JP7479640B2 - Ｐｃｒ法を用いた赤痢菌の広域ｏ血清群判定方法 - Google Patents
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Description
本発明は，赤痢菌のO血清型を判定する判定方法等に関する。
赤痢菌は，1897年に志賀潔により発見された下痢症の原因となる病原細菌である。細菌性赤痢は世界的に蔓延しており，特に栄養と衛生状態の悪い開発途上国で多発している。
日本において細菌性赤痢の感染事例は，毎年100から200件ほど報告されている。これらの感染事例のうち，アジア地域に旅行した帰国者からの分離報告が多くを占めるが，輸入食品を原因とする食中毒事例や，海外旅行を伴わない散発事例も報告されている。
加えて，赤痢菌と類似した症状を示す感染菌は，多く存在しており，これらを適切に判定し，正しい治療や対処を行う必要がある。これらの事情から，我が国においても，赤痢菌感染の迅速な判定手法が求められている。
日本において細菌性赤痢の感染事例は，毎年100から200件ほど報告されている。これらの感染事例のうち，アジア地域に旅行した帰国者からの分離報告が多くを占めるが，輸入食品を原因とする食中毒事例や，海外旅行を伴わない散発事例も報告されている。
加えて，赤痢菌と類似した症状を示す感染菌は，多く存在しており，これらを適切に判定し，正しい治療や対処を行う必要がある。これらの事情から，我が国においても，赤痢菌感染の迅速な判定手法が求められている。
また，赤痢菌は，分類学的には，腸内細菌科 Shigella 属に分類される。赤痢菌は，べん毛を発現していないために運動性が無く，主な生化学性状としては，乳糖非分解，インドール陰性，TSI斜面寒天培地においてガス産生陰性を示す。
さらに，赤痢菌は，O抗原型に基づいて，4菌種（S. dysenteriae：SD，S. flexneri：SF，S. boydii：SB，S. sonnei：SS）に分類され，少なくとも43種類（SD-13種類，SF-11種類，SB-18種類，SS-1種類）が定められている。
一方，赤痢菌と同様，O抗原を有する大腸菌は，O1からO188（欠番を含む）までの185種類が定められている。大腸菌は，赤痢菌と非常に高いゲノムDNAの相同性を有しており，特に，赤痢菌と大腸菌の糖鎖抗原（O抗原），およびそれをコードした遺伝子セットの多くは共通している（相同である）ことが分かっている。
さらに，赤痢菌は，O抗原型に基づいて，4菌種（S. dysenteriae：SD，S. flexneri：SF，S. boydii：SB，S. sonnei：SS）に分類され，少なくとも43種類（SD-13種類，SF-11種類，SB-18種類，SS-1種類）が定められている。
一方，赤痢菌と同様，O抗原を有する大腸菌は，O1からO188（欠番を含む）までの185種類が定められている。大腸菌は，赤痢菌と非常に高いゲノムDNAの相同性を有しており，特に，赤痢菌と大腸菌の糖鎖抗原（O抗原），およびそれをコードした遺伝子セットの多くは共通している（相同である）ことが分かっている。
赤痢菌と大腸菌は，歴史的な経緯や医学上の重要性などから，今なお独立した属と種として分類されているが，一般的な分類基準に基づくと，この２菌は同種とすることが妥当である。加えて，赤痢菌と大腸菌の遺伝的特徴を踏まえれば，赤痢菌と大腸菌のO抗原型判定法の統合と整備が望ましく，これにより，判定対象の広域化や赤痢菌誤同定回避などを含む検査体制の強化が可能となると考えられる。
しかしながら，O抗原型分類は国際基準として定められていることから，直ちに統合・整備することは現実的には難しいのが現状である。
しかしながら，O抗原型分類は国際基準として定められていることから，直ちに統合・整備することは現実的には難しいのが現状である。
このような状況の中，近年，血清学的なO抗原型の判定に代替する遺伝学的な判定法の開発が大腸菌を中心に進んでおり，検査現場での実用性が高いPCR法が有用な手法の一つとなっている（非特許文献１から３）。
これに対し，赤痢菌のO抗原型を網羅的に判定できる遺伝学的手法は，現在のところ存在しない。
これに対し，赤痢菌のO抗原型を網羅的に判定できる遺伝学的手法は，現在のところ存在しない。
Iguchi A, Iyoda S, Seto K, Morita-Ishihara T, Scheutz F, Ohnishi M, and Pathogenic E. coli Working Group in Japan. Escherichia coli O-genotyping PCR; a comprehensive and practical platform for molecular O-serogrouping. Journal of Clinical Microbiology 53(8):2427-32 (2015)
