KR20140022194A - 브루셀라 아보투스 균 특이적 동정용 고리매개등온증폭 프라이머 세트 및 이를 이용한 브루셀라 아보투스 균의 검출 방법 - Google Patents

브루셀라 아보투스 균 특이적 동정용 고리매개등온증폭 프라이머 세트 및 이를 이용한 브루셀라 아보투스 균의 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 브루셀라 아보투스 균 특이적 동정용 프라이머 세트 및 이를 이용한 브루셀라 아보투스 균의 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 프라이머 세트는 소 브루셀라병을 일으키는 브루셀라 아보투스 균만을 특이적으로 검출하여 소 브루셀라병을 신속하게 검색 및 진단할 수 있어, 병의 전염경로, 역학적 연구, 진단 및 치료 등에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

브루셀라 아보투스 균 특이적 동정용 고리매개등옥증폭 프라이머 세트 및 이를 이용한 브루셀라 아보투스 균의 검출 방법{Primer set for Brucella abortus strain-specific identification using loop-mediated isothermal amplification and method for detecting Brucella abortus using the same}
본 발명은 브루셀라 아보투스 균 특이적 동정용 프라이머 세트, 및 이를 이용한 소 브루셀라 균의 검출 방법에 관한 것이다.
브루셀라병은 잠복기가 긴 만성 전염병으로, 전 세계적으로 발생하고 있다. 특히 소 브루셀라병은 암소의 임신, 유산 등의 번식 장애를 일으키고, 수소에서는 고환염, 전립선염 등의 생식기 질환을 일으켜, 국내에서는 2종 가축전염병으로 분류되어, 검진 및 살처분의 근절 대책이 확립되어 있다. 또한, 소 브루셀라병은 소 뿐만 아니라 사람에게도 감염되어 파상열, 관절통, 오한, 쇠약 등 감기와 유사한 증상을 일으키는 인수공통전염병으로, 치료하지 않을 경우 심내막염 및 척추염 등으로 진행되어 사망에 이를 수 있다. 또한, 제3군 법정 전염병으로 분류되어 공중위생상 매우 중요한 질병으로 취급되고 있으며, 미국, 유럽 등 세계적으로 근절을 위해 많은 노력을 기울이고 있다.
브루셀라속 균주는 숙주 특이성, 배양 성상, 생화학적 및 혈청학적 특성에 따라 염소 및 면양의 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 소의 브루셀라 아보투스(B. abortus), 돼지의 브루셀라 수이스(B suis), 양의 브루셀라 오비스(B. ovis), 개의 브루셀라 캐니스(B. canis), 사막 쥐의 브루셀라 네오토매(B. neotomae)와, 최근에 해양 포유류인 바다사자, 물범, 돌고래 등에서 분리된 브루셀라 세티(B. ceti, 고래류)와 브루셀라 핀니페디알리스(B. pinnipedialis, 바다표범류) 등으로 분류된다. 이 중에서 브루셀라 멜리텐시스, 브루셀라 아보투스, 브루셀라 수이스 등 3종이 사람에게 병원성이 있는 것으로 알려져 있으며, 브루셀라 캐니스도 발생 사례가 보고되고 있다.
브루셀라병의 진단은 원인균의 분리와 항체 검사로 실시되고 있다. 그러나, 균주 분리에는 생물학적 안전성이 확보된 밀폐된 실험실에서 최소 10일에서 30일의 균 배양기간이 소요되며, 균을 동정하기 위한 25가지의 생화학적 성상 검사에 5일 정도의 추가 소요 기간이 필요하다. 또한 균을 취급하는 실험실과 실험자에 대한 생물학적 안전성(biosafety)이 확보되어야 하며, 실험자의 숙련도에 따라 생화학적 성상 검사에 다소 차이가 나 정확한 동정이 곤란한 문제점이 있다. 이에 따라 일반적으로 항체검사에 의한 양성 반응우의 색출 방법이 전 세계적으로 많이 이용되고 있다.
