KR20160036528A - 가닥―침입 기반된 dna 증폭 방법 - Google Patents

가닥―침입 기반된 dna 증폭 방법 Download PDF

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Abstract

가닥-침입 기반된 DNA 증폭에 의한 독소 발생 클로스트리디움 디피실 (C. difficile)을 검출하는 방법이 제공되는데, 이러한 방법에 사용하기에 적합한 올리고뉴클레오타이드, 조성물 및 키트도 함께 제공된다.

Description

가닥―침입 기반된 DNA 증폭 방법{STRAND-INVASION BASED DNA AMPLIFICATION METHOD}
본 발명은 가닥-침입 기반된 DNA 증폭에 의해 독소 발생 클로스트리디움 디피실(C. difficile)을 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 방법에서 사용하기 적합한 올리고뉴클레오타이드, 조성물 및 키트, 그리고 독소 발생 C. 디피실의 검출을 위한 이들의 용도에 관한 것이다.
클로스트리디아는 그람-양성, 포자 형성 혐기성 박테리아이다. 병원성 클로스트리디아 종은 큰 클로스트리디움 세포독소 (LCTs)의 군이 큰 인 비보 독성 뿐 아니라 큰 구조 및 서열 상동성을 가지는 매우 큰 독소로 이루어진 단백질 독소를 생산한다 (von Eichel-Streiber et al., 1996). C. 디피실 독소 A 및 B는 C. 디피실 병원성의 주요 원인이다. 오랜 시간 동안 독소 A는 주요 병독성 인자(virulence factor)로 고려되었지만, 많은 양의 증거가 실제로 독소 B가 C. 디피실 감염에서 주요 역할을 한다는 것을 보여주고 있다 (Lyras et al., 2009; Carter et al., 2012).
C. 디피실 독소 A 및 B 각각은 유전자 tcdA 및 tcdB에 의해 인코딩되고, 이들은 약 19.6 kb 병원성 유전자 자리 (PaLoc)에 위치한다. 상기 PaLoc은 각각 독소 발현의 음성 및 양성 조절자로서 기능하는 2개의 조절성 유전자들, 즉 tcdC 및 tcdR도 포함한다. PaLoc에 포함되어 있는 tcdE도, 독소 A 및 B 분비에 필요한 홀린-유사(holin-like) 단백질을 인코딩한다. 비-독소 발생 스트레인들에서 PaLoc는 115 bp 서열로 대체되어 있다 (Braun et al., 1996). DNA 증폭은 독소 발생 C. 디피실 스트레인들의 검출을 위해 사용되어 왔다 (Wren et al., 1990; McMillin et al., 1991; McMillin et al., 1992).
업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머, 및 가닥 침입 시스템에 따른 등온 DNA 증폭 과정은 WO 2009/150467에 기재되어 있다.
발명의 요약
본 발명은 측정될 시료에서 독소 발생 C. 디피실의 존재를 고려하여 독소 발생 C. 디피실의 타겟 핵산 서열의 검출에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머, 및 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드(strand invasion oligonucleotide)를 이용하며, 각각은 상기 타겟 핵산 서열에 상보적인 부위를 포함한다. 조합하여, 프라이머들 및 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드는 타겟 핵산 서열의 증폭을 제공한다. 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드는 상기 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머의 결합을 허용하도록 단일-가닥된 타겟 핵산 서열의 적어도 일부를 제공하여, DNA의 증폭을 가능하게 한다. 전형적으로, 상기 증폭은, 이중-가닥된 DNA의 열적 변성에 대한 필요 없이 등온 조건(isothermal conditions) 하에서 실시한다.
상기 타겟 핵산 서열의 증폭이 검출된다면, 이것은 상기 타겟 병원체 C. 디피실의 독소 발생 스트레인이 시료 내에 존재하고, C. 디피실의 비-독소 발생, 비-병원성 스트레인, 또는 다른 클로스트리디움 종들이 존재하지 않는다는 것을 나타낸다. 본 발명자들은 본 발명의 방법이 독소 발생 C. 디피실의 다른 타겟 핵산 서열들의 매우 특이적이고 민감한 검출을 제공한다는 것을 보였다.
본 발명은 시료 내 독소 발생 클로스트리디움 디피실(C. difficile)의 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 타겟 핵산 서열의 증폭을 촉진하는 조건 하에서 상기 시료를 최소 하나의 업스트림 프라이머, 최소 하나의 다운스트림 프라이머 및 최소 하나의 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 프라이머 및 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드 각각은 상기 타겟 핵산 서열에 상보적인 부위를 포함하고; 및 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드는 상기 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머의 결합을 허용하도록 단일-가닥된 타겟 핵산 서열의 적어도 일부를 제공한다.
본 발명은 조성물 및 키트를 추가적으로 제공하는데, 각각은 (a) 업스트림 프라이머, (b) 다운스트림 프라이머 및 (c) 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드로부터 선택된 최소 2개의 올리고뉴클레오타이드를 포함하고:
- (I) 상기 업스트림 프라이머는 서열번호 2 또는 이의 변이체 서열을 포함하는 30개 미만의 뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클레오타이드, 상기 다운스트림 프라이머는 서열번호 3 또는 이의 변이체 서열을 포함하는 30개 미만의 뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클레오타이드이며, 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 4 또는 이의 변이체 서열을 포함하는 30개보다 더 큰 뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클레오타이드이고, 이의 3' 부위에 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 추가적으로 포함하거나; 또는
- (II) 상기 업스트림 프라이머는 서열번호 7 또는 이의 변이체 서열을 포함하는 30개 미만의 뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클레오타이드, 상기 다운스트림 프라이머는 서열번호 8 또는 이의 변이체 서열을 포함하는 30개 미만의 뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클레오타이드이며, 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 9 또는 이의 변이체 서열을 포함하는 30개보다 더 큰 뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클레오타이드이고, 이의 3' 부위에 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 추가적으로 포함한다.
본 발명은 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머 및 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드의 용도를 추가적으로 제공하며, C. 디피실의 검출을 위한 방법에서 각각은 상기 (I)에 정의된 대로이거나, 또는 각각은 상기 (II)에 정의된 대로이다.
본 발명은 대상자에서 C. 디피실 감염의 진단을 위한 방법을 추가적으로 제공하는데, 상기 방법은 상기 대상자에서 유래된 시료에서 본 발명에 따른 독소 발생 C. 디피실의 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법을 실시하는 단계를 포함한다.
서열의 기재
서열번호 1은 tcdB 타겟 부위의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 2는 tcdB 정방향 프라이머의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 3은 tcdB 역방향 프라이머의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 4는 tcdB 가닥 침입성(invading) 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 5는 변형된 tcdB 가닥 침입성 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 6은 tcdA 타겟 부위의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 7은 tcdA 정방향 프라이머의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 8은 tcdA 역방향 프라이머의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 9는 tcdA 가닥 침입성 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 10은 변형된 tcdA 가닥 침입성 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이다.
발명의 상세한 설명
본 발명에서 개시된 방법들의 다른 적용이 당업계에서의 특이적인 필요에 따라 조정될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 또한 본 명세서에서 사용되는 용어들이 본 발명의 특이적 구현예들을 기재하고자 하는 목적만을 위한 것이고, 제한하고자 의도되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 또한 본 명세서 및 첨부된 청구항들에서 사용되는 대로 단수 형태 "a", "an", 및 "the"는 내용이 명확하게 다르게 기술하지 않는 한 복수의 지시물을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "폴리펩타이드(a polypeptide)"에 대한 언급은 2개 또는 이상의 그러한 폴리펩타이드들, 및 이와 유사한 것을 포함한다. 앞 또는 아래에서 인용되든 간에, 본 명세서에서 인용된 모든 공개물, 특허 및 특허출원들은 그 전문이 참조로서 본 명세서에 삽입된다.
시료 내 독소 발생 C. 디피실의 검출 방법
시료
일반적으로, 시료는 임상 시료, 예를 들어 C. 디피실을 가지거나, 또는 C. 디피실에 의한 감염을 가지는 것으로 의심되는 환자로부터 얻어진 시료이다. 하지만, 핵산이 상기 시료로부터 얻어지거나 또는 유래될 수 있다면 어떠한 시료도 이용할 수 있다. 따라서, 특정 C. 디피실 스트레인들의 레퍼런스 시료, 또는 환경적 시료들이 본 발명에서 사용될 수 있다. 적합한 타입의 임상 시료는 대상자에 존재하거나, 또는 대상자에 존재하는 것으로 의심되는 특정 타입의 감염에 따라 다양할 수 있다. 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 소변 또는 대변 시료일 수 있다. 선호되는 구현예에서, 상기 시료는 대변 시료이다. 상기 대변 시료는 위장관 감염을 가지는 대상자로부터 취해질 수 있다. 상기 감염은 설사를 나타내는 환자에 존재할 수 있다.
선호되는 구현예에서, 상기 시료는 포유동물 대상체 같은 동물 대상체들로부터 취해진다. 시료들은 보통 인간 대상자로부터 취해질 것이지만, 본 발명은 일반적으로 가축(domestic animals), 목축(livestock), 새 및 물고기에도 적용가능하다. 예를 들어, 본 발명은 수의적 또는 농업적 환경(setting)에 적용될 수 있다.
시료는 DNA 또는 RNA일 수 있는 핵산을 포함한다. 상기 핵산이 본 발명에 따른 검출을 허용하는 적합한 형태로 시료 내에 존재한다면, 상기 시료는 직접적으로 이용될 수 있다. 하지만, 전형적으로, 핵산은 상기 시료로부터 유래되거나, 얻어지거나 또는 추출된다. 검출 방법에 사용하기 위해 핵산을 포함하는 시료를 프로세싱하는 방법, 핵산을 추출하는 방법 및/또는 핵산을 정제하는 방법은 당업계에 잘-알려져 있다. 총 핵산이 분리될 수 있거나 또는 DNA 및 RNA가 개별적으로 분리될 수 있다.