Iguchi A, Iyoda S, Kikuchi T, Ogura Y, Katsura K, Ohnishi M, Hayashi T, Thomson NR. A complete view of the genetic diversity of the Escherichia coli O-antigen biosynthesis gene cluster. DNA Research 22(1):101-7 (2015)
Banjo M, Iguchi A, Seto K, Kikuchi T, Harada T, Scheutz F, Iyoda S; Pathogenic E. coli Working Group in Japan. Escherichia coli H-genotyping PCR; a complete and practical platform for molecular H-typing. J Clin Microbiol. pii: JCM.00190-18. doi: 10.1128/JCM.00190-18. (2018)
このような事情から，赤痢菌O抗原型を判定するPCR法の開発が，上記問題の解決や，赤痢菌の検査体制の強化に繋がるものと発明者らは考えた。
上記事情を背景として，本発明では，赤痢菌の遺伝学的判定手法の開発を課題とする。
上記事情を背景として，本発明では，赤痢菌の遺伝学的判定手法の開発を課題とする。
発明者らは，鋭意研究の結果，赤痢菌43種類と大腸菌184種類のO抗原コード遺伝子セットを用いた網羅的な配列比較分析を行ったところ，赤痢菌由来の33種類は大腸菌と共通しており，残る10種類は赤痢菌にユニークであることを見出した。
また，発明者らは，共通する33種類の赤痢菌O抗原型株について，発明者らが開発した大腸菌のO抗原型判定用PCRプライマーセットを用いて検査を行なったところ，共通する赤痢菌でも明瞭に識別できることを確認した。
さらに発明者らは，赤痢菌にユニークな10種類のO抗原型株について，既に公開されている配列情報を基に，配列的な多様性が認められるO抗原合成遺伝子wzxまたはwzyを標的としたPCRプライマーを新たにデザインし，赤痢菌と大腸菌の全標準株を用いて評価したところ，該当する赤痢菌O抗原型株を特異的に識別できることに成功した。
これらより，発明者らは，赤痢菌のO抗原を対象とする赤痢菌の判定方法やプライマー等の発明を完成させたものである。
また，発明者らは，共通する33種類の赤痢菌O抗原型株について，発明者らが開発した大腸菌のO抗原型判定用PCRプライマーセットを用いて検査を行なったところ，共通する赤痢菌でも明瞭に識別できることを確認した。
さらに発明者らは，赤痢菌にユニークな10種類のO抗原型株について，既に公開されている配列情報を基に，配列的な多様性が認められるO抗原合成遺伝子wzxまたはwzyを標的としたPCRプライマーを新たにデザインし，赤痢菌と大腸菌の全標準株を用いて評価したところ，該当する赤痢菌O抗原型株を特異的に識別できることに成功した。
これらより，発明者らは，赤痢菌のO抗原を対象とする赤痢菌の判定方法やプライマー等の発明を完成させたものである。
本発明は，以下の構成からなる。
本発明の第一の構成は，赤痢菌のO抗原遺伝子の核酸増幅を行うことにより，赤痢菌の血清型を判定することを特徴とする赤痢菌O血清群判定方法である。
本発明の第二の構成は，核酸増幅が，プライマーセット番号１から34に示されるプライマーセットのいずれか又は複数を用いてなされる第一の構成に記載の赤痢菌O血清群判定方法である。
本発明の第三の構成は，前記プライマーセットにおいて，下記のプライマーセットのいずれか一つを少なくとも含む第二の構成に記載の赤痢菌O血清群判定方法である。
プライマーセット10（配列番号19および20）
プライマーセット15（配列番号29および30）
プライマーセット20（配列番号39および40）
プライマーセット22（配列番号43および44）
プライマーセット25（配列番号49および50）
プライマーセット26（配列番号51および52）
プライマーセット30（配列番号59および60）
プライマーセット31（配列番号61および62）
プライマーセット32（配列番号63および64）
