JP6500773B2 - Ｐｃｒ法を用いた大腸菌の広域ｏ血清群判定方法 - Google Patents
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Description
本発明は，PCR法を用いた大腸菌の広域O血清群判定方法に関する。
腸管出血性大腸菌による感染症は，日本において，年間約4000件発生している。感染症患者の一部は溶血性尿毒症症候群や脳症などを併発して死亡することもあり，腸管出血性大腸菌は，時に，重大な結果をもたらす。そのため，腸管出血性大腸菌は，最も注意が必要な食中毒細菌の一つとして挙げられる。
腸管出血性大腸菌について，集団感染であるか否かの判断，汚染範囲の把握，汚染源・汚染経路の追跡と特定，さらに疫学研究を行うためには，腸管出血性大腸菌分離株の詳細な分類と比較が必要となる。その一つの方法として，菌体抗原を標的とした血清学的な分類方法（O血清群分類）が，ほぼすべての大腸菌分離株で行われている。
大腸菌について現在のところ，大腸菌のリファレンスと研究に関する世界保健機関協力センターでもあるデンマーク国立血清学研究所（SSI：Statens Serum Institut）により，184種類のO血清群が定められている（非特許文献１）。
日本においては，2007年から2011年の間に，地方衛生研究所や保健所などから国立感染症研究所に送付された約13,000株の腸管出血性大腸菌のO血清群を詳しく調べた結果，O157やO26，O111，O103といった，これまで主要とされてきたO血清群株が大半を占めていた。その一方，分離数は少ないものの，これまでに国内外において報告例の少ない（または無い）O血清群株も見つかり，総数で90種類ものO血清群が確認された。血便などの重症患者から希少O抗原型株が分離されたケースもあり，今後は，これら希少O血清群株についても十分な注意が必要となってくる。
日本においては，2007年から2011年の間に，地方衛生研究所や保健所などから国立感染症研究所に送付された約13,000株の腸管出血性大腸菌のO血清群を詳しく調べた結果，O157やO26，O111，O103といった，これまで主要とされてきたO血清群株が大半を占めていた。その一方，分離数は少ないものの，これまでに国内外において報告例の少ない（または無い）O血清群株も見つかり，総数で90種類ものO血清群が確認された。血便などの重症患者から希少O抗原型株が分離されたケースもあり，今後は，これら希少O血清群株についても十分な注意が必要となってくる。
一旦，腸管出血性大腸菌の感染などが起こった場合，医療機関の検査室や細菌の検査を行う機関では，感染拡大を防ぐために，迅速で正確な腸管出血性大腸菌の細分類を必要とする。しかしながら，このように多様なO血清群の腸管出血性大腸菌が存在する中で，現在行われている血清学的なO抗原型分類では，全ての腸管出血性大腸菌分離株を迅速に分類決定することは困難である。すなわち，国内メーカーからは50種類のO抗原免疫血清しか販売されておらず，国内メーカー販売品では上述した90種類のうち，わずか33種類しかカバーできていない。また，SSIが販売するO抗原免疫血清は高価（１種類約５万円）で，各検査室（機関）が全種類を揃えるのは実質的に不可能である。
これらの事情から，現在行われている血清学的なO血清群分類に代わる，迅速で精度の高い腸管出血性大腸菌O血清群の分類方法の開発が望まれている。
これらの事情から，現在行われている血清学的なO血清群分類に代わる，迅速で精度の高い腸管出血性大腸菌O血清群の分類方法の開発が望まれている。
STATENS SERUM INSTUT, E.coli strains, インターネット＜URL：http://www.ssi.dk/English/SSI%20Diagnostica/Products%20from%20SSI%20Diagnostica/Bacterial%20strains/E%20coli.aspx＞
上記事情を背景として，本発明では，現在行われている血清学的なO血清群分類に代わる，迅速で精度の高い腸管出血性大腸菌O血清群の分類手法の開発を課題とする。
すなわち，PCR法などの核酸増幅法により大腸菌O血清群（O抗原型）に準ずる遺伝学的分類を可能とする特異的プライマー配列を見出すことにより，このプライマー配列を用いた大腸菌の広域O血清群判別方法の開発を課題とする。
すなわち，PCR法などの核酸増幅法により大腸菌O血清群（O抗原型）に準ずる遺伝学的分類を可能とする特異的プライマー配列を見出すことにより，このプライマー配列を用いた大腸菌の広域O血清群判別方法の開発を課題とする。
発明者は，大腸菌O抗原に関連する遺伝子に着目した。すなわち，大腸菌染色体上の，O抗原合成を司る遺伝子領域に存在する，O抗原糖鎖合成酵素遺伝子（wzy）とO抗原糖鎖輸送タンパク遺伝子（wzxまたはwzm/wzt）である。これらの遺伝子は，大腸菌のO抗原型の間で，高い塩基配列的特異性を保持していることが知られている。
以下では，wzy，wzx，wzm，wztについて，大腸菌O抗原関連遺伝子と略する。
以下では，wzy，wzx，wzm，wztについて，大腸菌O抗原関連遺伝子と略する。
発明者は，O抗原コード領域の塩基配列情報が知られていない複数種の大腸菌株について，大腸菌O抗原関連遺伝子の塩基配列を明らかにした。この明らかにした複数種の塩基配列情報，ならびに既知の塩基配列情報を用いて，大腸菌O抗原関連遺伝子を増幅するためのプライマーセットに関する発明を完成させた。さらには，それらプライマーセットを用いて，大腸菌のO抗原型を特異的に検出，判別する大腸菌O抗原型の検査方法および検査キットにかかる発明を完成させた。
本発明は以下の構成からなる。
本発明の第一の構成は，大腸菌O抗原に特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセットであって、当該プライマーセットは下記群（1）〜群（9）から少なくとも１つのプライマーセットを含んで構成されることを特徴とする。
群（1）プライマーセット95：配列番号189及び190、プライマーセット34：配列番号67及び68、プライマーセット19：配列番号37及び38、プライマーセット72：配列番号143及び144、プライマーセット55：配列番号109及び110、プライマーセット73：配列番号145及び146、プライマーセット99：配列番号197及び198、プライマーセット89：配列番号177及び178、プライマーセット63：配列番号125及び126、プライマーセット66：配列番号131及び132、プライマーセット33：配列番号65及び66、プライマーセット37：配列番号73及び74、プライマーセット32：配列番号63及び64、プライマーセット75：配列番号149及び150、プライマーセット81：配列番号161及び162、からなる群。
