CN110982916B - 用于检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的引物组合及检测试剂盒 - Google Patents

用于检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的引物组合及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种用于检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的引物组合及检测试剂盒。本发明提供的引物组合由引物组I、引物组II和引物组III组成，即序列1至序列18所示的18条引物，实现了对产志贺毒素的大肠埃希氏菌的全部基因亚型进行快速检测。

Description

用于检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的引物组合及检测试剂盒
技术领域
本发明涉及细菌的分子生物学检测领域。更具体地，涉及一种用于检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的引物组合及检测试剂盒。
背景技术
产志贺毒素大肠杆菌(Shigatoxin-producing Escherichiacoli,STEC)是一类能产志贺毒素(志贺毒素1和/志贺毒素2)的大肠埃希氏菌的总称，是引起人类疾病的重要食源性致病菌之一，可引起人水样腹湾、出血性肠炎以及溶血性尿毒综合征(HUS)等，具有较高的发病率和死亡率。近年来，STEC在全球范围内引起散发感染和暴发报道明显增多，加强对STEC的日常监测，尤其对暴发疫情的现场快速处置尤为重要。目前，用于检测STEC的实验室方法很多，如传统检测法、免疫检测法和分子检测法。其中基因水平的检测，特别聚合酶链式反应(PCR)作为常用的一种分子生物学检测手段，已被普遍应用到大肠杆菌的检测当中，也是目前STEC暴发疫情处置首选的实验室检测技术。但是，就普通PCR技术来说，无论是单一还是多重反应都至少需要2-3小时左右的扩增后再进行电泳的步骤。而荧光定量PCR技术虽然不用进行电泳，但受荧光定量PCR仪通道数量的影响，以及多重荧光定量PCR试剂需要配置多种荧光探针，价格十分昂贵，并且高通道荧光定量PCR仪亦价格不菲，同时对实验室条件要求更高，基层推广受限。
此外，志贺毒素1(Stx1)基因存在a，c和d亚型，志贺毒素2(Stx2)基因存在a，b，c，d，e，f和g亚型。迄今为止，市场上还未见能够检测出志贺毒素1(Stx1)及2(Stx2)基因序列中全部基因亚型的方法。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供用于检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的引物组合。
本发明的第二个目的在于提供上述引物组合在制备用于检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的试剂盒中的应用，及检测试剂盒。
本发明的第三个目的在于提供一种产志贺毒素大肠埃希氏菌的检测方法。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
第一方面，本发明提供一种用于检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的引物组合：由引物组I、引物组II和引物组III组成：
所述引物组I由引物UidA-F3、引物UidA-B3、引物UidA-FIP、引物UidA-BIP、引物UidA-LF和引物UidA-LB组成；用于检测待测物是否含有大肠埃希氏菌。
所述引物UidA-F3为序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述引物UidA-B3为序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，所述引物UidA-FIP为序列表SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，所述引物UidA-BIP为序列表SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，所述引物UidA-LF为序列表SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，所述引物UidA-LB为序列表SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；
所述引物组II由引物Stx1-F3、引物Stx1-B3、引物Stx1-FIP、引物Stx1-BIP、引物Stx1-LF和引物Stx1-LB组成；用于检测待测物是否含有产志贺毒素1菌株。
所述引物Stx1-F3为序列表SEQ ID No.7所示的核苷酸序列，所述引物Stx1-B3为序列表SEQ ID No.8所示的核苷酸序列，所述引物Stx1-FIP为序列表SEQ ID No.9所示的核苷酸序列，所述引物Stx1-BIP为序列表SEQ ID No.10所示的核苷酸序列，所述引物Stx1-LF为序列表SEQ ID No.11所示的核苷酸序列，所述引物Stx1-LB为序列表SEQ ID No.12所示的核苷酸序列；
所述引物组III由引物Stx2-F3、引物Stx2-B3、引物Stx2-FIP、引物Stx2-BIP、引物Stx2-LF和引物Stx2-LB组成；用于检测待测物是否含有产志贺毒素2菌株。
所述引物Stx2-F3为序列表SEQ ID No.13所示的核苷酸序列，所述引物Stx2-B3为序列表SEQ ID No.14所示的核苷酸序列，所述引物Stx2-FIP为序列表SEQ ID No.15所示的核苷酸序列，所述引物Stx2-BIP为序列表SEQ ID No.16所示的核苷酸序列，所述引物Stx2-LF为序列表SEQ ID No.17所示的核苷酸序列，所述引物Stx2-LB为序列表SEQ ID No.18所示的核苷酸序列。
