CN111057775B

CN111057775B - 鉴定沙门氏菌属的特异性新分子靶标及其快速检测方法

Info

Publication number: CN111057775B
Application number: CN201911394381.5A
Authority: CN
Inventors: 张菊梅; 尚玉婷; 叶青华; 吴清平; 杨小鹃; 薛亮; 张淑红; 庞锐; 雷涛; 曾海燕; 张友雄; 吴浩明
Original assignee: Guangdong Detection Center of Microbiology of Guangdong Institute of Microbiology; Guangdong Huankai Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Guangdong Detection Center of Microbiology of Guangdong Institute of Microbiology; Guangdong Huankai Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2022-06-14
Anticipated expiration: 2039-12-30
Also published as: CN111057775A

Abstract

本发明提供了一组用于检测沙门氏菌的分子靶标，所述分子靶标包括如SEQ ID NO.1～13所示的核苷酸序列。本发明还提供例了一组用于检测如权利要求1所述的用于检测沙门氏菌分子靶标的引物，其核苷酸序列如SEQ IDNO.14～39所示。采用本发明的引物针对特异性靶标进行PCR扩增，通过检测扩增产物是否含有目的条带判定样品中是否含有沙门氏菌，该方法降低了检测成本，更加具有实用性；本发明的特异性分子靶标即13个保守核酸具有单一的特异性，检测结果特异，结果判定简单。

Description

鉴定沙门氏菌属的特异性新分子靶标及其快速检测方法

技术领域

本发明属于微生物检验技术领域，涉及鉴别沙门氏菌属的特异性新分子靶标及其快速检测方法。

背景技术

沙门氏菌(Salmonella)是一种常见的人畜共患病原菌，能够在人类、动物及环境间传播，对人类和动物都具体极大的危害。人类感染沙门氏菌，除伤寒和副伤寒是由水源传播以外，其它主要是由于食用了被污染的食品，特别是动物性食品而导致的。在世界各地的食物中毒事件中，由其引起的食物中毒事件常年居于前列，一般占总食物中毒的40％～60％，最高达90％。根据CDC的统计，美国平均每年有120万人被沙门氏菌感染，造成2万多人住院治疗，引起 450人死亡。在我国，每年由沙门氏菌引起的食物中毒约占细菌性食物中毒事件的40％，对人类健康构成很大的威胁。人体在感染沙门氏菌之后，可引发恶心、呕吐、腹泻、发烧等症状，若不及时治疗死亡率高达10％(Abdelhaseib等，2016)。通常情况下沙门氏菌食用量超过10⁵CFU即可造成人类感染，而对于高度易感人群15-20CFU即可引起沙门氏菌感染(Kokkinos等，2014)。

目前，沙门氏菌的检测主要利用国标规定的传统微生物培养方法(GB 4789.4-2016)，包括：预增菌培养、增菌培养、分离纯培养物、生化鉴定和血清学鉴定等5个基本步骤。传统检测方法可重复性强，稳定性良好，是目前为止可靠性最高的检测方法。但这种方法操作复杂繁琐，检测时间较长(5d以上)，无法满足现场快速检测的需要。以PCR为主的分子生物学检测方法以其快速、准确、简便的特点，逐渐成为取代传统检测方法最具潜力的检测技术之一。

在PCR检测技术中，靶标序列和设计引物的特异性是关键。早在1992年， Rahn等利用鼠伤寒沙门氏菌的invA基因设计出了一对引物139-141，运用PCR 技术检测沙门氏菌属，特异的扩增片段为284bp(Rahn等，1992)。此后，agfA (Doran等，1993)、hin(Way等，1993)、H-li(Way等，1993)、IS200(Cano 等，1993)、riC(Fluit等，1993)、spvR(Mahon等，1993)、spvC(Rexach等， 1994)、fliC(Song等，1994)、viaB(Hashimoto等，1995)、stn(Prager等，1995)、 iagAB(Chevrier等，1995)、fimA(Cohen等，1996)、ompC(Kwang等，1996)、 iroB(Baumler等，1997)、hilA(Guo等，2000)、fimY(Yeh等，2002)、orgC (Day等，2003)、gyrB(Kakinuma等，2003)、c25(Chen等，2010)等基因被陆续报道。研究表明，其中部分基因在极个别的沙门氏菌血清型中序列缺失，且在检测非沙门氏菌时易产生假阳性结果(Malorny等，2003；Moore等，2007)。因此，迫切需要系统性的挖掘特异性检测新靶标，从而为沙门氏菌的鉴定提供快速、准确的方法。