群（2）プライマーセット88：配列番号175及び176、プライマーセット87：配列番号173及び174、プライマーセット12：配列番号23及び24、プライマーセット29：配列番号57及び58、プライマーセット6：配列番号11及び12、プライマーセット3：配列番号5及び6、プライマーセット11：配列番号21及び22、プライマーセット50：配列番号99及び100、プライマーセット16：配列番号31及び32、プライマーセット13：配列番号25及び26、プライマーセット14：配列番号27及び28、からなる群。
群（3）プライマーセット92：配列番号183及び184、プライマーセット57：配列番号113及び114、プライマーセット90：配列番号179及び180、プライマーセット7：配列番号13及び14、プライマーセット67：配列番号133及び134、プライマーセット10：配列番号19及び20、プライマーセット28：配列番号55及び56、プライマーセット84：配列番号167及び168 、プライマーセット52：配列番号103及び104、プライマーセット49：配列番号97及び98、プライマーセット91：配列番号181及び182、からなる群。
群（4）プライマーセット79：配列番号157及び158、プライマーセット40：配列番号79及び80、プライマーセット85：配列番号169及び170、プライマーセット96：配列番号191及び192、プライマーセット21：配列番号41及び42、プライマーセット51：配列番号101及び102、プライマーセット15：配列番号29及び30、プライマーセット1：配列番号1及び2、プライマーセット54：配列番号107及び108、プライマーセット2：配列番号3及び4、からなる群。
群（5）プライマーセット41：配列番号81及び82、プライマーセット97：配列番号193及び194、プライマーセット59：配列番号117及び118、プライマーセット94：配列番号187及び188、プライマーセット100：配列番号199及び200、プライマーセット27：配列番号53及び54、プライマーセット5：配列番号9及び10、プライマーセット56：配列番号111及び112、プライマーセット68：配列番号135及び136、プライマーセット24：配列番号47及び48、プライマーセット61：配列番号121及び122、からなる群。
郡（6）プライマーセット80：配列番号159及び160、プライマーセット93：配列番号185及び186、プライマーセット23：配列番号45及び46、プライマーセット98：配列番号195及び196、プライマーセット60：配列番号119及び120、プライマーセット18：配列番号35及び36、プライマーセット101：配列番号201及び202、プライマーセット45：配列番号89及び90、プライマーセット77：配列番号153及び154、プライマーセット39：配列番号77及び78、プライマーセット22：配列番号43及び44、プライマーセット4：配列番号7及び8、プライマーセット70：配列番号139及び140、プライマーセット20：配列番号39及び40、からなる群。
群（7）プライマーセット86：配列番号171及び172、プライマーセット46：配列番号91及び92、プライマーセット36：配列番号71及び72、プライマーセット38：配列番号75及び76、プライマーセット64：配列番号127及び128、プライマーセット17：配列番号33及び34、プライマーセット47：配列番号93及び94、プライマーセット69：配列番号137及び138、プライマーセット26：配列番号51及び52、プライマーセット35：配列番号69及び70、プライマーセット62：配列番号123及び124、プライマーセット43：配列番号85及び86、プライマーセット9：配列番号17及び18、プライマーセット83：配列番号165及び166、からなる群。
群（8）プライマーセット25：配列番号49及び50、プライマーセット31：配列番号61及び62、プライマーセット74：配列番号147及び148、プライマーセット82：配列番号163及び164、プライマーセット53：配列番号105及び106、プライマーセット65：配列番号129及び130、プライマーセット8：配列番号15及び16、プライマーセット76：配列番号151及び152、プライマーセット78：配列番号155及び156、プライマーセット44：配列番号87及び88、プライマーセット58：配列番号115及び116、からなる群。
群（9）プライマーセット30：配列番号59及び60、プライマーセット48：配列番号95及び96、プライマーセット71：配列番号141及び142、からなる群。に示すプライマーからなることを特徴とするプライマーセット。
群（1）プライマーセット95：配列番号189及び190、プライマーセット34：配列番号67及び68、プライマーセット19：配列番号37及び38、プライマーセット72：配列番号143及び144、プライマーセット55：配列番号109及び110、プライマーセット73：配列番号145及び146、プライマーセット99：配列番号197及び198、プライマーセット89：配列番号177及び178、プライマーセット63：配列番号125及び126、プライマーセット66：配列番号131及び132、プライマーセット33：配列番号65及び66、プライマーセット37：配列番号73及び74、プライマーセット32：配列番号63及び64、プライマーセット75：配列番号149及び150、プライマーセット81：配列番号161及び162、からなる群。
群（2）プライマーセット88：配列番号175及び176、プライマーセット87：配列番号173及び174、プライマーセット12：配列番号23及び24、プライマーセット29：配列番号57及び58、プライマーセット6：配列番号11及び12、プライマーセット3：配列番号5及び6、プライマーセット11：配列番号21及び22、プライマーセット50：配列番号99及び100、プライマーセット16：配列番号31及び32、プライマーセット13：配列番号25及び26、プライマーセット14：配列番号27及び28、からなる群。