本発明の第一の構成は，赤痢菌のO抗原遺伝子の核酸増幅を行うことにより，赤痢菌の血清型を判定することを特徴とする赤痢菌O血清群判定方法である。
本発明の第二の構成は，核酸増幅が，プライマーセット番号１から34に示されるプライマーセットのいずれか又は複数を用いてなされる第一の構成に記載の赤痢菌O血清群判定方法である。
本発明の第三の構成は，前記プライマーセットにおいて，下記のプライマーセットのいずれか一つを少なくとも含む第二の構成に記載の赤痢菌O血清群判定方法である。
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プライマーセット31（配列番号61および62）
プライマーセット32（配列番号63および64）
本発明の第四の構成は，核酸増幅が，PCRによりなされる第一から第三の構成いずれかに記載の赤痢菌O血清群判定方法である。
本発明の第五の構成は，第一から第四の構成いずれかに記載の赤痢菌O血清群判定方法に用いられるプライマーである。
本発明の第六の構成は，第一から第四の構成いずれかに記載の赤痢菌O血清群判定方法に用いられるプライマーセットである。
本発明の第七の構成は，第六の構成に記載のプライマーセットを含み，赤痢菌O血清群判定方法に用いられるキットである。
本発明の第五の構成は，第一から第四の構成いずれかに記載の赤痢菌O血清群判定方法に用いられるプライマーである。
本発明の第六の構成は，第一から第四の構成いずれかに記載の赤痢菌O血清群判定方法に用いられるプライマーセットである。
本発明の第七の構成は，第六の構成に記載のプライマーセットを含み，赤痢菌O血清群判定方法に用いられるキットである。
本発明により，赤痢菌の遺伝学的判定手法の提供が可能となった。
すなわち本発明の判定方法によれば，赤痢菌のO抗原型33種類を，遺伝学的に迅速かつ正確に判定することが可能となった。本発明の成果は，今後，医療や公衆衛生・食品衛生の場において，赤痢菌と病原大腸菌の予防や感染拡大を防ぐ為の検査手法として有効であると期待できる。
すなわち本発明の判定方法によれば，赤痢菌のO抗原型33種類を，遺伝学的に迅速かつ正確に判定することが可能となった。本発明の成果は，今後，医療や公衆衛生・食品衛生の場において，赤痢菌と病原大腸菌の予防や感染拡大を防ぐ為の検査手法として有効であると期待できる。
以下，本発明の赤痢菌O血清群判定方法等について説明を行う。
本発明の赤痢菌O血清群判定方法は，赤痢菌のO抗原遺伝子の核酸増幅を行うことにより，赤痢菌の血清型を判定することを特徴とする。
すなわち，図２ないし３に示される通り，O抗原に基づく赤痢菌の血清型として，SD，SF，SB，SSで示される各血清型を，配列番号１から68に示されるプライマーセットを用いて核酸増幅により判定を行うものである。
すなわち，図２ないし３に示される通り，O抗原に基づく赤痢菌の血清型として，SD，SF，SB，SSで示される各血清型を，配列番号１から68に示されるプライマーセットを用いて核酸増幅により判定を行うものである。
O抗原遺伝子における核酸増幅を行うための手法については，核酸増幅が可能な限り特に限定する必要はなく，種々の核酸増幅法を用いることができる。このような核酸増幅法として例えば，PCR法やLAMP法が挙げられる。
PCR法の場合は，多様性領域に対するリバースプライマー，フォワードプライマー，これらプライマーの設計を行い，プライマーセットとして用いて核酸増幅を行えばよい。
LAMP法の場合は，多様性領域に対するFIP，F3プライマー，BIP，B3プライマー，これらプライマーの設計を行い，プライマーセットとして用いて核酸増幅を行えばよい。なお，LAMP法においては，ループプライマーなどのプライマーをプライマーセットとして用いてもよい。
以下では，本発明において好適に用いられる例として，PCR法を挙げて，説明を行う。
PCR法の場合は，多様性領域に対するリバースプライマー，フォワードプライマー，これらプライマーの設計を行い，プライマーセットとして用いて核酸増幅を行えばよい。
LAMP法の場合は，多様性領域に対するFIP，F3プライマー，BIP，B3プライマー，これらプライマーの設計を行い，プライマーセットとして用いて核酸増幅を行えばよい。なお，LAMP法においては，ループプライマーなどのプライマーをプライマーセットとして用いてもよい。
以下では，本発明において好適に用いられる例として，PCR法を挙げて，説明を行う。
PCR法による赤痢菌検査のためには，検体試料が必要である。この検体試料としては，通常用いられるあらゆる検体試料を用いることが可能であり，例えば，赤痢菌感染が疑われる食品，ヒトや動物由来の生体試料などが挙げられる。
