TWI504751B - 檢測困難梭狀桿菌核醣分型027之序列、技術平台及其方法 - Google Patents

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Description

檢測困難梭狀桿菌核醣分型027之序列、技術平台及其方法
本發明係有關於一種檢測困難梭狀桿菌核醣分型027之序列、技術平台及其方法，於活體外進行困難梭狀桿菌的流病偵測與基因分型，尤其係指針對檢測困難梭狀桿菌核醣分型027特有之目標序列SEQ ID NO：1所設計出之#1與#2引子對，並發展出一個單一步驟、快速且靈敏的技術平台，藉由聚合酶鏈鎖反應方式，即可偵測檢體是否具有目標序列之特徵，藉此達到快速確認檢體中有無包含核醣分型027菌株之目的。
按，由Holdeman於1977年首度發表之困難梭狀桿菌(Clostridium difficile)，係屬於芽孢桿菌科(Bacillaceae)梭孢桿菌屬(clostridium)，其屬名來自希臘文，意指梭狀物(spindle)，種名源自拉丁文difficile，是困難的意思，表示其在分離和研究上都比較困難；困難梭狀桿菌是一種厭氧性革蘭氏陽性桿菌，在人體外環境或醫療環境中，會形成孢子體，常透過醫療照護行為而傳播。困難梭狀桿菌尚有不同分型之菌株，其具有不同的毒性能力，其中有些亦為人體腸道中的正常菌叢(normalflora)之一，由於其他腸道菌的競爭壓抑才使其不易致病；但於醫院裡，有些病患會因為抗生素使用而抑制體內的正常菌叢，導致困難梭狀桿菌伺機性感染，引起 困難梭狀桿菌大量增生，由於困難梭狀芽孢桿菌主要的致病力來自於分泌的毒素A與毒素B，毒素會引發腸黏膜發炎及受損，因此會引起病人偽膜性結腸炎(pseudomembranous colitis)或嚴重腹瀉等，並可能引起病人敗血症，甚至死亡。另，曾有研究針對醫療機構所爆發困難梭狀桿菌相關疾病之臨床菌株進行分析，發現這些類似的菌株皆會分泌一種二元毒素CDT(binary toxin CDT)，並且於其致病基因tcdC上都有缺失(deletion)，如此的基因改變推測與毒素A與毒素B分泌增加相關。
近年來，困難梭狀桿菌感染症(Clostridium difficile infection，CDI)流行病學的改變與一株困難梭狀桿菌核糖分型(ribotype)027流行性菌株的出現有關，已知核糖分型027菌株具有高度毒性，並且由核糖分型027菌株引起的群突發事件中，常具有高致死率與高復發率之情形，因此分析困難梭狀桿菌分型將有助於了解其感染症之流病資訊；現有困難梭狀桿菌首要的分型方法為聚合脢連鎖反應之核糖分型(PCR ribotyping)，然全球卻沒有一套簡易標準化的檢測法可遵照。
目前困難梭狀桿菌診斷技術中無法直接以細菌基因分子診斷方式直接判讀是否為核醣分型027，必須以傳統聚合脢連鎖反應核糖分型方式，同時比對標準菌株的基因指紋圖譜才能獲得解答。請參閱第七圖，為習知困難梭狀桿菌核醣分型檢測分析圖，以習知方法進行核醣分型分析時，其缺點為需要大量已知核醣分型之菌株作為分型之標準依據，並需要強大的電腦分析，才有辦法作標準化分析，實驗室的再現性低，具有標準菌株是否購足的限制且程序較為繁瑣。
爰此，如何發展出可專一性且快速檢測困難梭狀桿菌核醣分型027菌株之方式，找到一個特定的基因片段並發展成為單一步 驟、快速且靈敏的診斷替代法，便成為此相關領域發明人思及之方向。
今，發明人即是鑑於上述現有之檢測困難梭狀桿菌核醣分型之方法於實際實施使用時仍具有多處缺失，於是乃一本孜孜不倦之精神，並藉由其豐富專業知識及多年之實務經驗所輔佐，而加以改善，並據此研創出本發明。
本發明主要目的為提供一種可專一性檢測困難梭狀桿菌核醣分型027之序列、技術平台及其方法，利用#1引子以及#2引子於活體外以聚合酶鏈鎖反應方式，偵測檢體是否具有目標序列特徵，藉此達到快速確認檢體中有無包含困難梭狀桿菌核醣分型027之目的。
