JP4899009B2 - LAMP法を用いたクロストリディウム・ディフィシルtoxinB遺伝子検出方法およびこの方法に用いるプライマーセット - Google Patents
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1.Toxin A検出用検査キットによる糞便検体中のtoxin A検出
2.細胞培養および中和試験による糞便検体中のtoxin B検出
3.嫌気培養によるクロストリディウム・ディフィシルの分離培養と分離培養された菌の毒素産生能の同定
分離された菌株の毒素産生能の同定は、以下のように行われる。
1.液体培地で3日以上培養した後に、toxin A検出キットでtoxin Aを、細胞培養法でtoxin Bを検出
2.PCR法により毒素遺伝子を検出
加藤はる (2003):クロストリディウム・ディフィシル毒素、臨床検査、47:169-174 加藤はる (2003):クロストリディウム・ディフィシル関連下痢症、JARMAM、14:121-126
2.菌が分離培養された場合、toxin Aキットの使用により、toxin A産生性の検討は可能であるが、toxin B産生性を調べることはできない。そのため、toxin A陰性toxin B陽性株の同定はできない。
3.分離菌株のtoxin A産生性を検討するためには液体培地で3日以上嫌気培養する必要があり、時間がかかる。
[1]クロストリディウム・ディフィシルのtoxin B遺伝子の少なくとも一部をLAMP法により増幅し得るプライマーセットを用意し、
検体中に含まれる菌体から、菌を培養することなくDNAを抽出し、
抽出したDNAを、前記プライマーセットを用いるLAMP法による増幅操作に供し、
増幅操作後に、産物中に、増幅されたDNAが含まれるか否かを増幅産物の濁度を測定すること、または蛍光目視検出で確認する、ことを含み、
前記プライマーセットが配列表に示された配列番号1〜6の塩基配列を有する6つのDNAを含む、
検体中の菌体に含まれるクロストリディウム・ディフィシルのtoxin B遺伝子を検出する方法。
[2]クロストリディウム・ディフィシルのtoxin B遺伝子の少なくとも一部をLAMP法により増幅し得るプライマーセットを用意し、
クックドミート培地を用いて検体中に含まれる菌を培養し、増殖したクロストリディウム・ディフィシルの菌体からDNAを抽出し、
抽出したDNAを、前記プライマーセットを用いるLAMP法による増幅操作に供し、
増幅操作後に、産物中に、増幅されたDNAが含まれるか否かを増幅産物の濁度を測定すること、または蛍光目視検出で確認する、ことを含み、
前記プライマーセットが配列表に示された配列番号1〜6の塩基配列を有する6つのDNAを含む、
検体中の菌体に含まれるクロストリディウム・ディフィシルのtoxin B遺伝子を検出する方法。
[3]検体中の菌が、toxin A陽性toxin B陽性菌株である場合、またはtoxin A陰性toxin B陽性菌株である場合に、toxin B遺伝子が増幅されて検出できる[1]または[2]に記載の方法。
[4]クロストリディウム・ディフィシルは、toxinotypeが0、I、III、IV、IX、XII、XVIII、XIX、XX、VIII、XVI、XVIIである場合に、toxin B遺伝子が増幅されて検出できる[1]〜[3]のいずれか1項に記載の方法。
[5]検体中の菌体に含まれるクロストリディウム・ディフィシルのtoxin B遺伝子を[1]〜[4]のいずれか1項に記載の方法により検出するために用いられる、配列表に示された配列番号1〜6の塩基配列を有する6つのDNAを含むプライマーセット。
[6][5]に記載のプライマーセットを含む、検体中の菌体に含まれるクロストリディム・ディフィシルのtoxin B遺伝子を[1]〜[4]のいずれか1項に記載の方法により検出するためのキット。
1.菌株におけるtoxin B産生能を調べる場合、DNA抽出ステップも含めて、例えば、1.5時間以内にtoxin B遺伝子の存在を調べることが可能である。
2.糞便検体からtoxin B遺伝子を検出する場合、DNA抽出ステップも含めて、例えば、3時間以内に解析が可能である。
3.LAMP法を用いるため、増副産物の有無を濁度測定により、あるいは試薬を反応液に加え蛍光目視検出による増副産物の有無の判定が可能であり、電気泳動による判定に比べて短時間での判定が可能である。
4.両毒素陽性株およびtoxin A陰性toxin B陽性株の両方のtoxin B陽性株を同定できる。
5.PCR法で必要なサーマルサイクラーや電気泳動装置等が必要ない。
6.細胞培養法で必要な培養細胞および必要な実験装置が必要ない。
(1)クロストリディウム・ディフィシルのtoxin B遺伝子の少なく一部をLAMP法により増幅し得るプライマーセットを用意する。
(2)検体中に含まれる菌体から、菌体を培養することなくDNAを抽出し、または検体中に含まれる菌体を培養し、培養した菌体からDNAを抽出する。
(3)抽出したDNAを、前記プライマーセットを用いるLAMP法による増幅操作に供する。