本研究团队首次系统完成了我国43个主要城市4300份食品中致病微生物风险调查，已分离保存了1500多株沙门氏菌，是目前我国食品源沙门氏菌最多的菌种资源库，为本发明特异性新靶标的挖掘及验证，提供了强有力的保障。

经对现有技术的文献检索，尚未发现与本发明沙门氏菌13个特异性新分子靶标及相应PCR检测方法的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供用于鉴别沙门氏菌属的特异性新分子靶标及相应的PCR检测方法。

本发明根据原核生物泛基因组自动化分析软件(Pan-Genomics AnalysisPipeline，PGAP)中的MP方法来获得沙门氏菌属的核心基因及非核心基因信息，比对流程在Perl编程语言编写的本地化脚本中实现。提取出沙门氏菌菌株特有基因的蛋白序列，通过本地Blast分别将其比对回沙门氏菌的蛋白总库及NCBI 非冗余蛋白数据库，去除能比对到已知的蛋白序列，剩下的则为沙门氏菌属新获得的特异性分子靶标，获得SEQ ID NO.1～13所示的核苷酸序列作为靶标分子。

本发明提供一组用于检测沙门氏菌的分子靶标，所述分子靶标包括如SEQ IDNO.1～13所示的核苷酸序列。

本发明还提供一组用于检测如上所述的用于检测沙门氏菌分子靶标的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.14～39所示。

本发明针对上述特异性分子靶标设计了特异性检测引物，可通过PCR扩增技术实现快速检测沙门氏菌。其中，检测如SEQ ID NO.1所示的核酸分子靶标的引物如SEQ IDNO.14～15所示；检测如SEQ ID NO.2所示的核酸分子靶标的引物如SEQ ID NO.16～17所示；检测如SEQ ID NO.3所示的核酸分子靶标的引物如SEQ ID NO.18～19所示；检测如SEQID NO.4所示的核酸分子靶标的引物如SEQ ID NO.20～21所示；检测如SEQ ID NO.5所示的核酸分子靶标的引物如 SEQ ID NO.22～23所示；检测如SEQ ID NO.6所示的核酸分子靶标的引物如SEQ ID NO.24～25所示；检测如SEQ ID NO.7所示的核酸分子靶标的引物如SEQID NO.26～27所示；检测如SEQ ID NO.8所示的核酸分子靶标的引物如SEQ ID NO.28～29所示；检测如SEQ ID NO.9所示的核酸分子靶标的引物如SEQ ID NO.30～31所示；检测如SEQ ID NO.10所示的核酸分子靶标的引物如SEQ ID NO.32～33所示；检测如SEQ ID NO.11所示的核酸分子靶标的引物如SEQ ID NO.34～35所示；检测如SEQ ID NO.12所示的核酸分子靶标的引物如SEQ ID NO.36～37所示；检测如SEQ ID NO.13所示的核酸分子靶标的引物如SEQ ID NO.38～39所示；

本发明还提供一种检测沙门氏菌的试剂盒，所述试剂盒包括如检测如上所述的引物组。

优选地，所述试剂盒还包括：2×PCR Mix、模板DNA、上下游引物和灭菌双蒸水。

本发明还提供一种检测沙门氏菌的方法，包括以下步骤：

(1)使用如权利要求2所述的特异性引物对检测样本进行PCR扩增；

(2)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析；若电泳结果的扩增产物在285、 182、197、818、335、216、313、483、374、317、247、121或711bp任意位置出现单一条带则判定样品中含有沙门氏菌，若未出现目标大小的条带则判定样品中不含有沙门氏菌。

优选地，所述PCR的反应体系为25μL，包括：2×PCR Mix 12.5μL、模板 DNA 1μL、10μM上下游引物各1.0μL，灭菌双蒸水补足体积至25μL。