群（3）プライマーセット92：配列番号183及び184、プライマーセット57：配列番号113及び114、プライマーセット90：配列番号179及び180、プライマーセット7：配列番号13及び14、プライマーセット67：配列番号133及び134、プライマーセット10：配列番号19及び20、プライマーセット28：配列番号55及び56、プライマーセット84：配列番号167及び168 、プライマーセット52：配列番号103及び104、プライマーセット49：配列番号97及び98、プライマーセット91：配列番号181及び182、からなる群。
群（4）プライマーセット79：配列番号157及び158、プライマーセット40：配列番号79及び80、プライマーセット85：配列番号169及び170、プライマーセット96：配列番号191及び192、プライマーセット21：配列番号41及び42、プライマーセット51：配列番号101及び102、プライマーセット15：配列番号29及び30、プライマーセット1：配列番号1及び2、プライマーセット54：配列番号107及び108、プライマーセット2：配列番号3及び4、からなる群。
群（5）プライマーセット41：配列番号81及び82、プライマーセット97：配列番号193及び194、プライマーセット59：配列番号117及び118、プライマーセット94：配列番号187及び188、プライマーセット100：配列番号199及び200、プライマーセット27：配列番号53及び54、プライマーセット5：配列番号9及び10、プライマーセット56：配列番号111及び112、プライマーセット68：配列番号135及び136、プライマーセット24：配列番号47及び48、プライマーセット61：配列番号121及び122、からなる群。
郡（6）プライマーセット80：配列番号159及び160、プライマーセット93：配列番号185及び186、プライマーセット23：配列番号45及び46、プライマーセット98：配列番号195及び196、プライマーセット60：配列番号119及び120、プライマーセット18：配列番号35及び36、プライマーセット101：配列番号201及び202、プライマーセット45：配列番号89及び90、プライマーセット77：配列番号153及び154、プライマーセット39：配列番号77及び78、プライマーセット22：配列番号43及び44、プライマーセット4：配列番号7及び8、プライマーセット70：配列番号139及び140、プライマーセット20：配列番号39及び40、からなる群。
群（7）プライマーセット86：配列番号171及び172、プライマーセット46：配列番号91及び92、プライマーセット36：配列番号71及び72、プライマーセット38：配列番号75及び76、プライマーセット64：配列番号127及び128、プライマーセット17：配列番号33及び34、プライマーセット47：配列番号93及び94、プライマーセット69：配列番号137及び138、プライマーセット26：配列番号51及び52、プライマーセット35：配列番号69及び70、プライマーセット62：配列番号123及び124、プライマーセット43：配列番号85及び86、プライマーセット9：配列番号17及び18、プライマーセット83：配列番号165及び166、からなる群。
群（8）プライマーセット25：配列番号49及び50、プライマーセット31：配列番号61及び62、プライマーセット74：配列番号147及び148、プライマーセット82：配列番号163及び164、プライマーセット53：配列番号105及び106、プライマーセット65：配列番号129及び130、プライマーセット8：配列番号15及び16、プライマーセット76：配列番号151及び152、プライマーセット78：配列番号155及び156、プライマーセット44：配列番号87及び88、プライマーセット58：配列番号115及び116、からなる群。
群（9）プライマーセット30：配列番号59及び60、プライマーセット48：配列番号95及び96、プライマーセット71：配列番号141及び142、からなる群。に示すプライマーからなることを特徴とするプライマーセット。
本発明の第二の構成は，腸管出血性大腸菌O抗原に特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセットであって、当該プライマーセットは、プライマーセット95：配列番号189及び190、プライマーセット80：配列番号159及び160およびプライマーセット86：配列番号171及び172のプライマーセットを含んで構成されることを特徴とする。
本発明の第三の構成は，下記いずれかのプライマーセットを含むことを特徴とする第二の構成に記載のプライマーセットである。
プライマーセット：フォワード：GGGGGTGGGTACTATATTGG及びリバース：AGCGCCTATTTCAGCAAAGA、
プライマーセット：フォワード：TAAGTACGGGGGTGCTTTTT及びリバース：AAGCTCCCGAGCACGTATAA、
プライマーセット：フォワード：CAAGAGTGCTCTGGGCTTCT及びリバース：AACGCAAGACAAGGCAAAAC、
プライマーセット：フォワード：CAGGTGAAGGTGGAATGGTTGTC及びリバース：TTAGAATTGAGACCATCCAATAAG、
プライマーセット：フォワード：CAGTTAATGTGGTGGCGAAGG及びリバース：CACCAGACAATGTAACCGCTG、
プライマーセット：フォワード：ATCCTATTCCCGGGAGTTTACG及びリバース：GCGTCATCGTATACACAGGAGC、
プライマーセット：フォワード：CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC及びリバース：CCCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG
プライマーセット：フォワード：GGGGGTGGGTACTATATTGG及びリバース：AGCGCCTATTTCAGCAAAGA、
プライマーセット：フォワード：TAAGTACGGGGGTGCTTTTT及びリバース：AAGCTCCCGAGCACGTATAA、
プライマーセット：フォワード：CAAGAGTGCTCTGGGCTTCT及びリバース：AACGCAAGACAAGGCAAAAC、
プライマーセット：フォワード：CAGGTGAAGGTGGAATGGTTGTC及びリバース：TTAGAATTGAGACCATCCAATAAG、
プライマーセット：フォワード：CAGTTAATGTGGTGGCGAAGG及びリバース：CACCAGACAATGTAACCGCTG、
プライマーセット：フォワード：ATCCTATTCCCGGGAGTTTACG及びリバース：GCGTCATCGTATACACAGGAGC、