(4)増幅操作後に、産物中に、増幅されたDNAが含まれるか否かを確認する。
本発明の方法では、クロストリディウム・ディフィシルのtoxin B遺伝子の少なく一部をLAMP法により増幅し得るプライマーセットを用意する。前述のように、クロストリディウム・ディフィシルのtoxin B遺伝子はPaLocに存在するが、PaLocは、菌株の種類によって、他種類の変異が存在する。本発明では、このような多種類の変異PaLocが存在するにも関わらず、菌株の種類によらず確実にtoxin B遺伝子を検出することを目的とする。このような目的を達成するという観点からは、クロストリディウム・ディフィシルのtoxin B遺伝子の少なく一部をLAMP法により増幅し得るプライマーセットとしては、例えば、以下の4種類のDNAからなるプライマーセットを用いることが好ましい。
5'-CTGCACCTAAACTTACACCATCTATCTTCCTACATTATCTGAAGGATT-3'
HK101(BIP): 配列番号2
5'-GAGCTAAGTGAAACGAGTGACCCGCTGTTGTTAAATTTACTGCC-3'
HK101(F3): 配列番号3
5'-GTATCAACTGCATTAGATGAAAC-3'
HK101(B3): 配列番号4
5'-CCAAAGATGAAGTAATGATTGC-3'
HK101(Loop-F): 配列番号5
5'-AATAGTTGCAATTATAGG-3'
HK101(Loop-B): 配列番号6
5'-AGACAAGAAATAGAAGCTAAGATAGG-3'
本発明の方法では、検体中に含まれる菌体から、菌体を培養することなくDNAを抽出するか、または検体中に含まれる菌体を培養し、培養した菌体からDNAを抽出する。具体的には、DNA抽出のステップとして以下の3つの方法を挙げることができる。
本発明の方法では、抽出したDNA(DNAテンプレイト)を、前記プライマーセットを用いるLAMP法による増幅操作に供する。LAMP法による増幅操作は、例えば、以下のように行うことができる。試薬(例えば、Bst DNAポリメラーゼ、反応バッファー、dNTPs、プライマーセット、蒸留水)を混合し、反応チューブに分注した後にDNAテンプレイトを加える。次いで、例えば、62℃にてインキュベートする。インキュベート時間は、例えば、30分〜90分の範囲である。
本発明の方法では、増幅操作後に、産物中に、増幅されたDNAが含まれるか否かを確認する。検体中に含まれる菌体中にtoxin B遺伝子が含まれている場合、増幅操作によりtoxin B遺伝子が増幅される。逆に、検体中に含まれる菌体中にtoxin B遺伝子が含まれていなければ、増幅操作によっても増幅されるDNAはない。
1.Bst DNAポリメラーゼ
2.反応バッファー
3.dNTPs
4.プライマーセット(本発明のプライマー)
5.コントロールDNA(陽性コントロール)
6.反応チューブ
7.説明書
1.原理と方法
(1)遺伝子増幅と検出
Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)法により遺伝子を増幅し、反応液の濁度変化によって増幅を検出し、電気泳動により確認した。
(2)使用したプライマー
配列番号1〜6のDNAを含むプライマーセット
25μl反応液中
Tris HCl (pH8.8) 20mM
KCl 10mM
MgSO4 8mM
(NH4)2SO4 10mM
Tween20 0.1%
ベタイン 0.8M
dNTPs 1.4mM
Bst DNAポリメラーゼ 1.0μl
プライマー
FIP 40pM
BIP 40pM
Loop-F 20pM
Loop-B 20pM
F3 5pM
B3 5pM
テンプレートDNA 1〜2μl (100ng〜1pg)
インキュベーション温度:62℃
標準菌株2株における解析
使用菌株:VPI 10463株(toxin A陽性toxin B陽性株)
DNA量25ng/μlから10倍希釈系列を作製し、各々のDNA 1μlを25μl反応液に加え経時的に濁度を測定した。濁度測定装置として栄研化学のLA-320Cを使用した。結果を図2に示す。
さらに、5% ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を図3に示す。
図2および3に示す結果から、DNA量25ng〜0.25pg/25μl反応液 (lanes 1-6)で30分〜1時間のインキュベーションで増幅反応が認められた。
DNA量35ng/μlから10倍希釈系列を作製し、各々のDNA 1μlを25μl反応液に加え経時的に濁度を測定した。結果を図4に示す。5% ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を図5に示す。これらの結果から、DNA量35ng〜0.35pg/25μl反応液 (lanes 1-6)で、30分〜1時間のインキュベーションで増幅反応が認められた。
臨床分離株における解析例
