CN116024362A - 一种同时检测婴幼儿配方奶粉中多种致病菌的lamp引物组及其试剂盒和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种同时检测婴幼儿配方奶粉中多种致病菌的LAMP引物组与试剂盒。本发明提供的LAMP引物组包括括沙门氏菌的LAMP引物组、阪崎肠杆菌的LAMP引物组、金黄色葡萄球菌的LAMP引物组。本发明提供的试剂盒可针对以上三种致病菌进行可视化快速检测，具有操作简便、高效率、高特异性、高灵敏度等特点，进一步提高检测效率，可以有效地控制沙门氏菌、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌污染，减少食品安全问题发生。
Description
技术领域
本发明属于病原微生物检测领域，具体涉及一种婴幼儿配方奶粉中的沙门氏菌(Salmonella paratyphi)、阪崎肠杆菌(Cronobactersakazakii)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的多重LAMP检测方法和检测试剂盒。
背景技术
婴幼儿配方奶粉是除了母乳外婴幼儿最主要的营养来源与膳食结构的组成，与婴幼儿能否健康成长有着十分密切的关系。由于婴幼儿配方奶粉的主要原材料为乳类及乳蛋白制品，富含丰富的营养物质，而且不是严格完全无菌产品，所以易在生产、运输、贮存、销售、流通的各个环节受到各类微生物的污染。近年来关于婴幼儿配方奶粉安全事件的发生主要都集中于致病性微生物的污染所导致的婴幼儿食源性疾病。因此针对市售婴幼儿配方奶粉建立一种快速简便的致病菌检测方法就显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供对沙门氏菌、阪崎肠杆菌和金黄色葡萄球菌有较高特异性的多重LAMP引物组。
本发明的另一个目的是提供一种操作简便、检测效率高、特异性好、灵敏度高可同时检测婴幼儿配方奶粉中的沙门氏菌、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌的可视化快速检测试剂盒。
本发明采取的技术方案是：一种同时检测婴幼儿配方奶粉中多种致病菌的LAMP引物组，包括沙门氏菌的LAMP引物组、阪崎肠杆菌的LAMP引物组、金黄色葡萄球菌的LAMP引物组；
沙门氏菌的LAMP引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
一对外引物如下：
SM-F3：AGGAGAAAAACTTCGGGAGC
SM-B3：ACGCTGCAAAACTTCAGAGA
一对内引物如下：
SM-FIP：TGACGTTACGCGCGAGTGTCGTTACGTGCTGCGAAATGC
SM-BIP：ATATGCTGGATCAGCTGGAGGCGGCATGTCTGAGCACTTCT
一对环引物如下：
SM-LF：CCGCCAGACAATGATAAAGCT
SM-LB：GGCAATTCGGGTAACCGGTAC
阪崎肠杆菌的LAMP引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
一对外引物如下：
BQ-F3：GCTCCGGAAGTACAGACCA
BQ-B3：GCGTCAGAACCGATACGG
一对内引物如下：
BQ-FIP：CCTTCCGGTTTCAGGGTAGCTTAGCACTTCACCCTGAAGTCT
BQ-BIP：GCGCTGGATCAGCTGTACTCTCTGAAGCCCAGAACCACTACA
一对环引物如下：
BQ-LF：TGTTGAAGTTGAACAGAACGTC
BQ-LB：CTGAGCAACCTGGATCCGAAA
金黄色葡萄球菌的LAMP引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
一对外引物如下：
JH-F3：AACAGTATATAGTGCAACTTCAA
JH-B3：CTTTGTCAAACTCGACTTCAA
一对内引物如下：
JH-FIP：ATGTCATTGGTTGACCTTTGTACATAAATTACATAAAGAACCTGCGA
JH-BIP：GTTGATACACCTGAAACAAAGCATCATTTTTTTCGTAAATGCACTTGC
一对环引物如下：
JH-LF：CCGTATCACCATCAATCGCTTTAAT
JH-LB：AAAGGTGTAGAGAAATATGGTCCTG。
一种同时检测婴幼儿配方奶粉中多种致病菌的LAMP检测试剂盒，包括：沙门氏菌的LAMP引物组；阪崎肠杆菌的LAMP引物组；金黄色葡萄球菌的LAMP引物组；10×ThermopolBuffer；MgSO4；dNTP Mix；Bst DNA聚合酶；HNB；甜菜碱；阳性对照品；无菌ddH2O。
