CN102094090A

CN102094090A - 一种霍乱毒素毒力基因检测试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN102094090A
Application number: CN 201010584749
Authority: CN
Inventors: 王婷; 张胜萍; 陆晔; 田桢干; 王传贵; 杜正平
Original assignee: East China Normal University; Shanghai Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of PRC
Current assignee: East China Normal University; Shanghai Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of PRC
Priority date: 2010-12-13
Filing date: 2010-12-13
Publication date: 2011-06-15
Anticipated expiration: 2030-12-13
Also published as: CN102094090B

Abstract

本发明涉及一种霍乱毒素毒力基因检测试剂盒及其检测方法，本发明的试剂盒包括以霍乱弧菌ctxA基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的三对引物：内引物FIP/BIP、外引物F3/B3、环引物LF/LB，以及Bst DNA聚合酶、反应液、样品预处理液、显色液、稳定液和阳性对照；检测霍乱毒素毒力基因的方法包括细菌DNA的提取、霍乱毒素毒力基因的环介导恒温扩增和显色检测。本发明的霍乱毒素毒力基因检测试剂盒扩增效率高、特异性强、灵敏度高、漏检率低，显色效果明显，适用于产毒霍乱弧菌的快速检测。

Description

一种霍乱毒素毒力基因检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种霍乱毒素毒力基因检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

霍乱是一类以腹泻为主要症状的烈性传染病，至今已发生7次世界大流行，1961年开始由埃尔托霍乱弧菌引起的霍乱第7次世界大流行，波及140个国家和地区，报告病例400万以上。据WHO专家会议估计，全球每年约发生550万例，其中以亚洲、非洲和拉丁美洲较为严重，引起亚洲10万和非洲2万人死亡。时至今日，霍乱仍然是最危险的烈性传染病之一。因此，早期迅速和正确的诊断对治疗和预防本病的蔓延有重大意义。

目前霍乱弧菌已被分为200多个血清群，但只有O1血清群和O139血清群能够引起流行。霍乱毒素(cholera toxin，CTX)是由致病的霍乱弧菌分泌的一种蛋白质，其结构基因位于染色体上大小为7～9.7kb的CTX遗传单元上，它由A、B两个亚单位构成，其中A亚单位是霍乱毒素的产毒亚单位，可进入人体小肠细胞内导致人体水分和电解质的大量丢失，严重时危害人生命。

传统霍乱弧菌检测方法，由于其检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的病原核酸检测技术在实际应用中存在一些问题，如普通聚合酶链式反应(PCR)技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而荧光实时定量聚合酶链式反应(real time PCR)技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，因此不适用于现场快速检测。而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以及时运用生物技术发展的最新成果对满足病原微生物检测要求的不断提高具有重要意义。其中恒温扩增(IsothermalAmplification)核酸快速检测技术是病原核酸检测技术上的长足进步，现已建立起来的环介导恒温扩增技术(LAMP)具有很多的优越性。

因此，需要一种检测效果更全面、特异性更高、漏检率更低的霍乱弧菌毒力基因检测试剂盒及检测方法以解决上述问题。

基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplication of DNA，简称LAMP)是利用Bst DNA聚合酶和根据靶基因序列设计的三对特殊的引物(即内引物FIP/BIP、外引物F3/B3以及环引物LF/LB)，特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎环DNA混合物。LAMP反应过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物——焦磷酸镁乳白色沉淀，即可通过肉眼观察判定结果。加入显色试剂后，结果判定更加方便容易。LAMP反应是在恒温(63～65℃)条件下45～90分钟内完成。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。LAMP法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与PCR技术(包括荧光实时定量PCR技术)进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。目前国家标准中以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化分析和血清学分型鉴定的通行方法，初步鉴定需2～3天，完成鉴定报告需10～15天。

申请号为200810157500.0的在先申请已经公开了产霍乱毒素霍乱弧菌环介导等温扩增快速检测方法，与此在先申请相比较，本发明的检测试剂盒与检测方法采用了三对引物(内引物FIP/BIP、外引物F3/B3以及环引物LF/LB)，使得本发明的检测试剂盒与方法具有更好的扩增效率、特异性及灵敏性。并且，本发明的反应体系中加入了羟基萘酚蓝显色液，鉴定结果更为直观清晰。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一是克服现有技术中耗时长，漏检率高，实验设备要求较高的不足，提供一种检测效果更全面、特异性高、灵敏性好，漏检率低，方便简单易操作的霍乱毒素毒力基因检测试剂盒。

本发明所提供的霍乱毒素毒力基因检测试剂盒包括下列组成：以霍乱弧菌ctxA基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的各三对引物：内引物FIP/BIP、外引物F3/B3、环引物LF/LB，以及Bst DNA聚合酶、反应液、样品预处理液、显色液、稳定液和阳性对照，

