CN102943113A - 大肠杆菌o157的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大肠杆菌O157的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和试剂盒。本发明针对大肠杆菌O157的rfbE基因，设计和筛选了一套特异性检测引物组以及含有该检测引物组的检测试剂盒和利用该检测试剂盒通过环介导等温扩增的检测方法，进而确定待检测样品中是否存在大肠杆菌O157的检测方法。本发明的检测试剂盒和检测方法具有灵敏度高、特异性强、准确率达到99%、检测时间短的优点，从样品处理到报告结果只需花8-10h，不需要PCR仪和电泳仪，操作过程简单，解决了传统检测方法耗时长、传统培养方法灵敏度低、血清凝集有交叉反应等问题，对于及时有效地应对食源性突发公共卫生事件具有重大意义，特别适合基层检测机构和食品加工企业自检使用。
Description
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种大肠杆菌O157的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和试剂盒。
背景技术：
大肠埃希氏菌O157（Escherichia coli O157）是一类能引起严重食物中毒的致泻大肠杆菌,Escherichia coli O157：H7是出血性大肠杆菌的主要血清型。自1982年以来，E.coli O157∶H7相继在美国、英国、加拿大、日本等国家引起暴发和流行。该致病菌是引起腹泻和出血性肠炎的重要致病菌，有2%~7%的病人会出现出血性肾病综合征，其感染已经成为世界性问题。除E.coli O157∶H7以外，产志贺毒素可发酵山梨醇的大肠埃希氏菌O157：NM(nonmobile)已经成为欧洲大陆过去10年重要的致病菌。人感染E.coli O157∶H7的主要途径是食用或接触被污染的牛肉、牛奶、蔬菜、水果和水源等，而且引发感染的剂量极低，仅摄取10个活菌就有可能致病，可引起出血性腹泻、出血性结肠炎、出血性尿毒症，甚至死亡。
对于E.coli O157的检测，我国现行国标GB/T 4789.36-2008中采用的方法是采用改良EC肉汤培养基（mEC+n），在36℃培养18~24h进行前增菌，然后平板划线显色培养基，或者免疫磁珠富集后平板划线显色培养基，之后挑取可疑菌落进行形态、染色及血清学试验、生化鉴定等进行最终判定，检测过程耗时长达2-4d，难以适应大批量食品样品快速检验的要求。我国行业进出口食品标准SN/T 0973-2010对E.coli O157:H7目前采用的方法是对样品在改良EC肉汤培养基（mEC+n）增菌后进行免疫学方法检测，同时辅助其他生化鉴定方法，此方法同国标方法有类似之处，检测周期比较长。
近年来，大肠杆菌O157分子检测方法如PCR、LAMP方法等逐渐建立起来，这些方法具有较高的特异性和灵敏性，但是由于食品种类复杂，样品成品及其背景微生物对E.coliO157的干扰较多，加上E.coli O157受到培养温度、盐度、pH值及培养基各种组分等因素的影响较大，因此，目前的各种方法中，还没有一套完善、高效、灵敏的检测方法适用于所有来源的样品包括（食品、水、土壤及临床样本）。此外，最近的研究发现，改良EC肉汤由于胆盐和新生霉素等抑菌剂含量较高，对目标菌E.coli O157的复苏和生长有一定影响，导致在一些复杂基质的样品中E.coli O157无法检出。
发明内容：
本发明的第一目的是提供一种应用环介导等温扩增检测大肠埃希氏菌（Escherichia coli）O157的检测引物组，利用该检测引物组可以特异性的检测大肠埃希氏菌O157。
本发明的应用环介导等温扩增检测大肠埃希氏菌（Escherichia coli）O157的检测引物组，其特征在于，由下列引物组成：
上游外引物F3：5’-TGCAACTACTGTAAGTAATGGA-3’；
下游外引物B3：5’-TTGTTCTATGTCACTAACAGAC-3’；
上游内引物FIP：5’-TGTTGGAACAATAACTTCATCTCCT-ACGGTTGCTCTTCATTTAGC-3’；