赤痢菌検査のための検体試料については，通常用いられる前処理を行い，PCR法に用いる際の試料とすればよい。例えば，タンパク質分解酵素等による組織細胞由来タンパク質を分解後，フェノール及びクロロホルムを用いて核酸抽出や精製を行ったり，市販されている抽出キットを用いて得られた核酸を抽出したりするなどである。
検体試料の準備ができたら，本発明のプライマーセットを用いて，核酸増幅のための操作を行う。この核酸増幅の際の操作として，例えば，少なくとも１セットのプライマーセット，耐熱性DNAポリメラーゼ，デオキシヌクレオチド3リン酸などの基質を反応溶液に加え，熱変性，アニーリング，伸長反応を行い，これらのサイクルを繰り返すことにより核酸増幅を行う。
検体試料の準備ができたら，本発明のプライマーセットを用いて，核酸増幅のための操作を行う。この核酸増幅の際の操作として，例えば，少なくとも１セットのプライマーセット，耐熱性DNAポリメラーゼ，デオキシヌクレオチド3リン酸などの基質を反応溶液に加え，熱変性，アニーリング，伸長反応を行い，これらのサイクルを繰り返すことにより核酸増幅を行う。
PCR法における本発明のプライマーセットは，フォワードプライマー（F）とリバースプライマー（R）の組み合わせからなる，合計2つのプライマーからなる組み合わせを含むものであり，図２または図３の配列番号1から配列番号68に示される核酸配列をプライマーとして用いればよい。
本発明においては，これらプライマーセットを単独で用いることもできるが，複数のプライマーセットを組み合わせて複合的なO血清型検出を行うことが好ましい。すなわち，一部のO抗原については，遺伝子の性質上，複数のO抗原が検出される場合がある。かかる場合に，複数のプライマーセットを組み合わせて検出を行うことにより，より精度の高い赤痢菌O血清型の判定が可能となるという効果を有する。
本発明においては，これらプライマーセットを単独で用いることもできるが，複数のプライマーセットを組み合わせて複合的なO血清型検出を行うことが好ましい。すなわち，一部のO抗原については，遺伝子の性質上，複数のO抗原が検出される場合がある。かかる場合に，複数のプライマーセットを組み合わせて検出を行うことにより，より精度の高い赤痢菌O血清型の判定が可能となるという効果を有する。
本発明の赤痢菌O血清群判定方法において，プライマーセット10（配列番号19および20），プライマーセット15（配列番号29および30），プライマーセット20（配列番号39および40），プライマーセット22（配列番号43および44），プライマーセット25（配列番号49および50），プライマーセット26（配列番号51および52），プライマーセット30（配列番号59および60），プライマーセット31（配列番号61および62），プライマーセット32（配列番号63および64），これらいずれか又は複数を用いて核酸増幅を行うことが好ましい。
これにより，従来はO抗原を対象としては不可能であった赤痢菌の検出・判定でき，本発明の網羅的検出を可能とし，有用性を向上させる効果を有する。
これにより，従来はO抗原を対象としては不可能であった赤痢菌の検出・判定でき，本発明の網羅的検出を可能とし，有用性を向上させる効果を有する。
本発明の赤痢菌O血清群判定方法において，図２ないし図３に示す以外の抗原を対象としたプライマーを組み合わせて判定を行ってもよい。このようなプライマーとして，例えば，国際公開第2014/157611号パンフレットに開示される大腸菌O血清型を判別するプライマーや，国際公開第2018/016451号パンフレットに開示される大腸菌H型を判別するプライマーなどが挙げられる。これらプライマーは本願発明者により発明がなされたものであり，これらを組み合わせることにより，赤痢菌O血清群の判定に加え，大腸菌型の判定も合わせて可能となることから，赤痢菌型と大腸菌型を統合させた判定が期待できるという効果を有する。
本発明において，プライマーセットを複数組み合わせたマルチプレックスとして検出を行うことが好ましい。これにより，一回のPCR核酸増幅判定で，複数種の赤痢菌O抗原を対象として判定・検出を行うことができ，赤痢菌O抗原判定の迅速化が可能となる効果を有する。
このようなマルチプレックスとしては，組み合わせるプライマーによる副反応がないことを考慮しつつ，プライマーセットの検出対象となる核酸増幅産物の長さが明瞭に区別できるよう設計すればよい。このようなマルチプレックスとして，例えば，実施例に示されるような，MP-S1（SB7，SB17，SS，SB13），MP-S2（SB12，SB18），MP-S3（SB9，SB16，SB2，SD10）のような組み合わせが挙げられる。