전형적으로는, 시료는 적절하게 프로세싱되어 핵산이 프라이머 및 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드와 접촉하기에 편리한 형태로 제공된다. 상기 핵산이 DNA라면, 상기 DNA는 전형적으로 이중-가닥된 형태로 제공된다. 상기 핵산이 RNA라면, 상기 RNA는 전형적으로 역전사효소 또는 역전사효소 활성을 가지는 폴리머라제를 이용하여 cDNA로 변환된다. 타겟 서열의 농도를 효과적으로 증폭하는 박테리아 세포에 존재하는 매우 많은 수의 리보좀으로 인해, RNA는 박테리아 검출에 유용할 수 있다.
타겟 핵산 서열
타겟 핵산 서열은 독소 발생 C. 디피실의 특이적 검출에 사용하기에 적합한 C. 디피실 게놈 (또는 앰플리콘)의 부위이다. 이것은 밀접하게 관련된 생물체들이 존재할지라도, 시료 내 독소 발생 C. 디피실의 존재에 대해 매우 정량적, 분명한 결정을 고려한다. 특이적 병원체의 독소 발생 스트레인 내 특이적인 타겟 핵산 서열의 선택, 및 상기 서열들의 검출을 위한 프라이머 및 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드의 필연적인 고안은 중요한 고려사항이다. 적절한 서열의 예들이 본 명세서에서 제공된다.
전형적으로는, 상기 타겟 핵산 서열은 C. 디피실 게놈에 대해 특이적일 것이다. 따라서 전형적으로 상기 타겟 핵산 서열은 관계된 종들, 예컨대 상동성 클로스트리디움 종들 내 어떠한 상동성 핵산 서열과 상이할 것이다. 전형적으로, 상기 타겟 핵산 서열은 관계된 종들 내 상동성 핵산 서열과 여러 개의 미스매치를 포함할 것이다. 좋게는, 상기 타겟 핵산 서열은 큰 클로스트리디움 독소에 대한 유전자들을 가지는 C. 디피실을 제외한 클로스트리디움 종들에 존재하지 않는다. 상기 타겟 핵산 서열은 좋게는 C. 소르델리 및/또는 C. 노비(C. novyi)에 존재하지 않는다. 상기 타겟 핵산 서열은 전형적으로 C. 디피실 및 C. 소르델리 및/또는 C. 노비를 포함하는 시료로부터 C. 디피실의 특이적 검출을 가능하게 한다.
상기 타겟 핵산 서열은 전형적으로 다른 C. 디피실 독소타입들(toxinotypes)에 대한 우수한 포괄성을 가지며, 이에 따라 전형적으로 존재하고 하나 이상의 C. 디피실 독소타입에서 검출할 수 있다. 상기 타겟 핵산 서열은 모든 C. 디피실 독소타입에 가장 최적으로 좋게는 최소 3개, 보다 좋게는 최소 5개, 최소 7개, 최소 10개, 최소 15개, 최소 20개, 최소 25개, 최소 30개, 최소 35개를 포함한다. C. 디피실 독소타입은 독소타입 0, I, II, IIIa, IIIb, IIIc, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XIa, XIb, XII, XIII, XIV, XV, XVI, XVII, XVIII; XIX, XX, XXI; XXII; XXIII; XXIV, XXV, XXVI, XXVII, XXVIII, XXIX, XXX, XXXI, XXXII 및 XXXIII, 그리고 당업계에서 기재되거나, 또는 자연에 존재하는 어떠한 추가적인 독소타입을 포함한다. 전형적으로, 상기 타겟 핵산 서열은 C. 디피실 감염과 관련된 질환들에서 임상 관련성이 있는 것으로 밝혀진 C. 디피실 독소타입을 포함한다.
상기 타겟 핵산 서열은 전형적으로 C. 디피실 게놈의 평균 GC 함량보다 더 높은 GC 함량을 가지는데, 이는 C. 디피실 레퍼런스 스트레인 630에서 29.1%이다. 상기 타겟 핵산 서열은 최소 30%, 보다 좋게는 최소 31%, 최소 32% 또는 최소 33%의 GC 함량을 가질 것이다. 상기 타겟 핵산 서열이 tcdA 또는 tcdB 유전자에 존재한다면, 이들 유전자의 평균 GC 함량은 27%이고, 그래서 상기 선호되는 GC 함량도 이들 유전자에 대한 평균과 비교하여 더 높다. 또한 상기 타겟 핵산 서열의 GC 함량은 이용된 등온 온도 조건 하에서 프라이머의 결합 및 상기 타겟 서열의 융해에 대한 필요와 관련하여 선택된다.
상기 타겟 핵산 서열 또는 앰플리콘은 독소 발생 C. 디피실의 특이적인 검출 및 상기 타겟 서열의 다른 부분에 적절한 방식으로 상기 업스트림 및 다운스트림 프라이머 및 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드의 혼성화를 제공하기에 충분한 길이이다. 상기 업스트림 프라이머의 5' 결합 위치부터 상기 다운스트림 프라이머의 5' 결합 위치까지 측정된 대로, 좋게는, 상기 앰플리콘은 최소 45개의 뉴클레오타이드 길이, 보다 좋게는 최소 50개, 최소 55개 또는 최소 60개의 뉴클레오타이드 길이이다.
상기 논의된 대로 독소 발생 C. 디피실의 특이적 검출을 위해 필요한 특징을 가진다면, 상기 타겟 핵산 서열은 상기 C. 디피실 게놈의 어떠한 부위에 존재할 수 있다. 상기 타겟 핵산 서열은 독소 발생 C. 디피실에 특이적인 비코딩성 DNA 부위 또는 독소 발생 C. 디피실에 특이적인 코딩성 DNA 부위에 존재할 수 있다. 상기 타겟 핵산 서열은 C. 디피실의 병원성 유전자 자리에 존재할 수 있다. 좋게는, 상기 타겟 핵산 서열은 C. 디피실의 tcdA 유전자 또는 tcdB 유전자에 존재한다. 다른 적합한 타겟 유전자들은 C. 디피실의 PaLoc 또는 이중 독소 유전자들 내 tcdC, tcdE, tcdR 유전자들을 포함할 수 있다. 서열들은 클로스트리디움 디피실 630 완전 게놈 (GenBank: AM180355.1), tcdA 유전자 (AM180355.1: 795843-803975, tcdB 유전자 (AM180355.1: 787393-794493)에 대해 나열된 접근번호에서 이용가능하다.
상기 타겟 핵산 서열은 좋게는 서열번호 1 또는 이의 변이체 (tcdA의 검출용) 또는 서열번호 6 또는 이의 변이체 (tcdB의 검출용)를 포함한다. 상기 타겟 핵산 서열은 서열번호 1 또는 이의 변이체, 또는 서열번호 6 또는 이의 변이체를 나타내는 센스 가닥, 및 상보적인 안티-센스 가닥을 포함하는 이합체(duplex)라는 것이 이해될 것이다. 상기 타겟 핵산 서열을 증폭하는 데 이용되는 업스트림 및 다운스트림 프라이머들은 이러한 이합체의 반대 가닥에 결합한다.
상기 타겟 핵산 서열은 레퍼런스 스트레인 C. 디피실 630에 대해 다른 독소타입에 존재하는 서열번호 1 또는 서열번호 6의 천연 변이체 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 1 또는 서열번호 6의 천연 변이체 서열은 다른 C. 디피실 독소타입의 알려진 서열들에서 발견되며, 예를 들어 몇몇 알려진 독소타입들에서 상응하는 서열은 서열번호 1의 서열과 1, 2 또는 3개의 미스매치들을 포함한다. 또한 아직 시퀀싱되지 않은 독소타입들도 서열번호 1 또는 서열번호 6에 대해 미스매치를 포함할 수 있다. 본 발명자들은 놀랍게도 본 발명의 방법이 그러한 미스매치들의 존재에도 넓은 범위의 독소타입들의 검출에 포괄적이라는 것을 보였다.
서열번호 1 또는 서열번호 6의 변이체들은 서열번호 1 또는 서열번호 6의 최소 35개의 인접(contiguous) 뉴클레오타이드, 보다 전형적으로는 최소 40개의 인접 뉴클레오타이드, 좋게는 최소 45개의 인접 뉴클레오타이드 또는 최소 50개의 인접 뉴클레오타이드에 대해 부분적으로 또는 완전 상보적인 부위를 포함할 수 있다. 상기 변이체들은 서열번호 1 또는 서열번호 6의 상응하는 원래의 타겟 서열의 부위에 대해 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개 또는 이상의 미스매치들 (치환들)을 가지는 부위를 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어 상기 변이체들은 상응하는 원래의 타겟 서열의 최소 35개의 인접 뉴클레오타이드의 상응하는 부위에 대해 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 미스매치들, 예컨대 1-3개 또는 1-5개의 미스매치들을 가지는 최소 35개 길이의 뉴클레오타이드 부위를 포함할 수 있다. 상기 변이체들은 상응하는 원래의 타겟 서열에서 동일한 길이의 상응하는 부위에 대해 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 미스매치들, 예컨대 1-5개 또는 1-8개의 미스매치들을 가지는 최소 40개, 45개, 또는 50개의 뉴클레오타이드 길이의 부위를 포함할 수 있다. 상기 변이체 서열에서 어떠한 미스매치들은 최소 2개, 최소 4개, 최소 5개, 또는 최소 10개의 뉴클레오타이드로 떨어져 존재할 수 있다.
택일적으로, 상기 변이체들은 원래의 타겟 서열과 완전 상보성(complementarity)인 최소 35개, 40개, 또는 45개의 뉴클레오타이드 길이의 부위를 포함할 수 있다.