第二方面，本发明要求保护上述用于检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的引物组合在制备检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的试剂盒中的应用。
根据本发明的具体实施方式，检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的试剂盒除了上述引物组合外，还可以包括实现LAMP反应所需的试剂，例如LAMP反应缓冲液、dNTPs和Bst DNA聚合酶等。
第三方面，本发明提供一种产志贺毒素大肠埃希氏菌的检测方法，该方法包括：以待测物的基因组DNA为模板，利用上述引物组合进行LAMP反应；通过反应液颜色变化或反应液浊度变化进行结果判定。
根据本发明的具体实施方式，以待测物的基因组DNA为模板，依次分别采用所述引物组合中的引物组I至引物组III进行LAMP反应，结果判定可以采用如下方法中的任一种：
(1)采用实时浊度仪实时浊度检测判定结果。实时浊度仪检测：LAMP在反应过程中发生以下反应式：
(DNA)n-1+dNTP—→(DNA)n+P2O7 4-
P2O7 4-+2Mg2+—→Mg2P2O7↓
其中Mg2P2O7即焦磷酸镁，为白色沉淀。依据这个原理，每隔6秒测定反应管的浊度并绘制成扩增直方图或曲线来判断反应的阴阳性。如果在反应50min内出现阳性扩增直方图(或“S型”扩增曲线)，表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如果在50min内没有出现扩增直方图(或“S型”扩增曲线)，表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。即UidA和Stx(Stx1或Stx2)两者反应管都为浊度上升表示待测样品中检出产志贺毒素1或2大肠埃希氏菌，两者之一或全部浊度无变化表示待测样品中未检出产志贺毒素1或2大肠埃希氏菌。
(2)目测法判定结果
当在反应液中添加Te指示显色剂，例如钙黄绿素指示剂时，根据反应液的颜色变化判断结果，在反应发生30-50分钟，反应管为绿色表示待测样品中检出目标基因，反应结果判定为阳性，橙色表示待测样品中未检出目标基因，反应结果判定为阴性。即UidA和Stx(Stx1或Stx2)两者反应管都为绿色表示待测样品中检出产志贺毒素1或2大肠埃希氏菌，两者之一或全部橙色表示待测样品中未检出产志贺毒素1或2大肠埃希氏菌；
本发明的有益效果如下：
本发明借助于LAMP快速检测技术，实现了对产志贺毒素的大肠埃希氏菌的全部基因亚型进行快速检测。本发明可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到产志贺毒素大肠埃希氏菌，不需要复杂仪器，为产志贺毒素大肠埃希氏菌检测提供了一个新的技术平台，可用于卫生应急系统现场筛查和检测产志贺毒素大肠埃希氏菌，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。
具体的：
1)高特异性：每组反应的6条引物对产志贺毒素大肠埃希氏菌靶序列的8个特异区域的识别保证了LAMP扩增的高度特异性，即LAMP能从相差仅一个核苷酸的基因标本中找出相应的靶序列进行扩增；
2)高灵敏度：灵敏度比普通PCR至少高100倍；
3)结果鉴定简便：可通过肉眼观察结果(钙黄绿素显色)，也可以直接用浊度仪判断结果；
4)操作简单：只要将检测样品(靶核酸)和检测试剂一起放入65℃恒温水浴锅中50分钟后就可以判断结果；
5)快速、高效扩增：整个LAMP扩增反应一小时内即可完成，且产率可达到0.5mg/mL。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1实施例3中采用引物组I的检测结果。
图2实施例3中采用引物组II的检测结果。
图3实施例3中采用引物组III的检测结果。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1LAMP检测的引物设计与合成
根据三种目标序列UidA，Stx1以及Stx2全部阅读框架的特点进行引物的设计。每组基因序列对应设计多组引物，大约100余组，筛选出可以扩增出Stx1基因a,c和d亚型，以及Stx2基因a,b,c,d,e,f和g亚型，并且扩增效率好，扩增速度快的LAMP引物。引物合成由北京擎科生物科技有限公司合成并纯化。
具体的，针对大肠杆菌种属UidA保守序列ID:CP043478.1设计用于检测大肠埃希氏菌的LAMP引物，筛选得引物组I，见表1：
表1引物序列表
Figure BDA0002353202630000041
针对产志贺毒素1(Stx1)大肠埃希氏菌保守序列ID:CP028700.1设计用于检测产志贺毒素1大肠埃希氏菌的LAMP引物，筛选得引物组II，见表2：
表1引物序列表
Figure BDA0002353202630000042
针对产志贺毒素2大肠埃希氏菌保守序列ID:CP032811.1设计用于检测产志贺毒素2大肠埃希氏菌的LAMP引物，筛选得引物组III，见表3：
表3引物序列表
Figure BDA0002353202630000043
Figure BDA0002353202630000051
实施例2本发明对产志贺毒素大肠埃希氏菌的LAMP检测方法的建立
在不同反应条件下对产志贺毒素1或2大肠埃希氏菌基因组DNA进行LAMP检测，以确定最佳反应条件，具体方法包括以下步骤：
