JP2016518130A - 鎖侵入に基づくdna増幅法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、鎖侵入(strand-invasion)に基づくDNA増幅による、毒素産生性クロストリジウム ディフィシル(C. ディフィシル)を検出するための方法に関する。本発明は、本方法における使用に適したオリゴヌクレオチド、組成物、及びキット、並びに毒素産生性C. ディフィシルの検出のためのそれらの使用にも関する。
クロストリジウム菌(Clostridia)は、グラム陽性、胞子形成性の嫌気性細菌である。病原性クロストリジウム菌種は、高いin vivo毒性並びに高い構造及び配列相同性を伴う非常に大きな毒素からなる、大クロストリジウム細胞毒(LCT)のグループのタンパク質毒素を産生する(von Eichel-Streiber et al., 1996)。C. ディフィシルのトキシンA及びトキシンBは、C. ディフィシルの病原性の主要な原因である。長年トキシンAが、主要な病原性因子であると考えられていたが、しかし、トキシンBがC. ディフィシルの感染における主要な役割を果たす事実を示す証拠の量が増えている(Lyras et al., 2009; Carter et al., 2012)。
本発明は、毒素産生性C.ディフィシルの標的核酸配列の検出に関し、試料中の毒素産生性C.ディフィシルの存在が判定されることを可能とする。本発明の方法は、上流プライマー、下流プライマー、鎖侵入オリゴヌクレオチドを用い、各々は前記標的核酸配列に相補的な領域を含む。プライマー及び鎖侵入オリゴヌクレオチドは、組み合わせると標的核酸配列の増幅をもたらす。鎖侵入オリゴヌクレオチドは、標的核酸配列の少なくとも一部を一本鎖にし、上流プライマー及び下流プライマーの結合を可能とし、その結果DNAの増幅を可能としている。典型的には、二本鎖DNAの熱変性の要件なしに、増幅は等温の条件下で実施される。
(I) 上流プライマーは、配列番号2又はその変異体の配列を含む、長さ30ヌクレオチド未満のオリグヌクレオチドであり、下流プライマーは、配列番号3又はその変異体の配列を含む、長さ30ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチドであり、鎖侵入オリゴヌクレオチドは、配列番号4又はその変異体の配列を含み、かつその3’領域に1つ以上の修飾ヌクレオチドをさらに含む、長さ30ヌクレオチドより長いオリゴヌクレオチドであるか; 又は
(II) 上流プライマーは、配列番号7又はその変異体の配列を含む、長さ30ヌクレオチド未満のオリグヌクレオチドであり、下流プライマーは、配列番号8又はその変異体の配列を含む、長さ30ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチドであり、鎖侵入オリゴヌクレオチドは、配列番号9又はその変異体の配列を含み、かつその3’領域に1つ以上の修飾ヌクレオチドをさらに含む、長さ30ヌクレオチドより長いオリゴヌクレオチドである。
配列番号1は、tcdBの標的領域のヌクレオチド配列である。
配列番号2は、tcdBの順方向プライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号3は、tcdBの逆方向プライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号4は、tcdBの鎖侵入オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
配列番号5は、修飾されたtcdBの鎖侵入オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
配列番号6は、tcdAの標的領域のヌクレオチド配列である。
配列番号7は、tcdAの順方向プライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号8は、tcdAの逆方向プライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号9は、tcdAの鎖侵入オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
配列番号10は、修飾されたtcdAの鎖侵入オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
開示される方法の異なる応用は、当技術分野における特定のニーズに対して適合され得ることが、理解される。本明細書で用いられる用語は、本発明の特定の実施例を説明する目的のためのみの用語であること、限定されることは意図されないことも、理解される。加えて、本明細書及び添付の請求項において、単数形の「a」、「an」、「the」は、別段の規定がない限り、複数の意味も含む。従って、「ポリペプチド(a polypeptide)」への参照は、2つ以上のかかるポリペプチドを含む、などとなる。上記又は下記に関わらず、本明細書で引用される全ての刊行物、特許、特許出願は、参照によりそれらの全体が本明細書中に組み込まれる。