所述的三对引物序列分别为：

内引物FIP：5’-CCAAAATGAACTCGATACCATCCATAAGAAGTTTCTGCTTTAGGTG-3’(SEQ ID NO 1)

内引物BIP：5’-GGTGCTTGATGAACAATTACATCGTCTGCTGCTGGAGCAATA-3’(SEQ ID NO 2)

外引物F3：5’-AGTCCTCATCCAGATGAAC-3’(SEQ ID NO 3)

外引物B3：5’-CCTGCCAATCCATAACCA-3’(SEQ ID NO 4)

环引物LF：5’-ATATTTGGGAGTATGGAATCC-3’(SEQ ID NO 5)

环引物LB：5’-TAATAGGGGCTACAGAGATAGATA-3’(SEQ ID NO 6)

所述的内引物FIP/BIP、环引物LF/LB各为1.2～2.0μmol/L，外引物F3/B3的浓度各为0.2～0.25μmol/L；优选内引物FIP/BIP、环LF/LB的浓度为1.6μmol/L，外引物F3/B3的浓度为0.2μmol/L。

所述的Bst DNA聚合酶：酶浓度4-10U/μL，优选酶浓度为8U/μL。

所述的反应液含：1.4～2mmol/L dNTPs、20～25mmol/L Tris-HCl、10～12.5mmol/L KCl、10～12.5mmol/L(NH₄)₂SO₄、8～10mmol/L MgSO₄、0.1～0.125体积％TritonX-100、0.8～1mol/L甜菜碱；

优选1.4mmol/L dNTPs、20mmol/L Tris-HCl、10mmol/L KCl、10mmol/L(NH₄)₂SO₄、8mmol/LMgSO₄、0.1％TritonX-100、0.8mol/L甜菜碱。

所述的显色液为HNB(羟基萘酚蓝)或SYBR Green I，优选HNB(羟基萘酚蓝)。

所述稳定液为矿物油。

所述的阳性对照为霍乱弧菌O1群或O139群基因组DNA。

本发明所要解决的另一技术问题是提供一种霍乱毒素毒力基因检测方法，包括如下步骤：

(1)将待测样品离心，去上清，得到沉淀；

(2)将步骤(1)的沉淀加入本发明检测试剂盒中的样品预处理液，混合均匀，沸水浴灭活后冰上冷却，高速离心，上清即为样品模板DNA；

(3)在反应容器中加入本发明试剂盒中的Bst DNA聚合酶0.9～1.8体积份数、反应液38～40体积份数、稳定液52～54.5体积份数、样品模板DNA 4.5～9体积份数、内引物FIP/BIP、环引物LF/LB各2体积份数、外引物F3/B3各4体积份数，恒温反应；

(4)反应结束后，样品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性；

步骤(3)中所述的恒温反应的反应条件为温度63～65℃，反应时间45～90min。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1.本发明的检测试剂盒只需一个恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备，检测成本低；2.由于选择了霍乱毒素(CTX)毒力基因的核酸序列的特异性保守区进行引物设计，应用六个区段，六条引物，使得本发明的检测试剂盒检测霍乱弧菌毒力基因的准确率更高。3.本发明的检测试剂盒扩增快速且高效，在不到1小时即可完成扩增，且产率更高；4.本发明的基因快速诊断试剂盒，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，因此具有高特异性；5.本发明的检测试剂盒灵敏度高，扩增模板仅需10拷贝或更少；6.本发明的基因快速诊断试剂盒鉴定简便，可通过肉眼观察鉴定，显色试剂(HNB)羟基萘酚蓝使得阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠。

附图说明

图1为实施例2霍乱弧菌O1群LAMP灵敏度实验结果。

图2为实施例2霍乱弧菌O1群LAMP灵敏度实验结果电泳图。

图3为实施例2霍乱弧菌O1群PCR灵敏度实验结果电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1霍乱毒素毒力基因检测试剂盒的制备

(1)按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物：

外引物F3：5’-AGTCCTCATCCAGATGAAC-3’(SEQ ID NO 3)

外引物B3：5’-CCTGCCAATCCATAACCA-3’(SEQ ID NO 4)

环引物LF：5’-ATATTTGGGAGTATGGAATCC-3’(SEQ ID NO 5)

环引物LB：5’-TAATAGGGGCTACAGAGATAGATA-3’(SEQ ID NO 6)

(2)购置DNA聚合酶：Bst DNA聚合酶置于容器；

(3)配制反应液和引物：反应液含有1.4mmol/L dNTPs、20mmol/L Tris-HCl、10mmol/LKCl、10mmol/L(NH₄)₂SO₄、8mmol/L MgSO₄、0.1％TritonX-100、0.8mol/L甜菜碱、内引物FIP/BIP、环引物LF/LB各1.6μmol/L和外引物F3/B3各0.2μmol/L，置于容器；

