JP2020513756A - クロストリジウム・ディフィシルのエピデミックなリボタイプのマーカーを検出するためのcobraプローブ - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、例えば、tcdC遺伝子の一部を増幅することによって、C.ディフィシルのエピデミックなリボタイプ(例えば、リボタイプ027)を検出する方法を提供する。C.ディフィシル由来のtcdC遺伝子の核酸配列が利用可能である(例えば、GenBank登録番号AM180355を参照のこと)。具体的には、tcdC核酸分子を増幅および検出するためのプライマーおよびプローブが本発明によって提供される。さらに、tcdC遺伝子のヌクレオチド117位における一塩基欠失、tcdCΔ117、を特異的に検出するためのCobraプローブが本発明により提供される。
本発明で使用するCobraプローブは米国特許第8,409,802号及び米国特許第9,068,225号に記載される。Cobraプローブは、標的核酸配列の存在又は不存在を特異的に検出することを可能にするフレキシブルなリンカーを有する2ドメインプローブを指す。1つ目のドメインは、標的核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションをドライブする「アンカー」としてのものである。このドメインは安定的に標的核酸にハイブリダイズし、潜在的なミスマッチに耐性であるか、あるいは標的核酸の相補的な領域(「アンカ−結合」領域)内の可変性が低い領域と二本鎖を形成するように設計されている。2つ目のドメインは、対象の配列を検出するように設計されている「レポーター」としてのものである。「レポーター」は、標的核酸の相補的な領域(「レポーター結合」領域)に高度に特異的であり、標的配列の存在又は不存在の検出、ならびにレポーター結合領域とのマッチ/ミスマッチの区別をすることができる。レポータードメインは、一般に、レポータードメインのハイブリダイゼーションの有無を区別することができるように標識が結合しているので、標的配列の存在又は不存在を検出するか、あるいは融解温度の変化を検出することによってプローブ領域におけるミスマッチを検出する。この設計の2ドメインプローブにより、対象の標的配列を検出する特異性を非常に向上することができる。
米国特許第4,683,202号、第4,683,195号、第4,800,159号、及び第4,965,188号は、従来のPCR技術を開示する。PCRは通常、選択された核酸鋳型(例、DNAまたはRNA)に結合する2つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。本発明において有用なプライマーは、tcdC核酸配列内での核酸合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを含む。プライマーは制限酵素による消化物から常法により精製することができ、あるいは、合成的に製造することができる。プライマーは、増幅において最大の効率を得るために、一本鎖であることが好ましいが、二本鎖であってもよい。二本鎖プライマーは最初に変性される、すなわち鎖を分離するように処理される。二本鎖核酸を変性する1つの方法は加熱によるものである。
FRET技術(例えば、米国特許第4,996,143号、第5,565,322号、第5,849,489号、及び第6,162,603号参照)は、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分が互いに一定の距離内にあると、可視化または検出及び/又は定量化が可能な2つの蛍光部分の間でエネルギー移動が起こるという概念に基づく。典型的には、ドナーが適切な波長の光照射によって励起されると、ドナーはエネルギーをアクセプターに伝達する。アクセプターは、典型的には、伝達されたエネルギーを異なる波長の光照射の形態で再出射する。
本発明は、生物学的又は非生物学的サンプル中のC.ディフィシルのtcdC遺伝子のヌクレオチド117位における一塩基欠失(tcdCΔ117)の存在又は不存在を検出するための方法を提供する。特許請求の範囲に記載の方法は、サンプルの汚染、例えばランからランへのキャリーオーバー汚染、偽陰性、例えば、感度、および偽陽性、例えば、特異性の問題を回避することができる。本方法は、一対のtcdCプライマーを用いてサンプルからtcdC核酸分子の一部を増幅することを含む少なくとも1回のサイクリング工程およびFRET検出工程を行うことを含む。好ましくはサーモサイクラー内で、複数回のサイクリング工程を行う。本発明の方法は、tcdCΔ117の存在を検出するためにtcdCプライマーおよびCobraプローブを使用して実施することができ、そしてtcdCΔ117が検出されることは、サンプル中にC.ディフィシルのエピデミックなリボタイプが存在することを示す。
本発明は、更に、C.ディフィシルのtcdC遺伝子のヌクレオチド117位における一塩基欠失(tcdCΔ117)を検出するための製品又はキットを提供する。本発明にかかる製品は、tcdCΔ117を検出するために使用されるプライマーおよびプローブを適切なパッケージ材料と共に含みうる。tcdCΔ117を検出するための代表的なプライマーおよびプローブは、tcdC核酸分子へのハイブリダイズが可能である。さらに、キットは、DNA固定化、ハイブリダイゼーション、および検出に必要な適切にパッケージされた試薬および材料、例えば固体支持体、バッファー、酵素、およびDNA標準を含んでもよい。プライマーおよびプローブの設計方法が本明細書に開示されており、tcdC核酸分子の増幅およびハイブリダイズをするプライマーおよびプローブの代表例が提供されている。
tcdC中のヌクレオチド117位における一塩基欠失(tcdCΔ117)を検出するために、伝統的なプローブおよびCobraプローブを、一塩基欠失を表す変異配列について設計した。JN 944619は、tcdCΔ117を検出するためのプライマーおよびプローブの設計に使用されるC.ディフィシルCD1395株のNCBI参照配列である。ゲノムおよびプラスミドDNAサンプルを様々なコピーレベルで試験し、cobas z 480装置(Roche Molecular Systems,Inc)によるリアルタイムPCRを用いて増幅を行った。
