CN106544443A

CN106544443A - 铜绿假单胞菌干粉化lamp快速检测试剂盒及其使用方法

Info

Publication number: CN106544443A
Application number: CN201611261312.3A
Authority: CN
Inventors: 万强; 吴清平; 周杨; 卢勉飞; 曲晓莹; 杨宁; 蔡芷荷
Original assignee: Guangdong Huankai Microbial Sci and Tech Co Ltd; Guangdong Huankai Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Guangdong Huankai Microbial Sci and Tech Co Ltd; Guangdong Huankai Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2016-12-30
Filing date: 2016-12-30
Publication date: 2017-03-29
Anticipated expiration: 2036-12-30
Also published as: CN106544443B

Abstract

本发明公开了铜绿假单胞菌干粉化LAMP快速检测试剂盒及基于其的快速检测方法。试剂盒包括冻干等温扩增剂，复溶液、阳性对照干粉、阴性对照、显色液、裂解液和封闭液，冻干等温扩增剂中含有dNTPs、Bst DNA聚合酶、扩增引物和冻干保护剂。本试剂盒中的引物对应铜绿假单胞菌特异性基因序列的八个区段，反应后加入显色液，阴阳性显色差异明显，具有特异性强、灵敏度高、易于操作、结果判断简单等优点，适合于食品安全、饮料、水、化妆品以及其它的原辅材料质量控制安全快速检测。本发明试剂盒便于常温运输，使用简单、快捷，无需专门仪器，降低成本并拓宽产品应用范围，更适用于现场快速检测以及基层偏远地区相关检测，具有广泛的应用前景。

Description

铜绿假单胞菌干粉化LAMP快速检测试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及一种干粉化的LAMP快速检测试剂及基于其的快速检测方法，特别涉及一种铜绿假单胞菌干粉化LAMP快速检测试剂盒及基于其的快速检测方法。

背景技术

铜绿假单胞菌是一种常见的水源性致病菌，广泛存在于各类型水中，对消毒剂、干燥、紫外线等理化因素及不良环境具有很强的抵抗力，饮用水以铜绿假单胞菌作为污染指示菌，当铜绿假单胞菌蔓延至全工序的管道、设备时，交叉污染将防不胜防，根据规定包装饮用水水源不得检出铜绿假单胞菌，因此水生产企业应通过检验来判断污染来源并进行有针对性的控制十分重要。现可用于瓶装水中铜绿假单胞菌检验的传统生化方法有涂布法、多试管MPN法和滤膜法，为提高检测效率，也可用酶联免疫技术、核酸探针技术、核酸扩增技术等分子生物学检测方法，进行快速检测和结果初筛。这些技术试图突破传统的形态学、生化反应等传统模式，不需要对目标菌进行分离提纯，而直接用样品或者样品的增菌液检测，使得检测向准确、快速和低成本方向发展。

LAMP技术是2000年由日本研究人员Notomi等开发的一种新型的体外等温扩增特异核酸片段的技术。该技术利用两对特殊引物和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶。使反应中在模板两端引物结合处循环出现环状单链结构，在等温条件下使引物顺利与模板结合并进行链置换扩增反应。LAMP用于快速检测无需复杂仪器，具有结果判读简单、灵敏度高、特异性好、检测范围广泛以及应用成本低的优点。在实际应用中，检测前均要配制相应的溶液反应体系，且其中成分较多，极易导致频繁操作引起的试剂污染、检测区间污染以及结果误差等，加之该反应体系中部分试剂需要冷冻储存，如所需的Bst DNA聚合酶需严格在-20℃条件下保存，温度过高会影响其酶活性，造成检测试剂失效。因此对该试剂的高温长途运输以及现场应用等造成不便，也提高了相应成本。同时，当前该检测方法尚未在食品安全、医药等领域推广开来，尤其在水体的快速检测上，作为非标方法，目前已有的LAMP产品仅仅针对检测流程，涉及到样品前处理的方式均无提及。且市场上基于环介导等温扩增技术的铜绿假单胞菌快速检测试剂盒较少，且能用于常温运输的干粉型同类产品尚未出现。

干粉型LAMP快速检测试剂盒开发的难点主要有以下几个：1)保持冻干过程中BstDNA聚合酶的活力基本不损失；2)设计出合适的引物；3)显色不够明显，难以区分结果。