가장 좋게는, 상기 타겟 핵산 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 6를 포함하거나 또는 서열번호 1 또는 서열번호 6 및 상보적인 안티센스 가닥으로 이루어질 수 있다.
하나 이상의 타겟 핵산 서열은, 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머 및 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드의 2개 이상 세트들을 제공함으로써 본 발명의 방법에서 검출될 수 있으며, 각 세트는 다른 타겟 핵산 서열의 검출을 위해 조정된다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 tcdB 및 tcdA 모두를 검출할 수 있다.
업스트림 및 다운스트림 프라이머
적합한 업스트림 및 다운스트림 프라이머는 목적 타겟 핵산 서열에 기반되고, 상기 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머의 결합을 허용하도록 단일-가닥된 타겟 핵산 서열의 적어도 일부를 부여하는 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드의 결합 위치를 고려하여 선택한다.
상기 업스트림 및 다운스트림 프라이머는 타겟에 대해 부분적이거나 또는 완전히 상보적이고 선택적으로 5' 및/또는 3' 플랭킹 비-상보적 서열인 서열을 포함한다. 택일적으로, 상기 업스트림 및 다운스트림 프라이머는 전적으로 상기 타겟에 대해 부분적이거나 또는 완전히 상보적인 서열로 이루어질 수 있다. 상기 타겟에 대해 상보적인 프라이머 서열의 길이는 상기 타겟 핵산 서열에 대해 특이적인 혼성화를 제공하기에 충분하다. 상보적인 서열의 길이는 전형적으로 최소 10개의 뉴클레오타이드, 보다 좋게는 최소 15개, 최소 16개, 또는 최소 17개의 뉴클레오타이드이다. 상보적인 서열의 길이는 10-25개, 15-25개, 10-30개 또는 15-30개의 뉴클레오타이드일 수 있다.
상기 서열 길이는 상기 타겟 핵산 서열에 대해 부분적이거나 또는 완전히 상보적일 수 있는 프라이머의 부분들을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 미스매치들은, 상기 타겟 서열의 특이적 증폭 및 검출을 여전히 허용하면서, 특히 증폭을 달성하기 위해 업스트림 및 다운스트림 프라이머 및 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드의 조합된 이용을 고려하여 특정 위치들에서 프라이머들과 상기 타겟 서열 간에 존재할 수 있다. 프라이머의 상보적인 부위와 상기 타겟 서열의 상응하는 부위 간에 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 미스매치들이 존재할 수 있다.
좋게는, 상기 프라이머는 독소 발생 C. 디피실의 특이적 검출을 허용하도록 고안한다. 따라서, 전형적으로 상기 프라이머는 독소 발생 C. 디피실에서만 발견되는 상보적 서열에 특이적으로 또는 선택적으로 혼성화시킨다. 하지만, 상기 두 번째 프라이머 및 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드와 조합하여 이용하는 경우 독소 발생 C. 디피실에서만 발견되는 서열의 특이적 증폭을 얻는다면, 상기 프라이머는 또한 다른 서열들, 예컨대 클로스트리디움 종에서 발견되는 서열에 혼성화할 수 있다.
특이적 또는 선택적 혼성화는, 그 서열이 시료 내 핵산, 예컨대 총 세포내 및 외래 DNA 또는 RNA를 포함하는 복잡한 생물학적 혼합물에 존재하는 경우 주어진 조건 하에서 특정 뉴클레오타이드 서열에 대한 프라이머의 결합만을 의미한다. 적절한 혼성화 조건은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, Sambrook, Fritsche and Maniatis "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press (1989)을 참고하고, 이는 전문으로 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 또한, 적절한 혼성화 조건은 하기 실시예들에서 제공된다. 당업자에게 알려진 대로, 적절한 혼성화 조건은 프로브 길이 및 이의 염기 조성에 따라 다양할 수 있다. 혼성화는 전형적으로 증폭할 때처럼 동일한 온도에서 실시하고, 이에 따라 이용되는 폴리머라제 및 리콤비나제 효소의 활성 프로파일에도 의존한다.
전형적으로 상기 업스트림 및 다운스트림 프라이머는 총 길이가 30개 미만의 뉴클레오타이드, 보다 좋게는 25개 미만의 뉴클레오타이드, 예컨대 15 내지 25개, 또는 15 내지 23개의 뉴클레오타이드일 것이다. 리콤비나제가 가닥 침입에 사용되는 경우 30개 미만의 뉴클레오타이드 길이의 프라이머가 이용되는 것이 특히 선호된다. 상기 프라이머들은 리콤비나제에 대한 기질로서 기능할 수 없다.
상기 업스트림 (또는 정방향) 프라이머는, 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드의 5' 결합 위치의 근처 또는 중첩하는 위치에서 상기 이합체 타겟 핵산 서열의 하나의 가닥의 5' 부위에 결합한다. 상기 다운스트림 (또는 역방향) 프라이머는, 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드의 3' 결합 위치의 근처 또는 중첩하는 위치에서 상기 이합체 타겟 핵산 서열의 반대 가닥의 5' 부위에 결합한다. 상기 업스트림 및 다운스트림 프라이머의 5' 결합 위치는 전형적으로 상기 이합체 타겟 서열 상에서 최소 45개의 뉴클레오타이드, 보다 좋게는 최소 50개, 최소 55개 또는 최소 60개의 뉴클레오타이드가 떨어져 있다.
상기 업스트림 및/또는 다운스트림 프라이머는 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드의 서열과 중첩하는 서열 부위를 가질 수 있다. 서열 중첩 부위는 전형적으로 1-8개의 뉴클레오타이드 길이이고, 최소 5개 또는 최소 6개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 상기 다운스트림 프라이머는 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드의 서열과 1-8개의 뉴클레오타이드의 서열 중첩 부위를 가질 수도 있다.
택일적으로, 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드의 결합 위치에 대해 상기 타겟 서열 근처의 위치 대신에 프라이머 결합과 함께, 상기 업스트림 및/또는 다운스트림 프라이머와 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드 간에 어떠한 서열 중첩이 존재하지 않을 수 있다.
프라이머가 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드 근처에 결합하는 경우, 전형적으로 상기 가닥 침입 뉴클레오타이드(Strand invasion oligonucleotide)의 관련 결합 위치와 상기 프라이머의 5' 말단 간에 25개 이하의 뉴클레오타이드, 보다 좋게는 20개 이하의 뉴클레오타이드, 15개 이하의 뉴클레오타이드, 또는 10개 이하의 뉴클레오타이드가 존재한다. 이것은 상기 프라이머가 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드의 결합에 의해 창출되는 단일-가닥된 부위에 혼성화할 수 있다는 것을 보장한다.
C. 디피실 tcdA 및 tcdB 유전자 내 타겟 뉴클레오타이드 서열의 결합을 위한 적합한 업스트림 및 다운스트림 프라이머가 본 명세서에 제공된다. 서열번호 1의 tcdB 타겟 서열의 검출을 위해 선호되는 업스트림 및 다운스트림 프라이머는 서열번호 2 및 서열번호 3, 또는 이의 변이체들의 프라이머이다. 서열번호 6의 tcdA 타겟 서열의 검출을 위해 선호되는 업스트림 및 다운스트림 프라이머는 서열번호 7 및 서열번호 8, 또는 이의 변이체들의 프라이머이다.
서열번호 2, 3, 7 및 8의 변이체들은 서열번호 2, 3, 7 및 8의 상응하는 원래의 프라이머 서열의 최소 10개의 인접 뉴클레오타이드에 대해 부분적이거나 또는 완전히 상보적인 부위를 포함하는 30개까지의 뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 좋게는, 상기 변이체들은 서열번호 2, 3, 7 또는 8의 상응하는 원래의 프라이머 서열의 최소 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 인접 뉴클레오타이드에 대해 부분적이거나 또는 완전히 상보적인 부위를 포함할 것이다. 원래 프라이머 서열이 21개까지의 뉴클레오타이드 길이 (서열번호 2) 같이 16개의 뉴클레오타이드 길이보다 더 길다면, 이에 대응하여 상기 변이체들은 이의 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개의 인접 뉴클레오타이드에 대해 부분적이거나 또는 완전히 상보적인 부위를 포함할 수 있다.
상기 변이체들은 상기 원래의 프라이머 서열 (및 이에 따라 타겟 서열)의 상응하는 부위에 대해서 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 미스매치들 (치환들)을 가지는 부위를 포함할 수 있으며 이에 대해 부분적으로 상보적이다. 따라서, 예를 들어, 상기 변이체들은 상기 상응하는 원래의 프라이머 서열의 최소 10개의 인접 뉴클레오타이드의 상응하는 부위에 대해 1개, 2개, 또는 3개의 미스매치들, 예컨대 1개 또는 2개의 미스매치들을 가지는 최소 10개의 뉴클레오타이드 길이의 부위를 포함할 수 있다. 상기 변이체들은 상기 상응하는 원래의 프라이머 서열에서 동등한 길이의 상응하는 부위에 대해 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 미스매치들, 예컨대 1-3개의 미스매치들을 가지는 최소 13개, 14개 또는 15개의 뉴클레오타이드 길이의 부위를 포함할 수 있다. 상기 변이체 프라이머 서열 내 어떠한 미스매치들은 최소 2개, 최소 4개, 최소 5개, 또는 최소 10개의 뉴클레오타이드가 떨어져 있을 수 있다.
택일적으로, 상기 변이체들은 원래의 프라이머 서열에 완전한 상보성 하에서 최소 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 뉴클레오타이드 길이의 부위를 포함할 수 있다.
서열번호 2, 3, 7 및 8의 변이체들은 또한 상기 상응하는 원래의 프라이머 서열의 서열에 대해 최소 70%의 서열 동일성, 좋게는 최소 75%, 최소 80%, 보다 좋게는 최소 85%, 최소 90%, 최소 95%의 서열 동일성을 가지는 30개까지의 뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클레오타이드일 수 있다.
