CN107988401A - 沙门氏菌干粉化lamp快速检测试剂盒 - Google Patents

沙门氏菌干粉化lamp快速检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了沙门氏菌干粉化LAMP快速检测试剂盒，该试剂盒由干粉化检测试剂、复溶液、阳性对照干粉、阴性对照干粉、封闭液、显色液和裂解液组成，以上7种试剂分别置于容器中。应用于本试剂盒中的6条引物对应沙门氏菌特异性靶基因序列的8个区段，通过加入显色液，阴阳性显色差异明显，具有特异性强、灵敏度高、易于操作、结果判断简单等优点，适合于食品安全和医药卫生领域中的沙门氏菌快速检测。另外，本发明为干粉化的检测试剂，便于常温运输，且使用简单、快捷，无需专门仪器，降低成本并拓宽产品应用范围，更适用于现场及偏远地区基层对沙门氏菌的快速检测，具有广泛的应用前景。

Description

沙门氏菌干粉化LAMP快速检测试剂盒
技术领域
本发明涉及微生物分子生物学检测试剂，具体涉及一种基于LAMP技术的干粉化沙门氏菌核酸快速检测试剂盒。
背景技术
沙门氏菌(Salmonella)是肠杆科中一种重要的人畜共患的革兰氏阴性菌病原菌。动物源性沙门氏菌易引起摄食者急性腹泻，甚至暴发食物中毒，导致胃肠炎、伤寒以及副伤寒，其中肉类和家禽类是沙门氏菌传播的主要媒介。近年来，沙门氏菌在全球范围内引起的危害呈上升趋势，在公共卫生学上，在食物中如何快速、准确、特异地检测沙门氏菌存在与否，具有重要意义。由于沙门氏菌血清型较多，其各类生化反应复杂，目前已建立了多种沙门氏菌检测方法，其中主要是采用传统培养基法，包括病原微生物分离鉴定、形态学鉴定和自动化鉴定方法。另外也有酶联免疫技术、核酸探针技术、核酸扩增技术等分子生物学检测方法，这些技术试图突破传统的形态学、生化反应等传统模式，不需要对沙门氏菌进行分离提纯，而直接用样品或者样品的增菌液检测，使得检测向准确、快速和低成本方向发展。
LAMP技术是由2000年由日本研究人员Notomi等开发的一种新型的核酸体外恒温扩增特异片段的分子检测技术。该技术利用两对特殊引物和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶。使反应中在模板两端引物结合处循环出现环状单链结构，在恒温条件下使引物顺利与模板结合并进行链置换扩增反应，与常规PCR相比，无需反复变温、电泳判读等过程，在灵敏度、特异性和检测范围等技术指标上能媲美甚至高于PCR技术，而不依赖专门的仪器可以实现现场的快速检测，其成本远低于荧光定量PCR。而在实际的应用中，如果在非实验室的条件下利用LAMP技术进行快速检测，检测前都要配制相应的反应体系溶液，容易造成由于多次操作引起的误差，且易造成实验区间的交叉污染，检测所需的部分试剂需要冷冻储存，不适合高温长途运输，尤其是Bst DNA聚合酶，需要在-20℃条件下保存，不宜反复冻融，以免影响酶活，因此会增加试剂的运输成本。目前该检测方法作为非标方法，尚未在食品安全、医药等领域推广开来，已有的LAMP产品仅仅针对检测流程，涉及到样品前处理的方式均无提及，加之市场上基于LAMP技术的沙门氏菌快速检测试剂盒较少，且能用于常温运输的干粉型同类产品尚未出现。
发明内容
本发明的目的在于针对现有沙门氏菌的传统致病微生物检测技术以及其相关产品制备工艺的不足，提供一种基于LAMP技术可常温运输的干粉化沙门氏菌快速检测试剂盒以及其制备使用方法。该试剂盒和使用方法涵盖从取样到检测的整体解决方案，可满足相关食品的生产、流通中各个环节的快速检测的需求。
本发明所采取的技术方案是：
一种沙门氏菌的LAMP引物组，包括外引物F3/B3、内引物FIP/BIP以及环引物LF/LB，其序列如下：
沙门氏菌-F3：cagttagaattaggtcttgacg
沙门氏菌-B3：cttttcgtggcaaaaatcct
沙门氏菌-FIP：tccgcgacacgttctgaaccctctattgtcaccgtggtcc
沙门氏菌-BIP：tgccgatttgaaggccggtacagtacgcttcgccgttc
沙门氏菌-LF：cctttggtaataacgataaactgg
沙门氏菌-LB：tattgatgcggatgccgcgcg。
一种沙门氏菌的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其LAMP引物组如上所示。
作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，检测试剂盒包括干粉化的检测试剂、复溶液、阳性对照干粉、阴性对照干粉、显色液、裂解液和封闭液。
作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，干粉化的检测试剂冻干前含有0.9～1.6mmol/L dNTPs、0.3～0.4U/μLBst DNA聚合酶、0.1～0.5μmol/L外引物F3/B3、1.0～2.0μmol/L内引物FIP/BIP、0.5～1.5μmol/L环引物LF/LB以及含3％～6％海藻糖(w/v)、0.01％～0.1％甘氨酸(w/v)、0.1％～1％牛血清白蛋白的冻干复合保护剂，余量为无菌超纯水。冻干复合保护剂优选含3％～5％海藻糖(w/v)、0.01％～0.1％甘氨酸(w/v)、0.1％～1％牛血清白蛋白。特别的，冻干复合保护剂为：3％海藻糖(w/v)、0.01％甘氨酸(w/v)、0.1％牛血清白蛋白。