为了保持Bst DNA聚合酶的活力，添加冻干保护剂是比较常规的选择，常用的冻干保护剂是海藻糖，但是其保护效果比较有限，比较难以保证产品质量。

发明内容

本发明的目的在于提供铜绿假单胞菌干粉化LAMP快速检测试剂盒及基于其的快速检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种应用于水中铜绿假单胞菌的快速检测试剂盒，包括冻干等温扩增剂，复溶液、阳性对照干粉、阴性对照、显色液、裂解液和封闭液，冻干等温扩增剂中含有dNTPs、Bst DNA聚合酶、外引物、内引物、环引物和冻干保护剂，冻干保护剂由海藻糖、甘氨酸和牛血清白蛋白组成。

作为上述快速检测试剂盒的进一步改进，冻干等温扩增剂在冻干前的组成为：0.9～1.6mmol/L dNTPs、0.3～0.4U/μL Bst DNA聚合酶、0.1～0.5μmol/L外引物F3/B3、1.0～2.0μmol/L内引物FIP/BIP、0.5～1.5μmol/L环引物LF/LB以及冻干复合保护剂含3％～6％(w/v)海藻糖、0.01％-0.1％(w/v)甘氨酸、0.1％-1％牛血清白蛋白，余量为无菌超纯水。

作为上述快速检测试剂盒的进一步改进，冻干等温扩增剂在冻干前的组成为：0.9～1.6mmol/L dNTPs、0.3～0.4U/μLBst DNA聚合酶、0.1～0.5μmol/L外引物F3/B3、1.0～2.0μmol/L内引物FIP/BIP、0.5～1.5μmol/L环引物LF/LB以及冻干复合保护剂含4％～5％(w/v)海藻糖、0.04％-0.07％(w/v)甘氨酸、0.4％-0.7％牛血清白蛋白，余量为无菌超纯水。

作为上述快速检测试剂盒的进一步改进，复溶液含有2～9mmol/L MgSO₄、8～12mmol/L KCl、15～20mmol/L Tris-HCl、8～12mmol/L(NH₄)₂SO₄、0.1～0.3％Triton X-100以及0.5～1.5mol/L甜菜碱。

作为上述快速检测试剂盒的进一步改进，外引物F3/B3、内引物FIP/BIP以及环引物LF/LB的序列如下：

铜绿假单胞菌-F3：AGCCAGGCGTTCAATGC

铜绿假单胞菌-B3：GTTGTTACCCAGGCGACG

铜绿假单胞菌-FIP：TCACCTCGCCGAGCCAGTACTGCTTCTGCGCAAGTACCCGA

铜绿假单胞菌-BIP：GGTCAGCCAGAGCTACCCCATCCGCCAGCTTGTACAGAGA

铜绿假单胞菌-LF：GCCGGAGTACTGGCTGT

铜绿假单胞菌-LB：AGCCAGAAGGTGCCCGA。

作为上述快速检测试剂盒的进一步改进，显色液由0.3～1.5mmol/L的钙黄绿素和2.4～7.2mmol/L的MnCl₂混合得到，钙黄绿素的终浓度为15～75μmol/L，MnCl₂的终浓度为120～360μmol/L。

作为上述快速检测试剂盒的进一步改进，裂解液含有：10～20mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)、1mmol/L EDTA、0.3～1％(w/v)SDS。

作为上述快速检测试剂盒的进一步改进，封闭液为液体石蜡。

一种水中铜绿假单胞菌的快速检测方法，包括如下步骤：

1)取水样抽滤，滤膜置于铜绿假单胞菌增菌培养基中增菌培养；

2)增菌培养完成后分离微生物，裂解后提取核酸；

3)将复溶液加入冻干等温扩增剂中，使冻干等温扩增剂完全溶解，得到反应液；

4)按等温扩增操作分别在不同管内的反应液中加入提取得到的样品核酸、阳性对照和阴性对照，反应结束后加入显色液，对结果进行判断。

作为上述快速检测方法的进一步改进，增菌培养基为添加有0.015％(w/v)十六烷三甲基溴化铵的TSB培养基。

本发明的有益效果是：

1)该试剂的干粉化制备工艺加入复合冻干保护剂，大大增加试剂稳定性，试剂的保质期时间可以延长到2年，便于常温运输，节约运输成本，临用前暴露于室温72小时后基本不影响使用效果。