上述的一种同时检测婴幼儿配方奶粉中多种致病菌的LAMP检测试剂盒，所述的沙门氏菌的LAMP引物组中，SM-F3、SM-B3、SM-FIP、SM-BIP、SM-LF、SM-LB的摩尔浓度比为8：8：1：1：4：4；所述的阪崎肠杆菌的LAMP引物组中，BQ-F3、BQ-B3、BQ-FIP、BQ-BIP、BQ-LF、BQ-LB的摩尔浓度比为8：8：1：1：4：4；所述的金黄色葡萄球菌的LAMP引物组中，JH-F3、JH-B3、JH-FIP、JH-BIP、JH-LF、JH-LB的摩尔浓度比为8：8：1：1：4：4。
上述的一种同时检测婴幼儿配方奶粉中多种致病菌的LAMP检测试剂盒，所述的MgSO4浓度为100mmol/L。
上述的一种同时检测婴幼儿配方奶粉中多种致病菌的LAMP检测试剂盒，所述的dNTP Mix浓度为10mmol/L。
上述的一种同时检测婴幼儿配方奶粉中多种致病菌的LAMP检测试剂盒，所述的HNB为羟基萘酚蓝，浓度为3mmol/L。
上述的一种同时检测婴幼儿配方奶粉中多种致病菌的LAMP检测试剂盒，所述的阳性对照品为乙型副伤寒沙门氏菌CMCC(B)50094、阪崎肠杆菌CMCC45401、金黄色葡萄球菌ATCC6538的基因组DNA。
一种采用上述的LAMP检测试剂盒同时检测沙门氏菌、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌的方法，包括以下步骤：
(1)反应容器内加入下表1所示用量的各组分进行LAMP反应，
表1多重LAMP反应体系中试剂盒内各组分添加量
(2)将反应容器内各组分混匀后，置于65℃条件下温浴60min，再于85℃条件下灭活5min终止反应，
(3)反应结果通过观察反应容器内的颜色变化来判断，若为紫罗兰色则为阴性，若为蓝色则为阳性。反应结果也可通过2％琼脂糖凝胶电泳来判断，若出现明亮且清晰的梯形扩增条带，则为阳性，若无条带则为阴性。
本发明的有益效果是：
1.本发明设计的多重LAMP引物组能够从多种常见致病菌中区分出沙门氏菌、阪崎肠杆菌和金黄色葡萄球菌，具有较强的特异性。
2.本发明在常规的LAMP引物组中加入了环引物，大大提升了反应速度。
2.本发明建立了婴幼儿配方奶粉中沙门氏菌、阪崎肠杆菌和金黄色葡萄球菌的多重LAMP检测体系，实现了三种菌的同时检测。
3.本发明在多重LAMP检测体系中添加了羟基萘酚蓝(HNB)，可通过观察反应容器内的颜色变化来判断检测结果，若为紫罗兰色则为阴性，若为蓝色则为阳性。而且还可以有效的减少污染发生的可能性。
4.本发明与国标方法相比，大大缩短了检测所需时间，在2h左右就可完成检测操作，在实际样品检测中表现良好，可以应用于未来婴幼儿配方奶粉致病菌的现场初步检测中，大大节约了检测时间与成本。
5.本发明可应用于但不限只能应用于婴幼儿配方奶粉基质中致病菌的检测，也可应用于可能存在这三种致病菌的其他食品基质的检测中。
附图说明
图1是多重LAMP体系反应温度优化结果；
其中，M：2000bp Marker，1：空白对照；2-8：多重LAMP体系的反应温度依次为62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃条件下的琼脂糖凝胶电泳结果。
图2是多重LAMP体系反应时间优化结果；
其中，M：2000bp Marker，1：空白对照；2-7：多重LAMP体系的反应时间依次为15min、30min、45min、60min、75min、90min条件下的琼脂糖凝胶电泳结果。
图3是多重LAMP体系Mg2+浓度优化结果；
其中，M：2000bp Marker，1：空白对照；2-11：多重LAMP体系的Mg2+浓度依次为2mmol/L、4mmol/L、6mmol/L、8mmol/L、10mmol/L、12mmol/L、14mmol/L、16mmol/L、18mmol/L、20mmol/L条件下的琼脂糖凝胶电泳结果。
图4是多重LAMP体系dNTP Mix浓度优化结果；
其中，M：2000bp Marker，1：空白对照；2-11：多重LAMP体系的dNTP Mix浓度依次为0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L、1.4mmol/L、1.6mmol/L、1.8mmol/L、2.0mmol/L、2.2mmol/L、2.4mmol/L条件下的琼脂糖凝胶电泳结果。
图5是多重LAMP体系可视化染料HNB浓度优化结果；
其中，M：2000bp Marker，1：空白对照；2-6：多重LAMP体系的可视化染料HNB浓度依次为0μmol/L、60μmol/L、120μmol/L、180μmol/L、240μmol/L条件下的琼脂糖凝胶电泳结果。
图6是多重LAMP体系可视化染料HNB浓度颜色对比结果；
