CN107022644B

CN107022644B - 果蔬中六种食源性致病菌多重lamp检测引物、检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN107022644B
Application number: CN201710446459.8A
Authority: CN
Inventors: 王文博; 刘宾; 苑学霞; 李瑞菊
Original assignee: Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-06-14
Filing date: 2017-06-14
Publication date: 2021-01-05
Anticipated expiration: 2037-06-14
Also published as: CN107022644A

Abstract

本发明公开了一种果蔬中六种食源性致病菌多重LAMP检测引物、检测试剂盒及检测方法，属于细菌基因检测技术领域。本发明设计得到单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠埃希氏菌O157:H7六种致病菌的快速检测引物组，对待测样品中所提取的细菌的基因组DNA利用包含上述引物组的检测试剂盒在同一反应体系中进行多重LAMP反应来判定样品中是否含有上述六种食源性致病菌。检测引物具有高特异性和高灵敏度，能在同一反应体系中准确检测上述六种食源性致病菌基因组DNA。可以实现简便、快速、准确检测，适于现场快速检测，对于提高致病菌分析检测技术和果蔬食用质量安全具有重要意义。

Description

果蔬中六种食源性致病菌多重LAMP检测引物、检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及细菌基因检测技术领域，具体地涉及一种果蔬中单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠埃希氏菌O157:H7六种食源性致病菌多重LAMP检测的检测引物、及其检测试剂盒和检测方法。

背景技术

作为全球性问题，食源性疾病广泛地威胁公共安全，由果蔬携带致病微生物引发疾病的现象也呈逐年增多的趋势。近年来随着国民经济的发展，对新鲜农产品的需求日益增加，然而生鲜果蔬特别是绿叶蔬菜很容易传播致病菌和病毒，很难通过常规方法清洗干净。因此，利用致病菌快速检测技术在果蔬上市之前快速抽检，确保入市产品安全无害具有重要意义。

单增李斯特菌 (Listeria monocytogenes)是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，被WHO划列为重点监测的食源性致病菌之一，目前也是我国重点关注的标准外微生物风险因子之一。阪崎肠杆菌是肠杆菌科的一种，能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，死亡率高达50% 以上。志贺氏菌（Shigella spp）属革兰氏染色阴性肠杆菌，是人类细菌性痢疾最常见的病原菌。近年来，志贺氏菌Ⅰ型的细菌性痢疾已发展为世界性流行趋势，我国至少在十余个省区发生了不同规模流行。金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）隶属于葡萄球菌属，革兰氏染色呈阳性。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生难题，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。沙门氏菌（Salmonella spp）是公共卫生领域的重要致病菌，属革兰氏染色阴性肠杆菌。据统计在世界各国发生的细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首，我国内陆地区所发生的细菌性食物中毒中也以沙门氏菌为首要原因。大肠埃希氏菌O157:H7是大肠杆菌中的一个亚型，虽然生长在健康人类和动物的肠道内的绝大多数菌种都是无害的，但这一菌种却会产生强烈的毒素，并引发严重的疾病。

按照现行的风险评估监测体系要求，有多类食品均需对上述六种食源性致病菌进行检测以排除其污染。现有技术的常规检测多采用传统培养方法，每个致病菌需应用独立的检测方法单独进行检测，费时费力，灵敏度低不能满足快速检测的需求，且受到检测人员专业背景、检测经验等多种因素影响，容易出现误判。增加了企业的储藏成本和质量控制成本，及政府对于食品安全的监管难度。

随着分子生物学方法在食品微生物检测中的逐步应用，致病菌的检测效率也逐步提升，但目前所采用的常规单重 PCR方法不能实现多种目标菌的同时检测，仍存在较大工作量。多重PCR 技术能在同一PCR反应体系内实现对多种目标DNA 的同步快速扩增，为病原微生物的鉴定提供了快速，灵敏，特异的方法。鉴于多重PCR技术有众多优势，现已被逐渐应用于病原微生物的检测。二重和三重PCR检测屡有相关报道。但由于多重PCR影响因素复杂，不同的引物、模板、引物浓度、模板浓度、Mg²⁺浓度、dNTP浓度及其比例等会产生复杂的综合效应，因此所同时检测的目标微生物种类越多，PCR体系建立的难度越大。