2)该干粉化试剂已将反应体系中部分组分试剂按相应比例组合，并经复溶液即溶即用，减少溶液配置步骤，使用更加便捷、准确，更适于基层现场检测；

3)该反应过程在等温条件下即可进行，无需特殊配套试剂以及仪器，大大降低了检测成本；

4)反应所需模板量少，灵敏度高，最低检验限可低至8CFU/Test；

5)利用靶基因序列设计并筛选三对引物，特异性地识别靶序列上的八个独立区域，具有高度特异性，实现反应在30～45min内完成，高效而快速；

6)通过反应前加入由钙黄绿素和氯化锰按照一定比例混合的显色液，可通过肉眼颜色变化或者荧光监测仪器对荧光图谱的变化对结果进行判读，阴阳性的颜色变化差异明显，判读直观方便，且避免反应后开盖造成的气溶胶污染；

7)铜绿假单胞菌增菌液中加入0.015％(w/v)十六烷三甲基溴化铵，它是一种选择性抑菌剂，作为一种季铵盐阳离子去污剂可释放细菌细胞中的氮和磷而抑制非绿脓杆菌细菌的生长，从而使铜绿假单胞菌增菌效果更好，可提高LAMP检测中铜绿假单胞菌的检出率。

具体实施方式

冻干等温扩增剂在冻干前的组成为：0.9～1.6mmol/L dNTPs、0.3～0.4U/μL BstDNA聚合酶、0.1～0.5μmol/L外引物F3/B3、1.0～2.0μmol/L内引物FIP/BIP、0.5～1.5μmol/L环引物LF/LB以及冻干复合保护剂含3％～6％(w/v)海藻糖、0.01％-0.1％(w/v)甘氨酸、0.1％-1％牛血清白蛋白，余量为无菌超纯水。

冻干等温扩增剂在冻干前的组成为：0.9～1.6mmol/L dNTPs、0.3～0.4U/μLBstDNA聚合酶、0.1～0.5μmol/L外引物F3/B3、1.0～2.0μmol/L内引物FIP/BIP、0.5～1.5μmol/L环引物LF/LB以及冻干复合保护剂含4％～5％(w/v)海藻糖、0.04％-0.07％(w/v)甘氨酸、0.4％-0.7％牛血清白蛋白，余量为无菌超纯水。

复溶液含有2～9mmol/L MgSO₄、8～12mmol/L KCl、15～20mmol/L Tris-HCl、8～12mmol/L(NH₄)₂SO₄、0.1～0.3％Triton X-100以及0.5～1.5mol/L甜菜碱。

外引物F3/B3、内引物FIP/BIP以及环引物LF/LB的序列如下：

铜绿假单胞菌-F3：AGCCAGGCGTTCAATGC

铜绿假单胞菌-B3：GTTGTTACCCAGGCGACG

铜绿假单胞菌-FIP：TCACCTCGCCGAGCCAGTACTGCTTCTGCGCAAGTACCCGA

铜绿假单胞菌-BIP：GGTCAGCCAGAGCTACCCCATCCGCCAGCTTGTACAGAGA

铜绿假单胞菌-LF：GCCGGAGTACTGGCTGT

铜绿假单胞菌-LB：AGCCAGAAGGTGCCCGA。

显色液由0.3～1.5mmol/L的钙黄绿素和2.4～7.2mmol/L的MnCl₂混合得到，钙黄绿素的终浓度为15～75μmol/L，MnCl₂的终浓度为120～360μmol/L。

裂解液含有：10～20mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)、1mmol/L EDTA、0.3～1％(w/v)SDS。也可以使用其他常用的裂解液。

封闭液为液体石蜡。可以使用其他的封闭液。

一种水中铜绿假单胞菌的快速检测方法，包括如下步骤：

2)增菌培养完成后分离微生物，裂解后提取核酸；

本试剂盒基于环介导等温扩增技术快速检测铜绿假单胞菌，是利用三对特殊引物和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，特异性识别靶序列上的八个独立区域，并实现在等温条件下(60～65℃)进行链置换扩增反应，克服了传统PCR反应需要通过热变性过程获得单链模板、检测时间长、易污染以及成本高等缺点，同时该方法在温和温度条件进行，操作简便，对检测人员的技术素质要求也低，便于对大样本实现成本低廉的快速筛选。目前国内主要以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化鉴定和血清学分型鉴定等通行方法进行食品微生物学相关检验，其初步鉴定一般需要2～3天，而最终完成鉴定报告则需10～15天，但采用本试剂盒检测从收集样本到检测完成仅需12～14小时，且本试剂盒采用钙黄绿素显色液，使得通过肉眼即可判读结果，更加直观清晰。