試料
一般に試料は、臨床的試料、例えばC. ディフィシルによる感染を有すると疑われる、又は感染を有する患者から得られる試料である。しかしながら、核酸が試料から得ることができる、又は由来し得ることを条件に、任意の試料が用いられ得る。従って、特定のC. ディフィシル菌株の標準試料、又は環境試料が、本発明に用いられ得る。臨床的試料の適切な種類は、被験体に存在する、又は存在することが疑われる特定の種類の感染により、様々である。試料は、血液、血漿、血清、尿又は便の試料であり得る。好適な実施態様において、試料は便の試料である。便の試料は、消化管感染を有する被験体から採取され得る。感染は、下痢を有する患者中に存在し得る。
標的核酸配列は、毒素産生性 C.ディフィシルの特異的な検出における使用に適切な、C. ディフィシルのゲノム(又はアンプリコン)の領域である。これは、非常に近縁の生物が存在する場合ですら、試料中の毒素産生性 C.ディフィシルの存在の非常に定性的で明確な判定を可能とする。特定の病原性の毒素産生菌株における特定の標的核酸配列の選択、それらの配列の検出のための、結果としてのプライマー及び鎖侵入オリゴヌクレオチドの設計は、考慮すべき重要なことである。適した配列の例は、本明細書で提供される。
適切な上流プライマー及び下流プライマーは、標的核酸配列の少なくとも一部を一本鎖にし、上流プライマー及び下流プライマーの結合を可能にする、鎖侵入オリゴヌクレオチドの結合部位を考慮しながら、目的の標的核酸配列を基礎として選択される。
適切な鎖侵入オリゴヌクレオチドは、上流プライマー及び下流プライマーの結合部位、及び上流プライマー及び下流プライマーの結合を可能にするのに適切な領域での、標的核酸配列を一本鎖にするための鎖侵入オリゴヌクレオチドに関する要件を考慮しながら、目的の標的核酸配列を基礎として選択される。
標的核酸配列の増幅を促進する条件下で、試料由来の核酸は、検出目的のための上流プライマー及び下流プライマー、並びに鎖侵入オリゴヌクレオチドと接触させられる。
DNA増幅を促進する条件下で、標的核酸配列と、プライマー及び鎖侵入オリゴヌクレオチドとの接触から生じる増幅DNAの存在は、任意の適切な手段により監視され得る。
本発明は、産物自体として、配列番号2〜5及び7〜10のプライマー及び鎖侵入オリゴヌクレオチド、並びにそれらの変異体、前記プライマー及び鎖侵入オリゴヌクレオチドを含む組成物及び調合物をさらに提供する。プライマー、及び必要に応じて鎖侵入オリゴヌクレオチドは、毒素産生性 C.ディフィシルの任意の検出方法で用いられ得る。典型的には、方法は鎖侵入に基づくDNA 増幅法である。しかしながら、毒素産生性 C.ディフィシルの特異的な検出が可能である任意の適切なDNA増幅法が、用いられ得る。上流プライマー及び下流プライマーは、鎖侵入オリゴヌクレオチドの使用を要件としないDNA増幅法、例えばPCRで用いられ得る。
本発明は、(a)上流プライマー、(b)下流プライマー及び(c) 鎖侵入オリゴヌクレオチドから選択される少なくとも2つのオリゴヌクレオチドを含む組成物及びキットも提供する。上流プライマー、下流プライマー、鎖侵入オリゴヌクレオチドは、上述した通りである。組成物又はキットは、上流プライマー及び下流プライマー、上流プライマー及び鎖侵入オリゴヌクレオチド、又は下流プライマー及び鎖侵入オリゴヌクレオチドを含み得る。好ましくは、組成物又はキットは、上流プライマー、下流プライマー及び鎖侵入オリゴヌクレオチドを含む。組成物又はキットは、本発明の方法、又は代替のDNA増幅法によるC. ディフィシルの検出のために適切であり得る。
本発明は、医療現場で特に有利である。本発明の検出方法は、高度に特異的な試験を提供し、臨床試料が毒素産生性 C.ディフィシル由来の標的核酸配列を含むか否かの判定を可能にする。方法は、毒素産生性C.ディフィシルに関連する様々な疾患の背景に適用され得る。加えて、方法は毒素産生性 C.ディフィシルのキャリアのスクリーニングに適用され得る。
実施例 1 - C. ディフィシル tcdB及びtcdAアッセイの設計
tcdA遺伝子及びtcdB遺伝子の検出及び増幅のための、特異的なオリゴヌクレオチドを設計することは、困難であった。tcdA遺伝子及びtcdB遺伝子は、互いの間だけでなく、他の大クロストリジウム毒に対しても、高い配列相同性を示す。C. ソルデリの細胞毒素遺伝子tcsLは、tcdBと最も近いホモログである(Popoff, 1987; Green, 1995)。C. ソルデリ tcsLに対する抗体は、C. ディフィシルのトキシンBと交差反応性がある。従って、C. ディフィシルのトキシンBの検出のためのラテラルフロー試験は、一般的にC. ソルデリ tcsLと交差反応をする。特異的なオリゴヌクレオチドの設計は、特異的な侵入オリゴヌクレオチドに関する要件によりさらに複雑になった。