(4)配制样品预处理液：样品预处理液含有20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、2mmol/LEDTA和1.2％体积Triton X-100，置于容器；

(5)购置稳定液：矿物油，置于容器；

(6)购置显色液：HNB(羟基萘酚蓝)，置于容器；

(7)提取阳性对照：提取霍乱弧菌O1群基因组DNA，置于容器；

(8)将上述7个容器装成试剂盒，封装。

制备工艺简述如下：

1、将内引物FIP/BIP、外引物F3/B3以及环LF/LB合成纯化后，定量配制，浓度检测，抽样质检；

2、将上述(2)～(4)步骤配制的液体无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；

3、将稳定液分装，抽样质检；

4、将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；

5、组装试剂盒。

实施例2霍乱毒素毒力基因检测试剂盒的应用

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株

本发明采用菌株有14株，主要来源于中国疾病预防控制中心、上海市疾病预防控制中心、浦东新区疾病预防控制中心。详见表1。

表1 菌株名称及来源

1.2分离菌株的鉴定

1.2.1将标本接种至TCBS琼脂、双洗平板上，TCBS上出现黄色菌落，双洗平板上出现灰黑色中心的菌落均为可疑菌落。在显微镜下菌体为稍弯的杆菌，菌体短，逗点状，菌体单端有一根鞭毛，运动活泼呈穿梭状，革兰氏染色阴性。生化反应：氧化酶+蔗糖+靛基质-硫化氢-动力+V-P+。

血清学反应：与霍乱弧菌O1群多价诊断血清发生凝集，生理盐水不凝集。

1.3样品处理(模板DNA提取)

1.3.1取1mL液体培养的菌液样品，10000rpm离心2分钟，获得菌体沉淀；

1.3.2在上述菌体沉淀中加入100μL样品预处理液混合均匀，沸水中煮20分钟后立即置于冰上冷却10分钟，10000rpm离心2分钟，上清即为样品模板DNA。

1.4、采用实施例1的试剂盒进行环介导等温扩增技术的反应过程

1.4.1在200μL反应管配制反应体系：反应液，显色液和引物共22μL，Bst DNA聚合酶1μL(8U)，稳定液30μL，模板DNA 2.5μL。

1.4.2将配制好的反应管于65℃恒温反应1小时。

1.5反应后处理

反应结束后，若反应管与阳性对照管一样显现天蓝色则为阳性，若反应管与阴性对照管一样显现紫色则为阴性。

1.6电泳

配制2％琼脂糖凝胶电泳。以溴乙锭作为染料进行显色反应观察结果。

1.7特异度试验

1.7.1纯菌株LAMP检测用LAMP方法对14株细菌进行扩增，根据显色反应观察结果，天蓝色为阳性，紫色阴性，验证方法特异性。

1.7.2几种菌株混合DNA检测用LAMP对霍乱弧菌O1群及沙门氏、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌的DNA等体积混合液取2.5ul作LAMP检测。

1.8灵敏度试验

将霍乱弧菌O1群提取的基因组DNA 10倍倍比稀释至10^-9，对各浓度级进行LAMP检测，结果见图1。

1.8重复性试验特异度试验和灵敏度试验分别重复2次。

2结果

2.1霍乱弧菌毒力基因LAMP检测方法的建立

2.2特异度试验霍乱弧菌O1群(编号N16961)，O139群(MO45)检测结果阳性，12株非霍乱弧菌均阴性，霍乱弧菌O1群、沙门氏菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌4种细菌DNA混合液为阳性，如表2所示。结果显示试剂盒具有高特异性。

表2 采用本发明方法进行特异性试验结果

检测样品	结果	检测样品	结果
				阴性对照	阴性	小肠结肠炎耶尔森氏菌	阴性
阳性对照	阳性	副溶血弧菌	阴性
				金黄色葡萄球菌	阴性	溶藻弧菌	阴性
大肠杆菌O157	阴性	麦氏弧菌	阴性
				志贺氏菌	阴性	拟态弧菌	阴性
福氏志贺氏菌	阴性	河弧菌	阴性
				沙门氏菌	阴性	霍乱弧菌O1	阳性
单增李斯特氏菌	阴性	霍乱弧菌O139	阳性