如无特别说明，本发明中的w/v为质量体积比，组成中的百分比如无特别说明，均指质量百分比。

下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。

铜绿假单胞菌LAMP引物的筛选

发明人设计了6组引物，分别如下：

表1、不同铜绿假单胞菌LAMP引物序列

说明，表中括号内的数字为其SEQ ID NO编号。

采用最优的6组引物序列组合，均含有环引物，经过统一的优化的反应体系测试，通过琼脂糖凝胶电泳观察反应产物，引物1仅需30min即有明显的扩增条带，引物2和引物4在40min左右，引物3、引物5和引物6在45min左右。

试剂盒的制备：

引物：表1中的引物组1。

冻干等温扩增剂：冻干前的组成如表2。

表2、不同冻干检测剂的组成表

冻干检测剂的制备方法：无菌环境下混合需要冻干处理的相关组分混合液，封装于容器中，按照常规冷冻干燥程序进行干燥，即可得到冻干等温扩增剂。

复溶液：组成如下，

组分	终浓度
		KCl	8mmol/L
Tris-HCl,，pH 8.8	16mmol/L
		(NH₄)₂SO₄	9mmol/L
MgSO₄	8mmol/L
		Triton X-100	0.2％
甜菜碱	1.2mol/L
		水	余量

无菌环境下混合复溶液组分，置于容器中。

阳性对照干粉：向提纯的铜绿假单胞菌基因组DNA溶液分别加入3％(w/v)的海藻糖，分装与容器中，同样经上述冻干程序制备阳性对照干粉。

显色液：由0.3mmol/L的的钙黄绿素和7.2mmol/L的MnCl₂等体积混合得到，钙黄绿素的终浓度为15μmol/L，MnCl₂的终浓度为360μmol/L，置于容器中。

封闭液：液体石蜡，无菌分装，置于容器。

裂解液：含有10～20mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)、1mmol/L EDTA、0.3～1％(w/v)SDS，置于容器中。

稳定性实验

分别取例1～6的冻干等温扩增剂进行稳定性实验，4℃保存，每隔3个月利用试剂盒进行产品的反应效果验证，结果见表3：

表3、不同冻干等温扩增剂的稳定性

采用例1复合冻干保护剂进行反应试剂的冻干，经过液氮预冻和冷冻干燥后，试剂冻干粉能保持较高的稳定性，最长的保质期时间为21-24个月，远高于同类型产品的12个月保质期，其检验限略有下降，均在50CFU/TEST左右，但是足以满足检测的需要。除仅含5％海藻糖(w/v)的单一保护剂的冻干粉有吸潮现象外，其余复合保护剂冻干成粉状制剂后在各自保质期范围内均保持良好形态，没有塌陷和镂空现象。

最低检验限和灵敏度的比较

1)用无菌接种环分别挑取铜绿假单胞菌(ATCC15442)的纯菌菌落，用灭菌生理盐水进行梯度稀释(稀释倍数分别为10⁰，10¹，10²，10³，10⁴，10⁵，10⁶，10⁷，10⁸)，并分别取各个稀释菌液100μL螺旋接种到TSA平板进行培养和计数

2)分别取以上稀释菌液100μL，6000r/min离心5min，弃上清，加入10μL裂解液充分悬浮菌体沉淀，99℃加热裂解菌体10min，热裂解结束后12000r/min离心15min，取上清即为粗提的菌体模板基因；

3)以上粗提DNA为模板进行PCR和LAMP反应，铜绿假单胞菌PCR引物为：PF-5’-CGGCCTGGGCGGAAGTTC-3’(SEQ ID NO：37)，PR-5’-TCGACGTCCGCCAGCTTGTAC-3’(SEQ ID NO：38)；

4)PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，72℃延伸10min，35个循环；

5)以上粗提DNA为模板进行LAMP反应，取出冻干型检测反应管，每管分别加入上述复溶液20μL，待管中干粉完全溶解，分别加入以上各个稀释菌液对应的粗提DNA模板2.5μL，无菌超纯水2.5μL，充分混匀后加入20μL/管封闭液，紧盖，设置64℃等温反应45min；

