CN110093429B - 一种腹泻性致病菌的高通量定量检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种腹泻性致病菌的高通量定量检测试剂盒，特点是包括9种腹泻性致病菌的LAMP检测引物组，特点是基因序列如SEQ ID NO.1～NO.36所示，还包括样品模板、10×反应缓冲液、MgSO4、dNTP、Bst DNA聚合酶和双蒸水，优点是特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强、成本低和无假阴性结果。
Description
技术领域
本发明涉及一种致腹泻性致病菌的快速检测试剂盒，尤其是涉及一种腹泻性致病菌的高通量定量检测试剂盒。
背景技术
腹泻（diarrhea）是临床上常见的症状，可因多种疾病而引起。一般是指每天大便次数增加或排便次数频繁，粪便稀薄或含有黏液脓血，或者还含有不消化的食物及其他病理性内容物，主要原因有细菌感染、病毒感染、食物中毒、生冷食物、食物滞留、肠道感染和小肠吸收不良等。细菌感染指人们在食用了被大肠杆菌、沙门菌、志贺菌等细菌污染的食品，或饮用了被细菌污染的饮料后可能发生肠炎或菌痢，出现不同程度的腹痛、腹泻、呕吐、里急后重、发热等症状。病毒感染指人体通过食物或其他途径感染多种病毒后易引起病毒性腹泻，如：感染轮状病毒、诺瓦克病毒、柯萨奇病毒、埃可等病毒后，出现腹痛、腹泻、恶心、呕吐、发热及全身不适等症状。感染性腹泻常伴有腹痛、恶心、呕吐及发热，小肠感染常为水样泻，大肠感染常含血性便。急性腹泻应根据病史、发病季节、伴随的全身症状等，首先通过粪便培养鉴别是病毒、细菌、寄生虫等引起的感染性腹泻，还是食物中毒、药物或其他疾病引起的腹泻，由于培养时间较长，不能鉴定到种，也不能定量。目前现有的致病性细菌检测技术有传统技术、基因芯片检测技术和测序技术。它们一般都需要大型的检测设备、昂贵的检测试剂，检测时间都超过24h，并且都是定性检测。因此，亟需一种腹泻性致病菌的高通量定量检测试剂盒，实现快速定量检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强、成本低、无假阴性结果的腹泻性致病菌的高通量定量检测试剂盒。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种腹泻性致病菌的高通量定量检测试剂盒，包括9种腹泻性致病菌的LAMP检测引物组，其基因序列如下表1所示：
表 1
所述的检测试剂盒的LAMP反应体系及各成分的终浓度如下：样品模板DNA 1μL，2.5μL 10×反应缓冲液，1.5μL浓度为100mM 的MgSO4，3.5μL 浓度为10mM 的dNTP，1μL浓度为8 U/μl Bst DNA 聚合酶，1μL FIP/BIP引物组溶液，1μL F3/B3引物组溶液和4μL甜菜碱，然后用双蒸水补足25μL；其中所述的FIP/BIP 引物组溶液分别为表1所述的单增李斯特菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属、致病性大肠杆菌、蜡样芽胞杆菌、奇异变形杆菌和副溶血弧菌的FIP/BIP引物组溶液，各引物终浓度均为40 μM，所述的F3/B3引物组溶液分别为表1所述的单增李斯特菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属、致病性大肠杆菌、蜡样芽胞杆菌、奇异变形杆菌和副溶血弧菌的F3/B3引物组溶液，各引物终浓度均为5 μM。
所述的检测试剂盒还包括显色剂，所述的显色剂为钙黄绿素/氯化锰溶液或者羟基萘酚蓝溶液或者SYBR-Green I，其中钙黄绿素/氯化锰溶液中钙黄绿素浓度为75μM，氯化锰浓度为 500μM；所述的羟基萘酚蓝溶液浓度为150μM，所述的钙黄绿素/氯化锰溶液或者所述的羟基萘酚蓝溶液的添加量为1μL/孔，所述的SYBR-Green I显色剂的添加量为5μL/孔。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种腹泻性致病菌的高通量定量检测试剂盒设计的引物特异强，可进行快速扩增，通过荧光染料根据双链DNA的多少来确定病原模板的量，从而达到定量检测，时间在2-3h就完成了整个检测，具有特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强、成本低、无假阴性结果的优点。
附图说明
图1为9种腹泻性致病菌LAMP特异性检测电泳图；其中A：单增李斯特菌特异性检测电泳图；B：霍乱弧菌特异性检测电泳图；C：金黄色葡萄球菌特异性检测电泳图；D：沙门氏菌属特异性检测电泳图；E：志贺氏菌属特异性检测电泳图；F：致病性大肠杆菌特异性检测电泳图；G：蜡样芽胞杆菌特异性检测电泳图；H：奇异变形杆菌特异性检测电泳图；I：副溶血弧菌特异性检测电泳图；M：DL2000 DNA Marker；1：单增李斯特菌；2：霍乱弧菌；3：金黄色葡萄球菌；4：沙门氏菌属；5：志贺氏菌属；6：致病性大肠杆菌；7：蜡样芽胞杆菌；8：奇异变形杆菌；9：副溶血弧菌；10：阴性对照；