下游内引物BIP：5’-AATGCTATAAAATACACAGGAGCCA-ATTTGCCAAGTTTCATTATCTGA-3’。
本发明的第二个目的是提供一种非疾病的诊断和治疗目的的大肠埃希氏菌O157的检测方法，其特征在于，对样品进行增菌培养获得增菌液，提取增菌液中的细菌DNA，然后通过 环介导等温扩增的方法用上述检测引物组对细菌DNA进行选择性扩增，确认是否存在有扩增产物。
所述的样品优选为肉制品，如猪肉和牛肉。
所述的对样品进行增菌培养优选是将样品接入选择性增菌液中，然后在42±1℃培养6~8小时，获得增菌液，所述的选择性增菌液为每225ml缓冲蛋白胨水中含有8mg万古霉素。利用该选择性增菌液可以选择的对肉制品中的大肠埃希氏菌O157进行增菌，BPW-V进行增菌，有利于E.coli O157的复苏和生长，且万古霉素抗生素的低剂量使用，可以有效抑制其他竞争菌的生长，42℃温度增菌培养也可以有效降低肉制品中其他杂菌的生长，提高目标菌E.coliO157的检出率，更有利于对肉制品进行检测。
所述的通过环介导等温扩增的方法用上述检测引物组对细菌DNA进行选择性扩增具体为：环介导等温扩增体系为体系总体积25μL，包括2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、0.4μL10mmol/LdNTPs、0.5μL 10μmol/L上游外引物F3、0.5μL 10μmol/L下游外引物B3、1μL40μmol/L上游内引物FIP、1μL 40μmol/L下游内引物BIP、0.6μL100mmol/L MgSO4、12.5μL2mol/L甜菜碱、4μL灭菌双蒸水ddH2O，Bst DNA聚合酶8U/μL和2μL细菌DNA，反应条件为在温度为65℃孵育45~60min。
所述的确认是否存在有扩增产物可以利用电泳检测、荧光显色检测或浊度检测环介导等温扩增反应产物是否具有扩增产物，优选用荧光显色检测，具体是在反应管中加入SYBRGreen Ⅰ显色剂，1~5min后观察结果，如果颜色为橙色，则样品大肠埃希氏菌O157阴性，无大肠埃希氏菌O157，如果颜色为绿色，则样品大肠埃希氏菌O157阳性，含有大肠埃希氏菌O157。
所述的10×Thermopol反应缓冲液是现有技术中的物质，可以从试剂公司购买到，其含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）、100mmol/L氯化钾（KCl）、100mmol/L硫酸铵（NH4）2SO4、20mmol/L硫酸镁（MgSO4）和1%曲拉通X-100（TtitonX-100），余量为水。
本发明的第三个目的是提供一种大肠埃希氏菌O157的检测试剂盒，包括环介导等温扩增试剂和检测引物组，其特征在于，所述的检测引物组由下列引物组成：
上游外引物F3：5’-TGCAACTACTGTAAGTAATGGA-3’
下游外引物B3：5’-TTGTTCTATGTCACTAACAGAC-3’
上游内引物FIP：5’-TGTTGGAACAATAACTTCATCTCCT-ACGGTTGCTCTTCATTTAGC-3’
下游内引物BIP：5’-AATGCTATAAAATACACAGGAGCCA-ATTTGCCAAGTTTCATTATCTGA-3’。
所述的大肠埃希氏菌O157的检测试剂盒还包括选择性增菌液，该选择性增菌液为每225ml缓冲蛋白胨水中含有8mg万古霉素。
本发明在对E.coli O157增菌液种类、增菌温度和培养时间等因素进行比较和验证的基础上，将万古霉素-缓冲蛋白胨水（BPW）选择增菌与rfbE-LAMP技术相结合，建立了一种检测肉制品中E.coli O157的快速方法。
rfbE基因是编码大肠杆菌O157菌体O抗原的特异合成酶，是鉴定大肠杆菌O157的重要依据，针对E.coli O157特异性基因设计特异性引物，具有较强的特异性，适于大肠杆菌O157的检测。本发明针对大肠杆菌O157的rfbE基因，设计和筛选了一套特异性检测引物组 以及含有该检测引物组的检测试剂盒和利用该检测试剂盒通过环介导等温扩增的检测方法，进而确定待检测样品中是否存在大肠杆菌O157的检测方法。本发明的检测试剂盒和检测方法具有灵敏度高、特异性强、准确率达到99%、检测时间短的优点，从样品处理到报告结果只需花8-10h，不需要PCR仪和电泳仪，操作过程简单，解决了传统检测方法耗时长、传统培养方法灵敏度低、血清凝集有交叉反应等问题，对于及时有效地应对食源性突发公共卫生事件具有重大意义，特别适合基层检测机构和饮用水加工企业自检使用。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