以含产志贺毒素1或2大肠埃希氏菌基因组DNA为模板，采用实施例1获得的引物组I至引物组III进行LAMP扩增，其中LAMP反应采用LAMP法核糖核酸扩增试剂盒(DNAAmplification Kit)，购自日本荣研化学株式会社(EIKEN CHEMICAL CO.,LTD,Tochigi,Japan)。23μl LAMP反应体系包括：反应缓冲液12.5μl(40mM Tris·HCl(pH 8.8)，20mMKCl，20mM(NH4)2SO4，0.2％Tween 20，1.6M甜菜碱(betaine)，16mM MgSO4，2.8mM dNTPs)，Bst DNA聚合酶1μl，以及相应的引物。引物加入量为：40pmol引物-FIP(UidA-FIP或Stx1-FIP或Stx2-FIP)，40pmol引物-BIP(UidA-BIP或Stx1-BIP或Stx2-BIP)，20pmol引物-LF(UidA-LF或Stx1-LF或Stx2-LP)，20pmol引物-LB(UidA-LB或Stx1-LB或Stx2-LB)，5pmol引物-F3(UidA-F3或Stx1-F3或Stx2-F3)，5pmol引物-B3(UidA-B3或Stx1-B3或Stx2-B3)。之后加去离子水补齐成23μl，最后加待测物的基因组DNA2μl构成25μl反应体系。上述反应体系为采用实时浊度法检测。若采用荧光目视检测时，需要在向上述预混溶液中添加荧光目视检测试剂1μl Te显色剂(北京海泰正元科技有限公司)，使其在未加入待测样本基因组前合计量仍达23μl即可。
LAMP的扩增条件为：置60℃-67℃恒温60min左右。以双蒸水为阴性对照。
反应结束后，进行结果判定。检测结果表明，本发明最佳的产志贺毒素1和2大肠埃希氏菌LAMP扩增条件为：置65℃，建议恒温时间为50min为宜。
实施例3特异性、灵敏性检测
一、本发明产志贺毒素大肠埃希氏菌的LAMP检测方法的特异性检测
1.待测菌株样本信息：采用菌株样本DNA基因组作为模板来进行LAMP检测。
表1具体菌株样本信息包括编号，菌株名称及包含基因
Figure BDA0002353202630000052
/>
Figure BDA0002353202630000061
2、LAMP法核糖核酸扩增试剂盒(DNAAmplification Kit)，日本荣研化学株式会社(EIKEN CHEMICAL CO.,LTD,Tochigi,Japan)；LAMP反应管(Reaction Tube)，日本荣研化学株式会社；Te显色剂(北京海泰正元科技有限公司)；实时浊度仪La-320C，日本荣研化学株式会社(EIKEN CHEMICAL CO.,LTD,Tochigi,Japan)；分光光度计：NanoDrop ND-1000。
3、待测样本的检测
以步骤1中的选用菌株样本中各待测样本为模板，分别采用实施例1制备的引物组I至引物组III对模板进行环介导等温扩增检测。反应条件及过程见实施例2。
LAMP反应结果检测：
(1)采用实时浊度仪La-320C(日本荣研化学株式会社)进行实时浊度检测判定结果。
实时浊度仪检测：LAMP在反应过程中发生以下反应式：
(DNA)n-1+dNTP—→(DNA)n+P2O7 4-
P2O7 4-+2Mg2+—→Mg2P2O7↓
其中Mg2P2O7即焦磷酸镁，为白色沉淀。依据这个原理，日本荣研化学株式会社开发出实时浊度仪LA-320c，每隔6秒测定反应管的浊度并绘制成扩增直方图或曲线来判断反应的阴阳性。本专利中全部反应扩增高峰均在反应发生14至25分钟之间。
如果在50min内出现阳性扩增直方图(或“S型”扩增曲线)，表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如果在50min内没有出现扩增直方图(或“S型”扩增曲线)，表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。
(2)目测法判定结果
当在反应液中添加Te指示显色剂，例如钙黄绿素指示剂时，根据反应液的颜色变化判断结果，在反应发生30-50分钟，反应管为绿色表示待测样品中存在目标基因，反应结果判定为阳性，橙色表示待测样品中不存在目标基因，反应结果判定为阴性。
4.实验结果
采用引物组I的检测结果见图1。结果表明，只有当待测样本为含有Uida基因组DNA(待测样本编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、13、14、15、16、17)的时候显示阳性扩增直方图(或“S型”扩增曲线)。当待测样本为样本编号为11、12、18、19、20或21的时候均不显示阳性扩增直方图(或“S型”扩增曲线)。当在反应液中添加显色剂，例如钙黄绿素指示剂时，根据反应液的颜色变化判断结果，反应管为绿色表示待测样品中存在Uida基因，橙色表示待测样品中不存在Uida基因；或者不添加钙黄绿素指示剂直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果，反应管为浊度上升表示待测样品中存在Uida基因，浊度无变化表示待测样品中不存在Uida基因。结果判定包括上述判定方式中任一方式，且上述判定结果均一致。
采用引物组II的检测结果见图2。结果表明，只有当待测样本为含有Stx1基因组DNA(待测样本编号为1、2、3、4、9、10)的时候显示阳性扩增直方图(或“S型”扩增曲线)。当待测样本为样本编号为5、6、7、8、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21的时候均不显示阳性扩增直方图(或“S型”扩增曲线)。当在反应液中添加显色剂，例如钙黄绿素指示剂时，根据反应液的颜色变化判断结果，反应管为绿色表示待测样品中存在Stx1基因，橙色表示待测样品中不存在Stx1基因；或者不添加钙黄绿素指示剂直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果，反应管为浊度上升表示待测样品中存在Stx1基因，浊度无变化表示待测样品中不存在Stx1基因。结果判定包括上述判定方式中任一方式，且上述判定结果均一致。
采用引物组III的检测结果见图3。结果表明，只有当待测样本为含有Stx2基因组DNA(待测样本编号为1、2、3、5、6、7、8、9、10)的时候显示阳性扩增直方图(或“S型”扩增曲线)。当待测样本为样本编号为4、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21的时候均不显示阳性扩增直方图(或“S型”扩增曲线)。当在反应液中添加显色剂，例如钙黄绿素指示剂时，根据反应液的颜色变化判断结果，反应管为绿色表示待测样品中存在Stx2基因，橙色表示待测样品中不存在Stx2基因；或者不添加钙黄绿素指示剂直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果，反应管为浊度上升表示待测样品中存在Stx2基因，浊度无变化表示待测样品中不存在Stx2基因。结果判定包括上述判定方式中任一方式，且上述判定结果均一致。