40℃で、等温の鎖侵入DNA増幅により、C. ディフィシルのtcdB遺伝子を増幅するために、配列番号2、3、5のtcdB検出オリゴヌクレオチドを用いた。DNA結合蛍光色素のサイバーグリーンIを、増幅の検出のため用い、蛍光光度計又はリアルタイムPCR装置のいずれかで、蛍光を測定した。テンプレートDNAの存在又は非存在下において、反応混合物は、反応緩衝液(10 mM トリスアセテート,pH 8、0.5 mM EDTA、4 mM DTT、150 mM スクロース、0.1 mg/ml BSA、5 % DMSO)、2 mM ATP、5% PEG1000、60 mMクレアチンリン酸 ジ(トリス) 塩、dNTP (dUTPにより置換されるdTTPを伴う)、12.5 mU/μl スクロースホスホリラーゼ、25 mU/μl クレアチンホスホキナーゼ、62.5 mU/μl Bsu ポリメラーゼ、0.1〜0.3 mg/ml T4 バクテリオファージ UvsX、0.25〜0.5 mg/ml T4 バクテリオファージ gp32、10 mM Mg-アセテート及びオリゴヌクレオチドを含んでいた。
tcdBアッセイの特異性を、実施例2で説明されたような反応において、テンプレートとしてC. ソルデリ ATCC 9714 gDNAを用いて試験した。C. ソルデリの毒素遺伝子 tcsLは、tcdBに最も近いと認められるホモログである。結果を図 2(a)に示す。テンプレートDNAとしての10 000 cpのC. ソルデリgDNAとのtcdBの反応は、DNAが増幅しないことを示したが、一方10 000 cpのC. ディフィシルBAA-1382 (630)は、サイバーグリーンIの蛍光強度の増加により測定される明らかな増幅を示した。
tcdBアッセイの感度を、C. ディフィシル BAA-1382 (630)の希釈系列を用いて試験し、増幅をサイバーグリーンI蛍光で測定し、リアルタイムPCRにより検出した。結果を図 2(b)に示す。テンプレートとしての10〜10 000 cp/反応のC. ディフィシル gDNAは、ポジティブな増幅を示したが、一方NTC,ネガティブコントロール及び1 cp/反応は、増幅しなかった。ネガティブコントロールの反応は、少なくともそれぞれ1000 cp/反応で、エンテロバクター エロゲネス、シトロバクター sp、シゲラ ソネイ、シゲラ フレックスネリ、ストレプトコッカス アガラクチア、リステリア モノサイトゲネス、エシェリキア コリ、エンテロバクター エロゲネス、エンテロバクター クロアカ、エンテロコッカス フェカリス、シトロバクター フロインデイ、クレブシエラ ニューモニエから単離されたgDNAの混合物を含んでいた。NTC=テンプレート無しのコントロール。
tcdBアッセイの包括性を、C. ディフィシル毒素型0、III、VIII及びXで試験した。結果を図3(A)及び(C)に示す。各毒素型からの2 ng gDNA/反応を、tcdB反応でのテンプレートとして用いた。全ての試験した毒素型は、ポジティブな増幅結果をもたらした(図 3A)。さらに、融解曲線分析は、単一の特異的なアンプリコンの増幅を示した(図 3C)。
配列番号7、8、10のtcdA検出オリゴヌクレオチドを、実施例1で説明したように、反応混合物と共に40℃で、C. ディフィシル tcdA遺伝子を増幅するために用いた。エンドプライマーのプライマーダイマーを産生する能力、又は自己プライミングを、テンプレートDNAの非存在下で試験した(テンプレート無しのコントロール,NTC)。オリゴヌクレオチドの、正確な標的DNAを検出、増幅する能力を、10〜10 000 cp/反応のC. ディフィシル BAA-1382 ゲノムDNA (gDNA)の存在下で、試験した。増幅産物の存在又は非存在を、サイバーグリーンI蛍光の増加により判定し(図 4a)、リアルタイムPCR装置で測定した。融解曲線分析を、単一の特異的なアンプリコンの増幅を確かめるため実施した(図 4b)。
SEQ ID NO: 1
AACCAAAGTGGAGTGTTACAAACAGGTGTATTTAGTACAGAAGATGGATTTAAATATTTTGCCCCA
SEQ ID NO: 2 AACCAAAGTGGAGTGTTACAA
SEQ ID NO: 3 TGGGGCAAAATATTTA
SEQ ID NO: 4 TCCTCCTGTACCTCGTTACAAACAGGTGTATTTAGTACAGAAGATGGATTTAAATA
SEQ ID NO: 5 TCCTCCTGTACCTCGTTACAAACAGGTGTATTTAGTACAGAAGmAmUmGmGmAmUmUmUmAmAmAmUmA/InvdT/ . mX = 2’-O-メチルRNA. invdT = 逆位のdTTP.