目前，已经有关于单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠埃希氏菌O157:H7的单重LAMP检测方法，但多重LAMP比单重LAMP更加快速、简便等特点，快速检测更加便捷。然而，由于引物之间的相互干扰、多重LAMP检测条件的优化、以及检测结果分析等方面的难度和复杂性，至今尚未有报道能同时检测所述果蔬中六种食源性致病菌的多重LAMP方法。

因此，一种简便、快速、灵敏度高、重复性好、定性准确的果蔬中单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠埃希氏菌O157:H7六种食源性致病菌多重LAMP检测的检测引物、及其检测试剂盒和检测方法亟待开发出来。

发明内容

本发明的目的在于提供一种果蔬中单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠埃希氏菌O157:H7六种食源性致病菌多重LAMP快速检测的检测引物、及其检测试剂盒和检测方法，操作简单、快速、灵敏度高、重复性好、定性准确，不仅简化检测，而且降低成本，对于提高食品质量安全具有重要意义。

本发明所采用的技术方案为：

一种果蔬中单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠埃希氏菌O157:H7六种食源性致病菌多重LAMP快速检测的检测引物，分别由一对外引物和一对内引物组成，其核苷酸序列分别如下：

单增李斯特菌的检测引物组具有如SEQ No.1～SEQ No.4所示的序列：

SEQ No.1 F3：ACATATGCTTAATCCACGTTAT；

SEQ No.2 B3：TTCGCATTATCTTTATGTTGTTG；

SEQ No.3 FIP：TACTGCAAGTGATGCTGCGT-TTTTGATACCTTTGTCATTGGTTC；

SEQ No.4 BIP: TCCACTCTTCATTTATGGAGGAGT-AACATAGTGGCCAACTGC；

阪崎肠杆菌的检测引物组具有如SEQ No.5～SEQ No.8所示的序列：

SEQ No.5 F3：GGCGCTTACCACTTTGTGAT；

SEQ No.6 B3：GCCTCTAGACGAAAGGGACT；

SEQ No.7 FIP：GAGGTGATCCAACCGCAGGT-CATGACTGGGGTGAAGTCG；

SEQ No.8 BIP：CCTGCAAGATACAACCTCGCGT-CGCAGACAACCCTGCTTC；

志贺氏菌检测引物组具有如SEQ No.9～SEQ No.12所示的序列：

SEQ No.9 F3：ACGGTCTGATTGAACTGTT；

SEQ No.10 B3：TGCGATCTGGTTCAACAA；

SEQ No.11 FIP：AGCGAGCAGTGTTTTAACCAG-TTCAAATTGTCCACCGTCT；

SEQ No.12 BIP：GCACTTTTATTCCGGATTGCGG-GCAGATGGTACACAACCTC；

金黄色葡萄球菌检测引物组具有如SEQ No.13～SEQ No.16所示的序列：

SEQ No.13 F3：TTGGTAGAGAGCAATTCAATG；

SEQ No.14 B3：TCTAAAACATGATGACCAATGG；

SEQ No.15 FIP：CACAGCTAAACTCGCTGCATG-ATTTGACACTTTTGTAATCGGA；

SEQ No.16 BIP：ACCAGCCAAAGCGTACAATC-TGGGTTTTTCCTAAACCAACA；

沙门氏菌检测引物组具有如SEQ No.17～SEQ No.20所示的序列：

SEQ No.17 F3：CCACCATCACCATTACCACA；

SEQ No.18 B3：CTGCCCTTGCCTGGAATT；

SEQ No.19 FIP：GGTCGAAAAAAAAGCCCGCACT-GCTGACGCGTACAGGAAAC；

SEQ No.20 BIP：CATGCGAGTGTTGAAGTTCGGC-GGCAACACGCAGAAAACG；

大肠埃希氏菌O157:H7检测引物组具有如SEQ No.21～SEQ No.24所示的序列：

SEQ No.21 F3：AACTACTGTAAGTAATGGAACG；

SEQ No.22 B3：GTGATTTTTTGTTCTATGTCACT；

SEQ No.23 FIP：TGTTGGAACAATAACTTCATCTCCT-GTTGCTCTTCATTTAGCTTTG；

SEQ No.24 BIP：AATGCTATAAAATACACAGGAGCCA-CAGACATTTGCCAAGTTTCA。

一种果蔬中单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠埃希氏菌O157:H7六种食源性致病菌多重LAMP快速检测的试剂盒：包括若干个装有反应液的LAMP反应管，其中每个反应管的反应液中含有设计好的上述特异性引物组。