2.3灵敏度试验

霍乱弧菌O1群原基因组DNA浓度为300ng/ul，LAMP方法可检测到300fg/ul，PCR可检测到30pg/ul，电泳结果也符合上述结果。结果见图1、图2

2.4重复性试验特异度试验重复两次，结果一致。灵敏度试验重复两次，数量级一致。

Claims

1.一种霍乱毒素毒力基因检测试剂盒，包括Bst DNA聚合酶，反应液，样品预处理液，显色液，稳定液和阳性对照，其特征在于：还包括以霍乱弧菌ctxA基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的各三对引物：内引物FIP/BIP、外引物F3/B3以及环引物LF/LB，所述的三对引物分别为：

内引物FIP：5’-CCAAAATGAACTCGATACCATCCATAAGAAGTTTCTGCTTTAGGTG-3’SEQ ID NO 1

内引物BIP：5’-GGTGCTTGATGAACAATTACATCGTCTGCTGCTGGAGCAATA-3’SEQ ID NO 2

外引物F3：5’-AGTCCTCATCCAGATGAAC-3’SEQ ID NO 3

外引物B3：5’-CCTGCCAATCCATAACCA-3’SEQ ID NO 4

环引物LF：5’-ATATTTGGGAGTATGGAATCC-3’SEQ ID NO 5

环引物LB：5’-TAATAGGGGCTACAGAGATAGATA-3’SEQ ID NO 6

2.根据权利要求1所述的霍乱毒素毒力基因检测试剂盒，其特征在于：所述的内引物FIP/BIP、环引物LF/LB均为1.2～2.0μmol/L，外引物F3/B3的浓度均为0.2～0.25μmol/L。

3.根据权利要求2所述的霍乱毒素毒力基因检测试剂盒，其特征在于：内引物FIP/BIP、环引物LF/LB的浓度均1.6μmol/L，外引物F3/B3的浓度为0.2μmol/L。

4.根据权利要求1所述的霍乱毒素毒力基因检测试剂盒，其特征在于：所述的Bst DNA聚合酶：酶浓度4-10U/μl，所述的显色液为羟基萘酚蓝或SYBR Green I。

5.根据权利要求4所述的霍乱毒素毒力基因检测试剂盒，其特征在于：所述的酶浓度为8U/μL，所述的显色液为羟基萘酚蓝。

6.根据权利要求1所述的霍乱毒素毒力基因检测试剂盒，其特征在于：所述的反应液含：1.4～2mmol/L dNTPs、20～25mmol/L Tris-HCl、10～12.5mmol/L KCl、10～12.5mmol/L(NH₄)₂SO₄、8～10mmol/L MgSO₄、0.1～0.125体积％TritonX-100、0.8～1mol/L甜菜碱。

7.根据权利要求6所述的霍乱毒素毒力基因检测试剂盒，其特征在于：所述的反应液含：1.4mmol/L dNTPs、20mmol/L Tris-HCl、10mmol/L KCl、10mmol/L(NH₄)₂SO₄、8mmol/L MgSO₄、0.1％TritonX-100、0.8mol/L甜菜碱。

8.根据权利要求1所述的霍乱毒素毒力基因检测试剂盒，其特征在于：所述稳定液为矿物油；所述的阳性对照为霍乱弧菌O1群或O139群基因组DNA；所述的样品预处理液含20mmol/L pH8.0的Tris-HCl、2mmol/L EDTA和1.2％体积Triton X-100。

9.一种根据权利要求1的试剂盒进行的霍乱毒素毒力基因检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)将待测样品离心，去上清，得到沉淀；

(2)将步骤(1)的沉淀加入权利要求1检测试剂盒中的样品预处理液，混合均匀，沸水浴灭活后冰上冷却，高速离心，上清即为样品模板DNA；

(3)在反应容器中加入权利要求1检测试剂盒中的Bst DNA聚合酶0.9～1.8体积份数、反应液38～40体积份数、稳定液52～54.5体积份数、样品模板DNA 4.5～9体积份数、内引物FIP/BIP、环引物LF/LB各2体积份数、外引物F3/B3各4体积份数，恒温反应；其中所述的内引物FIP/BIP、外引物F3/B3以及环引物LF/LB为以霍乱弧菌ctxA基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的各三对引物，其序列分别为：

内引物BIP：5’-GGTGCTTGATGAACAATTACATCGTCTGCTGCTGGAGCAATA-3’SEQ ID NO 2

外引物F3：5’-AGTCCTCATCCAGATGAAC-3’SEQ ID NO 3

外引物B3：5’-CCTGCCAATCCATAACCA-3’SEQ ID NO 4

环引物LF：5’-ATATTTGGGAGTATGGAATCC-3’SEQ ID NO 5

环引物LB：5’-TAATAGGGGCTACAGAGATAGATA-3’SEQ ID NO 6

(4)反应结束后，样品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性。

10.根据权利要求9所述的霍乱毒素毒力基因检测方法，其特征在于：步骤(3)中所述的恒温反应的反应条件为温度63～65℃，反应时间45～90min。