브루셀라병을 근절하기 위한 질병진단체계 수립시에 고려되어야 할 사항 중 첫 번째는 감염 집단내 감염 개체를 색출할 수 있는 진단 체계와 특이도 보다는 민감도가 우수한 진단법을 사용하는 것이다. 신속 간단하고 저렴한 진단법이 가장 이상적이고 효율적이다. 두 번째는, 균주 분리 및 동정을 위한 진단 체계가 확립되어야 한다. 특히 브루셀라병에 대한 예방 접종을 실시할 경우에는 백신주와 야외주의 감별을 위한 진단 방법이 마련되어야하며, 이러한 점을 고려할 때 PCR 기법을 이용하여 분리주의 감별 및 동정을 위한 진단체계를 수립하는 것이 바람직하다. 세 번째로 고려할 사항은, 브루셀라병 발생의 역학적 상황을 조사하기 위해 감염원의 색출 및 유입경로를 추적할 수 있는 유전학적 분석에 기인한 프로파일링(profiling) 기법에 관한 것이다.
현재 많이 사용되고 있는 혈청학적 진단 방법은 유사 항원 결정기를 가진 세균의 LPS의 교차반응에 의해 위양성 반응이 나타나지만, 이를 감별할 수 있는 정확한 검사 방법이 마련되어 있지 않은 상황이다. 브루셀라병 근절단계에 도달한 몇몇 국가에서도 위양성 반응에 따른 브루셀라병 발생으로 인한 정책의 혼선이 발생되기때문에, 신속 정확한 원인체의 분리 및 동정을 위한 PCR 기법 등을 이용한 진단체계의 마련이 필요한 실정이다.
최근 분자 유전학의 발전과 함께 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reactiono, PCR)을 이용한 여러가지 브루셀라병 진단 기법이 개발되어 실시되고 있으며, 감염집단을 검색하기 위해 유즙 내의 특이 유전자 부위를 검출하는 방법, 양성 집단내 감염개체를 색출하기 위한 개체 검사 방법, 분리한 균의 동정을 위한 동정방법 및 동정된 균의 분자유전학적 분석을 실시하여 감염원의 유입경로 등을 밝혀내는 역학 조사에 PCR 방법이 많이 이용되고 있다.
한편, LAMP(Loop-mediated isothermal amplification) PCR 법은 기존 PCR법과 달리 PCR 사이클이 필요없는 Bst 중합효소를 이용하여 등온의 조건에서 PCR을 수행하는 방법으로 기본적으로 4개의 프라이머를 이용하여, 양끝을 루프모양처럼 합성하여 유전자의 특정 부위를 무한대로 증폭하고, 증폭된 DNA 산물을 형광 검출용 시약을 이용하거나 침전반응시켜 증폭유무를 확인하는 방법으로, 고가의 PCR 또는 실시간 PCR 장비 없이 간단하게 30분 내지 1시간 내에 진단할 수 있는 방법이다.
최근, 16s rRNA 또는 OMP 25 유전자를 이용하여 브루셀라 균종 전체를 검색할 수 있는 브루셀라병 진단법이 보고되고 있으나, 종 각각에 대하여 특이적인 LAMP 법에 대하여 알려진 바 없다..
이에 본 발명자들은 브루셀라 아보투스 균주를 특이적으로 동정할 수 있는 LAMP 용 프라이머 세트를 제작하고, 이를 이용하여 브루셀라 아보투스 균주만을 동정함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 브루셀라 아보투스 균(소 브루셀라 균; Brucella abortus) 특이적 동정용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 브루셀라 아보투스 균 특이적 동정용 프라이머 세트를 포함하는 브루셀라 아보투스 균 동정용 고리매개등온증폭 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 브루셀라 아보투스 균 특이적 동정용 프라이머 세트를 포함하는 브루셀라 아보투스 균의 검출방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 브루셀라 아보투스 균 특이적 동정용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 브루셀라 아보투스 균 특이적 동정용 프라이머 세트를 포함하는 브루셀라 아보투스 균 동정용 고리매개등온증폭(LAMP) 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 브루셀라 아보투스 균 특이적 동정용 프라이머 세트를 포함하는 브루셀라 아보투스 균의 검출방법을 제공한다.