其中，所述试剂盒进一步包括：缓冲液Thermoplol buffer、氯化镁溶液（MgCl₂）、甜菜碱Betaine、链置换脱氧核糖核酸聚合酶Bst DNA聚合酶、UNG酶、正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、待检测样品的DNA模板以及双蒸水。

其中，所述缓冲液Thermoplol buffer 的添加量为2μL～3μL；所述氯化镁溶液（MgCl₂）的浓度优选15mM～25mM，添加量为1.5μL～2.5μL；所述甜菜碱Betaine的浓度优选5M～15M，添加量为2μL～3μL；所述链置换脱氧核糖核酸聚合酶Bst DNA聚合酶的活性单位为8U/μL，添加量为0.5μL～1.5μL；所述UNG酶的活性单位为1U/μL，添加量为0.5μL～1.5μL；所述正向外引物(F3) 和所述反向外引物(B3) 的浓度优选10μM～15μM，添加量为0.3μL～0.7μL；所述正向内引物(FIP)和反向内引物(BIP)的浓度优选10μM～15μM，添加量为1μL～3μL；所述脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP) 的浓度优选5mM～15mM，添加量为1.5μL～3.5μL；所述待测样品DNA模板的添加量为1μL～3μL。其中，外引物与内引物的摩尔比为1:4。

优选的，所述试剂盒中各试剂进一步包括2.5μL的Thermoplol buffer、2μL的浓度为 25mM的氯化镁溶液（MgCl₂）、2.5μL的浓度为10M的甜菜碱Betaine、1.0μL浓度为8U/μL的Bst DNA聚合酶、0.8μL浓度为1U/μL的UNG酶、0.5μL的浓度为10μM 的正向外引物 (F3)、0.5μL的浓度为10μM的反向外引物 (B3)、2μL的浓度为10μM 的正向内引物 (FIP)、 2μL的浓度为10μM 的反向内引物 (BIP)、2.5μL的浓度为10mM的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、2.5μL的待检测样品的 DNA 模板，加双蒸水补至 25μL。

优选的，所述的试剂盒，还包括1μL钙黄绿素。

一种果蔬中单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠埃希氏菌O157:H7六种食源性致病菌多重LAMP快速检测方法，其特征是包括以下步骤：(1)提取待检测细菌基因组DNA模板；

(2)将提取的DNA 模板在所述试剂盒中进行环介导等温扩增反应；

(3)对步骤（2）反应获得的产物进行测定，观察等温扩增反应导致的变化。

优选的，包括以下步骤：

(1) 提取待检测细菌基因组DNA模板：取培养好的待测细菌培养液1mL加到1.5mL无菌离心管中，14000r/min离心2min，吸弃上清液，加入80μLDNA提取液，混匀后95℃孵育10min；14000r/min离心2min，上清液即为核酸模板；将上清液移至另一洁净1.5mL无菌离心管于-20℃保藏备用。

(2)将提取的DNA 模板在所述试剂盒中进行环介导等温扩增反应：加入22.5μL/管复溶液于反应管中，加30μL/石蜡油；最后按顺序分别加入阴性对照、待测模板、阳性对照各2.5μL；利用Mini离心机瞬时离心，剪取相应数量显色管盖，盖紧，并置于金属浴中65℃恒温反应1h。

