1mM且該專一性雜交至美人魚發光桿菌美人魚亞種DNA片段之引子對於PCR反應中之最終濃度為約0.2mM。
10. 如請求項7之用於多套式PCR之引子對組合，其中(ii)所述之引子對針對美人魚發光桿菌美人魚亞種進行PCR擴增之擴增產物長度為約189鹼基對(bp)。
11. 如請求項7之用於多套式PCR之引子對組合，其可進一步包含用於鑑別美人魚發光桿菌殺魚亞種及美人魚發光桿菌美人魚亞種以外之菌種之引子對。
12. 一種鑑別生物樣品中美人魚發光桿菌殺魚亞種之方法，其包含：(a)使用請求項1至6中任一項的引子對針對生物樣品進行PCR擴增，其中該引子對無法專一性雜交至美人魚發光桿菌美人魚亞種之DNA片段或針對該菌種進行有效PCR擴增產生目標PCR產物；及(b)依據PCR結果鑑別美人魚發光桿菌殺魚亞種於該生物樣品中之存在及/或存在量之多寡。
13. 如請求項12之方法，其中該PCR為單套式聚合酶鏈鎖反應、多套式聚合酶鏈鎖反應(Multiplex PCR)或即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time PCR)。
14. 如請求項12之方法，其中該PCR中之引子黏合溫度為約68℃。
15. 如請求項12之方法，其可進一步包含將生物樣品檢體進行預培養20至24小時之步驟。
16. 如請求項12之方法，其可進一步包含與已知DNA濃度的標準樣品進行比較並藉以定量目標DNA量之步驟。
17. 一種套組，其包含如請求項1至6中任一項之引子對。
18. 一種套組，其包含如請求項7至11中任一項之引子對組合。