본 발명의 프라이머 세트는, 다양한 브루셀라 종 중에서 소 브루셀라병을 일으키는 브루셀라 아보투스 균만을 높은 민감도로 특이적으로 검출할 수 있어 소 브루셀라병을 신속하게 검색 및 진단할 수 있도록 하는 효과가 우수하다.
도 1은 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 브루셀라 아보투스 균을 특이적으로 검출한 결과를 나타낸 도이다.[도 1(A): 탁도 측정; 도 1(B): 자외선에서 형광 측정; 도 1(C): 아가로오즈 젤에서 전기영동; 레인 1: 브루셀라 아보투스; 레인 2: 브루셀라 캐니스; 레인 3: 브루셀라 수이스; 레인 4: 브루셀라 오비스; 레인 5: 브루셀라 네오토매; 레인 6: 브루셀라 메리텐시스; 레인 7: 오크로박트룸; 레인 8: 증류수]
도 2는 본 발명의 프라이머 세트의 민감도를 확인한 도이다[도 2(A): 시간에 따른 탁도 측정; 도 2(B)의 레인 1: 2 ng/㎕; 레인 2: 200 pg/㎕; 레인 3: 20 pg/㎕; 레인 4: 2 pg/㎕; 레인 5: 200 fg/㎕; 레인 6: 20 pg/㎕; 레인 7: 증류수].
본 발명은 브루셀라 아보투스(소 브루셀라 균; Brucella abortus)균 특이적 동정용 프라이머 세트를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 브루셀라 아보투스 균을 특이적으로 검출하는 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.
서열번호1의 Ba_FIP는 BCAN_B0548 영역의 정방향 내부 프라이머(forward internal primer);
서열번호2의 Ba_BIP는 BCAN_B0548 영역의 역방향 내부 프라이머(backward internal primer);
서열번호3의 Ba_F3는 BCAN_B0548 영역의 정방향 외부 프라이머(forward outer primer);
서열번호4의 Ba_B3는 BCAN_B0548 영역의 역방향 외부 프라이머(backward outer primer);
서열번호5의 Ba_LF는 BCAN_B0548 영역의 고리 정방향 프라이머(loop forward primer);
서열번호6의 Ba_LB는 BCAN_B0548 영역의 고리 역방향 프라이머(loop backward primer)이다.
상기 프라이머 세트는 등온고리매개증폭법(LAMP; Loop-mediated isothermal amplification) 용도로 사용하는 것이 바람직하다.
본원 발명에서 사용하는 용어인 “프라이머”란 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사 효소) 및 상이한 4가지 dNTP (deoxynucleoside triphosphate)의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소 (예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹 (예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
본원 발명에서 사용하는 용어인 “동정”은 시료에서 다른 미생물뿐만 아니라 동종의 브루셀라 종에서 브루셀라 아보투스 균을 분리하여 식별할 수 있는 것을 의미한다.
또한, 본 발명은 상기의 프라이머 세트를 포함하는 브루셀라 아보투스 균 동정용 고리매개등온증폭 키트를 제공한다.
본 발명의 6개의 프라이머 세트는 DNA를 증폭시킬 수 있는 고리매개등온증폭 (Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP) 반응 방법에만 이용될 수 있다. 6개의 프라이머 세트 중 2개(F3-forward outer primer, B3-backward outer primer)만 일반 PCR에 사용할 수 있다.
본 발명에서 고리매개등온증폭은, 변성(denaturation), 접합(annealing), 신장(extension) 세 가지 단계의 온도의 변화를 주어야 하는 기존의 PCR과 달리, 일정한 온도에서 변성, 접합 및 신장이 가능한 장점이 있다. 고리매개등온증폭에서는 특히 Bst . DNA 중합효소를 사용하며, 이 Bst . DNA 중합효소는 일반 PCR의 Taq . DNA 중합효소와는 달리 헬리카제(helicase)의 성격을 가지고 있어 DNA의 이중나선 구조를 열에 의한 변성을 거치지 않고 Tm 값에 가까운 접합 온도에서 변성, 접합 및 신장이 수행될 수 있도록 한다.