(3)对第二步反应获得的产物进行测定，观察等温扩增反应导致的变化：待上述步骤反应完成，将反应管颠倒停留5s，使反应液与显色液（显色液在盖中）充分混合，观察结果。

在阴性对照反应管呈橙色，阳性对照反应管呈绿色的前提下：若待检测样本反应管呈绿色，则可报告为检测对象阳性；若待测样本反应管呈橙色，则可报告为检测对象为阴性。

所述步骤(2)的进一步包括：以单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠埃希氏菌O157:H7六种食源性致病菌主要基因全序列为基础，设计4条特异性引物构成的特异性引物组，建立环介导等温扩增反应体系和反应程序，所述4条特异性引物构成的特异性引物组分别为正向外引物(F3)、反向外引物(B3)、正向内引物(FIP)、反向内引物(BIP)。所述4条特异性引物构成的特异性引物组序列分别为：单增李斯特菌的检测引物组具有如SEQ No.1～SEQ No.4所示的序列、阪崎肠杆菌的检测引物组具有如SEQ No.5～SEQ No.8所示的序列、志贺氏菌检测引物组具有如SEQ No.9～SEQ No.12所示的序列、金黄色葡萄球菌检测引物组具有如SEQ No.13～SEQ No.16所示的序列、沙门氏菌检测引物组具有如SEQ No.17～SEQ No.20所示的序列、大肠埃希氏菌O157:H7检测引物组具有如SEQ No.21～SEQ No.24所示的序列。

所述步骤(3)中对产物进行测定，观察等温扩增反应导致的变化可以采用琼脂糖凝胶电泳法或荧光染料法(SYBR Green I)；当采用琼脂糖凝胶电泳法测定时，因为环介导等温扩增反应形成各种不同长度的茎环状结构片段，则产物经琼脂糖凝胶电泳后可观察到明显梯形扩增带，表明发生了扩增反应，若没有观察到梯形扩增带，则无扩增。当采用荧光染料法(SYBR Green I)时，通过在步骤(2)中获得的产物中加入荧光染料SYBR Green I来肉眼判定，若发生扩增反应，则颜色变成绿色，为病毒阳性，若保持橙色不变若为橙色，则没有发生扩增反应。

本发明的有益效果：

(1) 本发明的检测引物特异性高，由于同时设计使用4条特异引物,所以特异性比PCR更高。

(2) 本发明的检测方法扩增效率高，扩增效率比PCR灵敏二个数量级，可检测到单拷贝的DNA分子。

(3) 本发明的检测试剂盒在1小时内即可完成，检测时间短，能在同一反应体系中准确检测上述六种食源性致病菌基因组DNA。

(4) 本发明的检测方法在65℃左右等温扩增，不需要贵重的热循环仪；肉眼检测扩增结果，不需要昂贵的荧光PCR等仪器；提供扩增对照，便于在遇到问题时现场快速检测分析，操作简便。

附图说明

附图1 草莓中单增李斯特菌多重LAMP扩增，感染组显示绿色，对照组无变化；

附图2 番茄中阪崎肠杆菌多重LAMP扩增，感染组显示绿色，对照组无变化；

附图3 香菜中志贺氏菌多重LAMP扩增，感染组显示绿色，对照组无变化；

附图4 苹果中金黄色葡萄球菌多重LAMP扩增，感染组显示绿色，对照组无变化；

附图5 生菜中沙门氏菌多重LAMP扩增，感染组显示绿色，对照组无变化；

附图6 黄瓜中大肠埃希氏菌O157:H7多重LAMP扩增，感染组显示绿色，对照组无变化。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例，实施例不应视作对本发明保护范围的限定。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例中使用的仪器：

拍击式均质器（西班牙IUL公司），生化培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司），高压灭菌锅（山东新华医疗器械股份有限公司），高速冷冻离心机（德国IKA公司），Mini离心机（美国Sigma公司），金属浴（英国PRIMA公司）超净工作台（山东新华医疗器械股份有限公司），AE-240型电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

药品及标准品：生理盐水、致病菌相应的二次增菌液、无菌拭子、脑浸液、API试剂条、7.5%氯化钠肉汤培养基、BPW、血平板、营养琼脂、显色培养基、TSA-YE、乳胶凝集均购自广东环凯微生物科技有限公司，联合增菌液购自北京良润生物科技有限公司。

DNA拷贝数的计算方法如下:

1A260吸光度值=ds DNA 50μg/mL:

核酸浓度=(0D260)×(稀释倍数)×(50) =x ng/μL；

平均分子量(MW)代表克/摩尔，单位道尔顿(do1ton)即ldolton＝lg/mol；摩尔=6. 02×10²³；平均分子量(MW) : dsDNA=(碱基数)×(660道尔顿/碱基)：

拷贝数计算公式：

(6.02×10²³copies/摩尔)×(x ng/μL×10^-9) / (DNA长度X660) =copies/μL。

实施例1：试剂盒的制备

所述试剂盒包括若干个装有反应液的LAMP反应管，其中每25μL反应液中含有：2.5μL的Thermoplol buffer、2μL 的浓度为25mM的氯化镁溶液（MgCl₂）、2.5μL的浓度为10M的甜菜碱Betaine、1.0μL浓度为8U/μL的Bst DNA聚合酶、0.8μL浓度为1U/μL的UNG酶、0.5μL的浓度为10μM 的正向外引物 (F3 序列如SEQ No.1、SEQ No.5、SEQ No.9、SEQ No.13、SEQNo.17、SEQ No.21)、0.5μL的浓度为10μM的反向外引物 (B3 序列如SEQ No.2、SEQ No.6、SEQ No.10、SEQ No.14、SEQ No.18、SEQ No.22)、2μL的浓度为10μM 的正向内引物 (FIP序列如SEQ No.3、SEQ No.7、SEQ No.11、SEQ No.15、SEQ No.19、SEQ No.23)、 2μL的浓度为10μM 的反向内引物 (BIP 序列如SEQ No.4、SEQ No.8、SEQ No.12、SEQ No.16、SEQ No.20、SEQ No.24)、2.5μL的浓度为10mM的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、2.5μL的待检测样品的DNA 模板，1μL钙黄绿素，加双蒸水补至 25μL。

实施例2：特异性实验

（1）取蔬菜样品6份，分别加入培养的单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠埃希氏菌O157:H7六种菌悬液，混匀后取样增菌待测。

（2）取待检测细菌基因组DNA模板，用无菌水进行梯度稀释，得到各个稀释液。

（3）以步骤2得到的稀释液为模板，分别采用实施例1制备的试剂盒进行环介导等温扩增。反应条件：65℃恒温60min。

引物组检测靶标基因的灵敏度为1.2×10²CFU/25g，验结果如表1：

表1 特异性实验结果

通过上表可得金黄色葡萄球菌LAMP方法只检测出金黄色葡萄球菌为阳性，与其他供试致病菌无交叉反应，特异性为100%。其他5种菌的LAMP方法也是如此，特异性为100%。

实施例3：灵敏度实验

(1)将待测蔬菜水果样品去掉表面泥土，各称量四份每份称重25g，其中三份分别对应加培养好的单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠埃希氏菌O157:H7菌液的低（L）、中（M）、高（H）浓度，然后加入225m L联合增菌液，36℃培养18～24小时；以联合增菌液增菌作为对照。

(2) 提取待检测细菌基因组DNA模板：取培养好的待测细菌培养液1mL加到1.5mL无菌离心管中，14000r/min离心2min，吸弃上清液，加入80μLDNA提取液，混匀后95℃孵育10min；14000r/min离心2min，上清液即为核酸模板；将上清液移至另一洁净1.5mL无菌离心管于-20℃保藏备用。

(3)将提取的DNA 模板在所述试剂盒中进行环介导等温扩增反应：加入22.5μL/管复溶液于反应管中，加30μL/管石蜡油；最后按顺序分别加入阴性对照、待测模板、阳性对照各2.5μL；利用Mini离心机瞬时离心，剪取相应数量显色管盖，盖紧，并置于金属浴中65℃恒温反应1h。

(4)对步骤（3）反应获得的产物进行测定，观察等温扩增反应导致的变化：待上述步骤反应完成，将反应管颠倒停留5s，使反应液与显色液（显色液在盖中）充分混合，观察结果。

在阴性对照反应管呈橙色，阳性对照反应管呈绿色的前提下：若待检测样本反应管呈绿色，则可报告为检测对象阳性；若待测样本反应管呈橙色，则可报告为检测对象为阴性。灵敏度检测结果如表2：