プライマーセット：フォワード：CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC及びリバース：CCCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG
本発明により，特異的プライマー配列を用いて，大腸菌の広域O血清群判別方法の提供が可能となった。
すなわち，本発明は，101種類の大腸菌O血清群の判別を新たに可能とするものである。また，本発明により，大腸菌O血清群を，迅速かつ正確に判定することが可能となり，感染症原因大腸菌の分類・同定を目的として，医療分野，公衆衛生分野及び食品衛生分野など，幅広い分野において利用すること期待できる。
すなわち，本発明は，101種類の大腸菌O血清群の判別を新たに可能とするものである。また，本発明により，大腸菌O血清群を，迅速かつ正確に判定することが可能となり，感染症原因大腸菌の分類・同定を目的として，医療分野，公衆衛生分野及び食品衛生分野など，幅広い分野において利用すること期待できる。
以下，本発明のプライマーセット，ならびにこれを用いた大腸菌の広域O血清群判定方法について，PCR法を例にとり，説明を行う。
PCR法による大腸菌検査のためには，検体試料が必要である。この検体試料としては，通常用いられるあらゆる検体試料を用いることが可能であり，例えば，大腸菌感染が疑われる食品，ヒトや動物由来の生体試料などが挙げられる。
大腸菌検査のための検体試料については，通常用いられる前処理を行い，PCR法に用いる際の試料とすればよい。例えば，タンパク質分解酵素等による組織細胞由来タンパク質を分解後，フェノール及びクロロホルムを用いて核酸抽出や精製を行ったり，市販されている抽出キットを用いて得られた核酸を抽出したりするなどである。
検体試料の準備ができたら，本発明のプライマーセットを用いて，核酸増幅のための操作を行う。この核酸増幅の際の操作として，例えば，少なくとも１セットのプライマーセット，耐熱性DNAポリメラーゼ，デオキシヌクレオチド3リン酸などの基質を反応溶液に加え，熱変性，アニーリング，伸長反応を行い，これらのサイクルを繰り返すことにより核酸増幅を行う。
検体試料の準備ができたら，本発明のプライマーセットを用いて，核酸増幅のための操作を行う。この核酸増幅の際の操作として，例えば，少なくとも１セットのプライマーセット，耐熱性DNAポリメラーゼ，デオキシヌクレオチド3リン酸などの基質を反応溶液に加え，熱変性，アニーリング，伸長反応を行い，これらのサイクルを繰り返すことにより核酸増幅を行う。
本発明のプライマーセットは，各種プライマーセットが，フォワード（F）とリバース（R）の組み合わせからなる，合計2つのプライマーからなる組み合わせ（以下，１組のフォワードとリバースプライマーを含んだ組み合わせを，「単位プライマーセット」という）を少なくとも１つ含む（図１から４）。また，それぞれの単位プライマーセットにより，特定の大腸菌O抗原における，ある大腸菌O抗原関連遺伝子の核酸増幅を行うことが可能である。
本発明のプライマーセットは，単位プライマーセットを少なくとも一つ含むが，複数の単位プライマーセットを含むことも可能である。これにより，プライマーセットを用いることで，複数の大腸菌O抗原の同時検出が可能となり，検査の迅速性を向上させる効果を有する。本発明においては，発明者により設計された単位プライマーセットを複数組み合わせてもよいし，大腸菌に関する他の病原性抗原や毒素産生遺伝子に関する単位プライマーセットを組み合わせてもよく，例えばstx1やstx2，eaeなどが挙げられる。単位プライマーセットを複数組み合わせる場合には，それぞれの単位プライマーによって増幅される拡散増幅産物のサイズに１０ｂｐ以上，好ましくは２０〜３０ｂｐ程度以上，さらに好ましくは４０ｂｐ以上の差がある単位プライマーセットを選択して組み合わせることができる。このように組み合わせることで，アガロースゲル電気泳動法等により拡散増幅産物の検出を行う際に，それぞれの拡散増幅産物の検出が容易となる。
本発明のプライマーセットは，単位プライマーセットを少なくとも一つ含むが，複数の単位プライマーセットを含むことも可能である。これにより，プライマーセットを用いることで，複数の大腸菌O抗原の同時検出が可能となり，検査の迅速性を向上させる効果を有する。本発明においては，発明者により設計された単位プライマーセットを複数組み合わせてもよいし，大腸菌に関する他の病原性抗原や毒素産生遺伝子に関する単位プライマーセットを組み合わせてもよく，例えばstx1やstx2，eaeなどが挙げられる。単位プライマーセットを複数組み合わせる場合には，それぞれの単位プライマーによって増幅される拡散増幅産物のサイズに１０ｂｐ以上，好ましくは２０〜３０ｂｐ程度以上，さらに好ましくは４０ｂｐ以上の差がある単位プライマーセットを選択して組み合わせることができる。このように組み合わせることで，アガロースゲル電気泳動法等により拡散増幅産物の検出を行う際に，それぞれの拡散増幅産物の検出が容易となる。
本発明のプライマーセットは，検出対象となる大腸菌分離株の核酸領域を効率よく増幅することが可能である。これにより，検出対象である大腸菌分離株を高率かつ迅速に検出することができる。加えて，プライマーセットを組み合わせて用いることにより，大腸菌分離株の判別が可能となる。
本発明において，これらプライマーセットは，主な検出対象の型の大腸菌分離株のみの検出に限定する意図ではなく，その他の型の大腸菌分離株の検出に用いてもかまわない。例えば，プライマーセット１を用いて，O5抗原以外の大腸菌分離株を検出するなどである。大腸菌分離株の検出・判別を行う場合，対象となる大腸菌O抗原型が分からないことが通常である。その場合などには種々のプライマーセットを複合的に用いることにより，より正確な大腸菌分離株の検出や判別が可能となる。
本発明において，これらプライマーセットは，主な検出対象の型の大腸菌分離株のみの検出に限定する意図ではなく，その他の型の大腸菌分離株の検出に用いてもかまわない。例えば，プライマーセット１を用いて，O5抗原以外の大腸菌分離株を検出するなどである。大腸菌分離株の検出・判別を行う場合，対象となる大腸菌O抗原型が分からないことが通常である。その場合などには種々のプライマーセットを複合的に用いることにより，より正確な大腸菌分離株の検出や判別が可能となる。
耐熱性DNAポリメラーゼは，通常用いられるあらゆる耐熱性DNAポリメラーゼを用いることができる。このような酵素として，例えば，pol Ｉ 型DNAポリメラーゼ，α型DNAポリメラーゼ，混合型DNAポリメラーゼ，Hot start用DNAポリメラーゼ等が挙げられる。