또한, 상기 변이체 프라이머들은 원래의 프라이머들의 결합 부위에 대해 tcdA 또는 tcdB 유전자로부터 5' 또는 3' 플랭킹 뉴클레오타이드 서열, 예컨대 5' 플랭킹 부위 및/또는 3'-부위로부터 5-10개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 상기 변이체 프라이머들은 상기 타겟 서열과 관련되지 않은 서열을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에서 이용되는 어떠한 업스트림 또는 다운스트림 프라이머는 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드 및/또는 검출가능한 표지, 예컨대 형광성 염료(dyes)를 포함할 수 있다.
가닥 침입 올리고뉴클레오타이드
적합한 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드는 상기 목적 타겟 핵산 서열에 기반하며, 상기 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머의 결합을 허용하도록 관련 부위에서 타겟 핵산 서열을 단일-가닥되도록 부여하는 상기 업스트림 및 다운스트림 프라이머의 결합 위치 및 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드에 대한 필요성을 고려하여 선택한다.
상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟에 대해 상보적인 서열 및 선택적으로 추가적인 플랭킹 비-상보적인 서열(들)을 포함한다. 상기 타겟에 대해 상보적인 상기 서열의 길이는 경험적으로 당업자에 의해 결정될 수 있고 선택적으로 등온 조건 하에서 상기 타겟 핵산 서열의 효율적인 가닥 침입을 제공하기에 충분하다. 상기 상보적인 서열은 RNA-DNA 상보적인 염기쌍 및 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 전형적으로, 상기 상보적인 서열의 길이는 최소 25개 또는 최소 27개의 뉴클레오타이드, 전형적으로 최소 30개의 뉴클레오타이드, 예컨대 최소 32개, 최소 33개 또는 최소 35개의 뉴클레오타이드, 보다 좋게는 최소 36개, 37개, 38개, 39개 또는 40개의 뉴클레오타이드 길이 또는 그 이상이다. 상보적인 서열의 길이는 30-50개, 32-50개, 35-50개, 40-50개, 35 내지 48개, 35 내지 46, 38 내지 45개 또는 40 내지 45개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
상기 서열 길이는 상기 타겟 핵산 서열에 대해 부분적으로 또는 완전히 상보적일 수 있는 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드의 일부를 의미한다는 것이 이해될 것이다. 미스매치들은 상기 타겟 서열의 특이적인 증폭 및 검출을 여전히 허용하면서, 특히 증폭을 달성하기 위해 업스트림 및 다운스트림 프라이머 및 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드의 조합된 이용을 고려하여 특정 위치들에서 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드와 상기 타겟 서열 간에 존재할 수 있다. 상보적인 서열의 총 길이에 따라, 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드의 상보적인 부위와 상기 타겟 서열의 상응하는 부위 간에 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 또는 8개의 미스매치들이 존재할 수 있다.
좋게는, 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드의 상보적인 서열은 독소 발생 C. 디피실의 특이적인 검출을 허용하도록 고안한다. 따라서, 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드는 좋게는 독소 발생 C. 디피실에서만 발견되는 상보적인 서열에 특이적으로 또는 선택적으로 혼성화한다. 하지만, 상기 프라이머들과 조합하여 이용하는 경우 독소 발생 C. 디피실에서만 발견되는 서열의 특이적 증폭을 얻는다면, 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드는 다른 서열들, 예컨대 다른 클로스트리디움 종들에서 발견되는 서열들에도 혼성화할 수 있다.
상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드의 상보적인 서열은 상기 업스트림 및 다운스트림 프라이머에 대한 결합 부위 (및 전형적으로 이에 대해 하나 이상에서 중첩하는 부위)에 개입하는 상기 타겟 서열의 일부에 혼성화한다. 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 및/또는 다운스트림 프라이머와 1-8개의 뉴클레오타이드의 중첩 부위, 예컨대 최소 5개 또는 최소 6개의 뉴클레오타이드 길이의 부위를 가질 수 있다.
상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드의 상보적인 서열의 5' 부위는 전형적으로 융해될 상기 이합체 타겟 뉴클레오타이드 서열 (앰플리콘)의 5' 경계로부터 25개 이하의 뉴클레오타이드, 보다 좋게는 20개 이하의 뉴클레오타이드 내에 결합한다.
선택적으로 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드는 상기 상보적인 서열 부위에 플랭킹하는 상기 타겟에 대해 비-상보적인 서열 부위(들)을 추가적으로 포함한다. 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드는 어떠한 뉴클레오타이드 서열일 수 있는 비-상보적인 5' 부위를 포함할 수 있다. 상기 비-상보적인 5' 부위는 전형적으로 최소 3개의 뉴클레오타이드 길이, 보다 전형적으로 최소 6개, 최소 8개, 좋게는 최소 10개, 최소 12개 또는 최소 14개의 뉴클레오타이드 길이이다. 상기 비-상보적인 5' 부위는 리콤비나제의 결합을 도울 수 있다. 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드는 invdT 같은 폴리머라제 연장을 차단하는 뉴클레오타이드를 포함하는 전형적으로 1-3개의 뉴클레오타이드 길이의 3' 비-상보적인 부위를 포함할 수 있다.
리콤비나제가 올리고뉴클레오타이드와 함께 이용되는 경우 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 최소 30개의 뉴클레오타이드 길이이다. 좋게는 상기 가닥 침입 뉴클레오타이드는 최소 35개, 최소 40개 또는 최소 45개의 뉴클레오타이드 길이, 보다 좋게는 최소 50개의 뉴클레오타이드이고, 최소 55개 이상의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드는 40-70개, 45-70개, 45-70개, 50-70개, 55-70개, 45-65개, 50-65개, 50-60개 또는 55-65개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
전형적으로 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드는 연장가능하지 않은 3' 말단을 가져, DNA 증폭을 위한 기질로서 기능할 수 없으며, 상기 타겟 서열은 이후 상기 특이적인 업스트림 및 다운스트림 프라이머의 추가적인 결합에서만 증폭된다. 이것은 비-특이적 증폭 산물의 형성을 방지한다. 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드는 3' 부위, 예컨대 3' 말단으로부터 10-15개 또는 10-20개의 뉴클레오타이드에 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 이상의 변형된 뉴클레오타이드들을 포함할 수 있다. 상기 가닥-침입 올리고뉴클레오타이드는 상기 3' 말단 뉴클레오타이드의 3' 변형을 포함할 수 있고, 디데옥시뉴클레오타이드일 수 있거나, 또는 3'아미노-알릴 기, 3'탄소 스페이서, 3'포스페이트, 3'바이오틴, 3'시알릴, 또는 3'티올을 포함할 수 있다. 상기 3' 뉴클레오타이드는 3'-3' 결합(linkage)에 의해 역방향으로 삽입된 뉴클레오타이드일 수 있다. 택일적이거나 또는 추가적으로, 상기 가닥-침입 올리고뉴클레오타이드의 3' 부위는 DNA 폴리머라제에 대해 좋지 않은 기질능을 가지는 뉴클레오타이드, 예컨대 PNA (펩타이드 핵산) 뉴클레오타이드, LNA (잠겨진 핵산), 2'-5' 결합된 DNA 또는 2'-O-메틸 RNA, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
상기 가닥-침입 올리고뉴클레오타이드가 전체적으로 PNA로 구성된 PNA 올리고머라면, 그러한 올리고뉴클레오타이드는 리콤비나제 효소의 부존재 하에서 이합체 DNA를 불안정화시키고 침입할 수 있다. 따라서, PNA 올리고뉴클레오타이드가 사용되는 경우, 본 발명의 방법은 리콤비나제 효소의 존재 없이 실시할 수 있다.
C. 디피실 tcdA 및 tcdB 유전자 내 타겟 뉴클레오타이드 서열에 대해 적합한 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드의 특이적인 예들이 본 명세서에서 제공된다. 서열번호 1의 tcdB 타겟 서열의 검출을 위해 선호되는 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 4이다. 특히 선호되는 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 4, 가장 좋게는 서열번호 5의 변형된 유도체이다. 서열번호 6의 상기 tcdA 타겟 서열의 검출을 위해 선호되는 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 9이다. 특히 선호되는 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 9, 가장 좋게는 서열번호 10의 변형된 유도체이다.
상기 논의된 대로, 본 발명에서 이용되는 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드는 3' 부위에 하나 이상의 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하여 폴리머라제 기질로서 이용되는 것을 차단한다. 따라서, 서열번호 4 또는 9의 변형된 유도체는 3' 부위, 전형적으로 3' 말단으로부터 10-15개 또는 10-20개의 뉴클레오타이드에 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 이상의 변형된 뉴클레오타이드들을 포함할 수 있다. 상기 변형들은 상기 논의된 변형들 중 어느 하나로부터 선택할 수 있다. 상기 변형된 유도체는 서열번호 4 또는 9에 대해 상응하는 서열의 PNA 올리고머일 수 있다.
서열번호 4 및 9의 변형된 유도체 외에도, 변이체 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드를 이용할 수 있다.
서열번호 4 및 9의 변이체들은 전형적으로 30개 초과의 뉴클레오타이드 길이, 보다 좋게는 최소 35개, 최소 40개, 또는 최소 45개의 뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클레오타이드이며, 서열번호 4 또는 9에 존재하는 상기 상응하는 원래의 타겟-상보적인 서열의 최소 30개의 인접 뉴클레오타이드에 대해 부분적으로 또는 완전히 상보적인 부위를 포함한다. 좋게는, 상기 변이체들은 서열번호 4 또는 9에 존재하는 상기 타겟-상보적인 서열의 최소 32개, 35개, 37개, 40개, 42개 또는 45개의 인접 뉴클레오타이드에 대해 부분적으로 또는 완전히 상보적인 부위를 포함할 것이다.