臨床分離株34株における、toxin A産生性、toxin B産生性、およびPCRによるtoxin B遺伝子検出および本発明によるtoxin B遺伝子検出法の結果を表1に示す。臨床分離株34株は、以下の表1に示す。
b検討菌株数。
糞便検体から抽出したDNAにおける解析例
27検体における糞便検体中毒素検出、クロストリディウム・ディフィシル培養、およびLAMPによる検体からのtoxin B遺伝子検出(本発明の方法)の結果の比較を表2に示す。本発明によるtoxin B遺伝子検出法は、DNA量 約5〜20 ng/μlで行った。
糞便検体を同量の99%エタノールを加え、30分間室温でインキュベートした。予備還元したセフォキシチン・サイクロセリン・マニトール培地(CCMA)にこの混合物を0.1ml接種し、48時間嫌気培養した。認められた黄色のコロニーをCCMA培地に継代し、コロニー形態、グラム染色、クロストリディウム・ディフィシルのグルタメートデヒドロゲナーゼを検出するラッテクス凝集反応(CDチェック、シオノギ)による反応などにより同定した。
QIAamp DNA stool mini kit (キアゲン)を使用した。
(Wilkins, T. D. and Lyerly, D. M. 2003. Clostridium difficile testing: after 20 years, still challenging J Clin Microbiol 41: 531-4. Borriello, S.P. et al. 1992. Molecular, immunological, and biological characterization of a toxinA-negative, toxin B-positive strain of Clostridium difficile. Infect Immun 60:4192-9.)
(2)細胞培養法のよる検体中toxin B検出は、検査に24時間あるいは48時間かかるが、LAMP法では2〜3時間以内に検査可能であった。(サンプル数が少なければ2時間で可能である)
(3)Toxin A検出キットでは検出できないtoxin A陰性toxin B陽性菌株が分離された検体においても、LAMP法では検出可能であった。
Claims (6)
- クロストリディウム・ディフィシルのtoxin B遺伝子の少なくとも一部をLAMP法により増幅し得るプライマーセットを用意し、
検体中に含まれる菌体から、菌を培養することなくDNAを抽出し、
抽出したDNAを、前記プライマーセットを用いるLAMP法による増幅操作に供し、
増幅操作後に、産物中に、増幅されたDNAが含まれるか否かを増幅産物の濁度を測定すること、または蛍光目視検出で確認する、ことを含み、
前記プライマーセットが配列表に示された配列番号1〜6の塩基配列を有する6つのDNAを含む、
検体中の菌体に含まれるクロストリディウム・ディフィシルのtoxin B遺伝子を検出する方法。 - クロストリディウム・ディフィシルのtoxin B遺伝子の少なくとも一部をLAMP法により増幅し得るプライマーセットを用意し、
クックドミート培地を用いて検体中に含まれる菌を培養し、増殖したクロストリディウム・ディフィシルの菌体からDNAを抽出し、
抽出したDNAを、前記プライマーセットを用いるLAMP法による増幅操作に供し、
増幅操作後に、産物中に、増幅されたDNAが含まれるか否かを増幅産物の濁度を測定すること、または蛍光目視検出で確認する、ことを含み、
前記プライマーセットが配列表に示された配列番号1〜6の塩基配列を有する6つのDNAを含む、
検体中の菌体に含まれるクロストリディウム・ディフィシルのtoxin B遺伝子を検出する方法。 - 検体中の菌が、toxin A陽性toxin B陽性菌株である場合、またはtoxin A陰性toxin B陽性菌株である場合に、toxin B遺伝子が増幅されて検出できる請求項1または2に記載の方法。
- クロストリディウム・ディフィシルは、toxinotypeが0、I、III、IV、IX、XII、XVIII、XIX、XX、VIII、XVI、XVIIである場合に、toxin B遺伝子が増幅されて検出できる請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 検体中の菌体に含まれるクロストリディウム・ディフィシルのtoxin B遺伝子を請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法により検出するために用いられる、配列表に示された配列番号1〜6の塩基配列を有する6つのDNAを含むプライマーセット。
- 請求項5に記載のプライマーセットを含む、検体中の菌体に含まれるクロストリディム・ディフィシルのtoxin B遺伝子を請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法により検出するためのキット。
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