其中，1：空白对照；上排2-5：未添加目标菌的LAMP体系的可视化染料HNB浓度依次为60μmol/L、120μmol/L、180μmol/L、240μmol/L的检测结果；下排2-5添加目标菌的LAMP体系的可视化染料HNB浓度依次为60μmol/L、120μmol/L、180μmol/L、240μmol/L的检测结果。
图7是多重LAMP体系特异性检测结果；
其中，M：2000bp Marker，1-21：依次为肠炎沙门氏菌(ATCC13076)、鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)、阪崎肠杆菌(CMCC45401)、阪崎肠杆菌(ATCC29544)、金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、金黄色葡萄球菌(ATCC29213)、单核细胞增生李斯特菌(CMCC 54004)、副溶血性弧菌(ATCC17802)、铜绿假单胞菌(ATCC9027)、蜡样芽孢杆菌(ATCC14579)、大肠埃希氏菌(CMCC44102)、大肠杆菌(ATCC10536)、大肠杆菌(ATCC25922)、阴沟肠杆菌(CMCC43501)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(ATCC23715)、痢疾志贺氏菌(ATCC13313)、福氏志贺氏菌(CMCC51572)、空肠弯曲杆菌(ATCC33291)、枯草芽孢杆菌(ATCC6633)、肺炎克雷伯氏菌(ATCC10031)、产酸克雷伯氏菌(实验室保藏)的琼脂糖凝胶电泳结果。
图8是多重LAMP试剂盒沙门氏菌基因组灵敏度检测结果；
其中，M：2000bp Marker，1-12：多重LAMP体系中沙门氏菌DNA模板浓度依次为10.3ng/μL、1.03×100ng/μL、1.03×10-1ng/μL、1.03×10-2ng/μL、1.03×10-3ng/μL、1.03×10-4ng/μL、1.03×10-5ng/μL、1.03×10-6ng/μL、1.03×10-7ng/μL、1.03×10-8ng/μL、1.03×10-9ng/μL、1.03×10-10ng/μL时的琼脂糖凝胶电泳结果。
图9是多重LAMP试剂盒阪崎肠杆菌基因组灵敏度检测结果；
其中，M：2000bp Marker，1-12：多重LAMP体系中阪崎肠杆菌DNA模板浓度依次为12.4ng/μL、1.24×100ng/μL、1.24×10-1ng/μL、1.24×10-2ng/μL、1.24×10-3ng/μL、1.24×10-4ng/μL、1.24×10-5ng/μL、1.24×10-6ng/μL、1.24×10-7ng/μL、1.24×10-8ng/μL、1.24×10-9ng/μL、1.24×10-10ng/μL时的琼脂糖凝胶电泳结果。
图10是多重LAMP试剂盒金黄色葡萄球菌基因组灵敏度检测结果；
其中，M：2000bp Marker，1-11：多重LAMP体系中金黄色葡萄球菌DNA模板浓度依次为9.17×100ng/μL、9.17×10-1ng/μL、9.17×10-2ng/μL、9.17×10-3ng/μL、9.17×10-4ng/μL、9.17×10-5ng/μL、9.17×10-6ng/μL、9.17×10-7ng/μL、9.17×10-8ng/μL、9.17×10-9ng/μL、9.17×10-10ng/μL时的琼脂糖凝胶电泳结果。
图11是多重LAMP试剂盒沙门氏菌菌液灵敏度检测结果；
其中，M：2000bp Marker，1-11：多重LAMP体系中沙门氏菌菌液浓度依次为2.6×108CFU/mL、2.6×107CFU/mL、2.6×106CFU/mL、2.6×105CFU/mL、2.6×104CFU/mL、2.6×103CFU/mL、2.6×102CFU/mL、2.6×101CFU/mL、2.6×100CFU/mL、2.6×10-1CFU/mL、2.6×10- 2CFU/mL时的琼脂糖凝胶电泳结果。
图12是多重LAMP试剂盒阪崎肠杆菌菌液灵敏度检测结果；
其中，M：2000bp Marker，1-9：多重LAMP体系中阪崎肠杆菌菌液浓度依次为4.1×107CFU/mL、4.1×106CFU/mL、4.1×105CFU/mL、4.1×104CFU/mL、4.1×103CFU/mL、4.1×102CFU/mL、4.1×101CFU/mL、4.1×100CFU/mL、4.1×10-1CFU/mL时的琼脂糖凝胶电泳结果。
图13是多重LAMP试剂盒金黄色葡萄球菌菌液灵敏度检测结果；
其中，M：2000bp Marker，1-8：多重LAMP体系中金黄色葡萄球菌菌液浓度依次为5.5×106CFU/mL、5.5×105CFU/mL、5.5×104CFU/mL、5.5×103CFU/mL、5.5×102CFU/mL、5.5×101CFU/mL、5.5×100CFU/mL、5.5×10-1CFU/mL时的琼脂糖凝胶电泳结果。