结论：以上结果表明，本发明提供的产志贺毒素1和2大肠埃希氏菌的LAMP引物组合中的三个引物组分别对其靶标基因有很高的特异性。
二、本发明产志贺毒素大肠埃希氏菌的LAMP检测方法的灵敏度检测
1、将待测样本1用无菌水进行10倍梯度稀释，得到各个稀释液。模板浓度依次为：1,100ng/微升；2,10ng/微升；3,1ng/微升；4,100pg/微升；5,10pg/微升；6,1pg/微升；7,100fg/微升；8,10fg/微升；9,1fg/微升；10,0.1fg/微升；11，双蒸水
2、同“特异性检测”的步骤
3、同“特异性检测”的步骤
4、实验结果
结果显示，引物组Ⅰ、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ检测靶标基因的灵敏度均为10fg/反应。
结论：本发明产志贺毒素1和2大肠埃希氏菌LAMP检测方法检测下限为10fg/反应，推算该方法比普通PCR至少明感100倍。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
序列表
<110> 刘思洁
赵薇
李可维
<120> 用于检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的引物组合及检测试剂盒
<130> JLC19I1041E
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctgacgcgat caaagacg 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atttggaaac ggcagagaa 19
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctcaatgtac accgacatgt ggacggtgat acatatccag ccat 44
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gctaacgtat ccacgccgta ttcgggtact ggaaaaagaa cttctg 46
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgaagagta tcagtgtgc 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggctgatgca gtttctcct 19
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
attgtgcgta atcccacg 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agtagtgtcc tgcctgat 18
<210> 9
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtcatcatca tgcatcgcga gttgtgccgg acacatagaa gg 42
<210> 10
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aattcagtat taatgccacg cttccggaca agactctgtt cgt 43
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cagaatggca tctgatgagt 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agaattgcat taatgcttcc a 21
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggtttcatca tatctggc 18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gagtgaggtc cacgtctc 18
<210> 15
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgacagtgac aaaacgcaga actagttcag tggtaataca atgac 45
<210> 16
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agcagaagcc ttacgcttca aggagcagtt tcagacag 38
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gctctggatg catctct 17
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cagagagaat ttcgtcag 18

Claims (4)

1.用于检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的引物组合，其特征在于，由引物组I、引物组II和引物组III组成：
所述引物组I由引物UidA-F3、引物UidA-B3、引物UidA-FIP、引物UidA-BIP、引物UidA-LF和引物UidA-LB组成；