核酸増幅反応操作が終了したら，核酸増幅産物の検出を行う。核酸増幅産物の検出には，通常用いられるあらゆる検出方法を用いることができる。例えば，増幅された塩基配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドを用いた検出や蛍光性インターカレーター法，アガロースゲル電気泳動法による検出などである。
また，核酸増幅反応操作を行いながら，核酸増幅物の検出を行ってもよい（RT-PCR）。この場合，インターカレーター法やハイブリダイゼーション法など，蛍光色素を用いた検出法を用いればよい。
また，核酸増幅反応操作を行いながら，核酸増幅物の検出を行ってもよい（RT-PCR）。この場合，インターカレーター法やハイブリダイゼーション法など，蛍光色素を用いた検出法を用いればよい。
本発明のプライマーセットを用いて核酸増幅の検出を行う際に必要な各種の試薬類は，あらかじめパッケージングしてキット化することにより，検査キットとすることができる。この場合，検査キットは，少なくとも１セットの本発明のプライマーセットと，核酸増幅用試薬を含む。核酸増幅用試薬として，例えば，耐熱性DNAポリメラーゼ，核酸合成の基質となる４種類のdNTP，酵素反応に好適な条件を与える緩衝液や塩類，酵素や鋳型を安定化する保護剤などが挙げられる。
＜＜実験例１，大腸菌O血清群の塩基配列の取得＞＞
一部の大腸菌O血清群については，これまでO抗原コード領域の塩基配列情報が明らかになっていないことから，これを明らかにする目的で行った。
一部の大腸菌O血清群については，これまでO抗原コード領域の塩基配列情報が明らかになっていないことから，これを明らかにする目的で行った。
１．実験方法
(1) 53種類の大腸菌O血清群（O5, O10, O12, O19, O23,O30, O33, O34, O36, O37, O38, O41, O48, O49, O51, O53, O54, O60, O63, O65, O69, O70, O74, O76, O80, O81, O82, O84, O88, O93, O95, O100, O102, O112ac, O120, O125, O133, O136, O140, O142, O144, O153, O154, O156, O163, O169, O170, O171, O175, O176, O179, O180, O181）について，これらの菌株より，DNAを精製した。
(2) 精製したDNAを鋳型DNAとして，O抗原コード領域の両外側に設計したプライマーを用いてPCRにて増幅後（増幅産物は15〜25kb），増幅産物をショットガンシークエンス法により決定した。
(3) 得られた配列情報からNCBIの統合データベースを基にアノテーションし（遺伝子範囲とその機能予測），wzy，wzx，wzm，wztを含む各遺伝子を特定した。
(1) 53種類の大腸菌O血清群（O5, O10, O12, O19, O23,O30, O33, O34, O36, O37, O38, O41, O48, O49, O51, O53, O54, O60, O63, O65, O69, O70, O74, O76, O80, O81, O82, O84, O88, O93, O95, O100, O102, O112ac, O120, O125, O133, O136, O140, O142, O144, O153, O154, O156, O163, O169, O170, O171, O175, O176, O179, O180, O181）について，これらの菌株より，DNAを精製した。
(2) 精製したDNAを鋳型DNAとして，O抗原コード領域の両外側に設計したプライマーを用いてPCRにて増幅後（増幅産物は15〜25kb），増幅産物をショットガンシークエンス法により決定した。
(3) 得られた配列情報からNCBIの統合データベースを基にアノテーションし（遺伝子範囲とその機能予測），wzy，wzx，wzm，wztを含む各遺伝子を特定した。
２．実験結果
表１のとおり，53種類のO抗原領域について，各遺伝子配列を明らかにした（配列番号203から255）。配列番号203から255のいずれかに示す塩基配列からなるDNA，あるいは前記塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA，からなるポリヌクレオチドを特異的に認識するプライマーを用いることで，大腸菌のO血清群の遺伝学的判別が可能となる。
表１のとおり，53種類のO抗原領域について，各遺伝子配列を明らかにした（配列番号203から255）。配列番号203から255のいずれかに示す塩基配列からなるDNA，あるいは前記塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA，からなるポリヌクレオチドを特異的に認識するプライマーを用いることで，大腸菌のO血清群の遺伝学的判別が可能となる。
＜＜実験例２，プライマーの設計＞＞
１．大腸菌O抗原関連遺伝子の遺伝子増幅が可能なプライマーの設計を行った。
２．実験例１で明らかになった５３種の遺伝子に加え，既知の48種類の大腸菌O血清群（O3, O9, O11, O15, O24, O27, O29, O32, O35, O40, O55, O56, O58, O59, O61, O79, O85, O87, O91, O98, O99, O104, O104, O109, O112ab, O114, O121, O130, O138, O139, O141, O143, O145, O146, O148, O150, O152, O155, O158, O159, O161, O165, O166, O167, O168, O172, O174, O177）の塩基配列から，大腸菌O抗原関連遺伝子の特定を行った。
３．wzy, wzx, wzm, wzt遺伝子の塩基配列を基に，PCRプライマーの設計を行った（図１から４）。
なお，O165についてはO抗原コード領域に含まれる糖転移酵素遺伝子（wcnU）上にプライマーを設計したもの含まれる。
１．大腸菌O抗原関連遺伝子の遺伝子増幅が可能なプライマーの設計を行った。