表2 灵敏度实验结果

金黄色葡萄球菌菌落数分别为120、1.3×10³和1.3×10⁴CFU/25g，LAMP方法检测结构均为阳性（表2），因此LAMP方法的灵敏度为120 CFU/25g。沙门氏菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌O157:H7、志贺氏菌、单增李斯特菌LAMP方法的灵敏度为115 CFU/25g。

实施例4：检测应用

(1)将结球生菜、苦菊、香菜、番茄、黄瓜、苹果、葡萄、草莓八种待测蔬菜水果样品去掉表面泥土，各称量四份每份称重25g，其中三份分别对应加培养好的单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠埃希氏菌O157:H7菌液的低（L）、中（M）、高（H）浓度，然后加入225m L联合增菌液，36℃培养18～24小时； (2) 提取待检测细菌基因组DNA模板：取培养好的待测细菌培养液1mL加到1.5mL无菌离心管中，14000r/min离心2min，吸弃上清液，加入80μLDNA提取液，混匀后95℃孵育10min；14000r/min离心2min，上清液即为核酸模板；将上清液移至另一洁净1.5mL无菌离心管于-20℃保藏备用。

(4)对步骤（3）反应获得的产物进行测定，观察等温扩增反应导致的变化：待上述步骤反应完成，将反应管颠倒停留5s，使反应液与显色液（显色液在盖中）充分混合，观察结果。在阴性对照反应管呈橙色，阳性对照反应管呈绿色的前提下：若待检测样本反应管呈绿色，则可报告为检测对象阳性；若待测样本反应管呈橙色，则可报告为检测对象为阴性。同时以联合增菌液增菌作为对照，同时采用国标方法进行检测对比，检测结果如表3：

国标方法：

GB 4789.30-2010食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验本标准；

GB 4789.40-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验本标准；

GB 4789.5-2012 食品安全国家标准食品微生物学检验志贺氏菌检验本标准；

GB 4789.10-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验本标准；

GB 4789.4-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验本标准；

GB 4789.36-2008 食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌 O157：H7/NM检验本标准。

表3 本发明方法和国标方法结果对照

注：样品编号中，P：苹果；C：草莓；F：番茄；X：香菜；K：苦菊；G：葡萄；S：生菜；H:黄瓜，H、M、L分别对应高、中、低三个浓度，CK为只添加联合培养液未添加增菌液的阴性对照表，供试菌株：L代表本发明LAMP方法、G代表国标方法。

检测结果表明对于八种蔬菜水果中的六种致病菌的检测，本发明方法和国标检测结果一致，结果符合率100%，本方法安全可靠。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所

<120> 果蔬中六种食源性致病菌多重LAMP检测引物、检测试剂盒及检测方法

<130> 2017

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acatatgctt aatccacgtt at 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttcgcattat ctttatgttg ttg 23

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tactgcaagt gatgctgcgt ttttgatacc tttgtcattg gttc 44

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tccactcttc atttatggag gagtaacata gtggccaact gc 42

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggcgcttacc actttgtgat 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcctctagac gaaagggact 20

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gaggtgatcc aaccgcaggt catgactggg gtgaagtcg 39

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cctgcaagat acaacctcgc gtcgcagaca accctgcttc 40

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

acggtctgat tgaactgtt 19

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tgcgatctgg ttcaacaa 18

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

agcgagcagt gttttaacca gttcaaattg tccaccgtct 40

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gcacttttat tccggattgc gggcagatgg tacacaacct c 41

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ttggtagaga gcaattcaat g 21

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tctaaaacat gatgaccaat gg 22

<210> 15

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cacagctaaa ctcgctgcat gatttgacac ttttgtaatc gga 43

<210> 16

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

accagccaaa gcgtacaatc tgggtttttc ctaaaccaac a 41

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ccaccatcac cattaccaca 20

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ctgcccttgc ctggaatt 18

<210> 19

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ggtcgaaaaa aaagcccgca ctgctgacgc gtacaggaaa c 41