所述引物UidA-F3为序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述引物UidA-B3为序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，所述引物UidA-FIP为序列表SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，所述引物UidA-BIP为序列表SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，所述引物UidA-LF为序列表SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，所述引物UidA-LB为序列表SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；
所述引物组II由引物Stx1-F3、引物Stx1-B3、引物Stx1-FIP、引物Stx1-BIP、引物Stx1-LF和引物Stx1-LB组成；
所述引物Stx1-F3为序列表SEQ ID No.7所示的核苷酸序列，所述引物Stx1-B3为序列表SEQ ID No.8所示的核苷酸序列，所述引物Stx1-FIP为序列表SEQ ID No.9所示的核苷酸序列，所述引物Stx1-BIP为序列表SEQ ID No.10所示的核苷酸序列，所述引物Stx1-LF为序列表SEQ ID No.11所示的核苷酸序列，所述引物Stx1-LB为序列表SEQ ID No.12所示的核苷酸序列；
所述引物组III由引物Stx2-F3、引物Stx2-B3、引物Stx2-FIP、引物Stx2-BIP、引物Stx2-LF和引物Stx2-LB组成；
所述引物Stx2-F3为序列表SEQ ID No.13所示的核苷酸序列，所述引物Stx2-B3为序列表SEQ ID No.14所示的核苷酸序列，所述引物Stx2-FIP为序列表SEQ ID No.15所示的核苷酸序列，所述引物Stx2-BIP为序列表SEQ ID No.16所示的核苷酸序列，所述引物Stx2-LF为序列表SEQ ID No.17所示的核苷酸序列，所述引物Stx2-LB为序列表SEQ IDNo.18所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述用于检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的引物组合在制备检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的试剂盒中的应用。
3.一种检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组合。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括实现LAMP反应的试剂。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111518934A (zh) * 2020-05-21 2020-08-11 四川大学 大肠杆菌及6种致病型基因的快速检测方法及试剂盒
CN112391485A (zh) * 2020-12-09 2021-02-23 江西中医药大学 用于检测口服药品中大肠杆菌的特异性引物及其检测方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102943113A (zh) * 2012-11-22 2013-02-27 广东省微生物研究所 大肠杆菌o157的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和试剂盒
CN108796098A (zh) * 2018-06-13 2018-11-13 华南理工大学 一种psr等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的引物、试剂盒及其方法
CN109355408A (zh) * 2018-09-26 2019-02-19 华南理工大学 一种psr检测大肠杆菌i型志贺毒素的引物、试剂盒及其方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2843057B1 (en) * 2013-09-03 2017-12-27 Pall Genedisc Technologies Method for determining the presence or absence of shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) in a food sample

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102943113A (zh) * 2012-11-22 2013-02-27 广东省微生物研究所 大肠杆菌o157的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和试剂盒
CN108796098A (zh) * 2018-06-13 2018-11-13 华南理工大学 一种psr等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的引物、试剂盒及其方法
CN109355408A (zh) * 2018-09-26 2019-02-19 华南理工大学 一种psr检测大肠杆菌i型志贺毒素的引物、试剂盒及其方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Xihong Zhao et al..Development and application of a loop-mediated isothermal amplification method on rapid detection Escherichia coli O157 strains from food samples .《Mol Biol Rep》.2009,第37卷摘要，第2186页表2. *
游淑珠等.LAMP 实时浊度法快速检测食品中产志贺毒素大肠埃希氏菌 .《食品工业科技》.2018,第39卷(第22期),241-246. *

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