상기 변이체들은 서열번호 4 또는 9의 상기 원래의 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드의 상응하는 타겟-상보적인 부위 (및 이에 따른 타겟 서열)에 대해서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 미스매치들 (치환들)을 가지는 부위를 포함할 수 있으며 이에 대해 부분적으로 상보적이다. 따라서, 예를 들어 상기 변이체들은 상기 상응하는 원래의 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드의 최소 40개의 인접 뉴클레오타이드의 상응하는 부위에 대해 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 미스매치들, 예컨대 1-4개 또는 1-3개의 미스매치들을 가지는 최소 30개의 뉴클레오타이드 길이의 부위를 포함할 수 있다. 상기 변이체들은
상기 변이체들은 상기 상응하는 원래의 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드에서 동등한 길이의 상응하는 부위에 대해 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 미스매치들, 예컨대 1-5개, 또는 1-3개의 미스매치들을 가지는 최소 35개, 40개, 42개, 또는 45개의 뉴클레오타이드 길이의 부위를 포함할 수 있다.
상기 변이체 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드 서열 내 어떠한 미스매치들은 최소 2개, 최소 4개, 최소 5개, 또는 최소 10개의 뉴클레오타이드가 떨어져 있을 수 있다.
택일적으로, 상기 변이체들은 상기 원래의 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드의 타겟-상보적인 부위에 대해 완전한 상보성인 최소 32개, 35개, 37개, 40개, 42개 또는 45개의 뉴클레오타이드 길이의 부위를 포함할 수 있다.
서열번호 4 및 9의 변이체들은 또한 상기 상응하는 원래의 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드의 타겟-상보적인 서열에 대해 최소 70%의 서열 동일성, 좋게는 최소 75%, 최소 80%, 보다 좋게는 최소 85%, 최소 90%, 최소 95%의 서열 동일성을 가지는 타겟-상보적인 부위를 포함하는 30개 초과의 뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클레오타이드일 수 있다.
또한, 상기 변이체 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드는, 5' 플랭킹 부위 및/또는 3-부위로부터 5-10개 또는 5-15개의 뉴클레오타이드 같은 상기 원래의 올리고뉴클레오타이드의 결합 부위에 관하여 tcdA 또는 tcdB의 5' 또는 3' 플랭킹 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 추가적 서열을 포함할 수 있다.
상기 변이체 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드의 잔여 서열은 전형적으로 상기 타겟 서열과 관련되어 있지 않고, 또한 전형적으로 상기 원래의 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드과 관련되어 있지 않다.
상기 변이체 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드는 3' 부위에 하나 이상의 변형된 올리고뉴클레오타이드, 예컨대 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 그 이상의 변형된 올리고뉴클레오타이드를 추가적으로 포함하며, 3' 말단으로부터 10-15개 또는 10-20개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 상기 변형은 앞서 논의된 변형들 중 어느 하나로부터 선택할 수 있다. 본 발명의 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드는 검출가능한 표지, 예를 들어 형광성 염료를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 타겟 핵산 서열의 증폭
시료로부터 유래된 핵산은 검출을 위해 상기 타겟 핵산 서열의 증폭을 촉진하는 조건 하에서 상기 업스트림 및 다운스트림 프라이머 및 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드와 접촉시킨다.
그러한 조건은 전형적으로 DNA 폴리머라제 효소의 존재를 포함한다. 적합한 조건은 당업계에 알려진 폴리머라제 효소의 활성을 제공하는 데 이용되는 어떠한 조건을 포함한다.
상기 조건은 효소 성능 또는 안정성에 필요한 모든 4개의 dNTPs, dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP 또는 이의 유사체, 적합한 완충제/pH 및 다른 인자들을 전형적으로 포함한다. 상기 조건은 세제 및 안정화제의 존재를 포함할 수 있다. 이용되는 온도는 전형적으로 등온적, 즉 증폭 과정 전반에 걸쳐서 일정하다. 이용되는 온도는 전형적으로 폴리머라제 효소 및 다른 효소 구성성분의 특성에 의존적이며, 프라이머 및 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드에 요구되는 혼성화 온도도 반영한다. Bsu 폴리머라제가 사용되는 경우, 적합한 온도는 40섭씨온도이다.
이용되는 폴리머라제는 전형적으로 가닥-이동 활성을 가진다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "가닥 이동(strand displacement)"은 선택적으로 보조 단백질들과 함께 DNA 합성 동안 이중 가닥된 DNA의 부위와 만나는 동안 상보적인 가닥들을 옮기는 DNA 폴리머라제의 능력을 기재하는 것이다. 적합한 DNA 폴리머라제는 대장균(E. coli), B. 서브틸리스(B. subtiltis), 또는 B. 스테아로터모필러스(B. stearothermophilus)로부터 유래된 polI, 및 이의 기능성 단편들 또는 변이체들, 그리고 T4 및 T7 DNA 폴리머라제 및 이의 기능성 단편들 또는 변이체들을 포함한다. 선호되는 폴리머라제는 Bsu DNA 폴리머라제 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이다.
조건은 리콤비나제의 존재를 추가적으로 포함할 수 있다. 어떠한 리콤비나제 시스템이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 상기 리콤비나제 시스템은 원핵 또는 진핵 기원일 수 있으며, 박테리아, 효모, 파아지, 또는 포유동물 기원일 수 있다. 상기 리콤비나제는 5'-3' 또는 3'-5' 방향으로 단일-가닥된 올리고뉴클레오타이드를 중합할 수 있다. 상기 리콤비나제는 T4, T2, T6, Rb69, Aeh1, KVP40 같은 미오비리대(myoviridae) 파아지, 아시네토박터 파아지 133, 애로모나스 파아지 65, 시아노파아지 P-SSM2, 시아노파아지 PSSM4, 시아노파아지 S-PM2, Rbl4, Rb32, 애로모나스 파아지 25, 비브리오 파아지 nt-1, phi-1, Rbl6, Rb43, 파아지 31, 파아지 44RR2.8t, Rb49, 파아지 Rb3, 또는 파아지 LZ2로부터 유래할 수 있다. 선호되는 구현예에서, 상기 T4 리콤비나제 UvsX (접근번호: P04529) 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이 이용된다. 진핵생물의 Rad 시스템 또는 대장균 또는 다른 원핵시스템의 recA-Reco 시스템도 이용될 수 있다.
상기 조건은 단일-가닥된 결합 단백질 (예컨대, gp32, 접근번호 P03695) 및 리콤비나제 로딩제 (예컨대, UvsY, 접근번호 NP_049799.2) 같은 리콤비나제 보조 단백질의 존재를 추가적으로 포함할 수 있다. 선호되는 구현예에서, 상기 조건은 T4 gp32, UvsX 및 UvsY 단백질을 포함한다.
상기 리콤비나제 (예컨대, UvsX), 및 상기 리콤비나제 로딩제 (예컨대, UvsY) 및 단일 가닥된 DNA 결합 단백질 (예컨대 gp32)가 이용된다면, 각각은 동일하거나 또는 다른 미오비리대 파아지 원으로부터 얻어진 천연, 하이브리드 또는 돌연변이 단백질일 수 있다. 천연(native) 단백질은 야생형 또는 천연 변이체 단백질일 수 있다.
상기 조건은 리콤비나제의 효율을 증가시키는 데 이용되는 다른 인자들, 예컨대 DNA 상호작용을 조절하는 데 이용되는 화합물, 예를 들어 프롤린, DMSO 또는 DNA 상에 리콤비나제의 로딩을 증가시키는 것으로 알려진 과밀제(crowding agents)를 추가적으로 포함할 수 있다 (Lavery P et. Al JBC 1992, 26713, 9307-9314; WO2008/035205).
상기 조건은 ATP 재생산 시스템의 존재를 추가적으로 포함할 수 있다. 다양한 ATP 재생산 시스템은 당업자에게 알려져 있으며, 해당효소를 포함한다. ATP 재생산 시스템의 적합한 구성성분들은 하나 이상의 포스포크레아틴, 크레아틴 키나제, 미오키나제, 피로포스파타제, 수크로오스 및 수크로오스 포스포릴라제를 포함할 수 있다. 상기 조건은 ATP의 존재를 추가적으로 포함할 수 있다.
마그네슘 이온, DTT 또는 다른 환원제, 염류, BSA/PEG 또는 다른 과밀제 같은 추가적인 구성성분들도 포함될 수 있다.
프라이머 및 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 상기 기재된 다양한 구성성분들은 DNA 증폭을 제공하기 위해 다양한 농도로 제공될 수 있다. 당업자는 실제적으로 다양한 구성성분들의 적합한 작동 농도를 선택할 수 있다.
증폭된 DNA 존재의 검출
DNA 증폭을 촉진하는 조건 하에서 프라이머 및 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드와 상기 타겟 핵산 서열을 접촉시켜 초래되는 증폭된 DNA의 존재는 어떠한 적합한 수단에 의해 모니터링할 수 있다.
상기 프라이머들 중 하나 또는 모두, 또는 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드는 표지 또는 다른 검출가능한 모이어티와 결합할 수 있다. 어떠한 표지 또는 검출가능한 모이어티가 이용될 수 있다. 적합한 표지의 예들은 방사성 동위원소 또는 형광성 모이어티, 및 형광단의 FRET 쌍 및 수용체 모이어티를 포함한다. 택일적으로, 또는 추가적으로 증폭된 DNA를 검출하는 하나 이상의 프로브가, 표지 또는 다른 검출가능한 모이어티에 다시 삽입됨으로써 이용될 수 있다. 상기 프로브는 앰플리콘 내 어떠한 적합한 위치에 결합할 수 있다. 다른 증폭된 타겟 서열을 검출하는 프로브들은 다른 형광 파장에서 시그널을 방출하여 멀티플렉스 검출을 제공할 수 있다. 증폭된 DNA에 삽입된 염료는 상기 증폭된 DNA를 검출하는 데 이용될 수도 있으며, 예를 들어 SYBR 그린 및 티아졸 오렌지이다.