优选地，所述PCR反应程序为95℃预变性5min；95℃变性30s；58℃ 退火30s；72℃延伸30s，共进行35个循环；72℃延伸10min。

本发明的有益效果：本发明公开了用于鉴别沙门氏菌属的13个特异性分子靶标及相关PCR检测方法，与现有技术相比，本发明的检测方法具有检测时间短，准确度高，且无需经过生理生化等试验即可检测到沙门氏菌，降低了检测成本，更加具有实用性；本发明的特异性分子靶标即13个保守核酸具有单一的特异性，检测结果特异，结果判定简单。

附图说明

图1为实施例2中特异靶标分子SEQ ID NO.1对沙门氏菌属以及非沙门氏菌PCR检测结果电泳图(图A为沙门氏菌属；图B为非沙门氏菌；图中位置1 为阳性对照；M：marker；C：空白)。

图2为实施例2中特异靶标分子SEQ ID NO.2对沙门氏菌属以及非沙门氏菌PCR检测结果电泳图(图A为沙门氏菌属；图B为非沙门氏菌；图中位置1 为阳性对照；M：marker；C：空白)。

图3为实施例2中特异靶标分子SEQ ID NO.3对沙门氏菌属以及非沙门氏菌PCR检测结果电泳图(图A为沙门氏菌属；图B为非沙门氏菌；图中位置1 为阳性对照；M：marker；C：空白)。

图4为实施例2中特异靶标分子SEQ ID NO.4对沙门氏菌属以及非沙门氏菌PCR检测结果电泳图(图A为沙门氏菌属；图B为非沙门氏菌；图中位置1 为阳性对照；M：marker；C：空白)。

图5为实施例2中特异靶标分子SEQ ID NO.5对沙门氏菌属以及非沙门氏菌PCR检测结果电泳图(图A为沙门氏菌属；图B为非沙门氏菌；图中位置1 为阳性对照；M：marker；C：空白)。

图6为实施例2中特异靶标分子SEQ ID NO.6对沙门氏菌属以及非沙门氏菌PCR检测结果电泳图(图A为沙门氏菌属；图B为非沙门氏菌；图中位置1 为阳性对照；M：marker；C：空白)。

图7为实施例2中特异靶标分子SEQ ID NO.7对沙门氏菌属以及非沙门氏菌PCR检测结果电泳图(图A为沙门氏菌属；图B为非沙门氏菌；图中位置1 为阳性对照；M：marker；C：空白)。

图8为实施例2中特异靶标分子SEQ ID NO.8对沙门氏菌属以及非沙门氏菌PCR检测结果电泳图(图A为沙门氏菌属；图B为非沙门氏菌；图中位置1 为阳性对照；M：marker；C：空白)。

图9为实施例2中特异靶标分子SEQ ID NO.9对沙门氏菌属以及非沙门氏菌PCR检测结果电泳图(图A为沙门氏菌属；图B为非沙门氏菌；图中位置1 为阳性对照；M：marker；C：空白)。

图10为实施例2中特异靶标分子SEQ ID NO.10对沙门氏菌属以及非沙门氏菌PCR检测结果电泳图(图A为沙门氏菌属；图B为非沙门氏菌；图中位置 1为阳性对照；M：marker；C：空白)。

图11为实施例2中特异靶标分子SEQ ID NO.11对沙门氏菌属以及非沙门氏菌PCR检测结果电泳图(图A为沙门氏菌属；图B为非沙门氏菌；图中位置 1为阳性对照；M：marker；C：空白)。

图12为实施例2中特异靶标分子SEQ ID NO.12对沙门氏菌属以及非沙门氏菌PCR检测结果电泳图(图A为沙门氏菌属；图B为非沙门氏菌；图中位置 1为阳性对照；M：marker；C：空白)。

图13为实施例2中特异靶标分子SEQ ID NO.13对沙门氏菌属以及非沙门氏菌PCR检测结果电泳图(图A为沙门氏菌属；图B为非沙门氏菌；图中位置 1为阳性对照；M：marker；C：空白)。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。