图2为9种腹泻性致病菌LAMP特异性可视化检测图，其中注：A：单增李斯特菌特异性检测图；B：霍乱弧菌特异性检测图；C：金黄色葡萄球菌特异性检测图；D：沙门氏菌属特异性检测图；E：志贺氏菌属特异性检测图；F：致病性大肠杆菌特异性检测图；G：蜡样芽胞杆菌特异性检测图；H：奇异变形杆菌特异性检测图；I：副溶血弧菌特异性检测图；M：DL2000 DNAMarker；1：单增李斯特菌；2：霍乱弧菌；3：金黄色葡萄球菌；4：沙门氏菌属；5：志贺氏菌属；6：致病性大肠杆菌；7：蜡样芽胞杆菌；8：奇异变形杆菌；9：副溶血弧菌；10：阴性对照；
图3为9种腹泻性致病菌LAMP灵敏度检测检测图；其中左侧为电泳图，右侧为可视化检测图，A：单增李斯特菌特异性检测图；B：霍乱弧菌特异性检测图；C：金黄色葡萄球菌特异性检测图；D：沙门氏菌属特异性检测图；E：志贺氏菌属特异性检测图；F：致病性大肠杆菌特异性检测图；G：蜡样芽胞杆菌特异性检测图；H：奇异变形杆菌特异性检测图；I：副溶血弧菌特异性检测图；M：DL2000 DNA Marker；1：阴性对照；8-2：分别为10倍浓度梯度稀释的质粒模板；
图4为具体实施例五样品检测实例图，其中A为羟基萘酚蓝作为指示剂的微流控生物芯片检测结果，B为SYBR-Green I作为指示剂的微流控生物芯片检测结果；1：单增李斯特菌；2：霍乱弧菌；3：金黄色葡萄球菌；4：沙门氏菌属；5：志贺氏菌属；6：致病性大肠杆菌；7：蜡样芽胞杆菌；8：奇异变形杆菌；9：副溶血弧菌；10：阴性对照。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例一
一种腹泻性致病菌的高通量定量检测试剂盒，包括9种腹泻性致病菌的LAMP检测引物组，其基因序列如下表1所示：
表 1
上述基因靶位点设计：选种间特异、种内保守的基因设计引物，是因为外部引物F3同样有机会与模板上的F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链。此时，FIP上的F1c就能实现与此单链上Fl的互补，通过自我碱基配对形成环状结构。同样的，下游引物BIP和B3存在类似于引物FIP和F3的合成，这就为形成哑铃状的单链结构提供了可能。此时，3’端的Fl区段在具有链置换能力的DNA聚合酶作用下，就会以自身为模板，进行DNA合成，形成茎环状结构。
依据上述选择9种腹泻致病菌的特异性基因片段为靶目标，应用PRIMEREXPLORERV5软件设计引物，引物的合成由上海生工生物工程有限公司完成。将引物与靶目标比对，进行大量筛选试验和分析，得到特异、敏感、稳定的上述F3、B3、FIP、BIP 的LAMP检测引物组；将设计合成的4条引物进行反应时间和温度优化实验后，确定扩增效率和特异性最好的反应条件。
具体实施例二
一种腹泻性致病菌的高通量定量检测试剂盒，其LAMP反应体系及各成分的终浓度如下：样品模板DNA 1μL， 2.5μL 10×反应缓冲液，1.5μL浓度为100mM 的MgSO4，3.5μL 浓度为10mM 的dNTP，1μL浓度为8 U/μl Bst DNA 聚合酶，1μL FIP/BIP引物组溶液，1μL F3/B3引物组溶液和4μL甜菜碱，然后用双蒸水补足25μL；其中FIP/BIP 引物组溶液分别为表1所示的单增李斯特菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属、致病性大肠杆菌、蜡样芽胞杆菌、奇异变形杆菌和副溶血弧菌9个菌的FIP/BIP引物组溶液，各引物终浓度均为40 μM， F3/B3引物组溶液分别为上述表1所示的单增李斯特菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属、致病性大肠杆菌、蜡样芽胞杆菌、奇异变形杆菌和副溶血弧菌9个菌的F3/B3引物组溶液，各引物终浓度均为5 μM。
上述检测试剂盒还包括显色剂，显色剂为钙黄绿素/氯化锰溶液或者羟基萘酚蓝溶液或者SYBR-Green I，其中钙黄绿素/氯化锰溶液中钙黄绿素浓度为75μM，氯化锰浓度为500μM；所述的羟基萘酚蓝溶液浓度为150μM，钙黄绿素/氯化锰溶液或者羟基萘酚蓝溶液的添加量为1μL/孔，SYBR-Green I显色剂的添加量为5μL/孔。还设置有阴性对照为水，阳性对照为双链的DNA。
具体实施例三
一种利用上述具体实施例二检测试剂盒进行腹泻性致病菌的高通量定量检测的方法，包括以下步骤：