C.ディフィシルの3つの株由来のゲノムDNAを鋳型として使用した。株12840由来の鋳型は野生型C.ディフィシルを表す。株11313由来の鋳型は、tcdC遺伝子のオリゴヌクレオチド120位にSNPを有する変異型C.ディフィシルを表し、これは二成分毒素を産生するが、Δ117については野生型である。株11314由来の鋳型は、tcdCΔ117遺伝子を有する変異型C.ディフィシル株を表す。フォワードプライマー(配列番号:4)およびリバースプライマー(配列番号:5)による通常のセンスプローブΔ117−センスFQ4(配列番号:3)を用いたPCR実験から得た増殖曲線を図3に示す。最大のシグナルが、100(1e2)および1000(1e3)コピー/反応濃度の11314鋳型(tcdCΔ117)で観察されたが、10(1e1)コピー/反応濃度の11314鋳型ではシグナルが観察されなかった。また、識別可能なシグナルは、105(1e5)および106(1e6)コピー/反応濃度で株11313の鋳型(SNP120)から、および105コピー/反応濃度で12840野生型の鋳型からも検出することができた。対照的に、プローブΔ117−Cobra FQ9(配列番号1)またはΔ117−Cobra FQ6(配列番号2)を同じフォワードプライマーおよびリバースプライマーと共に使用した場合、11314 tcdCΔ117鋳型について感度が高かった(シグナルは10[1e1]コピー/反応で検出された)のみならず、105(1e5)または106(1e6)のコピー/反応濃度で株11313および株12840の鋳型に対するシグナルは減少するか又は観察されなかった(図4および図5)。
Claims (15)
- サンプル中のC.ディフィシルのリボタイプ027株のtcdC遺伝子のヌクレオチド117位における一塩基欠失(tcdCΔ117)を検出する方法であって、
該方法は、
サンプルをtcdCプライマーのセットに接触させ、tcdC核酸がサンプル中に存在する場合、増幅産物を生成することを含む増幅工程を実施すること;
増幅産物を検出可能なtcdCΔ117プローブに接触させることを含むハイブリダイズ工程を実施すること;及び、
前記検出可能なtcdCΔ117プローブからのシグナルの存在又は不存在を検出すること,ここで、シグナルの存在はサンプル中のtcdCΔ117の存在を示し、シグナルの不存在はサンプル中のtcdCΔ117の不存在を示す;
を含み、
ここで前記検出可能なtcdCΔ117プローブは、ヌクレオチド117位における一塩基欠失に完全に相補的なコンティグ配列を有するレポータードメインを含むCobraプローブであり、かつ前記レポータードメインは、1つまたは複数のヘキサエチレングリコール(HEG)を含む非ヌクレオシドリンカーによりアンカードメインから分離されている、前記方法。 - 前記ハイブリダイズ工程は、前記増幅産物をドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分が標識された前記Cobraプローブに接触させることを含み;かつ
前記検出工程は、前記Cobraプローブのドナー蛍光部分とアクセプター蛍光部分間の蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の存在又は不存在を検出することを含み,ここで、蛍光の存在又は不存在は、サンプル中のtcdCΔ117の存在又は不存在を示す、
請求項1に記載の方法。 - 前記増幅は、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を用いる、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記Cobraプローブは、配列番号1及び2からなる群より選択される配列又はそれらの相補体を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記tcdCΔ117プローブは、二次構造の形成を許容する核酸配列を含み、ここで前記二次構造の形成は、ドナー蛍光部分とアクセプター蛍光部分の間が空間的に近接する結果をもたらす、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の蛍光部分は、クエンチャーである、請求項2〜5のいずれか一項に記載の方法。
- C.ディフィシルのリボタイプ027株のtcdC遺伝子のヌクレオチド117位における一塩基欠失(tcdCΔ117)を検出するためのキットであって、
一対のオリゴヌクレオチドプライマー、ここで、各オリゴヌクレオチドプライマーは、ヌクレオチド117位を含むtcdC遺伝子の部分配列の逆鎖にハイブリダイズ可能である;および
配列番号1および2からなる群より選択される配列又はそれらの相補体を含む検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブ:
を含むキット。 - 前記検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分を含む、請求項7に記載のキット。
- 前記アクセプター蛍光部分はクエンチャーである、請求項8に記載のキット。
- ヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、および核酸ポリメラーゼの機能に必要なバッファを更に含む、請求項7〜9のいずれか一項に記載のキット。
- 配列番号1および2からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドの配列又はそれらの相補体を含むオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドは少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項11に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの保存的に修飾されたバリエーションを含む、請求項11又は12に記載のオリゴヌクレオチド。
- 1つまたは複数の検出可能な標識を更に含む、請求項11〜13のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの標識部分及び/又は少なくとも1つのクエンチャー部分を含む、請求項14に記載のオリゴヌクレオチド。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022071436A1 (ja) * | 2020-09-30 | 2022-04-07 | 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 | 生物学的および生理学的プロセスを感知するrnaの測定方法 |
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