6)以上PCR与LAMP扩增产物用琼脂糖凝胶电泳来判读，平板菌落计数确定最低检验限。

结果：琼脂糖凝胶电泳结果显示铜绿假单胞菌PCR的最低检验限在10⁴倍数稀释处，LAMP最低检验限制在10⁶倍数稀释处。对应的菌落计数采用GB 4789.2-2010食品微生物学检验菌落总数测定标准，铜绿假单胞菌在10⁶倍数稀释处为8CFU，LAMP检测的灵敏度远高于PCR。

纯菌的检测

1)样品处理：

用于纯菌的筛选鉴定中，用接种环挑取单菌落半环，转移到含有30μL裂解液的无菌PCR管中，充分混匀后水浴或者金属浴99℃热裂解10min；裂解结束后转到离心机中12000r/min离心10min，取上清即为样品粗提基因组DNA，选用菌株见表4：

表4

2)等温扩增反应

取出冻干型检测反应管，每管分别加入上述复溶液20μL，待管中干粉完全溶解，分别加入以上各类菌粗提的DNA模板2.5μL，其中，取1管作为阴性对照，1管作为阳性对照，分别加入对应的对照试剂2.5μL，后分别向所有各管中加入显色液2.5μL，充分混匀后加入20μL封闭液，紧盖，经Biometra professional PCR仪进行等温扩增，64℃等温反应45min；

3)反应后判读

反应结束后，对比反应前后颜色变化，若呈现荧光绿则为阳性，淡橙色则为阴性，若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测，整个观察过程不得打开反应管盖。检测结果见表5：

表5

结果，经本发明检测，以上所选的铜绿假单胞菌和非铜绿假单胞菌属的快速检测中，铜绿假单胞菌选取的标准菌株和分离株在检测体系中均出现明显荧光绿，而所选非铜绿假单胞菌属各菌反应前后无颜色变化，仍为淡橙色，可见本发明具有极好的特异性，能有效检出铜绿假单胞菌。

本发明所述的包装饮用水中铜绿假单胞菌的检测方法如下：

1)样品处理：取250mL待检水样进行抽滤，后将滤膜置于100mL铜绿假单胞菌增菌培养基(含0.015％(w/v)十六烷三甲基溴化铵的胰蛋白胨大豆肉汤培养基TSB)中，37±1℃条件下增菌8-12h。吸增菌液1mL到1.5mL规格的无菌离心管中，6000r/min离心5min，弃上清，加入30μL裂解液，充分悬浮菌体，轻弹管壁消除气泡，99℃加热10min，12000r/min离心15min，上清即为粗提的DNA；

2)等温扩增反应：取出冻干型检测反应管，每管分别加入上述复溶液20μL，待管中干粉完全溶解，分别加入以上各样品粗提的DNA模板2.5μL，其中取1管作为阴性对照，1管作为阳性对照，分别加入对应的对照试剂2.5μL，后分别向所有各管中加入显色液2.5μL，充分混匀后加入20μL封闭液，紧盖，经Biometra professional PCR仪进行等温扩增，64℃等温反应45min；

3)反应后判读：反应结束后，观察反应管中溶液由检测前的淡橙色变为荧光绿色，与阳性对照管变化相同，表示有铜绿假单胞菌检出，反之，无颜色变化，表示无检出。

参照上述“本发明所述包装饮用水中铜绿假单胞菌的检测方法”的操作，与包装饮用水中铜绿假单胞菌的其他的LAMP检测方法，不同之处在于增加了前增菌步骤，以及选用了营养丰富的TSB培养基和具有极强选择性的抑菌剂十六烷三甲基溴化铵，其他操作相同，对比其他方法的效果，可使铜绿假单胞菌检出率更高，避免漏检现象。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东环凯生物科技有限公司