取待检样品，按照市售细菌DNA提取试剂盒提取样品模板DNA，取样品模板DNA 1μL，按照LAMP反应体系组成加入2.5μL 10×反应缓冲液，1.5μL MgSO4，3.5μL dNTP，1μL Bst DNA 聚合酶，1μL FIP/BIP引物组溶液，1μL F3/B3引物组溶液和4μL甜菜碱，然后用双蒸水补足25μL后混匀，取混合液20μL加至样品检测芯片的每个加样孔（其中引物组溶液分别为单增李斯特菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属、致病性大肠杆菌、蜡样芽胞杆菌、奇异变形杆菌和副溶血弧菌9个菌的引物组溶液，每一个菌种的引物组溶液相应加到一个加样孔中，加上加阴性对照的加样孔，参与反应的加样孔一共为10个），再在每个孔中加入1μL显色剂，打开仪器电源开关，待屏幕自检完成，打开反应室盖，将芯片放入仪器反应室内，盖上反应室盖，屏幕上点击“开始”按钮，仪器自动进行，等待反应结束，仪器提示后进入检测菜单界面，选择检测，仪器会自动读取芯片反应室的颜色数据（使用羟基萘酚蓝作为显色剂时阳性为蓝色，阴性为紫罗兰色；使用钙黄绿素为显色剂时，绿色为阳性，黄色为阴性）并按照RGB值进行浓度换算，最后给出每个孔样品中所含细菌核酸的拷贝数。
若是使用SYBR-Green I显色液时，取混合液20μL加至样品检测芯片的每个加样孔。打开仪器电源开关，待屏幕自检完成，打开反应室盖，将芯片放入仪器反应室内，盖上反应室盖，屏幕上点击“开始”按钮，仪器自动进行，等待反应结束，取出芯片，每个加样孔加5μL的SYBR-Green I的工作液。进入仪器检测菜单界面，选择检测，仪器会自动读取芯片反应室的颜色数据（绿色为阳性，橙色为阴性）并按照RGB值进行浓度换算，最后给出每个样品中所含细菌核酸的拷贝数。
图1为上述9种腹泻性致病菌的LAMP反应后的电泳图谱；图2为采用上述方法使用SYBR-Green I染料后的9种腹泻性致病菌的LAMP反应结果，绿色的为阳性，橙色的为阴性。由图1和图2可知，样品检测芯片中只有对应的腹泻致病菌LAMP检测引物为阳性，空白对照及其余非目的菌检测结果均为阴性。
具体实施例四
灵敏度试验：将分别含有9种腹泻性致病菌特异片段的质粒10倍梯度稀释，取各稀释度进行LAMP扩增反应，9种病原微生物LAMP 方法的检测限为10-70 copies /μL。如图3所示，图中8为原始浓度，8-2分别为10倍稀释的模板，进行LAMP反应后，分别用电泳和使用SYBR-Green I染料染色观察结果。初始浓度A ：3.25×107 copies /μL、B：6.77×107copies /μL、C：5.15×107 copies /μL、D：6.33×107 copies /μL、E：1.86×107 copies /μL、F：2.92×107 copies /μL、G：4.87×107 copies /μL、H：5.73×107 copies /μL、I：4.74×107 copies /μL。
具体实施例五
将疑似待测食物样品2例按照相关国标方法进行样品前处理，制备DNA模板，样品经上述具体实施例三方法LAMP反应（离心式微流控生物芯片）检测后， A样品使用羟基萘酚蓝进行显示， B通过SYBR-Green I染料染色。结果如图4所示，结果显示样品A中含有蜡样芽胞杆菌和沙门氏菌，B样品中，含有蜡样芽胞杆菌和副溶血弧菌。经生理生化试验验证，以上两个样品中含有检出的致病菌。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 宁波大学
<120> 一种腹泻性致病菌的高通量定量检测试剂盒
<130>
<160> 36
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单增李斯特菌recA-F3
<400> 1
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<211> 19
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<400> 2
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<400> 20
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<223> 致病性大肠杆菌ehxA-F3
<400> 21
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<400> 22
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<223> 致病性大肠杆菌ehxA-FIP
<400> 23