1、选择性增菌液的配制：
（1）万古霉素抑菌剂的配制
称取8mg万古霉素干粉，加入1mL纯水溶解，0.22μm膜过滤除菌，得到万古霉素抑菌剂。
（2）培养基配制
称取25.5g缓冲蛋白胨成品干粉，用1000mL蒸馏水，搅拌加热煮沸至充分溶解，121℃高压灭菌15min，分装三角瓶，每瓶225mL，冷却至40℃，每瓶加入1mL万古霉素抑菌剂，得到万古霉素-缓冲蛋白胨水。
2、环介导等温扩增检测：
（1）环介导等温扩增体系：环介导等温扩增反应体系含有1×Thermopol反应缓冲液、300~500μmol/L dNTP s（四种脱氧核苷酸的混合物）、4~6mmol/L硫酸镁（MgSO4）、0.1~0.3μmol/L外引物（F3/B3），1~2μmol/L内引物（FIP/BIP），0.8～1mol/L甜菜碱，Bst DNA 聚合酶8U/μL，细菌DNA。
上游外引物F3：5’-TGCAACTACTGTAAGTAATGGA-3’
下游外引物B3：5’-TTGTTCTATGTCACTAACAGAC-3’
上游内引物FIP：5’-TGTTGGAACAATAACTTCATCTCCT-ACGGTTGCTCTTCATTTAGC-3’
下游内引物BIP：5’-AATGCTATAAAATACACAGGAGCCA-ATTTGCCAAGTTTCATTATCTGA-3’。
最佳反应体系为：反应体系为25μL，包括2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、0.4μL 10mmol/LdNTPs、0.5μL 10μmol/L上游外引物F3、0.5μL 10μmol/L下游外引物B3、1μL 40μmol/L上游内引物FIP、1μL 40μmol/L下游内引物BIP、0.6μL100mmol/L MgSO4、12.5μL 2mol/L甜菜碱、2μL细菌DNA模板、4μL灭菌双蒸水ddH2O，Bst DNA聚合酶8Μ/μL。
（2）环介导等温扩增条件：于恒温水浴锅上65℃孵育45-60min，取出反应管。
（3）观察结果：在反应管中加入1μL 10%的显色剂SYBR Green Ⅰ，直接用肉眼观察颜色变化，如颜色为橙色，说明待检测样品阴性，不含有E.coli O157，如颜色变为绿色，说明待检测样品阳性，含有E.coli O157。
实施例1：人工污染牛肉中大肠杆菌0157检测
1、样品处理
将标准菌株E.coli O157∶H7NCTC12900，在LB肉汤中复苏18h，取1mL菌液用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，将10-6、10-7、10-8三个稀释度进行平板计数，浓度分别为4×102、4×101和4×100cfu/mL；取10-8浓度菌液1ml加入到25g不含E.coli O157∶H7的牛肉样品 中，混匀1h进行人工染菌。
2、样品增菌
将上述25g人工染菌牛肉类样品，加入到225mL万古霉素-缓冲蛋白胨水中，42±1℃培养6h后得增菌液，取1mL增菌液到2mL灭菌离心管中，加入20μL
E.coli 0157免疫磁珠富集10min，用100μL PBS-Tween20洗涤3次，提取细菌DNA。
3、细菌DNA的提取
取1mL磁珠富集的细菌培养物，10000rpm离心3min，弃上清，沉淀加入50μLTE充分悬浮混匀，于100℃水浴10min，冰上冷却3min，12000r/min离心10min，取上清即为细菌DNA，备用。
4、LAMP扩增
25μL的环介导等温扩增反应体系：包括2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、0.4μL10mmol/LdNTPs、0.5μL10μmol/L上游外引物F3、0.5μL 10μmol/L下游外引物B3、1μL40μmol/L上游内引物FIP、1μL 40μmol/L下游内引物BIP、0.6μL100mmol/L MgSO4、12.5μL2mol/L甜菜碱、2μL细菌DNA模板、4μL灭菌双蒸水ddH2O，Bst DNA聚合酶8U/μL，于PE2400PCR仪上进行65℃恒温扩增45min，得到环介导等温扩增反应（LAMP）产物。