このようなマルチプレックスとしては，組み合わせるプライマーによる副反応がないことを考慮しつつ，プライマーセットの検出対象となる核酸増幅産物の長さが明瞭に区別できるよう設計すればよい。このようなマルチプレックスとして，例えば，実施例に示されるような，MP-S1（SB7，SB17，SS，SB13），MP-S2（SB12，SB18），MP-S3（SB9，SB16，SB2，SD10）のような組み合わせが挙げられる。
耐熱性DNAポリメラーゼは，通常用いられるあらゆる耐熱性DNAポリメラーゼを用いることができる。このような酵素として，例えば，pol Ｉ 型DNAポリメラーゼ，α型DNAポリメラーゼ，混合型DNAポリメラーゼ，Hot start用DNAポリメラーゼ等が挙げられる。
核酸増幅反応操作が終了したら，核酸増幅産物の検出を行う。核酸増幅産物の検出には，通常用いられるあらゆる検出方法を用いることができる。例えば，増幅された塩基配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドを用いた検出や蛍光性インターカレーター法，アガロースゲル電気泳動法による検出などである。
また，核酸増幅反応操作を行いながら，核酸増幅物の検出を行ってもよい（RT-PCR）。この場合，インターカレーター法やハイブリダイゼーション法など，蛍光色素を用いた検出法を用いればよい。
また，核酸増幅反応操作を行いながら，核酸増幅物の検出を行ってもよい（RT-PCR）。この場合，インターカレーター法やハイブリダイゼーション法など，蛍光色素を用いた検出法を用いればよい。
本発明のプライマーセットを用いて核酸増幅の検出を行う際に必要な各種の試薬類は，あらかじめパッケージングしてキット化することにより，検査キットとすることができる。この場合，検査キットは，少なくとも１セットの本発明のプライマーセットと，核酸増幅用試薬を含む。核酸増幅用試薬として，例えば，耐熱性DNAポリメラーゼ，核酸合成の基質となる４種類のdNTP，酵素反応に好適な条件を与える緩衝液や塩類，酵素や鋳型を安定化する保護剤などが挙げられる。
＜＜赤痢菌と大腸菌におけるO抗原遺伝子の比較分析＞＞
赤痢菌と大腸菌におけるO抗原遺伝子について，これらの配列をDBから比較検討を行い，核酸配列の相同性を網羅的に調べることを目的に分析を行った。
赤痢菌と大腸菌におけるO抗原遺伝子について，これらの配列をDBから比較検討を行い，核酸配列の相同性を網羅的に調べることを目的に分析を行った。
１．分析結果を図１に示す。図１は，O抗原遺伝子のマーカー遺伝子として，O抗原糖鎖合成酵素遺伝子（wzy）とO抗原糖鎖輸送タンパク遺伝子（wzx），これらそれぞれの遺伝子と赤痢菌のO抗原遺伝子との相同性を調べた結果である。
(1) 赤痢菌由来の33種類は，表に示すそれぞれの大腸菌O抗原血清型と比較して，97から100%と高い相同性を有していた。
(2) 残りの10種類については，類似するO血清群は認められなかった。
(3) また，赤痢菌のうちSF1aからSF5については，O抗原コード遺伝子群は相同であるものの，コード領域外の遺伝子が糖鎖構造を修飾して抗原性が変化していることが確認された。
(1) 赤痢菌由来の33種類は，表に示すそれぞれの大腸菌O抗原血清型と比較して，97から100%と高い相同性を有していた。
(2) 残りの10種類については，類似するO血清群は認められなかった。
(3) また，赤痢菌のうちSF1aからSF5については，O抗原コード遺伝子群は相同であるものの，コード領域外の遺伝子が糖鎖構造を修飾して抗原性が変化していることが確認された。
＜＜赤痢菌検出のためのプライマー設計＞＞
赤痢菌O抗原の明瞭な判定を可能とすることを目的に検討を行った。
赤痢菌O抗原の明瞭な判定を可能とすることを目的に検討を行った。
１．赤痢菌O抗原を検出するため，大腸菌と共通するO血清群については，既存の文献からプライマーを引用して用い，その他については，新規にプライマーを設計して検討を行った。表中における参考文献の表記については，下記の文献である。
［A］Iguchi A, Iyoda S, Seto K, Morita-Ishihara T, Scheutz F, Ohnishi M. 2015. Escherichia coli O-Genotyping PCR: a Comprehensive and Practical Platform for Molecular O Serogrouping. J Clin Microbiol 53:2427-32.