实施例1沙门氏菌属特异性新分子靶标的挖掘

根据NCBI中GenBank数据库及本团队自测的沙门氏菌全基因组DNA序列，进行比较基因组学分析。采用泛基因组分析软件Roary，将相似性达95％的功能基因聚类为同一基因簇，比对流程在Perl编程语言编写的本地化脚本中实现。将泛基因组分析之后产生的矩阵文件gene_presence_absence.csv转换成0/1 形式，每一列对应菌株的基因簇携带情况，值为1表示携带该基因，值为0表示不携带该基因，对携带情况进行组合排序便可筛选出沙门氏菌属特有的基因片段，基因序列如SEQ ID NO.1～13所示。提取出沙门氏菌菌株13个特异性基因的蛋白序列，通过本地Blast分别将其比对回沙门氏菌的蛋白总库及NCBI非冗余蛋白数据库，去除能比对到已知的蛋白序列，剩下的则为沙门氏菌属新获得的特异性分子靶标，所述分子靶标的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～13所示。

实施例2沙门氏菌属特异性新分子靶标快速检测方法的建立

本实施例提供了一种检测沙门氏菌属的方法：根据实施例1获得的沙门氏菌属的任一个新特异性分子靶标设计引物，均能组成快速检测方法，且包括以下步骤：

引物的设计：根据上述13个新特异性分子靶标碱基序列SEQ ID NO.1～13 设计特异性扩增引物，引物序列如下表：

表1沙门氏菌属特异性PCR检测引物序列

DNA模板制备：将细菌在营养肉汤中进行培养，使用商品化的细菌基因组 DNA抽提试剂盒提取细菌基因组DNA，作为待检模板。

PCR检测体系及扩增程序：

PCR检测体系为25μL，其中包括：2×PCR Mix 12.5μL、模板DNA 1μL、 10μM上下游引物各1.0μL，灭菌双蒸水补足体积至25μL；

PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s；58℃退火30s；72 ℃延伸30s，共进行35个循环；72℃延伸10min。

PCR方法检测结果的判定

凝胶电泳检测扩增产物，如电泳结果扩增产物分别在285、182、197、818、 335、216、313、483、374、317、247、121、711bp位置是否存在单一扩增条带，如果存在，说明样品中含有沙门氏菌；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含沙门氏菌。

PCR检测方法的特异性评价结果

取95株不同血清型的沙门氏菌，大肠埃希氏菌、志贺氏菌等46株非沙门氏菌按照上述方法进行PCR检测，结果如图1所示，本发明检测方法均只有沙门氏菌显示出特异性扩增条带，非沙门氏菌均无特异性条带。所用菌株及检测结果如下表所示，表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。

表2本发明沙门氏菌属特异性评价试验结果

实施例3沙门氏菌疑似菌株的检测

采用实施例2中的沙门氏菌属PCR检测方法对391株从食品样品中分离的沙门氏菌疑似菌株进行检测，食品样品采集于广东省的超市及集贸市场，样品处理及疑似菌株的分离参见国标法。利用本发明的特异分子靶标和引物及检测方法，沙门氏菌共检出391株，与生化反应试验及16s rDNA鉴定结果相一致。通过本实施例说明本发明沙门氏菌属的特异性靶标以及检测引物可靠性高。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心），广东环凯生物科技有限公司，广东环凯生物技术有限公司