4、结果观察
扩增后的LAMP产物加入2μL10%的显色剂SYBR Green Ⅰ，结果显示为绿色，说明样品中含有E.coli O157∶H7，而阴性对照（H2O）为橙色，阳性对照（E.coli O157∶H7NCTC12900菌株DNA）为绿色。用此方法可以将低量的目标菌检测出来，灵敏度可以达到4cfu/mL。
实施例2：冷鲜猪肉中大肠杆菌0157检测
1、样品增菌
将25g市场购买的猪肉样品，加入到225mL万古霉素-缓冲蛋白胨水中，42±1℃培养8h后得增菌液，取1mL增菌液到2mL灭菌离心管中，加入20μL
E.coli 0157免疫磁珠富集10min，用100μL PBS-Tween20洗涤3次，提取细菌DNA。
2、细菌DNA的提取
取1mL磁珠富集的细菌培养物，10000rpm离心3min，弃上清，沉淀加入50μLTE充分悬浮混匀，于100℃水浴10min，冰上冷却3min，12000r/min离心10min，取上清即为细菌DNA，备用。
3、LAMP扩增
25μL的环介导等温扩增反应体系：包括2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、0.4μL10mmol/LdNTPs、0.5μL 10μmol/L上游外引物F3、0.5μL 10μmol/L下游外引物B3、1μL40μmol/L上游内引物FIP、1μL 40μmol/L下游内引物BIP、0.6μL100mmol/L MgSO4、12.5μL2mol/L甜菜碱、2μL细菌DNA模板、4μL灭菌双蒸水ddH2O，Bst DNA聚合酶8U/μL，于PE2400 PCR仪上进行65℃恒温扩增60min，得到环介导等温扩增反应（LAMP）产物。
4、显色剂观察结果
在反应管的LAMP产物中加入1μL显色剂SYBR Green Ⅰ，观察颜色变化，反应管颜色变为绿色，检测结果阳性，说明样品中含有E.coli O157，这与传统国标GB/T 4789.36-2008方法结果吻合，证明此方法数据可靠，而阴性对照（H2O）为橙色，阳性对照（E.coliO157∶H7NCTC12900菌株DNA）为绿色。
实施例3：冷鲜牛肉中大肠杆菌0157检测
1、样品增菌
将25g市场购买的牛肉样品，加入到225mL万古霉素-缓冲蛋白胨水中，42±1℃培养8h后得增菌液，取1mL增菌液到2mL灭菌离心管中，加入20μL
E.coli 0157免疫磁珠富集10min，用100μL PBS-Tween20洗涤3次，提取细菌DNA。
2、细菌DNA的提取
取1mL磁珠富集的细菌培养物，10000rpm离心3min，弃上清，沉淀加入50μLTE充分悬浮混匀，于100℃水浴10min，冰上冷却3min，12000r/min离心10min，取上清即为细菌DNA，备用。
3、LAMP扩增
25μL的环介导等温扩增反应体系：包括2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、0.4μL10mmol/LdNTPs、0.5μL 10μmol/L上游外引物F3、0.5μL 10μmol/L下游外引物B3、1μL40μmol/L上游内引物FIP、1μL 40μmol/L下游内引物BIP、0.6μL100mmol/L MgSO4、12.5μL2mol/L甜菜碱、2μL细菌DNA模板、4μL灭菌双蒸水ddH2O，Bst DNA聚合酶8U/μL，于PE2400 PCR仪上进行65℃恒温扩增60min，得到环介导等温扩增反应（LAMP）产物。
4、显色剂观察结果
在反应管的LAMP产物中加入1μL显色剂SYBR Green Ⅰ，观察颜色变化，反应管颜色为橙色，检测结果阴性，说明样品中E.coli O157未检出，这与传统国标GB/T 4789.36-2008方法的结果吻合，证明此方法数据可靠，而阴性对照（H2O）为橙色，阳性对照（E.coliO157∶H7NCTC12900菌株DNA）为绿色。