<210> 20

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

catgcgagtg ttgaagttcg gcggcaacac gcagaaaacg 40

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

aactactgta agtaatggaa cg 22

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gtgatttttt gttctatgtc act 23

<210> 23

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tgttggaaca ataacttcat ctcctgttgc tcttcattta gctttg 46

<210> 24

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

aatgctataa aatacacagg agccacagac atttgccaag tttca 45

Claims

1.一种果蔬中单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）、志贺氏菌（Shigella sp.）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙门氏菌（Salmonella sp.）和大肠埃希氏菌(Escherichia.coli) O157:H7六种食源性致病菌多重LAMP检测试剂盒，包括若干个装有反应液的LAMP反应管，其特征在于：每个反应管的反应液中含有果蔬中单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠埃希氏菌O157:H7六种食源性致病菌多重LAMP检测引物，分别由一对外引物和一对内引物组成，所述外引物和内引物的核苷酸序列分别为：

单增李斯特菌的检测引物组的序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.4所示：

SEQ ID No.1 F3：ACATATGCTTAATCCACGTTAT；

SEQ ID No.2 B3：TTCGCATTATCTTTATGTTGTTG；

SEQ ID No.3 FIP：TACTGCAAGTGATGCTGCGTTTTTGATACCTTTGTCATTGGTTC；

SEQ ID No.4 BIP：TCCACTCTTCATTTATGGAGGAGTAACATAGTGGCCAACTGC；

阪崎肠杆菌的检测引物组的序列如SEQ ID No.5～SEQ ID No.8所示：

SEQ ID No.5 F3：GGCGCTTACCACTTTGTGAT；

SEQ ID No.6 B3：GCCTCTAGACGAAAGGGACT；

SEQ ID No.7 FIP：GAGGTGATCCAACCGCAGGTCATGACTGGGGTGAAGTCG；

SEQ ID No.8 BIP：CCTGCAAGATACAACCTCGCGTCGCAGACAACCCTGCTTC；

志贺氏菌检测引物组的序列如SEQ ID No.9～SEQ ID No.12所示：

SEQ ID No.9 F3：ACGGTCTGATTGAACTGTT；

SEQ ID No.10 B3：TGCGATCTGGTTCAACAA；

SEQ ID No.11 FIP：AGCGAGCAGTGTTTTAACCAGTTCAAATTGTCCACCGTCT；

SEQ ID No.12 BIP：GCACTTTTATTCCGGATTGCGGGCAGATGGTACACAACCTC；

金黄色葡萄球菌检测引物组的序列如SEQ ID No.13～SEQ ID No.16所示：

SEQ ID No.13 F3：TTGGTAGAGAGCAATTCAATG；

SEQ ID No.14 B3：TCTAAAACATGATGACCAATGG；

SEQ ID No.15 FIP：CACAGCTAAACTCGCTGCATGATTTGACACTTTTGTAATCGGA；

SEQ ID No.16 BIP：ACCAGCCAAAGCGTACAATCTGGGTTTTTCCTAAACCAACA；

沙门氏菌检测引物组的序列如SEQ ID No.17～SEQ ID No.20所示：

SEQ ID No.17 F3：CCACCATCACCATTACCACA；

SEQ ID No.18 B3：CTGCCCTTGCCTGGAATT；

SEQ ID No.19 FIP：GGTCGAAAAAAAAGCCCGCACTGCTGACGCGTACAGGAAAC；

SEQ ID No.20 BIP：CATGCGAGTGTTGAAGTTCGGCGGCAACACGCAGAAAACG；

大肠埃希氏菌O157:H7检测引物组的序列如SEQ ID No.21～SEQ ID No.24所示：

SEQ ID No.21 F3：AACTACTGTAAGTAATGGAACG；

SEQ ID No.22 B3：GTGATTTTTTGTTCTATGTCACT；

SEQ ID No.23 FIP：TGTTGGAACAATAACTTCATCTCCTGTTGCTCTTCATTTAGCTTTG；

SEQ ID No.24 BIP：AATGCTATAAAATACACAGGAGCCACAGACATTTGCCAAGTTTCA；

所述试剂盒还包括：缓冲液Thermoplol buffer、氯化镁溶液(MgCl₂)、甜菜碱Betaine、链置换脱氧核糖核酸聚合酶Bst DNA聚合酶、UNG酶、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、待检测样品的DNA 模板以及双蒸水。