為了達到上述實施目的，本發明人提出一種活體外檢測困難梭狀桿菌核醣分型027之技術平台及其方法，用以檢測經過純化和分離之目標序列；其中，目標序列可為一去氧核糖核酸(DNA)序列，其具有與SEQ ID NO：1至少85%之序列同一性，較佳係具有至少90%之序列同一性，更佳係具有至少95%之序列同一性，或可為SEQ ID NO：1序列。
一種活體外檢測困難梭狀桿菌核醣分型027之技術平台，其包括：(1)對於困難梭狀桿菌核醣分型027具有特異性，用以進行聚合酶鏈鎖反應之引子對，係包含#1引子及#2引子，其中#1引子係包含SEQ ID NO：2，而#2引子係包含SEQ ID NO：3，此引子對係針對困難梭狀桿菌核醣分型027之SEQ ID NO：1序列區域所設計；以及(2)多重聚合酶鏈鎖反應所需之引子組及偵測材料。
本發明之又一目的為提供一種活體外檢測困難梭狀桿菌及其核醣分型027之方法，其包括下列步驟：係先取得一臨床檢體 DNA；再於活體外以對困難梭狀桿菌毒素基因及核醣分型027基因具專一性之引子組進行多重聚合酶鏈鎖反應擴增檢體DNA，以檢測檢體是否含有符合目標序列SEQ ID NO：1之特徵，若符合特徵係表示檢體含有困難梭狀桿菌核醣分型027，其中，上述之特徵係包括序列或序列之長度。
於本發明之一實施例中，檢體係選自受感染之糞便或困難梭狀桿菌。
(S1)‧‧‧步驟一
(S2)‧‧‧步驟二
第一圖：本發明較佳實施例之檢測方法步驟流程圖
第二圖-(a)：本發明其一具體實施例之其中三十一種標準菌株核醣分型檢測分析圖
第二圖-(b)：本發明其一具體實施例之其中二十種標準菌株核醣分型檢測分析圖
第三圖-(a)：本發明其一具體實施例之第1至41號臨床菌株檢測分析圖
第三圖-(b)：本發明其一具體實施例之第42至73號臨床菌株檢測分析圖
第三圖-(c)：本發明其一具體實施例之第74至119號臨床菌株檢測分析圖
第三圖-(d)：本發明其一具體實施例之第120至149號臨床菌株檢測分析圖
第三圖-(e)：本發明其一具體實施例之第150至210號臨床菌株檢測分析圖
第三圖-(f)：本發明其一具體實施例之第211至273號臨床菌株檢測分析圖
第三圖-(g)：本發明其一具體實施例之第274至334號臨床菌株檢測分析圖
第三圖-(h)：本發明其一具體實施例之第335至380號臨床菌株檢測分析圖
第三圖-(i)：本發明其一具體實施例之第381至414號臨床菌株檢測分析圖
第四圖：本發明其一具體實施例之核醣分型檢測分析圖
第五圖：本發明具體實施例之困難梭狀桿菌毒素檢測分析圖
第六圖：本發明具體實施例之困難梭狀桿菌毒素及核醣027分型檢測分析圖
第七圖：習知困難梭狀桿菌核醣分型檢測分析圖
本發明之目的及其結構功能上的優點，將依據以下圖面所示之結構，配合具體實施例予以說明，俾使審查委員能對本發明有更深入且具體之瞭解。
本發明一種經過純化和分離於活體外檢測困難梭狀桿菌核醣分型027之目標序列，其去氧核糖核酸序列可例如為具有與SEQ ID NO：1(請參閱序列表所示)至少85%之序列同一性，較佳係為具有至少90%，更加係為具有至少95%之序列同一性或可為SEQ ID NO：1胺基酸序列。
首先，本發明提出一種活體外檢測困難梭狀桿菌核醣分型027之技術平台，主要包括有：(1)對於困難梭狀桿菌核醣分型027具有特異性，用以進行聚合酶鏈鎖反應(PCR)之引子對，係包含#1引子及#2引子，其中#1引子係包含SEQ ID NO：2以及#2引子係包含SEQ ID NO：3，且#1引子與#2引子係針對困難梭狀桿菌核醣分型027之目標序列SEQ ID NO：1序列區域所設計；以及(2)多重聚合酶鏈鎖反應所需之引子組及偵測材料。