SEQ ID NO: 6
ATGGATAGGTGGAGAAGTCAGTGATATTGCTCTTGAATACATAAAACAATGGGCTGATATTAA
SEQ ID NO: 7 ATGGATAGGTGGAGAAGTC
SEQ ID NO: 8 TTAATCTCAGCCCATTG
SEQ ID NO: 9 TCCTCCTGTACCTCAGAAGTCAGTGATATTGCTCTTGAATACATAAAACAATGG
SEQ ID NO: 10
TCCTCCTGTACCTCAGAAGTCAGTGATATTGCTCTTGAATmAmCmAmUmAmAmAmAmCmAmAmUmGmG/InvdT/ . mX = 2’-O-メチルRNA. invdT = 逆位のdTTP.
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Claims (15)
- 試料中の毒素産生性 C.ディフィシルの標的核酸配列を検出するための方法であって、前記方法は、前記標的核酸配列の増幅を促進する条件下で、前記試料を少なくとも1つの上流プライマー、少なくとも1つの下流プライマー及び少なくとも1つの鎖侵入オリゴヌクレオチドに接触させることを含み、
各々の前記プライマー及び前記鎖侵入オリゴヌクレオチドが、前記標的核酸配列に相補的な領域を含み;かつ
前記鎖侵入オリゴヌクレオチドが、標的核酸配列の少なくとも一部を一本鎖にし、前記上流プライマー及び下流プライマーの結合を可能にする、方法。 - 前記標的核酸配列が、C. ディフィシルの病原性遺伝子座(PaLoc)に位置する遺伝子中に存在し、必要に応じて、前記C. ディフィシルの遺伝子がtcdB又はtcdAである、請求項1に記載の方法。
- 前記標的核酸配列のGC含量が少なくとも30%である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記C. ディフィシルの遺伝子がtcdBであり、かつ前記標的核酸配列が配列番号1又はその変異体を含む、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記C. ディフィシルの遺伝子がtcdAであり、かつ前記標的核酸配列が配列番号6又はその変異体を含む、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記上流プライマーが、配列番号2若しくはその変異体の配列を含む、長さ30ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチドであり、及び/又は前記下流プライマーが、配列番号3若しくはその変異体の配列を含む、長さ30ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチドであり、及び/又は前記鎖侵入オリゴヌクレオチドが、配列番号4若しくはその変異体の配列を含み、かつその3’領域に1つ以上の修飾ヌクレオチドをさらに含む、長さ30ヌクレオチドよりも長いオリゴヌクレオチドである、請求項4に記載の方法。
- 前記上流プライマーが、配列番号7若しくはその変異体の配列を含む、長さ30ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチドであり、及び/又は前記下流プライマーが、配列番号8若しくはその変異体の配列を含む、長さ30ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチドであり、及び/又は前記鎖侵入オリゴヌクレオチドが、配列番号9若しくはその変異体の配列を含み、かつその3’領域に1つ以上の修飾ヌクレオチドをさらに含む、長さ30ヌクレオチドよりも長いオリゴヌクレオチドである、請求項5に記載の方法。
- 前記試料をリコンビナーゼに接触させることをさらに含む、上記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的核酸配列の増幅を促進する等温の条件下で実施される、上記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- (a)上流プライマー、(b)下流プライマー及び(c)鎖侵入オリゴヌクレオチドから選択される、少なくとも2つのオリゴヌクレオチドを含む組成物であって、
各々の前記オリゴヌクレオチドが請求項6に記載されるものか、又は
各々の前記オリゴヌクレオチドが請求項7に記載されるものである、組成物。 - (a)上流プライマー、(b)下流プライマー及び(c)鎖侵入オリゴヌクレオチドから選択される、少なくとも2つのオリゴヌクレオチドを含むキットであって、
各々の前記オリゴヌクレオチドが請求項6に記載されるものか、又は
各々の前記オリゴヌクレオチドが請求項7に記載されるものである、キット。 - 少なくとも1つの(a)のオリゴヌクレオチド、少なくとも1つの(b)のオリゴヌクレオチド、及び少なくとも1つの(c)のオリゴヌクレオチドを含む、請求項10に記載の組成物、又は請求項11に記載のキット。
- DNAポリメラーゼ及び/又はリコンビナーゼをさらに含む、請求項12に記載の組成物又はキット。
- 毒素産生性 C.ディフィシルの検出方法における、上流プライマー、下流プライマー、及び必要に応じた鎖侵入オリゴヌクレオチドの使用であって、各々が請求項6に記載されるものか、又は各々が請求項7に記載されるものである、使用。
- 被験体由来の試料において、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法を実施することを含む、前記被験体でのC. ディフィシルの感染の診断方法。
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