상기 증폭된 DNA로부터 유래되는 시그널의 검출은 실-시간 PCR을 포함하는 어떠한 적합한 시스템에 의해 행해질 수 있다.
프라이머 및 올리고뉴클레오타이드
본 발명은 자체 산물로서 서열번호 2 내지 5 및 7 내지 9 및 이의 변이체들의 프라이머 및 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드 및 상기 프라이머 및 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 추가적으로 제공한다. 상기 프라이머 및 선택적으로 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드는 독소 발생 C. 디피실의 검출을 위한 어떠한 방법에 이용할 수 있다. 전형적으로, 상기 방법은 가닥-침입 기반된 DNA 증폭 방법이다. 하지만, 독소 발생 C. 디피실의 특이적 검출을 허용하는 어떠한 적합한 DNA 증폭 방법이 이용될 수 있다. 상기 업스트림 및 다운스트림 프라이머들은 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드의 사용을 요구하지 않는 DNA 증폭, 예컨대 PCR에 이용될 수 있다.
조성물 및 키트
또한 본 발명은 (a) 업스트림 프라이머, (b) 다운스트림 프라이머 및 (c) 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드로부터 선택된 최소 2개의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 조성물 및 키트를 제공한다. 상기 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머 및 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드는 상기 기재된 대로이다. 상기 조성물 또는 키트는 업스트림 및 다운스트림 프라이머, 업스트림 프라이머 및 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드, 또는 다운스트림 프라이머 및 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 좋게는, 상기 조성물 또는 키트는 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머 및 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 상기 조성물 또는 키트는 본 발명의 방법, 또는 택일적인 DNA 증폭 방법에 따라 C. 디피실의 검출에 적합할 수 있다.
상기 조성물 또는 키트가 서열번호 1 (tcdB)의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 사용에 적합하다면, 전형적으로 상기 업스트림 프라이머는 서열번호 2 또는 이의 변이체 서열을 포함하는 30개 미만의 뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클레오타이드이고, 상기 다운스트림 프라이머는 서열번호 3 또는 이의 변이체 서열을 포함하는 30개 미만의 뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클레오타이드이며, 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 4 또는 이의 변이체의 서열을 포함하는 30개 초과의 뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클레오타이드이고, 이의 3' 부위에 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 추가적으로 포함한다. 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 5의 서열을 가질 수 있다.
상기 조성물 또는 키트가 서열번호 6 (tcdA)의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 사용에 적합하다면, 전형적으로 상기 업스트림 프라이머는 서열번호 7 또는 이의 변이체의 서열을 포함하는 30개 미만의 뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클레오타이드이며, 상기 다운스트림 프라이머는 서열번호 8 또는 이의 변이체의 서열을 포함하는 30개 미만의 뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클레오타이드이고, 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 9 또는 이의 변이체의 서열을 포함하는 30개 초과의 뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클레오타이드이고, 이의 3' 부위에 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 추가적으로 포함한다. 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 10의 서열을 가질 수 있다.
상기 조성물 또는 키트는 서열번호 1의 타겟 핵산 서열의 검출을 가능하게 하는 첫 번째 세트의 올리고뉴클레오타이드들을 제공하며 추가적으로 서열번호 6의 타겟 핵산 서열의 검출을 가능하게 하는 두 번째 세트의 올리고뉴클레오타이드들을 제공한다.
상기 조성물은, 예를 들어 용액, 동결건조물(lyophilisate), 현탁액, 또는 오일 또는 수성 운반체(vehicle) 내 에멀젼일 수 있다.
상기 키트에서, 최소 2개의 올리고뉴클레오타이드들이 혼합물로서, 또는 개별 컨테이너로 제공될 수 있다. 선택적으로 상기 키트는 본 발명의 방법에 사용하기 위한 설명서를 추가적으로 포함한다. 상기 키트는 증폭된 DNA의 검출을 위한 방법을 포함한다.
선택적으로 상기 키트 또는 조성물은 증폭된 DNA를 검출하는 하나 이상의 프로브를 포함한다. 상기 키트 또는 조성물은 하나 이상의 DNA 폴리머라제, 리콤비나제, 및 리콤비나제 보조 단백질을 선택적으로 포함한다. 좋게는, 상기 DNA 폴리머라제는 Bsu 폴리머라제이다. 좋게는, 상기 리콤비나제는 선택적으로 리콤비나제 보조 단백질 UvsY 및 gp32과 조합된 박테리오파아지 T4 UvsX이다. 상기 키트 또는 조성물은 상기 기재된 대로 본 발명의 방법에서 DNA 증폭을 위해 필요로 하는 dNTPs, 적합한 완충액 및 다른 인자들을 추가적으로 포함할 수 있다.
C. 디피실에 의한 감염의 진단 및 의학적 적용
본 발명은 의학적 세팅에 특히 유용하다. 본 발명의 검출 방법들은 임상 시료가 독소 발생 C. 디피실로부터 유래된 타겟 핵산 서열을 포함하는 지 여부의 결정을 가능하게 하는 매우 특이적인 테스트를 제공한다. 상기 방법은 독소 발생 C. 디피실과 연관된 질병 세팅의 범위에 적용될 수 있다. 추가적으로, 상기 방법은 독소 발생 C. 디피실의 담체를 스크리닝하는 데 적용될 수 있다.
독소 발생 C. 디피실이 존재하는지 아닌지의 결정은 환자에 존재하거나 또는 존재하는 것으로 의심되는 어떠한 질환 또는 질병의 포함일 수 있다. 그러한 질환들은 독소 발생 C. 디피실의 존재에 의해 야기되거나, 이의 존재와 연결되거나, 또는 이의 존재에 의해 약화되는 질환들을 포함할 수 있다. 따라서, 환자는 독소 발생 C. 디피실의 존재를 지시하는 증상을 나타낼 수 있으며, 시료는 C. 디피실의 존재를 결정하고 선택적으로 상기 기재된 방법에 의해 이의 독소타입을 결정하기 위해 환자로부터 얻어질 수 있다.
따라서 본 발명은 대상자에서 독소 발생 C. 디피실에 의해 야기되는 감염의 진단을 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 대상자에서 유래된 시료에서 본 발명에 따라 독소 발생 C. 디피실로부터 유래된 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 독소 발생 C. 디피실의 스트레인, 예컨대 대상자에 의해 제공되는 시료로부터 유래된 미생물 배양물을 동정하는 다른 단계들을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 특히 선호되는 구현예는 위장관 감염을 가진 환자들, 특히 설사의 증상을 가진 환자들에 존재하는 독소 발생 C. 디피실의 동정이다.
따라서 본 발명은 독소 발생 C. 디피실에 의해 야기되는 설사 같은 위장관 질병을 위한 진단 방법을 제공한다. 상기 진단 방법은 항생제 내성 마커들 및 병독성 마커들을 검출하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 방법은 주어진 환자를 위한 최적 치료법을 가능하게 하기 때문에 위장관 질병의 환자 관리에서 현저한 개선을 제공한다. 이에 따라 상기 테스트는 병원 입원 기간, 재입원의 빈도를 감소시키고 비용을 감소시킬 것이다.
상기 진단 방법은 환자의 시료로부터 유래된 핵산에 기반되어 편리하게 실시할 수 있어, 위장관 질병이 독소 발생 C. 디피실에 의한 감염으로 인한 것인지에 대한 지시를 임상의에게 제공한다. 또한 상기 진단 방법은 C. 디피실의 독소타입 및 병독성에 대한 지시를 제공하고 상기 C. 디피실이 어떠한 항생제에 대한 내성이 있는 지에 대한 지시를 제공할 수 있다. 상기 테스트의 결과에 따라, 이후 의학적 치료가, 예를 들어 항생제의 이용에 의해 최적화될 수 있다.
도 1은: (a) tcdB 어세이 증폭 플롯. SybrGreen I이 검출을 위해 사용되었고 형광은 실-시간 PCR 장치로 측정하였다. X-축: 시간(분), Y-축: SybrGreen I 형광 (형광 강도, 임의적 단위). 위쪽 기록(upper trace): tcdB SIBA 어세이에서 템플레이트로서 이용된 10000 게놈 카피 (cp) C. 디피실(C. difficile) BAA-1382 (630) gDNA. 아래쪽 기록(lower trace) = 템플레이트가 없는 대조군 (no template control, NTC)은 증폭하지 않았다. (b) tcdB 반응의 융해곡선 분석. X-축: 온도 (섭씨온도), Y-축: (-d(형광)/d(온도), 임의적 단위). SybrGreen I을 이용한 증폭-후 융해곡선 분석은 템플레이트로서 C. 디피실 BAA-1382 (630) gDNA와 tcdB 반응에서 하나의 특이적인 앰플리콘의 증폭을 나타냈다. (c) 양성 및 음성 tcdB 반응으로부터의 전기영동도(electropherogram). X-축: 이동 지수(migration index) (아래쪽 마커가 0%이고 위쪽 마커가 100%일 때의 %), Y-축 (형광 강도, 임의적 단위). 아래쪽 기록 = tcdB 어세이에서 템플레이트로서 이용된 10000 게놈 카피 (cp) C. 디피실 BAA-1382 (630) gDNA. 위쪽 기록 = 템플레이트가 없는 대조군 (NTC). tcdB 반응은 MultiNA 마이크로칩 전기영동 시스템으로 분석하였다. 반응 올리고뉴클레오타이드들 (역방향(rev) 및 정방향(fwd) 프라이머 및 침입성 올리고)만이 NTC 반응으로부터 검출된 반면에 특이적 증폭 산물이 10000 cp C. 디피실 gDNA가 템플레이트로서 이용되었던 tcdB 반응으로부터 검출되었다
는 것을 보여준다.