請參閱第一圖所示，為本發明較佳實施例之檢測方法步驟流程圖，其檢測方法主要包括有：步驟一(S1)：係取得一檢體DNA，其中此檢體係選自受感染之糞便或困難梭狀桿菌，且係為困難梭狀桿菌或其毒素或兩者組合已被確認之檢體；以及步驟二(S2)：係於活體外以對困難梭狀桿菌毒素基因及核醣分型027具專一性之引子組進行多重聚合酶鏈鎖反應擴增(amplification)檢體DNA，並以上述技術平台(可例如但不限定為一套組)檢測檢體是否含有符合目標序列SEQ ID NO：1之特徵，可例如為序列或序列之長度(2,981bp)與SEQ ID NO：1相符合者，若符合特徵係表示檢體含有困難梭狀桿菌核醣分型027。
此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。
簡言之，本發明係有關於困難梭狀桿菌(Clostridium difficile) 核醣分型027菌株所特有之專一序列作為檢測依據之技術平台；此技術平台包括：專一性偵測困難梭狀桿菌核醣分型027之特異性序列的引子設計，及應用於進行多重聚合酶鏈鎖反應之引子組，以及此技術平台的檢測流程。本發明人發展出一套多重聚合酶鏈鎖反應的檢測法，其方法係先從臨床糞便樣本分離出DNA，於活體外進行困難梭狀桿菌的流病偵測與基因分型，並同時篩選出臨床上是否存在困難梭狀桿菌核醣分型027菌株。其中，毒素基因分型的引子設計是以毒基因型的困難梭狀桿菌致病基因座作為依據；另外還有一組引子利用核醣分型菌株所特有的序列作為偵測依據，可用以專一性的結合在標的序列SEQ ID NO：1上。藉此達到快速確認檢體中有無包含核醣分型027菌株之目的。因此，本發明人找到一個具有專一性的基因位點，並發展出一個單一步驟、快速且靈敏的技術平台用於臨床檢測困難梭狀桿菌核醣分型027菌株存在與否。
實驗一：取得檢體DNA
菌株來源係由美國加州大學洛杉磯分校(University of California，Los Angeles，UCLA)Prof.Goldstein實驗室購得40株已知核醣分型之標準菌株，以及由瑞典CCUG種源庫(Culture Collection，Universityof Göteborg，Sweden)購得11株標準菌株；另，404株困難梭狀桿菌臨床菌株係取自署立台南醫院病人之臨床分離菌株；將上述菌株皆保存於-80℃。
於菌株培養時，直接自凍管取菌塗布於洋菜培養基(CDC anaerobe 5% sheep blood agar)，並置於培養箱中之厭氧缸內，以 37℃培養48小時；再取其中單一菌落接種到50ml培養液(brain heart infusion(BHI)broth)內，密封後置於厭氧培養箱內，以37°C培養48小時，上述培養液係包含有37g/L之brain heart infusion、5g/L之酵母抽取物(yeast extraction)，和1g/L之L-半胱氨酸(L-cysteine)。
接著，將培養於50mL離心管內之菌株以2,500g離心10分鐘，並去除上清液留下沉澱物(pellet)，再以1mL PBS緩衝液回溶沉澱物後，取出200μL，利用套組(Genomic DNA Mini Kit，Geneaid)所指示之步驟進行DNA萃取。
進一步地，本發明係利用六組引子(如表一)所建立之多重聚合酶鏈鎖反應(multiplex-PCR)來檢測困難梭狀桿菌之16s rDNA、tcdA、tcdB、cdtA、cdtB，以及tcdC等六個基因，作為困難梭狀桿菌菌株毒素分型(toxin genotyping)之依據。基因擴增之反應條件為：(1)DNA變性步驟(denaturation)：94℃，5分鐘；(2)接合步驟(annealing)：以94℃，1分鐘，接著55℃，1分鐘，再72℃，1分鐘為一循環，共35個循環；以及(3)延展步驟(extension或elongation)：72℃，5分鐘，並將產物保存在4℃環境。接著，利用2%洋菜膠(agarose gel)進行電泳反應(100伏特，40分鐘)後，再以溴化乙菲錠(ethidiumbromide，EtBr)染色以進行產物分析。