본 발명의 브루셀라 아보투스 균 동정용 키트는 브루셀라 아보투스 균 검출용 프라이머 세트와 미생물 검출키트에 포함되는 통상적인 구성성분을 포함할 수 있다. 상기 브루셀라 아보투스 균 검출용 키트에 포함되는 통상적인 구성성분은 반응완충액, Bst DNA 중합효소, dNTP 및 MgCl2 등일 수 있다. 상기 브루셀라 아보투스 균 동정용 키트에는 브루셀라 아보투스 판별용 배지 또는 상기 배지를 포함하는 균주 배양용 장치를 추가로 포함할 수 있다. 상기 균주 배양용 장치는 상기 배지 특히, 바람직하게는 고체상의 상기 배지와 상기 배지가 적재되어 있는 용기로 구성될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기의 브루셀라 아보투스 균 특이적 동정용 프라이머 세트와 생물학적 시료를 혼합하여 고리매개등온증폭법을 수행하는 단계를 포함하는 브루셀라 아보투스 균의 검출방법을 제공한다.
본 발명의 프라이머 세트는 브루셀라 아보투스 균의 BCAN_B0548 영역을 분석하여 제조된 프라이머 세트이다. 상기의 프라이머 세트를 이용하면, 10종, 22 생태형(biovar)의 브루셀라 표준균주와 함께 유전학적, 혈청학적으로 관련된 비 브루셀라균 8종의 DNA중에서 브루셀라 아보투스 균만 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였고, 200 fg/㎕ 의 농도의 DNA에서도 브루세라 아보투스의 존재 여부를 검출할 수 있어, 높은 특이도와 민감도로 소 브루셀라병을 신속하고 정확하게 진단할 수 있다.
상기 생물학적 시료는 동물의 혈액, 땀, 소변, 대변, 조직일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 동물은 사람, 개, 소, 돼지, 양, 고래 및 돌고래 등을 포함한다.
상기의 방법은 브루셀라 균 중에서 브루셀라 아보투스 균을 특이적으로 검출하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[ 실시예 1] 브루셀라 아보투스 를 특이적으로 검출하는 LAMP PCR 용 프라이 머 세트의 제작
브루셀라 아보투스(B. abortus)만을 특이적으로 증폭할 수 있는 새로운 LAMP PCR 용 프라이머를 제작하였다. 구체적으로, Prime explorer V4 소프트웨어를 이용하여 BCAN_B0548 영역의 8개 유전적 부위(genetic sites)에서 4개의 프라이머 및 증폭을 더욱 가속화시키는 LF와 LB 프라이머 2개로 구성된 총 6개의 프라이머를 제작하였다.
이를 표 1에 나타내었고, 서열번호 1 내지 6으로 표시하였다.
프라이머 서열
Ba_FIP(서열번호1) 5`-AGTGGCGCCAGTAGTATTGACGTGAGCGTGGACAAGGTGT-3`
Ba_BIP(서열번호2) 3`-CGCAGGGCGATGGTCTGTTGCCAGTTGAAGTTGCCCGTAG-3`
Ba_F3(서열번호 3) 5`-GGGCTTACGCTTGGATCG-3`
Ba_B3(서열번호 4) 5`-CGTAGCTGGGGCTATTCGT-3`
Ba_LF(서열번호 5) 5`-TCGTTGACCTGCTGGTTGAT-3`
Ba_LB(서열번호 6) 5`-GGCAATGGCACCTGGACA-3`
상기 표 1에서,
서열번호1의 Ba_FIP는 BCAN_B0548 영역의 정방향 내부 프라이머;
서열번호2의 Ba_BIP는 BCAN_B0548 영역의 역방향 내부 프라이머;
서열번호3의 Ba_F3는 BCAN_B0548 영역의 정방향 외부 프라이머;
서열번호4의 Ba_B3는 BCAN_B0548 영역의 역방향 외부 프라이머;
서열번호5의 Ba_LF는 BCAN_B0548 영역의 고리 정방향 프라이머;
서열번호6의 Ba_LB는 BCAN_B0548 영역의 고리 역방향 프라이머이다.
[ 실시예 2] 브루셀라 아보투스 ( Brucella abortus ) 특이적 검출 확인
상기 실시예 1에서 제작된 프라이머가 브루셀라 아보투스를 특이적으로 동정하는지 확인하기 위하여, 10종, 22 생태형(biovar)의 브루셀라 표준균주와 함께 유전학적, 혈청학적으로 관련된 비 브루셀라 균 8종에 대하여 LAMP PCR을 수행하였다.