按照步骤2的方法提取表1所述菌株的DNA，分别按照步骤3和步骤4的方法进行LAMP扩增和显色剂观察结果，结果如表1所示，从表1可以看出，其他非目标菌（如表1所示）扩增和检测结果均呈阴性橙色，表明此试剂盒和检测方法具有较高的特异性。
表1：非目标菌的扩增结果
注：+阳性；-阴性。
Claims (10)
1.一种应用环介导等温扩增检测大肠埃希氏菌（Escherichia coli）O157的检测引物组，其特征在于，由下列引物组成：
上游外引物F3：5’-TGCAACTACTGTAAGTAATGGA-3’；
下游外引物B3：5’-TTGTTCTATGTCACTAACAGAC-3’；
上游内引物FIP：5’-TGTTGGAACAATAACTTCATCTCCT-ACGGTTGCTCTTCATTTAGC-3’；
下游内引物BIP：5’-AATGCTATAAAATACACAGGAGCCA-ATTTGCCAAGTTTCATTATCTGA-3’。
2.一种非疾病的诊断和治疗目的的大肠埃希氏菌O157的检测方法，其特征在于，对样品进行增菌培养获得增菌液，提取增菌液中的细菌DNA，然后通过环介导等温扩增的方法用权利要求1所述的检测引物组对细菌DNA进行选择性扩增，确认是否存在有扩增产物。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的样品为肉制品。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的肉制品为猪肉或牛肉。
5.根据权利要求3或4所述的检测方法，其特征在于，所述的对样品进行增菌培养是将样品接入选择性增菌液中，然后在42±1℃培养6~8小时，获得增菌液，所述的选择性增菌液为每225ml缓冲蛋白胨水中含有8mg万古霉素。
6.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的通过环介导等温扩增的方法用权利要求1所述的检测引物组对细菌DNA进行选择性扩增具体为：环介导等温扩增体系为体系总体积25μL，包括2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、0.4μL 10mmol/LdNTPs、0.5μL10μmol/L上游外引物F3、0.5μL 10μmol/L下游外引物B3、1μL 40μmol/L上游内引物FIP、1μL 40μmol/L下游内引物BIP、0.6μL100mmol/L MgSO4、12.5μL 2mol/L甜菜碱、4μL灭菌双蒸水ddH2O，Bst DNA聚合酶8U/μL和2μL细菌DNA，反应条件为在温度为65℃孵育45~60min。
7.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的确认是否存在有扩增产物是利用电泳检测、荧光显色检测或浊度检测环介导等温扩增反应产物是否具有扩增产物。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述的用荧光显色检测，具体是在反应管中加入SYBR Green Ⅰ显色剂，1~5min后观察结果，如果颜色为橙色，则样品大肠埃希氏菌O157阴性，无大肠埃希氏菌O157，如果颜色为绿色，则样品大肠埃希氏菌O157阳性，含有大肠埃希氏菌O157。
9.一种大肠埃希氏菌O157的检测试剂盒，包括环介导等温扩增试剂和检测引物组，其特征在于，所述的检测引物组由下列引物组成：
上游外引物F3：5’-TGCAACTACTGTAAGTAATGGA-3’
下游外引物B3：5’-TTGTTCTATGTCACTAACAGAC-3’
上游内引物FIP：5’-TGTTGGAACAATAACTTCATCTCCT-ACGGTTGCTCTTCATTTAGC-3’
下游内引物BIP：5’-AATGCTATAAAATACACAGGAGCCA-ATTTGCCAAGTTTCATTATCTGA-3’。
10.根据权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的大肠埃希氏菌O157的检测试剂盒还包括选择性增菌液，该选择性增菌液为每225ml缓冲蛋白胨水中含有8mg万古霉素。
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