實驗二：利用與困難梭狀桿菌核醣分型027具特異性之引子對檢測不同菌株
首先，本發明人將困難梭狀桿菌CD196(核醣分型027)，NC_013315.1菌株與困難梭狀桿菌630(核醣分型012)，NC_009089.1菌株的解序基因體做比對分析後，發現困難梭狀桿菌CD196中存在一組獨特基因區域(目標序列，SEQ ID NO：1)為核醣分型027特有，此基因區域主要係自3,490,544到3,493,524範圍的兩個基因(分別為CD196_2946：hypothetical protein與CD196_2947：CRISPR-associated helicase cas3)，故針對此目標序列設計專一性引子對，以期做為臨床檢測之專一性標誌。而此對與 困難梭狀桿菌核醣分型027具有特異性，可用以進行聚合酶鏈鎖反應之引子對，分別為正股#1引子及反股#2引子，#1引子序列可為SEQ ID NO：2(24bp，Tm：57.1℃)，並且#2引子序列可為SEQ ID NO：3(19bp，Tm：51.1℃)，其放大之長度範圍可為2,981bp。
將本發明設計之引子利用National Center for Biotechnology Information(NCBI)資料庫所提供目前已解序完成的17株(strains)困難梭狀桿菌，包含CD196、BI-1、R20291、2007855、CIP 107932、QCD-37x79、QCD-97b34、QCD-76w55、QCD-66c26、QCD-32q58、630、M68、M120、QCD23m63、ATCC 43255、BI-9，以及QCD-63q42之基因體作序列比對，而比對結果顯示只有核醣分型027菌株才具有這段獨特的目標序列存在。
萃取上述菌株之DNA，並使用Phusion Flash PCR Master Mix(Thermo Scientific)與20pmol正股#1引子與反股#2引子混合進行聚合酶鏈鎖反應。基因擴增之反應條件為：(1)DNA變性步驟(denaturation)：98℃，10秒；(2)接合步驟(annealing)：以98℃，1秒，接著54℃，5秒，再72℃，70秒為一循環，共30個循環；以及(3)延展步驟(extension或elongation)：72℃，1分鐘，並將產物保存在4℃環境。接著，利用1%洋菜膠進行電泳反應(100伏特，50分鐘)後，再以溴化乙菲錠(ethidiumbromide，EtBr)染色以進行產物分析。若所得產物具有與目標序列SEQ ID NO：1相同之序列或相同片段大小(2,981bp)，則表示檢體含有困難梭狀桿菌核醣分型027。
結果
結果一：本發明之引子對具有困難梭狀桿菌核醣分型027專一性
首先，請參閱第二圖，為本發明其一具體實施例之標準菌株核醣分型檢測分析圖，利用本發明#1引子與#2引子，將不同菌株DNA進行聚合酶鏈鎖反應後，由第二-(a)圖以及第二-(b)圖之結果可得知，於11株標準菌株與40株已知核醣分型的菌株中，僅4株為核醣分型027(RT027)之菌株(R20291、BAA 1805、BI-1，以及BI-7)，才具有與目標序列大小片段相符之產物出現，其它皆沒有產物，值得注意的是，其中已知與核醣分型027相似之菌株(RT019、RT075，以及RT153)亦無出現此片段相符之產物。