作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，复溶液含有2～9mmol/LMgSO4、8～12mmol/L KCl、15～20mmol/L Tris-HCl、8～12mmol/L(NH4)2SO4、0.1～0.3％Triton X-100以及0.5～1.5mol/L甜菜碱。
作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，显色液由0.3～1.5mmol/L的钙黄绿素和2.4～7.2mmol/L的MnCl2按照混合得到，钙黄绿素的终浓度为15～75μmol/L，MnCl2的终浓度为120～360μmol/L。
作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，裂解液含有：10～20mmol/LTris-HCl pH 8.3、1mmol/L EDTA、0.3～1％SDS。
作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，封闭液为无菌石蜡油。
作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，阳性对照干粉为提纯的沙门氏菌基因组DNA制成的冻干粉，阴性对照干粉为提纯的非沙门氏菌基因组DNA制成的冻干粉。
作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，，使用方法包括如下步骤：
(1)取25g待检样品氯化镁孔雀绿增菌液(RV)，增菌时间为10h±2h，对增菌液中的菌体富集用于LAMP快速检测；
(2)取以上1～2mL增菌液6000r/min离心，去上清；
(3)分别向(2)中离心得到沉淀中加入裂解液，充分悬浮，水浴或者金属浴99℃热裂解10min，裂解结束后12000r/min离心15min，上清即为待检样品粗提核酸；
(4)取n个冻干粉管(n＝待检测样品数+1管阳性对照+1管阴性对照)，向冻干粉管内加入复溶液，待冻干粉充分溶解后，待检测的样品核酸加入反应管中，对照管分别加入经无菌超纯水溶解的沙门氏菌基因组DNA作为阳性对照，以经无菌超纯水溶解的非沙门氏菌基因组DNA作为阴性对照，后按照一定比例加入显色液，充分混匀后加入封闭液，设置65℃恒温反应；
(5)反应后结果判读：反应结束后，建议在自然光线充足的环境条件下，将样品置于白色背景下观察结果，阴性对照反应管呈淡橙色，阳性对照反应管呈荧光绿，待测样品反应管以此作为对照进行判读，若阴阳对照反应管任一结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测。
本发明的有益效果是：
本试剂盒基于LAMP技术快速检测沙门氏菌，是利用3对特殊引物和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，特异性识别靶序列上的8个独立区域，并实现在恒温条件下(60～65℃)进行链置换扩增反应，克服了传统PCR反应需要通过热变性过程获得单链模板、检测时间长、易污染以及成本高等缺点，同时该方法在温和温度条件进行，操作简便，对检测人员的技术素质要求也低，便于对大样本实现成本低廉的快速筛选。目前国内主要以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化鉴定和血清学分型鉴定等通行方法进行食品微生物学相关检验，其初步鉴定一般需要2～3天，而最终完成鉴定报告则需5～7天，但采用本试剂盒检测从收集样本到检测完成仅需12～14小时，且本试剂盒采用钙黄绿素显色液，使得通过肉眼即可判读结果，更加直观清晰。
①该试剂的干粉化制备工艺加入复合冻干保护剂，大大增加试剂稳定性，试剂的保质期时间可以延长到2年，且便于常温运输，节约运输成本；②该干粉化试剂已将反应体系中部分组分试剂按相应比例组合，并经复溶液即溶即用，减少溶液配置步骤，使用更加便捷、准确，更适于基层现场检测；③该反应过程在恒温条件下即可进行，无需特殊配套试剂以及仪器，大大降低了检测成本；④反应所需模板量少，灵敏度高，最低检验限可低至35CFU/Test；⑤利用靶基因序列的3对特殊引物，特异性地识别靶序列上的8个独立区域，整个反应在30～45min内完成，高效而快速；⑥反应前加入由钙黄绿素和氯化锰混合的显色液，通过肉眼观察颜色变化或者荧光监测仪器对荧光图谱的变化对结果进行判读，判读直观方便，且避免反应后开盖造成的气溶胶污染。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
引物的筛选
表1、不同的引物组序列表
引物序列的编号如下：
表2、引物组的序列编号表
对以上6组引物采取统一的优化反应体系测试，经琼脂糖凝胶电泳观察反应产物，发现引物组2仅需反应30min即可出现明显扩增条带，而引物组1和引物组6需40min左右，引物组3、引物组4和引物组5需45min左右。
试剂盒的制备