도 2는: (a) tcdB 어세이의 특이성. X-축: 시간(분), Y-축: SybrGreen I 형광 (형광 강도, 임의적 단위). 10000 cp C. 디피실 BAA-1382 (630) 및 10000 cp C. 소르델리(C. sordellii) ATCC 9714 gDNA를 tcdB 반응을 위한 템플레이트로서 이용하였다. 오직 C. 디피실 gDNA만이 증폭 및 검출되었다. 템플레이트가 없는 대조군 (NTC)은 증폭을 나타내지 않는다. (b) tcdB 어세이의 민감도. X-축: 시간(분), Y-축: SybrGreen I 형광 (형광 강도, 임의적 단위). tcdB 어세이의 민감도는 템플레이트로서 C. 디피실 BAA-1382 (630) gDNA의 희석 시리즈를 이용하여 결정하였다. 10-10000 cp C. 디피실 gDNA는 SybrGreen I 형광에서의 증가에 의해 측정된 증폭을 나타내는 반면에 템플레이트 없는 대조군 (NTC) 및 음성 대조군 반응은 증폭하지 않았다. 모든 반응들은 0.5 ng/μl 청어 정자 DNA의 존재 하에서 실시하였다
는 것을 보여준다.
도 3은: (a) tcdB 어세이의 포괄성(inclusivity). X-축: 시간(분), Y-축: SybrGreen I 형광 (형광 강도, 임의적 단위). C. 디피실 독소타입(toxinotypes) 0, III, VIII 및 X의 순수 배양물로부터 분리된 2 ng gDNA를 tcdB 어세이에 대한 템플레이트로 이용하였다. NTC (템플레이트가 없는 대조군). 모든 테스트된 독소타입들은 양성 증폭 결과를 나타냈다. (b) 독소타입들의 패널에 대한 tcdB 어세이의 포괄성으로, 상세하게는 상기 (a)에서와 같지만, C. 디피실 독소타입 0, I, II, IIIa, IIIb, IIIc, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XIa, XIb, XII, XIII, XIV, XV, XVI, XVII, XVIII; XIX, XX, XXI; XXII; XXIII; XXIV, XXV, XXVI, XXVII, XXVIII, XXIX, XXX, XXXI, XXXII 및 XXXIII의 순수 배양물로부터 분리된 2 ng gDNA를 이용한다. 오직 2개의 독소타입들, 즉 XIa 및 XIb가 음성 증폭 결과를 나타냈다. (c) (a)에서처럼, 다른 C. 디피실 독소타입들로부터 분리된 gDNA 템플레이트와의 tcdB 반응에 대한 융해곡선 분석. X-축: 온도 (섭씨온도), Y-축: (-d(형광)/d(온도), 임의적 단위). 모든 C. 디피실 독소타입들은 하나의 앰플리콘의 증폭을 나타냈다. 템플레이트 없는 대조군 (NTC)는 증폭을 나타내지 않는다. (d) (b)의 독소타입의 패널에 대한 융해곡선 분석으로서, 상세하게는 상기 (c)에서와 같다. 융해곡선 분석도 독소타입 XIa 및 XIb에 대해 증폭을 나타내지 않았다
는 것을 보여준다.
도 4는: (a) tcdB 어세이 증폭 플롯. SybrGreen I이 검출을 위해 사용되었고 형광은 실-시간 PCR 장치로 측정하였다. X-축: 시간(분), Y-축: SybrGreen I 형광 (형광 강도, 임의적 단위). 증폭은 100-10000 cp/반응 C. 디피실 BAA-1382 (630) gDNA에서 관찰되었고, 0-10 cp/반응 C. 디피실 BAA-1382 (630) gDNA의 존재 하에서 및 템플레이트가 없는 대조군 (NTC)에서 어떠한 증폭도 관찰되지 않았다. (b) tcdA 어세이 융해곡선 분석. X-축: 온도 (섭씨온도), Y-축: (-d(형광)/d(온도), 임의적 단위). 상기 융해곡선 분석은 하나의 특이적인 앰플리콘의 증폭을 나타낸다. 템플레이트가 없는 대조군 (NTC)은 증폭을 나타내지 않는다.
다음의 실시예들은 본 발명을 예시한다.
실시예들
실시예 1 - C. 디피실 tcdB 및 tcdA 어세이의 고안
tcdA 및 tcdB 유전자의 검출 및 증폭을 위한 특이적 올리고뉴클레오타이드를 고안하는 것이 도전 중이었다. tcdA 및 tcdB 유전자는 서로에 대해서 뿐 아니라 다른 큰 클로스트리디움 독소에 대해서도 높은 서열 상동성을 나타낸다. C. 소르델리(C. sordellii) 세포독소 유전자인 tcsL이, tcdB의 가장 근접한 상동물이다 (Popoff, 1987; Green, 1995). C. 소르델리 tcsL에 대한 항체가 C. 디피실 독소 B와 교차-결합한다. 따라서, C. 디피실 독소 B의 검출을 위한 측방 유동 테스트(lateral flow tests)는 C. 소르델리 tcsL과 흔히 교차-반응한다. 또한 특이적 올리고뉴클레오타이드의 고안은 특이적 침입성 올리고뉴클레오타이드에 대한 필요에 의해 복잡하게 되었다.
추가적으로, C. 디피실 게놈의 GC 함량은 GC 함량이 27.4%인 tcdB 유전자에도 적용되는 낮은 함량 (29.1 %)이다. 이러한 낮은 GC 함량도 도전하는 DNA 증폭에 적합한 올리고뉴클레오타이드를 고안하게 하였다. 낮은 GC 함량을 가진 프라이머는 낮은 융해 온도 (Tm)를 가지는데, 이는 올리고뉴클레오타이드의 결합을 불안정화시키며 증폭의 나쁜 효율을 초래한다.
우선, tcdA 및 tcdB 유전자의 적합한 부위는 검출 및 증폭을 위한 타겟팅을 위해 선택한다. tcdB (서열번호 1) 및 tcdA (서열번호 6)에 대한 특정 타겟 부위는 아래에 보여진다. 상기 타겟 부위는 1) C. 디피실에 대해 특이적, 즉 밀접하게 상동적인 클로스트리디움 종과 상이하도록 선택되거나, 2) C. 디피실 독소타입들에 대한 좋은 포괄성을 나타내도록 선택되며 3) 평균적으로 C. 디피실 게놈보다 더 높은 GC 함량을 가지도록 선택되었다.
두 번째로, 특이적 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 부위들의 증폭을 위해 고안하였다. C. 디피실 tcdB 유전자 및 tcdA 유전자의 검출 및 증폭에 사용되는 특이적 올리고뉴클레오타이드가 하기에 보여진다 (서열번호 2-5 및 7-10).
실시예 2 - tcdB 어세이 테스팅
서열번호 2, 3 및 5의 tcdB 검출성 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 40℃에서 등온 가닥 침입 DNA 증폭에 의해 C. 디피실 tcdB 유전자를 증폭시켰다. DNA 결합 형광성 염료 SybrGreen I이 증폭의 검출을 위해 사용되었고 형광은 형광계 또는 실-시간 PCR 장치 중 어느 하나로 측정하였다. 반응 혼합물은 템플레이트 DNA의 존재 또는 부존재 하에서 반응 완충액 (10 mM Tris-아세테이트, pH 8, 0.5 mM EDTA, 4 mM DTT, 150 mM 수크로오스, 0.1 mg/ml BSA, 5% DMSO), 2 mM ATP, 5% PEG1000, 60 mM 포스포크레아틴 di(tris) 염, dNTPs (dUTP로 대체된 dTTP와 함께), 12.5 mU/μl 수크로오스 포스포릴라제, 25 mU/μl 크레아틴 포스포키나제, 62.5 mU/μl Bsu 폴리머라제, 0.1-0.3 mg/ml T4 박테리오파아지 UvsX, 0.25-0.5 mg/ml T4 박테리오파아지 gp32, 10 mM Mg-아세테이트 및 올리고뉴클레오타이드를 포함하였다.
프라이머-프라이머 또는 자가-프라이밍(self-priming)을 생성하는 상기 말단 프라이머 및 침입성 올리고뉴클레오타이드의 능력은 템플레이트 DNA의 부존재 (템플레이트가 없는 대조군, NTC) 하에서 테스트하였다. 올바른 타겟 DNA를 검출하고 증폭하는 상기 올리고뉴클레오타이드의 능력은 C. 디피실 BAA-1382 게놈 DNA (gDNA)의 존재 하에서 테스트하였다. 증폭 산물의 존재 또는 부존재는 SybrGreen I 형광 (도 1a) 및 융해곡선 분석 (도 1b) 모두에서의 증가에 의해 결정하였다.
상기 증폭 산물은 MultiNA 마이크로칩 전기영동 시스템 (도 1c)으로 추가적으로 분석하였다. 템플레이트로서 C. 디피실 gDNA의 10000 카피 (cp)를 이용한 양성 tcdB 증폭 반응으로부터의 전기영동도는 예상된 길이를 가진 DNA 단편의 출현을 보였다. 이러한 단편은 템플레이트가 없는 대조군 반응에서는 검출되지 않았다.
실시예 3. C. 디피실의 특이성
tcdB 어세이의 특이성은 실시예 2에 기재된 대로의 반응에서 템플레이트로서 C. 소르델리 ATCC 9714 gDNA를 이용하여 테스트하였다. C. 소르델리 독소 유전자 tcsL은 tcdB에 대한 가장 밀접한 것으로 밝혀진 상동물이다. 결과는 도 2(a)에 보여진다. 템플레이트 DNA로서 10000 cp C. 소르델리 gDNA를 이용한 tcdB 반응은 어떠한 DNA 증폭을 보이지 않았지만 10000 cp C. 디피실 BAA-1382 (630)을 이용한 tcdB 반응은 SybrGreen I 형광 강도에서의 증가에 의해 측정된 대로 명확한 증폭을 나타냈다.