<120> 鉴定沙门氏菌属的特异性新分子靶标及其快速检测方法

<130> 12.25

<160> 39

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 297

<212> DNA

<213> 合成

<400> 1

atgacgccgc aactcacctg gacgcgtgag gcggacactc tggtgctggc gggagagctg 60

gatcaggacg tgttggcgcc gctatgggac gcgcgcgtag aagcgatgaa tggcgttacc 120

cgtatcgacc tgagccagat ctccagggtg gatacagggg gactggcgct gctggcgcac 180

cttgtgaacc aggcaaaaaa gcagggcaat gccgtgtcgc tgtctggcgt taacgacaag 240

gtttacgcgc tggcgcaatt atataacttg cccgaagacg tacttccccg tatgtaa 297

<210> 2

<211> 288

<212> DNA

<213> 合成

<400> 2

atgaataatc attttgggaa aggcttaatg gccgggttgc acgcgccata tgcatatagc 60

gcgcatcatg cggtgaattt ctgttctgag tataaacgtg gctttgtatt aggttttaca 120

caccgtatgt tcgaaaagac cggcgatcgt caacttagcg cgtgggaggc cggaattctg 180

acgcgtcgct atggtctgga taaagaaatg gtgatggatt tctttaaaga gaatcattcc 240

gggatggcgg ttcgcttctt tatggccggt tatcgactcg aaggttga 288

<210> 3

<211> 321

<212> DNA

<213> 合成

<400> 3

atgccgcatc ccctgaattt acaacgcggg tttagcctcc cggaagtttt agtggcgatg 60

gttctaatag taatgatcgt caccgcgctg tcaggctatc agcgggtatt aatgcacagt 120

tttgcattac gacaccagta tctccagatc tggcggcagg cgtggcagca aacggcgctg 180

tatccatttt cgcctgctga cggctggaag gccaaccgga tgcagacaac gcaatcggga 240

tgtgtcagca tcagcgtcac gatggtttca ccctctggca ggcaggggca gatgacgcgc 300

ttgcattgtc caaatcgtta a 321

<210> 4

<211> 969

<212> DNA

<213> 合成

<400> 4

atgttaagaa tagcgaatga agagcgtccg tgggtggaga tgcttccaac gcaaggcgct 60

accattggtg agctgacatt gagtatgcaa caatatccag tacagcaagg gacattattt 120

accataaatt atcataatga gctgggtagg gtgtggattg cagaacaatg ctggcagcgc 180

tggtgtgaag ggttaattgg caccgctaat cgatcggcta tcgatcctga attgctatat 240

ggaatagctg aatgggggct ggcgccgtta ttgcaagcca gtgatgccac cctctgtcag 300

aacgaaccgc caacatcctg cagtaatcta ccacatcagc tagcgttgca tattaaatgg 360

atagttgaag aacatgagtt ccatagcatt atttttacat ggccaacggg ttttttgcgc 420

aatatagtcg gagagctttc tgctgagcgt caacagattt atcctgctcc tcctattgta 480

gtccctgtat atttaggctg gtgccagctt acattaattg aacttgagtc tatcgaaatc 540

ggcatgggcg ttcggattca ttgctttggc gacatcagac tcggtttttt tgctattcaa 600

ctaccagggg gaatctacgc aagggtattg ctgacagagg ataacacgat gaaatttgac 660

gaattagtcc aggatatcga aacgctactt gcgtcaggga gcccaatgtc aaagagtgac 720

ggaacgtctt cagtcgaact tgagcagata ccacaacagg tgctctttga gatcggacgt 780

gcgagtctgg aaattggaca attacggcaa cttaaaacgg gggacgtttt gcctgtaggt 840

ggatgttttg cgccagaggt gacgataaga gtaaatgacc gtattattgg gcaaggtgag 900

ttgattgcct gtggcaatga atttatggtg cgtattacac gttggtatct ttccaaaaat 960

acagcgtaa 969

<210> 5

<211> 417

<212> DNA

<213> 合成

<400> 5

atgaaacgct tactacttat tacggctttg ttaccctttg ctgtattggc ccagccaatt 60

aacactatga ataatcctaa tcagccaggt tatcagatcc ccagccagca gcgtatgcag 120

acgcagatgc aaacgcagca gattcagcag cagggtatgt tgaaacaaca gatgcaaacg 180

caggcgcgca gccagcagca aaatctacag tcgcagttga atgccaatac gcagcgggtt 240

cagcagggac agccgggcaa cggtatgctc ggtcagcaaa cgctgcccaa tacgcagggc 300

ggaatgctca gcggcagcgg aaatccggac cggatgctaa accattccca gccaatgttg 360

cagcagggca gcgggacgcc gcagcctgac atcccgctga aaaccatcag cccttaa 417

<210> 6

<211> 291

<212> DNA

<213> 合成

<400> 6

gtggaatcat tgctaaaatc tgaagttatt agcgacgatg ttcgacggtt gctgctggaa 60

atcatgtttg cgggcgttaa ccatagcctg atttcccagg tacatgcgat gttaccagcg 120

ctaacggtta ttgttccgga taaaaaatta cagttggtat gtctggcatt attgttggcg 180

ggtttaaatg agccgctaaa agccgcgaaa attttatcgg atattgattt gccagaggct 240