２．実験例１で明らかになった５３種の遺伝子に加え，既知の48種類の大腸菌O血清群（O3, O9, O11, O15, O24, O27, O29, O32, O35, O40, O55, O56, O58, O59, O61, O79, O85, O87, O91, O98, O99, O104, O104, O109, O112ab, O114, O121, O130, O138, O139, O141, O143, O145, O146, O148, O150, O152, O155, O158, O159, O161, O165, O166, O167, O168, O172, O174, O177）の塩基配列から，大腸菌O抗原関連遺伝子の特定を行った。
３．wzy, wzx, wzm, wzt遺伝子の塩基配列を基に，PCRプライマーの設計を行った（図１から４）。
なお，O165についてはO抗原コード領域に含まれる糖転移酵素遺伝子（wcnU）上にプライマーを設計したもの含まれる。
＜＜実験例３，プライマーセットの核酸増幅の確認＞＞
１．PCR法の反応条件及び検出
(1) 表２に従い，反応液を混和し，サーマルサイクラー（ABI3100）で〔94℃-30秒，58℃-30秒，72℃-1分〕×25サイクル，反応させた。
(2) 反応液の一部を1%アガロースゲルで電気泳動し，エチジウムブロマイドで染色後にUVトランスイルミネーター上で予測されるサイズの増幅産物（バンド）を確認した。
１．PCR法の反応条件及び検出
(1) 表２に従い，反応液を混和し，サーマルサイクラー（ABI3100）で〔94℃-30秒，58℃-30秒，72℃-1分〕×25サイクル，反応させた。
(2) 反応液の一部を1%アガロースゲルで電気泳動し，エチジウムブロマイドで染色後にUVトランスイルミネーター上で予測されるサイズの増幅産物（バンド）を確認した。
２．特異的判定の確認
(1) 全ての大腸菌O血清群をカバーする標準株184株を用い，各プライマーセットによるPCR法を実施した。
(2) まずは図１９のように，プールテンプレートDNA（PT: pool template）を準備し，PT1からPT37のDNAセットを用いてPCR法を行った。
(3) 次に，反応のあったPT中に含まれる単一テンプレートDNA（ST: single template）を用いて判定した。
(4) 結果，それぞれのプライマーセットが標的とするO血清群株に反応し，それ以外のO血清群株には反応しないことを確認した。
(1) 全ての大腸菌O血清群をカバーする標準株184株を用い，各プライマーセットによるPCR法を実施した。
(2) まずは図１９のように，プールテンプレートDNA（PT: pool template）を準備し，PT1からPT37のDNAセットを用いてPCR法を行った。
(3) 次に，反応のあったPT中に含まれる単一テンプレートDNA（ST: single template）を用いて判定した。
(4) 結果，それぞれのプライマーセットが標的とするO血清群株に反応し，それ以外のO血清群株には反応しないことを確認した。
＜＜実験例４， O121，O145，O165等の腸管出血性大腸菌O抗原と毒素産生遺伝子等の同時検出＞＞
１．実験例２の方法に従い検討を行った。
２．すなわち，表３に従い，各抗原に対するプライマーを含む反応液を調整し，サーマルサイクラー（ABI3100）で〔94℃-30秒，58℃-30秒，72℃-1分〕×25サイクル，反応させた。なお，プライマーとして，O121は配列番号159及び160，O145は配列番号171及び172，O165は配列番号189及び190のものを用いた。
その他の抗原については，O26がフォワード：GGGGGTGGGTACTATATTGG（配列番号258）及びリバース：AGCGCCTATTTCAGCAAAGA（配列番号259），O103がフォワード：TAAGTACGGGGGTGCTTTTT（配列番号260）及びリバース：AAGCTCCCGAGCACGTATAA（配列番号261），O111がフォワード：CAAGAGTGCTCTGGGCTTCT（配列番号262）及びリバース：AACGCAAGACAAGGCAAAAC（配列番号263），O157がフォワード：CAGGTGAAGGTGGAATGGTTGTC（配列番号264）及びリバース：TTAGAATTGAGACCATCCAATAAG（配列番号265），stx1がフォワード：CAGTTAATGTGGTGGCGAAGG（配列番号266）及びリバース：CACCAGACAATGTAACCGCTG（配列番号267），stx2がフォワード：ATCCTATTCCCGGGAGTTTACG（配列番号268）及びリバース：GCGTCATCGTATACACAGGAGC（配列番号269），eaeがフォワード：CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC（配列番号270）及びリバース：CCCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG（配列番号271）のものを用いた（図２０を参照）。
３．反応液の一部を1%アガロースゲルで電気泳動し，エチジウムブロマイドで染色後にUVトランスイルミネーター上で予測されるサイズの増幅産物（バンド）を確認した。
４．結果を図２１に示す。
(1) 実験例２で作成を行ったプライマーを用いて検出を行ったO121は，O111及びeaeが共存する状態でも，検出が可能であった。
(2) 同様に，O145は，eae及びstx1が共存する状態でも，検出が可能であった。
(3) さらに，O165は，eae，stx1，stx2が共存する状態でも，検出が可能であった。
(4) 即ち，腸管出血性大腸菌O抗原；O165，O103，O111，O157，O26，O121及びO145，並びに毒素産生遺伝子等；stx1，stx2及びeaeが共存する状態でも，それぞれの腸管出血性大腸菌O抗原の検出が可能であった。
５．O165抗原に対するプライマーとして，配列番号256及び257のものを用いた場合にも，同様の結果が得られた（図２２）。
６．これらの結果から，実験例２で作成を行ったプライマーにより，他のO抗原や毒素産生遺伝子等が共存する場合でも，目的とするO抗原の検出が可能であること，及び，他の抗原との同時検出が可能であることが示された。
１．実験例２の方法に従い検討を行った。
２．すなわち，表３に従い，各抗原に対するプライマーを含む反応液を調整し，サーマルサイクラー（ABI3100）で〔94℃-30秒，58℃-30秒，72℃-1分〕×25サイクル，反応させた。なお，プライマーとして，O121は配列番号159及び160，O145は配列番号171及び172，O165は配列番号189及び190のものを用いた。