실시예 4. C. 디피실 검출의 민감도
tcdB 어세이의 민감도는 C. 디피실 BAA-1382 (630)의 연속 희석으로 테스트하였으며 증폭은 SybrGreen I 형광으로 측정하였고 실-시간 PCR로 검출하였다. 결과는 도 2b에 보여진다. 템플레이트로서 10-10000 cp/반응의 C. 디피실 gDNA는 양성 증폭을 나타내는 반면에 NTC, 음성 대조군 및 1 cp/반응은 증폭하지 않았다. 음성 대조군 반응은 각각 최소 1000 cp/반응으로 엔테로박터 에로게네스(Enterobacter aerogenes), 시트로박터 종(Citrobacter sp .), 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei), 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 스트렙토코커스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 대장균(Eschericia coli), 엔테로박터 애로게네스(Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae), 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 시트로박터 프룬디(Citrobacter freundii) 및 클렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae)로부터 분리된 gDNA의 혼합물을 포함하였다. NTC = 템플레이트가 없는 대조군.
실시예 5. C. 디피실 독소타입 검출의 포괄성
tcdB 어세이의 포괄성은 C. 디피실 독소타입 0, III, VIII 및 X으로 테스트하였다. 결과는 도 3a 및 3c에 보여진다. 각 독소타입에 대해 2 ng gDNA/반응이 tcdB 반응에서 템플레이트로서 사용하였다. 모든 테스트된 독소타입들은 양성 증폭 결과를 제공하였다 (도 3a). 추가적으로, 융해곡선 분석은 하나의 특이적 앰플리콘의 증폭을 나타냈다 (도 3c).
추가적으로 tcdB 어세이의 포괄성은 37개의 더 큰 패널(panel)의 C. 디피실 독소타입들 0, I, II, IIIa, IIIb, IIIc, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XIa, XIb, XII, XIII, XIV, XV, XVI, XVII, XVIII; XIX, XX, XXI; XXII; XXIII; XXIV, XXV, XXVI, XXVII, XXVIII, XXIX, XXX, XXXI, XXXII 및 XXXIII으로 테스트하였다. 결과는 도 3b 및 3c에 보여진다. XIa 및 X1b을 제외한 모든 독소타입들, 총 35개의 독소타입들이 양성 증폭 결과를 제공하였으며 (도 3b), 증폭-후 양성 증폭 반응으로부터의 융해곡선 분석은 하나의 앰플리콘의 증폭을 나타냈다 (도 3c). 또한 독소타입 XIa 및 XIb에 대한 증폭-후 융해곡선 분석은 어떠한 증폭도 나타내지 않았다. 독소타입 XIa 및 XIb에 대한 음성 증폭은 이들이 독소 A 또는 독소 B 중 어느 하나를 생산하지 않았기 때문에 예측된다 (Rupnik et al. 2001). 이들은 tcdB 유전자가 전혀 없지만 최소 tcdA 유전자의 일부 부분을 포함한다.
실시예 6. tcdA SIBA 어세이 테스팅
서열번호 7, 8 및 10의 tcdA 검출성 올리고뉴클레오타이드는 실시예 1에 기재된 반응 혼합물로 40℃에서 C. 디피실 tcdA 유전자를 증폭하기 위해 이용되었다. 프라이머-다이머 또는 자가-프라이밍을 생성하는 각 말단 프라이머의 능력은 템플레이트 DNA의 부존재 (템플레이트가 없는 대조군, NTC)에서 테스트하였다. 올바른 타겟 DNA를 검출하고 증폭하는 올리고뉴클레오타이드의 능력은 10-10000 cp/반응 C. 디피실 BAA-1382 게놈 DNA (gDNA)의 존재 하에서 테스트하였다. 증폭 산물의 존재 또는 부존재는 SybrGreen I 형광 (도 4a)의 증가에 의해 결정하고 실-시간 PCR 장치로 측정하였다. 융해곡선 분석은 하나의 특이적 앰플리콘의 증폭을 확인하기 위해 실시하였다 (도 4b).
본 발명의 서열
서열번호 1
AACCAAAGTGGAGTGTTACAAACAGGTGTATTTAGTACAGAAGATGGATTTAAATATTTTGCCCCA
서열번호 2 AACCAAAGTGGAGTGTTACAA
서열번호 3 TGGGGCAAAATATTTA
서열번호 4 TCCTCCTGTACCTCGTTACAAACAGGTGTATTTAGTACAGAAGATGGATTTAAATA
서열번호 5 TCCTCCTGTACCTCGTTACAAACAGGTGTATTTAGTACAGAAGmAmUmGmGmAmUmUmUmAmAmAmUmA/InvdT/. mX = 2'-O-메틸 RNA. invdT = 반전된(inverted) dTTP.
서열번호 6 ATGGATAGGTGGAGAAGTCAGTGATATTGCTCTTGAATACATAAAACAATGGGCTGATATTAA
서열번호 7 ATGGATAGGTGGAGAAGTC
서열번호 8 TTAATCTCAGCCCATTG
서열번호 9 TCCTCCTGTACCTCAGAAGTCAGTGATATTGCTCTTGAATACATAAAACAATGG
서열번호 10 TCCTCCTGTACCTCAGAAGTCAGTGATATTGCTCTTGAATmAmCmAmUmAmAmAmAmCmAmAmUmGmG/InvdT/. mX = 2'-O-메틸 RNA. invdT = 반전된 dTTP.
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Claims (15)

  1. 시료에서 독소 발생 클로스트리디움 디피실(C. difficile)의 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 타겟 핵산 서열의 증폭을 촉진하는 조건 하에서 상기 시료를 최소 하나의 업스트림 프라이머, 최소 하나의 다운스트림 프라이머 및 최소 하나의 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드와 접촉시키는 단계를 포함하며,
    상기 프라이머 및 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드 각각은 상기 타겟 핵산 서열에 상보적인 부위를 포함하고; 및
    상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드는 상기 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머의 결합을 허용하도록 단일-가닥된 타겟 핵산 서열의 적어도 일부를 제공하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 타겟 핵산 서열은 C. 디피실의 병원성 유전자 자리 (PaLoc)에 위치된 유전자 내에 존재하며, 선택적으로 상기 C. 디피실 유전자는 tcdB 또는 tcdA인 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 타겟 핵산 서열의 GC 함량은 적어도 30%인 것인 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 C. 디피실 유전자는 tcdB이고 상기 타겟 핵산 서열은 서열번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 것인 방법.
  5. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 C. 디피실 유전자는 tcdA이며 상기 타겟 핵산 서열은 서열번호 6 또는 이의 변이체를 포함하는 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 업스트림 프라이머는 서열번호 2 또는 이의 변이체 서열을 포함하는 30개 미만의 뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클레오타이드이고/이거나, 상기 다운스트림 프라이머는 서열번호 3 또는 이의 변이체 서열을 포함하는 30개 미만의 뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클레오타이드이며/이거나, 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 4 또는 이의 변이체 서열을 포함하는 30개보다 더 큰 뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클레오타이드이고, 이의 3' 부위에 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 추가적으로 포함하는 것인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 업스트림 프라이머는 서열번호 7 또는 이의 변이체 서열을 포함하는 30개 미만의 뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클레오타이드이고/이거나, 상기 다운스트림 프라이머는 서열번호 8 또는 이의 변이체 서열을 포함하는 30개 미만의 뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클레오타이드이며/이거나, 상기 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 9 또는 이의 변이체 서열을 포함하는 30개보다 더 큰 뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클레오타이드이고, 이의 3' 부위에 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 추가적으로 포함하는 것인 방법.
  8. 선행하는 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 상기 시료를 리콤비나제와 접촉시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것인 방법.
  9. 선행하는 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 상기 타겟 핵산 서열의 증폭을 촉진하는 등온 조건 하에서 실시하는 것인 방법.
  10. (a) 업스트림 프라이머, (b) 다운스트림 프라이머 및 (c) 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드로부터 선택된 최소 2개의 올리고뉴클레오타이드들을 포함하는 조성물로서,
    상기 올리고뉴클레오타이드 각각은 제6항에 정의된 대로이거나 또는 상기 올리고뉴클레오타이드 각각은 제7항에 정의된 대로인 것인 조성물.
  11. (a) 업스트림 프라이머, (b) 다운스트림 프라이머 및 (c) 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드로부터 선택된 최소 2개의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 키트로서,
    상기 올리고뉴클레오타이드 각각은 제6항에 정의된 대로이거나 또는 상기 올리고뉴클레오타이드 각각은 제7항에 정의된 대로인 것인 키트.
  12. 제10항, 또는 제11항에 있어서, 상기 조성물 또는 키트는 (a)의 최소 하나의 올리고뉴클레오타이드, (b)의 최소 하나의 올리고뉴클레오타이드, 및 (c)의 최소 하나의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 조성물 또는 키트.
  13. 제12항에 있어서, 상기 조성물 또는 키트는 DNA 폴리머라제 및/또는 리콤비나제를 추가적으로 포함하는 것인 조성물 또는 키트.
  14. 독소 발생 C. 디피실의 검출을 위한 방법에서 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머, 및 선택적으로 가닥 침입 올리고뉴클레오타이드의 용도로서, 각각은 제6항에 정의된 대로이거나 또는 제7항에 정의된 대로인 것인 용도.
  15. 대상자에서 C. 디피실 감염의 진단을 위한 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상자에서 유래된 시료에서 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 정의된 대로의 방법을 실시하는 단계를 포함하는 것인 방법.
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