［B］Han W, Liu B, Cao B, Beutin L, Kruger U, Liu H, Li Y, Liu Y, Feng L, Wang L, DNA microarray-based identification of serogroups and virulence gene patterns of Escherichia coli isolates associated with porcine postweaning diarrhea and edema disease. Appl Environ Microbiol. 2007 Jun;73(12):4082-8
［C］Iguchi A, Mentzer von A, Kikuchi T, Thomson R N. An untypeable enterotoxigenic Escherichia coli represents one of the dominant types causing human disease. Microbial Genomics 2017 Jul 3;3(9):e000121.
［D］DebRoy C, Roberts E, Davis M, Bumbaugh A. Multiplex polymerase chain reaction assay for detection of nonserotypable Shiga toxin-producing Escherichia coli strains of serogroup O147. Foodborne Pathog Dis. 2010 Nov;7(11):1407-14
［A］Iguchi A, Iyoda S, Seto K, Morita-Ishihara T, Scheutz F, Ohnishi M. 2015. Escherichia coli O-Genotyping PCR: a Comprehensive and Practical Platform for Molecular O Serogrouping. J Clin Microbiol 53:2427-32.
［B］Han W, Liu B, Cao B, Beutin L, Kruger U, Liu H, Li Y, Liu Y, Feng L, Wang L, DNA microarray-based identification of serogroups and virulence gene patterns of Escherichia coli isolates associated with porcine postweaning diarrhea and edema disease. Appl Environ Microbiol. 2007 Jun;73(12):4082-8
［C］Iguchi A, Mentzer von A, Kikuchi T, Thomson R N. An untypeable enterotoxigenic Escherichia coli represents one of the dominant types causing human disease. Microbial Genomics 2017 Jul 3;3(9):e000121.
［D］DebRoy C, Roberts E, Davis M, Bumbaugh A. Multiplex polymerase chain reaction assay for detection of nonserotypable Shiga toxin-producing Escherichia coli strains of serogroup O147. Foodborne Pathog Dis. 2010 Nov;7(11):1407-14
２．検討を行ったところ，下記のことが明らかとなった。
(1) 大腸菌と共通する33種類の赤痢菌O抗原型株について，発明者らが開発した大腸菌のO抗原型判定用PCRプライマーセット（国際公開第2014/157611号パンフレット）を用いて検査を行なったところ，共通する赤痢菌でも明瞭に識別できることを確認した（不図示）。
(2) また，赤痢菌に特異的な（大腸菌のO血清群と重複しない）10種類のO型を検出するプライマー（既知のSB16のプライマーを含む）を用いて、増幅産物長が異なるプライマーを組み合わせた3種類のマルチプレックスPCR（MP-S1、MP-S2、MP-S3）を構築した。これを用いて赤痢菌の全O型株に対する特異性の評価を行ったところ、該当O型株のみで明瞭なPCR産物が得られることを確認した（図４）。
(1) 大腸菌と共通する33種類の赤痢菌O抗原型株について，発明者らが開発した大腸菌のO抗原型判定用PCRプライマーセット（国際公開第2014/157611号パンフレット）を用いて検査を行なったところ，共通する赤痢菌でも明瞭に識別できることを確認した（不図示）。