상기의 균주 각각의 게놈 DNA를 순수 분리하였다. 각 균주로부터 추출한 2 ㎕의 주형 DNA를 포함한 12.5㎕의 고리매개등온증폭(LAMP) 반응혼합물 (40 mM Tris-HCl, pH 8.8, 20 mM KCl, 20 mM (NH4)2SO4, 0.2% Tween 20, 1.6 M Betaine)과 1.5㎕의 (8 units) Bst DNA 중합효소, 6㎕ 프라이머 혼합액, 0.5 ㎕의 100 mM MgSO4 및 2.5mM의 각각의 dNTP 1㎕에 1.5㎕의 증류수를 가하여 최종 부피가 25㎕가 되도록 하였고, 상기의 반응용액의 구성을 하기의 표 2에 나타내었다.
premix solution 구성성분 용량
2 X reaction Mix 12.5 ㎕
Bc_F3 primer (5 pmole/㎕) 1 ㎕
Bc_B3 primer (5 pmole/㎕) 1 ㎕
Bc_FIP primer (40 pmole/㎕) 1 ㎕
Bc_BIP primer (40 pmole/㎕) 1 ㎕
Bc_LF primer (20 pmole/㎕) 1 ㎕
Bc_LB primer (20 pmole/㎕) 1 ㎕
2.5 mM dNTPs (각각) 1 ㎕
100 mM MgSO4 0.5 ㎕
주형 DNA 2 ㎕
Bst DNA 중합효소 1.5 ㎕
형광 검출 반응물질(Fluorescent Detection Reagent ;FD) 1 ㎕
총 25 ㎕
이렇게 만들어진 반응용액을 실시간 항온탁도측정기를 사용하여 65℃에서 1 시간 동안 반응한 후 80℃에서 2분간 두어 반응을 종료하고, LAMP 반응의 증폭 산물을 확인하였으며, 형광검출 및 전기영동을 실시하였다. 결과를 도 1 및 표 3에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 실시간 항온탁도측정 이용시, 브루셀라 아보투스 균에서만 증폭피크를 확인하였고(도 1 A), 자외선을 이용한 형광검출(도 1 B) 및 전기영동(도 1 C)에서도 브루셀라 아보투스 균만 특이적으로 1시간 이내에 검출됨을 확인하였다.
또한, 표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 브루셀라 아보투스 균 특이적 LAMP 프라이머의 경우, 다른 종의 균주와 비특이적인 반응이 일어나지 않았고, 브루셀라 아보투스 bv 1-6, 9 및 브루셀라 아보투스 백신균주 RB51 및 S19에만 반응하여 브루셀라 균 중에서도 브루셀라 아보투스 균만을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였다. 이러한 결과를 통해, 본 발명의 프라이머는 유전적으로 유사한 브루셀라 균 중에서 브루셀라 아보투스 균만을 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 프라이머임을 확인하였다.