atggcgctgc gtctgttatt tcctgcacca aatgaggggt ttgaaaattg a 291

<210> 7

<211> 375

<212> DNA

<213> 合成

<400> 7

atgcgtatta ccaaagttga aggaagtcta gggttgccat gccagtctta tcaggatgat 60

aacgaggcgg aggcggaacg tatggacttt gaacaactca tgcaccaggc attacccatt 120

ggtgagaata atcctcctgc agcattgaat aagaacgtgg ttttcacgca acgttatcgt 180

gttagtggcg gttatcttga cggtgtagag tgtgaagtat gtgaatcagg ggggctaatc 240

cagttaagaa tcaatgtccc tcatcatgaa atttaccgtt cgatgaaagc gctaaagcag 300

tggctggagt ctcagttgct gcatatgggg tatataattt ccctggagat attctatgtt 360

aagaatagcg aatga 375

<210> 8

<211> 552

<212> DNA

<213> 合成

<400> 8

atgcgcctgc ttccggaact cgccacctgt cacgacgttt ctattcctga gctgctcgcc 60

agccgggatg agagacaagc aagacagcgc gcctggctaa cacgccacgc cactccgctg 120

gtctccttta ccgtggtggc gccaggcccg atgaaagaca gcgcgttaac ccgccggatc 180

tttaatcacg gcgtgactgc cctgcacacg ctggcagaag agtatggctg gaccatccgg 240

gagcaggctg cactggcttc cgccagcggg ccggaagggc tgctggcgat tgacgcgccc 300

gctcaggcgc tcaaacaggc gaccatcgcg ctggaacagc gttatccact ggggcgtctg 360

tgggatatcg atgtcctgac ggcggaaggc gaaatactct cccgccgcca tttcgcgctt 420

cccgctcgcc gctgtctgct gtgcgggcaa agcgcggctg aatgcgcgcg gggtaaaacc 480

cacgcgctga ctgatttact gattcatatg gaggcgctgc tgcatgatgc cgattcccgc 540

caacccgact aa 552

<210> 9

<211> 378

<212> DNA

<213> 合成

<400> 9

atggaaactt tgctggagat aatcgcgcgg cgtgaaaagc aattacgcgg caaacttacc 60

gtacttgatc agcagcaaca ggcgattatt acggaacagc agatttgcca gacgcgcgtt 120

ttagcagtga ctaccagact gaaagaatta atgggctggc aaggtacgtt atcttgtcat 180

ttattgttgg ataagaaaca acaaatggcc ggactattca cacaggcgca gagctttttg 240

acgcaacggc agcagttaga aaatcagtat cagcagcttg tctcccggcg aagcgaatta 300

cagaagaatt ttaatgcgct tatgaaaaag aaagaaaaaa ttactatggt attaagcgat 360

gcgtattacc aaagttga 378

<210> 10

<211> 435

<212> DNA

<213> 合成

<400> 10

atgatgatga aagaagatca gaaaaataaa atacccgaag acattctgaa acagctatta 60

tccgttgatc cggaaaccgt ttatgccagt ggttacgcct catggcagga gggggattat 120

tcgcgcgccg taatcgattt tagctggctg gtgatggccc agccatggag ttggcgtgcc 180

catattgcat tggctggcac ctggatgatg cttaaagaat acacgacggc cattaatttc 240

tatggacatg ccttgatgct ggatgccagc catccagaac cggtttacca aacgggcgtc 300

tgtctcaaaa tgatggggga acccgggttg gcgagagagg cttttcaaac cgcaatcaag 360

atgagttatg cggatgcctc atggagtgag attcgccaga atgcgcaaat aatggttgat 420

actcttattg cttaa 435

<210> 11

<211> 267

<212> DNA

<213> 合成

<400> 11

atgaatgatt ctgaattgac gcaatttgta acgcaacttt tatggatcgt cctgtttacg 60

tctatgccgg tggtgttggt ggcatcggta gttggtgtca tcgtaagcct tgttcaggcc 120

ttgactcaaa tacaggacca aacgctacag ttcatgatta aattattggc aattgcaata 180

accttaatgg tcagctaccc atggcttagc ggtatcctgt tgaattatac ccggcagata 240

atgttacgaa ttggagagca tggttga 267

<210> 12

<211> 216

<212> DNA

<213> 合成

<400> 12

atggatattg cacaattagt ggatatgctc tcccacatgg cgcaccaggc aggccaggcc 60

attaatgaca aaatgaatgg taatgatttg ctcaacccag aatcgatgat taaagcgcaa 120

tttgccttac agcagtattc tacatttatt aattacgaaa gttcactgat caaaatgatc 180

aaggatatgc ttagtggaat cattgctaaa atctga 216

<210> 13

<211> 780

<212> DNA

<213> 合成

<400> 13

atggcacaac aggtaaatga gtggcttatt gcattggctg tggcttttat tcgaccattg 60

agcctctctt tattacttcc cctattaaaa agtggcagtt tagggtccgc gcttttacgt 120

aatggcgtgc ttatgtcact tacctttccc atcttaccaa tcatttacca gcagaagatt 180

atgatgcata ttggtaaaga ttacagttgg ttagggttag tcaccggaga ggtgattatt 240