ACTGCATGCTGACGAGAAAAATCATGCTGCGTTTTTAGAAGAC 43
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<223> 致病性大肠杆菌ehxA-BIP
<400> 24
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<223> 蜡样芽胞杆菌cesT-FIP
<400> 27
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<220>
<223> 奇异变形杆菌flhD-B3
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TGTTCTATTGTTTCGCTGTC 20
<210> 31
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 奇异变形杆菌flhD-FIP
<400> 31
CATAGAATCGCTGATACCCAGTCTGCAGAGGTTAATTAACCAAGA 45
<210> 32
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 奇异变形杆菌flhD-BIP
<400> 32
GATGCACTAAAAGAGCTAACATTGCTTCAAACCGGAAATTACAGAT 46
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 副溶血弧菌VirG-F3
<400> 33
TTCAGAGCCAAGCGAATG 18
<210> 34
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 副溶血弧菌VirG-B3
<400> 34
CTCCTTTCCCAGCTTGAA 18
<210> 35
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 副溶血弧菌VirG-FIP
<400> 35
TCTTGACACATCTCCACCTCTATATGGTGGATTTCTGTCGAAGG 44
<210> 36
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 副溶血弧菌VirG-BIP
<400> 36
ATCAATGTCTTACTGTTGCTTCTCAGCGCAATAAGAAAAGAATATTGAAC 50
Claims (3)
1.一种腹泻性致病菌的高通量定量检测试剂盒，其特征在于：包括9种腹泻性致病菌的LAMP检测引物组，所述9种腹泻性致病菌为单增李斯特菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属、致病性大肠杆菌、蜡样芽胞杆菌、奇异变形杆菌和副溶血弧菌，所述9种腹泻性致病菌的LAMP检测引物组的核苷酸序列如下表所示：
2.根据权利要求1所述的一种腹泻性致病菌的高通量定量检测试剂盒，其特征在于：所述的检测试剂盒的LAMP反应体系及各成分的终浓度如下：样品模板DNA 1μL，2.5μL 10×反应缓冲液，1.5μL浓度为100mM的MgSO4，3.5μL浓度为10mM的dNTP，1μL浓度为8U/μl Bst DNA聚合酶，1μL FIP/BIP引物组溶液，1μL F3/B3引物组溶液和4μL甜菜碱，然后用双蒸水补足25μL；其中所述的FIP/BIP引物组溶液分别为权利要求1所述的单增李斯特菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属、致病性大肠杆菌、蜡样芽胞杆菌、奇异变形杆菌和副溶血弧菌的FIP/BIP引物组溶液，各引物终浓度均为40μM，所述的F3/B3引物组溶液分别为权利要求1所述的单增李斯特菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属、致病性大肠杆菌、蜡样芽胞杆菌、奇异变形杆菌和副溶血弧菌的F3/B3引物组溶液，各引物终浓度均为5μM。
3.根据权利要求2所述的一种腹泻性致病菌的高通量定量检测试剂盒，其特征在于：所述的检测试剂盒还包括显色剂，所述的显色剂为钙黄绿素/氯化锰溶液或者羟基萘酚蓝溶液或者SYBR-Green I，其中钙黄绿素/氯化锰溶液中钙黄绿素浓度为75μM，氯化锰浓度为500μM；所述的羟基萘酚蓝溶液浓度为150μM，所述的钙黄绿素/氯化锰溶液或者所述的羟基萘酚蓝溶液的添加量为1μL/孔，所述的SYBR-Green I显色剂的添加量为5μL/孔。
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