종 균주명 본 발명의 프라이머를 이용한 PCR
브루셀라 종(Brucella species)
브루셀라 아보투스(B. abortus) bv. 1 544 +
브루셀라 아보투스 bv. 2 86/8/59 +
브루셀라 아보투스 bv. 3 Tulya +
브루셀라 아보투스 bv. 4 292 +
브루셀라 아보투스 bv. 5 B3196 +
브루셀라 아보투스 bv. 6 870 +
브루셀라 아보투스 bv. 9 C68 +
브루셀라 아보투스 RB51 +
브루셀라 아보투스 S19 +
브루셀라 수이스(B. suis)bv.1 1330 -
브루셀라 수이스 bv. 2 Thomsen -
브루셀라 수이스 bv. 3 686 -
브루셀라 수이스 bv. 4 40 -
브루셀라 수이스 bv. 5 513 -
브루셀라 오비스(B. ovis ) 63/290 -
브루셀라 네오토매(B. neotomae) 5K33 -
브루셀라 멜리텐시스(B. melitensis) bv. 1 16M -
브루셀라 멜리텐시스 bv. 2 63/9 -
브루셀라 멜리텐시스bv. 3 Ether -
브루셀라 세티(B. ceti) B1/94 -
브루셀라 핀니페디알리스(B. pinnipedialis ) B2/94 -
브루셀라 마이크로티(B. microti) CCM4915 -
브루셀라 이노피나타(B. inopinata ) B01 -
Non - Brucella organisms
오크로박트룸 안트로피 (Ochrobactrum anthropi) -
에셔리키아 콜리(Esherichia coli) O157:H7 -
파스텔라 멀토시다( Pasteurella multocida -
살모넬라 엔티리카(Salmonella enterica subsp. enterica) -
예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) O:9 -
캄피오박터 제주니( Campylobacter jejuni ) -
스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) isolate -
크로스트리디움 퍼프리겐스(Clostridum perfrigens) isolate -
[ 실시예 3] 브루셀라 아보투스 특이적 LAMP 프라이머 세트의 민감도 확인
브루셀라 아보투스 균을 특이적으로 검출하는 LAMP PCR 프라이머 세트의 민감도를 확인하기 위하여, 브루셀라 아보투스 표준 균주의 DNA를 증류수로 10진 계단 희석하여 20 fg/㎕ 내지 2 ng/㎕의 DNA 시료를 준비한 후, 실시예 2와 같은 방법으로 LAMP PCR을 수행하였다.
결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 60분 이내에 200 fg/㎕ 농도의 낮은 DNA 시료에서도 브루셀라 아보투스 균의 검출이 가능함을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 브루셀라 아보투스 동정용 프라이머 세트는 브루셀라 아보투스 균을 특이적으로 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 낮은 농도의 브루셀라 아보투스 균을 민감하게 검출할 수 있는 효과적인 프라이머임을 확인하였다.
<110> Korea Animal, plant and Fisheries quarnantine and inspection agency <120> Primer set for Brucella abortus strain-specific identification using loop-mediated isothermal amplification and method for detecting Brucella abortus using the same <130> P-130 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This is forward internal primer for identifying Brucella abortus <400> 1 agtggcgcca gtagtattga cgtgagcgtg gacaaggtgt 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This is backward internal primer for identifying Brucella abortus <400> 2 cgcagggcga tggtctgttg ccagttgaag ttgcccgtag 40 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This is forward outer primer for identifying Brucella abortus <400> 3 gggcttacgc ttggatcg 18 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This is backward outer primer for identifying Brucella abortus <400> 4 cgtagctggg gctattcgt 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This is loop forward primer for identifying Brucella abortus <400> 5 tcgttgacct gctggttgat 20 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This is loop backward primer for identifying Brucella abortus <400> 6 ggcaatggca cctggaca 18

Claims (7)

  1. 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 제 1프라이머 세트;
    서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 제 2프라이머 세트; 및
    서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 제 3프라이머 세트를 포함하는 브루셀라 아보투스 균 동정용 프라이머 세트.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 고리매개등온증폭법에 사용되는 것을 특징으로 하는 브루셀라 아보투스 균 동정용 프라이머 세트.
  3. 제 1항의 프라이머 세트를 포함하는 브루셀라 아보투스 동정용 고리매개등온증폭 키트.
  4. 제 1항의 브루셀라 아보투스 균 특이적 동정용 프라이머 세트와 생물학적 시료를 혼합하여 고리매개등온증폭법을 수행하는 단계를 포함하는 브루셀라 아보투스 균의 검출방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 동물의 혈액, 땀, 소변, 대변 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 브루셀라 아보투스 균의 검출방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 동물은 사람, 개, 소, 돼지, 양, 고래 및 돌고래로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 브루셀라 아보투스 균의 검출방법.
  7. 제 4항에 있어서, 상기 검출은 브루셀라 균 중에서 브루셀라 아보투스 균을 특이적으로 검출하는 것을 특징으로 하는, 브루셀라 아보투스 균의 검출방법.
KR1020120088438A 2012-08-13 2012-08-13 브루셀라 아보투스 균 특이적 동정용 고리매개등온증폭 프라이머 세트 및 이를 이용한 브루셀라 아보투스 균의 검출 방법 KR101437385B1 (ko)

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