另，將收集到的404株臨床菌株進行toxin genotyping以作為臨床檢體的初步篩選與毒素分型分類，並針對不同毒素分型族群(尤其是具有高毒力基因型之菌株)再進行MLST分型做更進階的次分類而得到特性相似的不同族群。其中值得注意的是，已知此臨床檢體中有出現核醣分型027相似(ribotype 027-like)、核醣分型078，以及核醣分型078相似(ribotype 078-like)等的群體(數據未公開)；因此於獲得以上資訊後，進一步針對414株臨床株菌進行核醣分型027專一性檢測，並將已知為核醣分型027之兩菌株(BAA1805與R20291)作為陽性對照組(positive control)；分析結果請參閱第三圖，各臨床菌株並未有與目標序列大小片段相符之產物出現(第三-(a)圖~第三-(i)圖)，表示臨床菌株並未有核醣分型027菌株存在，此結果與先前已知結果吻合。
結果二：本發明之引子對可區分核醣分型027與核醣分型027相似之菌株
由於核醣分型027之菌株特徵是具有tcdC負調控基因18個鹼基缺失，但具有tcdC基因缺失者，並不一定為核醣分型027；因此，為避免偽陽性結果，發明人已經在臨床菌株中發現4株tcdC負調控基因18個鹼基缺失的菌株(如第四圖之no.294、2、381，以及286)，但在多位基因座序列分析(MLST)與核醣分型分析後排除為核醣分型027的可能(數據未公開)，使用本發明所設計之核醣分型027專一性引子可準確的區隔出正確的核醣分型027菌株(僅核醣分型027之菌株R20291、BAA 1805、BI-1，以及BI-7，才有與目標序列大小片段相符之產物出現)，並無偽陽性的結果。由此可知，此引子對與目標序列確實對於檢測核醣分型027具有專一性，可以於臨床上提供一個快速簡單的診斷方法。
請參閱第五圖，為本發明具體實施例之困難梭狀桿菌毒素檢測分析圖，本發明人亦已建立一套多重聚合酶鏈鎖反應(multiplex-PCR)可快速篩檢臨床菌株其毒力基因型，其主要係以16s rDNA、tcdA、tcdB、cdtA、cdtB，以及tcdC等六個基因，作為困難梭狀桿菌菌株毒素分型(toxin genotyping)之依據。
請參閱第六圖，結合以上發現，本發明人亦已建立一套多重聚合酶鏈鎖反應(multiplex-PCR)技術平台，可快速篩檢臨床菌株其毒力基因型，其主要係以tcdB、cdtB，以及tcdC等三個基因，再加上核醣分型027具有專一性之基因，發展出一個單一步驟、快速 且靈敏的技術平台，作為困難梭狀桿菌菌株毒素分型及核醣分型027之依據。
由此可知，本發明針對目標序列所設計之#1引子及#2引子確實可專一地判別是否為困難梭狀桿菌核醣分型027菌株，若結合快速篩檢臨床菌株毒力基因型之方法，將可顯著提昇此菌株檢測效率，藉此，可增加檢測的時效性，達到臨床快速檢測是否為困難梭狀桿菌核醣分型027菌株之目的。
由上述之實施說明可知，本發明與現有技術相較之下，本發明具有以下優點：
1.本發明係針對核醣分型027特有之目標序列設計出一對專一性引子，相較於習知核醣分型之方法，本發明僅需一株陽性菌做參考並只要進行基因擴增流程，不需要特定標準菌株，亦不需電腦特殊分析，由電泳膠圖結果即可直接判讀結果，具有高專一性及流程簡單之優點。
2.本發明係取得檢體DNA，於活體外檢測是否為困難梭狀桿菌核醣分型027菌株，未來具有發展成商業化快篩套組、將之應用於臨床檢體快篩之潛力，亦可作為一種診斷替代法(diagnostic alternative)。
3.目前市面上尚無針對困難梭狀桿菌核醣分型027菌株的直接診斷技術，本發明之技術平台及方法尤其可直接並快速檢測是否為核醣分型027菌株，將可大幅減少臨床病人等待檢測結果之時間，而適時地得到妥當的治療，故本發明對於臨床病人亦是一大助 益。
綜上所述，本發明之檢測困難梭狀桿菌核醣分型027之序列、技術平台及其方法，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。
惟，上述所揭之圖示及說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。