2.如权利要求1所述的一种果蔬中单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠埃希氏菌O157:H7六种食源性致病菌多重LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述缓冲液Thermoplol buffer的添加量为2μL～3μL；所述氯化镁溶液(MgCl₂)的浓度为15mM～25mM，添加量为1.5μL～2.5μL；所述甜菜碱Betaine的浓度为5M～15M，添加量为2μL～3μL；所述链置换脱氧核糖核酸聚合酶Bst DNA聚合酶的活性单位为8U/μL，添加量为0.5μL～1.5μL；所述UNG酶的活性单位为1U/μL，添加量为0.5μL～1.5μL；正向外引物F3和反向外引物B3的浓度为10μM～15μM，添加量为0.3μL～0.7μL；正向内引物FIP和反向内引物BIP的浓度为10μM～15μM，添加量为1μL～3μL；所述脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)的浓度为5mM～15mM，添加量为1.5μL～3.5μL；所述待测样品DNA模板的添加量为1μL～3μL；其中，外引物与内引物的摩尔比为1:4。

3.如权利要求2所述的一种果蔬中单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠埃希氏菌O157:H7六种食源性致病菌多重LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中各反应管中试剂进一步为2.5μL的Thermoplol buffer、2μL 的浓度为25mM的氯化镁溶液(MgCl₂)、2.5μL的浓度为10M的甜菜碱Betaine、1.0μL浓度为8U/μL的BstDNA聚合酶、0.8μL浓度为1U/μL的UNG酶、0.5μL的浓度为10μM 的正向外引物F3、0.5μL的浓度为10μM的反向外引物B3、2μL的浓度为10μM 的正向内引物FIP、2μL的浓度为10μM 的反向内引物BIP、2.5μL的浓度为10mM的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、2.5μL的待检测样品的 DNA模板，加双蒸水补至25μL。

4.如权利要求2或3任一所述的一种果蔬中单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠埃希氏菌O157:H7六种食源性致病菌多重LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括1μL钙黄绿素。

5.一种果蔬中单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠埃希氏菌O157:H7六种食源性致病菌多重LAMP检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1) 提取待检测细菌基因组DNA模板：取培养好的待测细菌培养液1mL加到1.5mL无菌离心管中，14000r/min离心2min，吸弃上清液，加入80μLDNA提取液，混匀后95℃孵育10min；14000r/min离心2min，上清液即为核酸模板；将上清液移至另一洁净1.5mL无菌离心管于-20℃保藏备用；

2)将提取的DNA 模板在如权利要求1～4任意一项所述的试剂盒中进行环介导等温扩增反应：加入22.5μL/管反应液于反应管中，加30μL/管石蜡油；最后按顺序分别加入阴性对照、待测模板、阳性对照各2.5μL；利用Mini离心机瞬时离心，剪取相应数量显色管盖，盖紧，并置于金属浴中65℃恒温反应1h；

3)对步骤2)反应获得的产物进行测定，观察等温扩增反应导致的变化：待上述步骤反应完成，将反应管颠倒停留5s，使反应液与显色液充分混合，观察结果；

所述步骤3)中对产物进行测定，观察等温扩增反应导致的变化采用琼脂糖凝胶电泳法，环介导等温扩增反应形成各种不同长度的茎环状结构片段，则产物经琼脂糖凝胶电泳后可观察到明显梯形扩增带，表明发生了扩增反应，若没有观察到梯形扩增带，则无扩增。

6.如权利要求5所述的一种果蔬中单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠埃希氏菌O157:H7六种食源性致病菌多重LAMP检测方法，其特征在于：所述步骤3)中对产物进行测定，观察等温扩增反应导致的变化采用荧光染料法，通过在步骤2)中获得的产物中加入荧光染料SYBR Green I来肉眼判定，若发生扩增反应，则颜色变成绿色，为阳性，若保持橙色不变，则没有发生扩增反应。