ggttttttaa ttgggttttg tgcggcggtt cccttttggg ccgttgatat ggcggggttt 300

ctgcttgata ctttacgtgg cgcgacaatg ggtacgatat tcaattctac aatggaagct 360

gaaacctcac tttttggctt gcttttcagc cagtttttgt gtgttatttt ctttataagc 420

ggcggcatgg agtttatatt aaacattctg tatgagtcat accaatattt accaccgggg 480

cgtactttat tatttgatcg gcaattttta aaatatatcc aggcagagtg gagaacgctt 540

tatcaattat gtgtcagttt ctctcttcct gccataatat gtatggtatt agccgatctg 600

gctttaggtc ttttaaatcg gtcggcacaa caattgaatg tgtttttctt ctcaatgccg 660

ctcaaaagta tattagttct actgacgctc ctgatctcat tcccttatgc tcttcatcac 720

tatttggttg aaagcgataa attttatatt tatctgaaag actggttccc atctgtatga 780

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 14

atgacgccgc aactcacctg 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 15

aagtacgtct tcgggcaagt 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 16

atgcggtgaa tttctgttct 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 17

cgccatcccg gaatgattct 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 18

gttttagtgg cgatggttct 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 19

catcccgatt gcgttgtctg 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 20

tccagtacag caagggacat 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 21

cacaggcaat caactcacct 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 22

atcctaatca gccaggttat 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 23

gatggttttc agcgggatgt 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 24

ctgaagttat tagcgacgat 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 25

ctggcaaatc aatatccgat 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 26

aggaagtcta gggttgccat 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 27

ataccccata tgcagcaact 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 28

gacgtttcta ttcctgagct 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 29

cgcctccata tgaatcagta 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 30

atggaaactt tgctggagat 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 31

ctttggtaat acgcatcgct 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 32

tgccagtggt tacgcctcat 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 33

tctggcgaat ctcactccat 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 34

acgcaatttg taacgcaact 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 35

aaccatgctc tccaattcgt 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 36

taatgatttg ctcaacccag 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 37

gattccacta agcatatcct 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 38

ggcacaacag gtaaatgagt 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 39

agagcataag ggaatgagat 20

Claims

1.一组用于检测沙门氏菌的分子靶标组合作为被检测靶标在鉴别沙门氏菌中的应用，其特征在于，所述分子靶标组合包括如SEQ ID NO.1~13所示的核苷酸序列，所述应用为非疾病诊断和治疗目的应用；

所述沙门氏菌为S. Enteritidis、S. Typhimurium、S. Rissen、S. Virchow、S. Senftenberg、S. Meleagridis、S. Pomona、S. Albany、S. Indiana、S.Derby、S. London、S. Istanbul、S. Stanley、S. Newport、S. Weltevreden、S. Thompson、S. Wandsworth、S. Infantis、S. Lomita、S. Agona、S. Saintpaul、S. Hadar、S. Corvallis、S. Kottbus、S. Kentucky、S. Aberdeen、S. Litchfield、S. Montevideo、S. Give、S. Singapore、S. Mbandaka、S. Riggil、S. Lagos、S. Heidelberg、S. Eingedi、S. Bareilly、S. Manhattan、S. Potsdam、S. Tallahassee、S. Braenderup、S. Muenster或S. Chailey。