(2) また，赤痢菌に特異的な（大腸菌のO血清群と重複しない）10種類のO型を検出するプライマー（既知のSB16のプライマーを含む）を用いて、増幅産物長が異なるプライマーを組み合わせた3種類のマルチプレックスPCR（MP-S1、MP-S2、MP-S3）を構築した。これを用いて赤痢菌の全O型株に対する特異性の評価を行ったところ、該当O型株のみで明瞭なPCR産物が得られることを確認した（図４）。
３．これらの結果より，国際公開第2014/157611号パンフレット等に開示される大腸菌O抗原に対するプライマーと，今回，開発を行った新規プライマーを組み合わせて検出を行うことにより，赤痢菌のO抗原型33種類の網羅的な検出を可能とする遺伝学的判定手法の提供が可能となった。
＜＜ヒト患者由来株を用いたプライマーの評価＞＞
設計されたプライマーが，ヒト患者由来株を検出できるかどうかを確認することを目的に検討を行った。
設計されたプライマーが，ヒト患者由来株を検出できるかどうかを確認することを目的に検討を行った。
１．結果を図５に示す。
(1) 血清型が異なる全ての志賀赤痢菌（dysenteriae）において，O抗原型判定用PCRプライマーセット（国際公開第2014/157611号パンフレット）に開示されている各プライマーにより，検出が可能であった。
(2) 血清型が異なる全てのボイド赤痢菌（boydii）において，O抗原型判定用PCRプライマーセット（国際公開第2014/157611号パンフレット）に開示されている各プライマー，ならびに本願において設計されたプライマー（OgSB2）により，検出が可能であった。
２．これらの結果から，国際公開第2014/157611号パンフレット等に開示される大腸菌O抗原に対するプライマーならびに本願における新規プライマーにより，ヒト検体においても赤痢菌の検出が可能であることが示された。
(1) 血清型が異なる全ての志賀赤痢菌（dysenteriae）において，O抗原型判定用PCRプライマーセット（国際公開第2014/157611号パンフレット）に開示されている各プライマーにより，検出が可能であった。
(2) 血清型が異なる全てのボイド赤痢菌（boydii）において，O抗原型判定用PCRプライマーセット（国際公開第2014/157611号パンフレット）に開示されている各プライマー，ならびに本願において設計されたプライマー（OgSB2）により，検出が可能であった。
２．これらの結果から，国際公開第2014/157611号パンフレット等に開示される大腸菌O抗原に対するプライマーならびに本願における新規プライマーにより，ヒト検体においても赤痢菌の検出が可能であることが示された。
Claims (4)
- 赤痢菌のO抗原遺伝子の核酸増幅を行うことにより，赤痢菌の血清型を判定する赤痢菌O血清群判定方法であって，
核酸増幅が，プライマーセット番号１から34に示されるプライマーセットのいずれか又は複数を用いてなされ，かつ，
下記のプライマーセットのいずれか一つを少なくとも含むことを特徴とする赤痢菌O血清群判定方法。
プライマーセット10（配列番号19および20）
プライマーセット15（配列番号29および30）
プライマーセット20（配列番号39および40）
プライマーセット22（配列番号43および44）
プライマーセット25（配列番号49および50）
プライマーセット26（配列番号51および52）
プライマーセット30（配列番号59および60）
プライマーセット31（配列番号61および62）
プライマーセット32（配列番号63および64）
- 核酸増幅が，PCRによりなされる請求項１に記載の赤痢菌O血清群判定方法。
- 請求項１又は２に記載の赤痢菌O血清群判定方法に用いられる下記いずれかのプライマーセット。
プライマーセット10（配列番号19および20）
プライマーセット15（配列番号29および30）
プライマーセット20（配列番号39および40）
プライマーセット22（配列番号43および44）
プライマーセット25（配列番号49および50）
プライマーセット26（配列番号51および52）
プライマーセット30（配列番号59および60）
プライマーセット31（配列番号61および62）
プライマーセット32（配列番号63および64）
- 請求項３に記載のプライマーセットを少なくとも含み，赤痢菌O血清群判定方法に用いられるキット。
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| 井口純，大腸菌のＯ抗原合成遺伝子領域の解析と検査法の確立，日本細菌学雑誌，2016年，Vol. 71，pp. 209-215 |
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