(1)引物合成：按照引物组2提供的序列合成寡聚核苷酸引物，并定量配制。
(2)制备该试剂冻干粉：按照表3所示在无菌环境下混合需要冻干处理的相关组分混合液，封装于容器中，置于液氮预冻后再按照常规冷冻干燥，最后可得到干粉化的检测试剂。
表3
(3)制备复溶液：按照表4所示在无菌环境下混合复溶液混合液，置于容器中。
表4
组分 终浓度
KCl 8mmol/L
Tris-HCl,，pH 8.8 16mmol/L
(NH4)2SO4 9mmol/L
MgSO4 6mmol/L
Triton X-100 0.2％
甜菜碱 1.2mol/L
(4)制备阳性对照干粉：向提纯的沙门氏菌基因组DNA溶液分别加入3％的海藻糖(w/v)，分装后经上述冻干程序制备阳性对照干粉。
(5)制备阴性对照干粉：向提纯的非沙门氏菌基因组DNA溶液分别加入3％的海藻糖(w/v)，分装后经上述冻干程序制备阴性对照干粉。
(6)配制显色液：由0.3mmol/L钙黄绿素和7.2mmol/LMnCl2等体积混合得到，钙黄绿素的终浓度为15μmol/L，MnCl2的终浓度为360μmol/L，置于容器中。
(7)将封闭液液体石蜡油无菌分装，置于容器；
(8)配制裂解液：含有10～20mmol/L Tris-HCl，pH 8.3、1mmol/L EDTA、0.3～1％SDS，置于容器中。
(9)组装试剂盒，提供使用说明书，封装。
稳定性试验
根据上述试剂冻干粉制备获取9例不同组分的试剂冻干粉，并相应地组装成9种不同的试剂盒，存放于2～8℃环境中，每隔3个月对该9种试剂盒产品进行灵敏度试验，结果见表5。
表5、不同实例检测试剂的稳定性数据
采用例9复合冻干保护剂进行反应试剂的冻干，经过液氮预冻和冷冻干燥后，试剂冻干粉能保持较高的稳定性，最长的保质期时间为21～24个月，远高于同类型产品的12个月保质期，在保存12个月后，其检验限略有下降，部分检测试剂出现了失活的情况。除含5％海藻糖的复合保护剂有吸潮现象外，其余复合保护剂冻干成粉状制剂后在各自保质期范围内均保持良好形态，没有塌陷和镂空现象。
最低检验限和灵敏度的比较
(1)用无菌接种环分别挑取福氏沙门氏菌CMCC(B)50093的纯菌菌落，用无菌生理盐水进行梯度稀释(稀释倍数分别为100，101，102，103，104，105，106，107，108)，并分别取各个稀释菌液100μL螺旋接种到TSA平板进行培养和计数；
(2)分别取以上稀释菌液100μL，6000r/min离心5min，弃上清，加入10μL裂解液充分悬浮菌体沉淀，99℃加热裂解菌体10min，菌体裂解液12000r/min离心15min，取上清即为粗提的菌体模板基因；
(3)以上粗提DNA为模板进行PCR和LAMP反应，沙门氏菌PCR引物为：PF-5’-cgtcgtactagcgcgggccttga-3’(SEQ ID NO：37)，PR-5’-actcgtagctgccctatgacc-3’(SEQID NO：38)；
(4)扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，72℃延伸10min，35个循环；
(5)以上粗提DNA为模板进行LAMP反应，取出干粉化检测反应管，每管分别加入上述复溶液20μL，待管中干粉完全溶解，分别加入以上各个稀释菌液对应的粗提DNA模板2.5μL，无菌超纯水2.5μL，充分混匀后加入20μL/管封闭液，紧盖，设置65℃恒温反应45min；
(6)以上PCR与LAMP扩增产物用琼脂糖凝胶电泳来判读，平板菌落计数确定最低检验限。
结果：琼脂糖凝胶电泳结果显示沙门氏菌PCR的最低检验限在105倍数稀释处，LAMP最低检验限制在106倍数稀释处。并参照GB 4789.2-2016《食品微生物学检验菌落总数测定》，测定对应的菌落计数，结果沙门氏菌在106倍数稀释处为35CFU，显示LAMP检测的灵敏度远高于PCR。
纯菌的检测
(1)样品处理
用于纯菌的筛选鉴定中，用接种环挑取各菌的单菌落半环，转移到含有30μL裂解液的无菌PCR管中，充分混匀后水浴或者金属浴99℃热裂解10min；裂解结束后转到离心机中12000r/min离心10min，取上清即为样品粗提基因组DNA，选用的菌株见表6。
表6
(2)恒温扩增反应
取出干粉化检测反应管，每管分别加入上述复溶液20μL，待管中干粉完全溶解，分别加入以上各类菌粗提的DNA模板2.5μL，其中，取1管作为阴性对照，1管作为阳性对照，分别加入对应的对照试剂2.5μL，后分别向所有各管中加入显色液2.5μL，充分混匀后加入20μL封闭液，紧盖，经Biometra professional PCR仪设置65℃恒温反应45min。
(3)反应后判读
反应结束后，对比反应前后颜色变化，若呈现荧光绿则为阳性，淡橙色则为阴性，若阴阳性对照反应管结果与上述任一情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测，整个观察过程不得打开反应管盖。检测结果见表7。
表7
结果，经本发明检测，以上所选的沙门氏菌和非沙门氏菌的核酸快速检测中，沙门氏菌的标准菌株和分离株在各自的反应液中出现明显荧光绿，而非沙门氏菌属各菌反应前后均未出现明显颜色变化，仍为淡橙色，可见本发明具有极好的特异性，能有效检出沙门氏菌。