广东环凯微生物科技有限公司

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<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 29

aggacctcga ccgtcggat 19

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 30

ggacctcgac cgtcggattt 20

<210> 31

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 31

ccagagctac cccagcag 18

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 32

agcgaaggtt cttgagatcg 20

<210> 33

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 33

tcgttgttac ccaggcgacg cccagaaggt gcccgact 38

<210> 34

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 34

aggccaaggg tatcctccag cagttgagcg gccgaagtg 39

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<211> 19

<212> DNA

<213> 人工引物

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tccgccagct tgtacagag 19

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<212> DNA

<213> 人工引物

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<212> DNA

<213> 人工引物

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cggcctgggc ggaagttc 18

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<212> DNA

<213> 人工引物

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tcgacgtccg ccagcttgta c 21

Claims

1.一种应用于水中铜绿假单胞菌的快速检测试剂盒，包括冻干等温扩增剂，复溶液、阳性对照干粉、阴性对照、显色液、裂解液和封闭液，冻干等温扩增剂中含有dNTPs、Bst DNA聚合酶、外引物、内引物、环引物和冻干保护剂，其特征在于：冻干保护剂由海藻糖、甘氨酸和牛血清白蛋白组成。

2.根据权利要求1所述的快速检测试剂盒，其特征在于：冻干等温扩增剂在冻干前的组成为：0.9～1.6 mmol/L dNTPs、0.3～0.4 U/μL Bst DNA聚合酶、0.1～0.5 μmol/L外引物F3/B3、1.0～2.0 μmol/L内引物FIP/BIP、0.5～1.5 μmol/L环引物LF/LB以及冻干复合保护剂含3% ~ 6%( w/v)海藻糖、0.01%-0.1% (w/v)甘氨酸、0.1%-1% 牛血清白蛋白，余量为无菌超纯水。

3.根据权利要求2所述的快速检测试剂盒，其特征在于：冻干等温扩增剂在冻干前的组成为：0.9～1.6 mmol/L dNTPs、0.3～0.4 U/μLBst DNA聚合酶、0.1～0.5 μmol/L外引物F3/B3、1.0～2.0 μmol/L内引物FIP/BIP、0.5～1.5 μmol/L环引物LF/LB以及冻干复合保护剂含4% ~ 5% (w/v)海藻糖、0.04%-0.07% (w/v)甘氨酸、0.4%-0.7%牛血清白蛋白，余量为无菌超纯水。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的快速检测试剂盒，其特征在于：复溶液含有2～9mmol/L MgSO₄、8～12 mmol/L KCl、15～20 mmol/L Tris-HCl、8～12 mmol/L (NH₄)₂SO₄、0.1～0.3% Triton X-100以及0.5～1.5 mol/L甜菜碱。

5.根据权利要求1～3任意一项所述的快速检测试剂盒，其特征在于：外引物F3/B3、内引物FIP/BIP以及环引物LF/LB的序列如下：

铜绿假单胞菌-F3：AGCCAGGCGTTCAATGC

铜绿假单胞菌-B3：GTTGTTACCCAGGCGACG

铜绿假单胞菌-FIP：TCACCTCGCCGAGCCAGTACTGCTTCTGCGCAAGTACCCGA

铜绿假单胞菌-BIP：GGTCAGCCAGAGCTACCCCATCCGCCAGCTTGTACAGAGA

铜绿假单胞菌-LF：GCCGGAGTACTGGCTGT

铜绿假单胞菌-LB：AGCCAGAAGGTGCCCGA。

6.根据权利要求1～3任意一项所述的快速检测试剂盒，其特征在于：显色液由0.3～1.5 mmol/L的钙黄绿素和2.4～7.2 mmol/L的MnCl₂混合得到，钙黄绿素的终浓度为15～75μmol/L，MnCl₂的终浓度为120～360 μmol/L。

7.根据权利要求1～3任意一项所述的快速检测试剂盒，其特征在于：裂解液含有：10～20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)、1 mmol/L EDTA、0.3～1%（w/v）SDS。

8.根据权利要求1～3任意一项所述的快速检测试剂盒，其特征在于：封闭液为液体石蜡。

9.一种水中铜绿假单胞菌的快速检测方法，包括如下步骤：

1）取水样抽滤，滤膜置于铜绿假单胞菌增菌培养基中增菌培养；

2）增菌培养完成后分离微生物，裂解后提取核酸；

3）将复溶液加入冻干等温扩增剂中，使冻干等温扩增剂完全溶解，得到反应液；

4）按等温扩增操作分别在不同管内的反应液中加入提取得到的样品核酸、阳性对照和阴性对照，反应结束后加入显色液，对结果进行判断。

10.根据权利要求9所述的快速检测方法，其特征在于：增菌培养基为添加有0.015%（w/v）十六烷三甲基溴化铵的TSB培养基。