2.一组用于检测如权利要求1所述的用于检测沙门氏菌分子靶标组合的引物组，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.14~39所示；

检测如SEQ ID NO.1所示的核酸分子靶标的引物如SEQ ID NO.14~15所示；检测如SEQID NO.2所示的核酸分子靶标的引物如SEQ ID NO.16~17所示；检测如SEQ ID NO.3所示的核酸分子靶标的引物如SEQ ID NO.18~19所示；检测如SEQ ID NO.4所示的核酸分子靶标的引物如SEQ ID NO.20~21所示；检测如SEQ ID NO.5所示的核酸分子靶标的引物如SEQ IDNO.22~23所示；检测如SEQ ID NO.6所示的核酸分子靶标的引物如SEQ ID NO.24~25所示；检测如SEQ ID NO.7所示的核酸分子靶标的引物如SEQ ID NO.26~27所示；检测如SEQ IDNO.8所示的核酸分子靶标的引物如SEQ ID NO.28~29所示；检测如SEQ ID NO.9所示的核酸分子靶标的引物如SEQ ID NO.30~31所示；检测如SEQ ID NO.10所示的核酸分子靶标的引物如SEQ ID NO.32~33所示；检测如SEQ ID NO.11所示的核酸分子靶标的引物如SEQ IDNO.34~35所示；检测如SEQ ID NO.12所示的核酸分子靶标的引物如SEQ ID NO.36~37所示；检测如SEQ ID NO.13所示的核酸分子靶标的引物如SEQ ID NO.38~39所示；

3.一种检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求2所述的引物组。

4.如权利要求3所述的检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：2×PCR Mix、模板DNA、上下游引物和灭菌双蒸水。

5.一种非诊断和治疗目的的检测沙门氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）使用如权利要求2所述的引物组对检测样本进行PCR扩增；

（2）将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析；若核苷酸序列如SEQ ID NO.14-15所示引物的扩增产物的电泳结果出现285bp的条带、核苷酸序列如SEQ ID NO.16-17所示引物的扩增产物的电泳结果出现182bp的条带、核苷酸序列如SEQ ID NO.18-19所示引物的扩增产物的电泳结果出现197bp的条带、核苷酸序列如SEQ ID NO.20-21所示引物的扩增产物的电泳结果出现818 bp的条带、核苷酸序列如SEQ ID NO.22-23所示引物的扩增产物的电泳结果出现335bp的条带、核苷酸序列如SEQ ID NO.24-25所示引物的扩增产物的电泳结果出现216bp的条带、核苷酸序列如SEQ ID NO.26-27所示引物的扩增产物的电泳结果出现313bp的条带、核苷酸序列如SEQ ID NO.28-29所示引物的扩增产物的电泳结果出现483bp的条带、核苷酸序列如SEQ ID NO.30-31所示引物的扩增产物的电泳结果出现374bp的条带、核苷酸序列如SEQ ID NO.32-33所示引物的扩增产物的电泳结果出现317bp的条带、核苷酸序列如SEQ ID NO.34-35所示引物的扩增产物的电泳结果出现247bp的条带、核苷酸序列如SEQ ID NO.36-37所示引物的扩增产物的电泳结果出现121bp的条带、或核苷酸序列如SEQID NO.38-39所示引物的扩增产物的电泳结果出现711bp的条带则判定样品中含有所述沙门氏菌；若未出现目标大小的条带则判定检测样品中不含有所述沙门氏菌；

6.如权利要求5所述的检测沙门氏菌的方法，其特征在于，PCR的反应体系为25 μL，包括：2×PCR Mix 12.5 μL、模板DNA 1 μL、10 μM上下游引物各1.0 μL，灭菌双蒸水补足体积至25 μL。

7.如权利要求5所述的检测沙门氏菌的方法，其特征在于，PCR的反应程序为95ºC预变性5 min；95ºC变性30 s；58ºC退火30 s；72ºC延伸30 s，共进行35个循环；72ºC延伸10 min。