常规食品中沙门氏菌的快速检测
(1)样品处理，取25g待检样品氯化镁孔雀绿增菌液(RV)，37±1℃增菌10h±2h；吸增菌液1mL到1.5mL规格的无菌离心管中，6000r/min离心5min，弃上清；加入30μL裂解液，充分悬浮菌体，轻弹管壁消除气泡，99℃加热10min，12000r/min离心15min，上清即为粗提的DNA；
(2)恒温扩增反应，取出干粉化检测反应管，每管分别加入上述复溶液20μL，待管中干粉完全溶解，分别加入以上各样品粗提的DNA模板2.5μL；另取2管分别做阴性对照和阳性对照，分别加入对应的对照试剂2.5μL，后分别向所有各管中加入显色液2.5μL，充分混匀后加入20μL封闭液，紧盖，设置Biometra professional PCR仪至65℃恒温反应45min；
(3)反应结束后，观察反应管中溶液由检测前的淡橙色变为荧光绿色，与阳性对照管变化相同，表示有沙门氏菌检出，如颜色无变化，表示无检出。
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<110> 广东环凯微生物科技有限公司
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atcgtcagca catgcgctac g 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 24
gcatcgtagc ccgtagctac g 21
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 25
gtgcgacgtg cvaacgcgcc c 21
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 26
tgcgagctag ctagcaacgg 20
<210> 27
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<212> DNA
<213> 人工引物
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tgcagctagc tagcccgtag cccgtagctt gcacgcac 38
<210> 28
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<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 28
cgtagctctc gagctagcgc tgcacgtccg cgactcgc 38
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<212> DNA
<213> 人工引物
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cgtcgacgat gcgcgtgccc 20
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<212> DNA
<213> 人工引物
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atgctgatgc tgcccgcgcc gtc 23
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工引物
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gttcctagct agcttgcgct ag 22
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<212> DNA
<213> 人工引物
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<212> DNA
<213> 人工引物
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cgcgctgagc ttcgcgccgt gaccgcvtga cgccctgc 38
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<212> DNA
<213> 人工引物
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cgtagctagt cgcgcgtagc tccgtgcacg cacgccg 37
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<212> DNA
<213> 人工引物
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<213> 人工引物
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<212> DNA