その他の抗原については，O26がフォワード：GGGGGTGGGTACTATATTGG（配列番号258）及びリバース：AGCGCCTATTTCAGCAAAGA（配列番号259），O103がフォワード：TAAGTACGGGGGTGCTTTTT（配列番号260）及びリバース：AAGCTCCCGAGCACGTATAA（配列番号261），O111がフォワード：CAAGAGTGCTCTGGGCTTCT（配列番号262）及びリバース：AACGCAAGACAAGGCAAAAC（配列番号263），O157がフォワード：CAGGTGAAGGTGGAATGGTTGTC（配列番号264）及びリバース：TTAGAATTGAGACCATCCAATAAG（配列番号265），stx1がフォワード：CAGTTAATGTGGTGGCGAAGG（配列番号266）及びリバース：CACCAGACAATGTAACCGCTG（配列番号267），stx2がフォワード：ATCCTATTCCCGGGAGTTTACG（配列番号268）及びリバース：GCGTCATCGTATACACAGGAGC（配列番号269），eaeがフォワード：CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC（配列番号270）及びリバース：CCCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG（配列番号271）のものを用いた（図２０を参照）。
３．反応液の一部を1%アガロースゲルで電気泳動し，エチジウムブロマイドで染色後にUVトランスイルミネーター上で予測されるサイズの増幅産物（バンド）を確認した。
４．結果を図２１に示す。
(1) 実験例２で作成を行ったプライマーを用いて検出を行ったO121は，O111及びeaeが共存する状態でも，検出が可能であった。
(2) 同様に，O145は，eae及びstx1が共存する状態でも，検出が可能であった。
(3) さらに，O165は，eae，stx1，stx2が共存する状態でも，検出が可能であった。
(4) 即ち，腸管出血性大腸菌O抗原；O165，O103，O111，O157，O26，O121及びO145，並びに毒素産生遺伝子等；stx1，stx2及びeaeが共存する状態でも，それぞれの腸管出血性大腸菌O抗原の検出が可能であった。
５．O165抗原に対するプライマーとして，配列番号256及び257のものを用いた場合にも，同様の結果が得られた（図２２）。
６．これらの結果から，実験例２で作成を行ったプライマーにより，他のO抗原や毒素産生遺伝子等が共存する場合でも，目的とするO抗原の検出が可能であること，及び，他の抗原との同時検出が可能であることが示された。
＜＜実験例５，７抗原の同時検出＞＞
１．実験例２の方法に従い検討を行った。
２．すなわち，表４に従い，各抗原に対するプライマーを含む反応液を調整し，サーマルサイクラー（ABI3100）で〔94℃-30秒，58℃-30秒，72℃-1分〕×25サイクル，反応させた。なお，プライマーとして，O112acは配列番号67及び68，O148は配列番号175及び176，O158は配列番号183及び184，O114は配列番号157及び158，O144は配列番号81及び82，O159は配列番号185及び186，O169は配列番号91及び92のものを用いた。
３．反応液の一部を1%アガロースゲルで電気泳動し，エチジウムブロマイドで染色後にUVトランスイルミネーター上で予測されるサイズの増幅産物（バンド）を確認した。
４．結果を図２２に示す。実験例２で作成を行ったプライマーを用いて検出を行ったところ，全てのO抗原が検出可能であった。
５．この結果から，実験例２で作成を行ったプライマーにより，他のO抗原が共存する場合でも，目的とするO抗原の検出が可能であること，及び，他の抗原との同時検出が可能であることが示された。
１．実験例２の方法に従い検討を行った。
２．すなわち，表４に従い，各抗原に対するプライマーを含む反応液を調整し，サーマルサイクラー（ABI3100）で〔94℃-30秒，58℃-30秒，72℃-1分〕×25サイクル，反応させた。なお，プライマーとして，O112acは配列番号67及び68，O148は配列番号175及び176，O158は配列番号183及び184，O114は配列番号157及び158，O144は配列番号81及び82，O159は配列番号185及び186，O169は配列番号91及び92のものを用いた。
３．反応液の一部を1%アガロースゲルで電気泳動し，エチジウムブロマイドで染色後にUVトランスイルミネーター上で予測されるサイズの増幅産物（バンド）を確認した。
４．結果を図２２に示す。実験例２で作成を行ったプライマーを用いて検出を行ったところ，全てのO抗原が検出可能であった。
５．この結果から，実験例２で作成を行ったプライマーにより，他のO抗原が共存する場合でも，目的とするO抗原の検出が可能であること，及び，他の抗原との同時検出が可能であることが示された。
複数のO抗原が共存する場合における検出系としては，上記実験例の抗原及びプライマーの組み合わせに限定されるものではなく，例えば，O9：配列番号109及び110，O41：配列番号23及び24，O33：配列番号13及び14，O174：配列番号199及び200，O60：配列番号35及び36，並びにO80：配列番号49及び50のような組み合わせを構成することも可能である。
本発明は，感染症原因大腸菌の分類・同定を目的として，医療分野，公衆衛生分野及び食品衛生分野など，幅広い分野において利用することができる。
Claims (3)
- 大腸菌O抗原に特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセットであって、当該プライマーセットは下記群（1）〜群（9）から少なくとも１つのプライマーセットを含んで構成されることを特徴とするプライマーセット。
群（1）プライマーセット95：配列番号189及び190、プライマーセット34：配列番号67及び68、プライマーセット19：配列番号37及び38、プライマーセット72：配列番号143及び144、プライマーセット55：配列番号109及び110、プライマーセット73：配列番号145及び146、プライマーセット99：配列番号197及び198、プライマーセット89：配列番号177及び178、プライマーセット63：配列番号125及び126、プライマーセット66：配列番号131及び132、プライマーセット33：配列番号65及び66、プライマーセット37：配列番号73及び74、プライマーセット32：配列番号63及び64、プライマーセット75：配列番号149及び150、プライマーセット81：配列番号161及び162、からなる群。