〈110〉 國立成功大學
〈120〉 檢測困難梭狀桿菌核醣分型027之套組及其方法
〈160〉 3
〈170〉 PatentIn version 3.5
〈210〉 1
〈211〉 2981
〈212〉 DNA
〈213〉 困難梭狀桿菌(Clostridium difficile)
〈400〉 1
〈210〉 2
〈211〉 24
〈212〉 DNA
〈213〉 人工序列
〈400〉 2
〈210〉 3
〈211〉 19
〈212〉 DNA
〈213〉 人工序列
〈400〉 3
(S1)‧‧‧步驟一
(S2)‧‧‧步驟二

Claims (7)

  1. 一種去氧核糖核酸序列之用途，係用於活體外專一性檢測困難梭狀桿菌核醣分型027，其中該去氧核糖核酸序列係SEQ ID NO：1。
  2. 一種活體外檢測困難梭狀桿菌核醣分型027之技術平台，其包括：對於困難梭狀桿菌核醣分型027具有特異性，用以進行聚合酶鏈鎖反應(PCR)之引子對，係包含#1引子及#2引子；其中該#1引子係具有如SEQ ID NO：2之去氧核糖核酸序列以及該#2引子係具有如SEQ ID NO：3之去氧核糖核酸序列。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之活體外檢測困難梭狀桿菌核醣分型027之技術平台，其中該#1引子以及該#2引子係針對困難梭狀桿菌核醣分型027之SEQ ID NO：1序列區域所設計。
  4. 一種活體外檢測困難梭狀桿菌核醣分型027之方法，其包括下列步驟：步驟一：係取得一檢體DNA；以及步驟二：係於活體外以對困難梭狀桿菌毒素基因及核醣分型027具專一性之引子對，進行聚合酶鏈鎖反應擴增(amplification)該檢體DNA，並檢測該檢體是否含有符合該目標 序列SEQ ID NO：1之特徵，若符合該特徵係表示該檢體含有困難梭狀桿菌核醣分型027；其中該引子對係包含#1引子及#2引子，且該#1引子係具有如SEQ ID NO：2之去氧核糖核酸序列以及該#2引子係具有如SEQ ID NO：3之去氧核糖核酸序列。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之活體外檢測困難梭狀桿菌核醣分型027之方法，其中該步驟一之檢體係為困難梭狀桿菌或其毒素或兩者之組合已被確認之檢體。
  6. 如申請專利範圍第4項所述之活體外檢測困難梭狀桿菌核醣分型027之方法，其中該檢體係選自受感染之糞便或困難梭狀桿菌。
  7. 如申請專利範圍第4項所述之活體外檢測困難梭狀桿菌核醣分型027之方法，其中該目標序列SEQ ID NO：1之特徵係包括序列或序列之長度。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Stabler RA, He M, Dawson L, Martin M, Valiente E, Corton C, Lawley TD, Sebaihia M, Quail MA, Rose G, Gerding DN, Gibert M, Popoff MR, Parkhill J, Dougan G, Wren BW，" Comparative genome and phenotypic analysis of Clostridium difficile 027 strains provides insight into the evolution of a hypervirulent bacterium"， Genome Biol ，2009，Vol.10， page R102 *

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