<213> 人工引物
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cgtcgtacta gcgcgggcct tga 23
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<212> DNA
<213> 人工引物
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actcgtagct gccctatgac c 21

Claims (10)

1.一种沙门氏菌的LAMP引物组，包括外引物F3/B3、内引物FIP/BIP以及环引物LF/LB，其特征在于：其序列如下：
沙门氏菌-F3：cagttagaattaggtcttgacg
沙门氏菌-B3：cttttcgtggcaaaaatcct
沙门氏菌-FIP：tccgcgacacgttctgaaccctctattgtcaccgtggtcc
沙门氏菌-BIP：tgccgatttgaaggccggtacagtacgcttcgccgttc
沙门氏菌-LF：cctttggtaataacgataaactgg
沙门氏菌-LB：tattgatgcggatgccgcgcg。
2.一种沙门氏菌的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：其LAMP引物组如权利要求1所示。
3.根据权利要求1所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：检测试剂盒包括干粉化的检测试剂、复溶液、阳性对照干粉、阴性对照干粉、显色液、裂解液和封闭液。
4.根据权利要求3所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：干粉化的检测试剂冻干前含有0.9～1.6mmol/L dNTPs、0.3～0.4U/μLBst DNA聚合酶、0.1～0.5μmol/L外引物F3/B3、1.0～2.0μmol/L内引物FIP/BIP、0.5～1.5μmol/L环引物LF/LB以及含3％～6％海藻糖(w/v)、0.01％～0.1％甘氨酸(w/v)、0.1％～1％牛血清白蛋白的冻干复合保护剂，余量为无菌超纯水。
5.根据权利要求3所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：复溶液含有2～9mmol/L MgSO4、8～12mmol/L KCl、15～20mmol/L Tris-HCl、8～12mmol/L(NH4)2SO4、0.1～0.3％Triton X-100以及0.5～1.5mol/L甜菜碱。
6.根据权利要求3所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：显色液由0.3～1.5mmol/L的钙黄绿素和2.4～7.2mmol/L的MnCl2按照混合得到，钙黄绿素的终浓度为15～75μmol/L，MnCl2的终浓度为120～360μmol/L。
7.根据权利要求3所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：裂解液含有：10～20mmol/L Tris-HCl pH 8.3、1mmol/L EDTA、0.3～1％SDS。
8.根据权利要求3所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：封闭液为无菌石蜡油。
9.根据权利要求3所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：阳性对照干粉为提纯的沙门氏菌基因组DNA制成的冻干粉，阴性对照干粉为提纯的非沙门氏菌基因组DNA制成的冻干粉。
10.根据权利要求3所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：使用方法包括如下步骤：
(1)取25g待检样品氯化镁孔雀绿增菌液(RV)，增菌时间为10h±2h，对增菌液中的菌体富集用于LAMP快速检测；
(2)取以上1～2mL增菌液6000r/min离心，去上清；
(3)分别向(2)中离心得到沉淀中加入裂解液，充分悬浮，水浴或者金属浴99℃热裂解10min，裂解结束后12000r/min离心15min，上清即为待检样品粗提核酸；
(4)取冻干粉管，向冻干粉管内加入复溶液，待冻干粉充分溶解后，待检测的样品核酸加入反应管中，对照管分别加入经无菌超纯水溶解的沙门氏菌基因组DNA作为阳性对照，以经无菌超纯水溶解的非沙门氏菌基因组DNA作为阴性对照，后按照一定比例加入显色液，充分混匀后加入封闭液，设置65℃恒温反应；
(5)反应后结果判读：反应结束后，建议在自然光线充足的环境条件下，将样品置于白色背景下观察结果，阴性对照反应管呈淡橙色，阳性对照反应管呈荧光绿，待测样品反应管以此作为对照进行判读，若阴阳对照反应管任一结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测。
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