群（2）プライマーセット88：配列番号175及び176、プライマーセット87：配列番号173及び174、プライマーセット12：配列番号23及び24、プライマーセット29：配列番号57及び58、プライマーセット6：配列番号11及び12、プライマーセット3：配列番号5及び6、プライマーセット11：配列番号21及び22、プライマーセット50：配列番号99及び100、プライマーセット16：配列番号31及び32、プライマーセット13：配列番号25及び26、プライマーセット14：配列番号27及び28、からなる群。
群（3）プライマーセット92：配列番号183及び184、プライマーセット57：配列番号113及び114、プライマーセット90：配列番号179及び180、プライマーセット7：配列番号13及び14、プライマーセット67：配列番号133及び134、プライマーセット10：配列番号19及び20、プライマーセット28：配列番号55及び56、プライマーセット84：配列番号167及び168 、プライマーセット52：配列番号103及び104、プライマーセット49：配列番号97及び98、プライマーセット91：配列番号181及び182、からなる群。
群（4）プライマーセット79：配列番号157及び158、プライマーセット40：配列番号79及び80、プライマーセット85：配列番号169及び170、プライマーセット96：配列番号191及び192、プライマーセット21：配列番号41及び42、プライマーセット51：配列番号101及び102、プライマーセット15：配列番号29及び30、プライマーセット1：配列番号1及び2、プライマーセット54：配列番号107及び108、プライマーセット2：配列番号3及び4、からなる群。
群（5）プライマーセット41：配列番号81及び82、プライマーセット97：配列番号193及び194、プライマーセット59：配列番号117及び118、プライマーセット94：配列番号187及び188、プライマーセット100：配列番号199及び200、プライマーセット27：配列番号53及び54、プライマーセット5：配列番号9及び10、プライマーセット56：配列番号111及び112、プライマーセット68：配列番号135及び136、プライマーセット24：配列番号47及び48、プライマーセット61：配列番号121及び122、からなる群。
郡（6）プライマーセット80：配列番号159及び160、プライマーセット93：配列番号185及び186、プライマーセット23：配列番号45及び46、プライマーセット98：配列番号195及び196、プライマーセット60：配列番号119及び120、プライマーセット18：配列番号35及び36、プライマーセット101：配列番号201及び202、プライマーセット45：配列番号89及び90、プライマーセット77：配列番号153及び154、プライマーセット39：配列番号77及び78、プライマーセット22：配列番号43及び44、プライマーセット4：配列番号7及び8、プライマーセット70：配列番号139及び140、プライマーセット20：配列番号39及び40、からなる群。
群（7）プライマーセット86：配列番号171及び172、プライマーセット46：配列番号91及び92、プライマーセット36：配列番号71及び72、プライマーセット38：配列番号75及び76、プライマーセット64：配列番号127及び128、プライマーセット17：配列番号33及び34、プライマーセット47：配列番号93及び94、プライマーセット69：配列番号137及び138、プライマーセット26：配列番号51及び52、プライマーセット35：配列番号69及び70、プライマーセット62：配列番号123及び124、プライマーセット43：配列番号85及び86、プライマーセット9：配列番号17及び18、プライマーセット83：配列番号165及び166、からなる群。
群（8）プライマーセット25：配列番号49及び50、プライマーセット31：配列番号61及び62、プライマーセット74：配列番号147及び148、プライマーセット82：配列番号163及び164、プライマーセット53：配列番号105及び106、プライマーセット65：配列番号129及び130、プライマーセット8：配列番号15及び16、プライマーセット76：配列番号151及び152、プライマーセット78：配列番号155及び156、プライマーセット44：配列番号87及び88、プライマーセット58：配列番号115及び116、からなる群。
群（9）プライマーセット30：配列番号59及び60、プライマーセット48：配列番号95及び96、プライマーセット71：配列番号141及び142、からなる群。 - 腸管出血性大腸菌O抗原に特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセットであって、当該プライマーセットは、プライマーセット95：配列番号189及び190、プライマーセット80：配列番号159及び160およびプライマーセット86：配列番号171及び172のプライマーセットを含んで構成されることを特徴とするプライマーセット。
- 下記いずれかのプライマーセットを含むことを特徴とする請求項２に記載のプライマーセット。
プライマーセット：フォワード：GGGGGTGGGTACTATATTGG及びリバース：AGCGCCTATTTCAGCAAAGA、
プライマーセット：フォワード：TAAGTACGGGGGTGCTTTTT及びリバース：AAGCTCCCGAGCACGTATAA、
プライマーセット：フォワード：CAAGAGTGCTCTGGGCTTCT及びリバース：AACGCAAGACAAGGCAAAAC、
プライマーセット：フォワード：CAGGTGAAGGTGGAATGGTTGTC及びリバース：TTAGAATTGAGACCATCCAATAAG、
プライマーセット：フォワード：CAGTTAATGTGGTGGCGAAGG及びリバース：CACCAGACAATGTAACCGCTG、
プライマーセット：フォワード：ATCCTATTCCCGGGAGTTTACG及びリバース：GCGTCATCGTATACACAGGAGC、
プライマーセット：フォワード：CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC及びリバース：CCCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG
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