图14是多重LAMP试剂盒人工污染样品沙门氏菌灵敏度检测结果；
其中，M：2000bp Marker，1-12：多重LAMP体系中人工污染样品中沙门氏菌DNA模板浓度依次为10.9ng/μL、1.09×100ng/μL、1.09×10-1ng/μL、1.09×10-2ng/μL、1.09×10- 3ng/μL、1.09×10-4ng/μL、1.09×10-5ng/μL、1.09×10-6ng/μL、1.09×10-7ng/μL、1.09×10- 8ng/μL、1.09×10-9ng/μL、1.09×10-10ng/μL时的琼脂糖凝胶电泳结果。
图15是单重商品化沙门氏菌LAMP试剂盒人工污染样品沙门氏菌灵敏度检测结果；
其中，M：2000bp Marker，1-12：单重商品化沙门氏菌LAMP试剂盒检测中人工污染样品中沙门氏菌DNA模板浓度依次为10.9ng/μL、1.09×100ng/μL、1.09×10-1ng/μL、1.09×10-2ng/μL、1.09×10-3ng/μL、1.09×10-4ng/μL、1.09×10-5ng/μL、1.09×10-6ng/μL、1.09×10-7ng/μL、1.09×10-8ng/μL、1.09×10-9ng/μL、1.09×10-10ng/μL时的琼脂糖凝胶电泳结果。
图16是多重LAMP试剂盒人工污染样品阪崎肠杆菌灵敏度检测结果；
其中，M：2000bp Marker，1-12：多重LAMP体系中人工污染样品中阪崎肠杆菌DNA模板浓度依次为11.3ng/μL、1.13×100ng/μL、1.13×10-1ng/μL、1.13×10-2ng/μL、1.13×10- 3ng/μL、1.13×10-4ng/μL、1.13×10-5ng/μL、1.13×10-6ng/μL、1.13×10-7ng/μL、1.13×10- 8ng/μL、1.13×10-9ng/μL、1.13×10-10ng/μL时的琼脂糖凝胶电泳结果。
图17是单重商品化阪崎肠杆菌LAMP试剂盒人工污染样品阪崎肠杆菌灵敏度检测结果；
其中，M：2000bp Marker，1-12：单重商品化阪崎肠杆菌LAMP试剂盒检测中人工污染样品中阪崎肠杆菌DNA模板浓度依次为11.3ng/μL、1.13×100ng/μL、1.13×10-1ng/μL、1.13×10-2ng/μL、1.13×10-3ng/μL、1.13×10-4ng/μL、1.13×10-5ng/μL、1.13×10-6ng/μL、1.13×10-7ng/μL、1.13×10-8ng/μL、1.13×10-9ng/μL、1.13×10-10ng/μL时的琼脂糖凝胶电泳结果。
图18是多重LAMP试剂盒人工污染样品金黄色葡萄球菌灵敏度检测结果；
其中，M：2000bp Marker，1-11：多重LAMP体系中人工污染样品中金黄色葡萄球菌DNA模板浓度依次为9.97×100ng/μL、9.97×10-1ng/μL、9.97×10-2ng/μL、9.97×10-3ng/μL、9.97×10-4ng/μL、9.97×10-5ng/μL、9.97×10-6ng/μL、9.97×10-7ng/μL、9.97×10-8ng/μL、9.97×10-9ng/μL、9.97×10-10ng/μL时的琼脂糖凝胶电泳结果。
图19是单重商品化金黄色葡萄球菌LAMP试剂盒人工污染样品金黄色葡萄球菌灵敏度检测结果；
其中，M：2000bp Marker，1-11：多重LAMP体系中人工污染样品中金黄色葡萄球菌DNA模板浓度依次为9.97×100ng/μL、9.97×10-1ng/μL、9.97×10-2ng/μL、9.97×10-3ng/μL、9.97×10-4ng/μL、9.97×10-5ng/μL、9.97×10-6ng/μL、9.97×10-7ng/μL、9.97×10-8ng/μL、9.97×10-9ng/μL、9.97×10-10ng/μL时的琼脂糖凝胶电泳结果。
图20是人工污染样品多重LAMP试剂盒检测结果；
其中，1-40：蓝色为阳性结果，即样品中存在沙门氏菌、阪崎肠杆菌或金黄色葡萄球菌；紫色为阴性结果，即样品中不存在沙门氏菌、阪崎肠杆菌或金黄色葡萄球菌。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明做进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
实施例1一种多重LAMP引物组
(一)多重LAMP引物组的设计
本实施例针对沙门氏菌侵袭蛋白基因(invA)、阪崎肠杆菌外膜蛋白基因(ompA)和金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因(nuc)进行多重LAMP引物组设计。首先选择在GenBank公布的沙门氏菌invA基因、阪崎肠杆菌ompA基因和金黄色葡萄球菌nuc基因相关序列中的保守序列进行下载，再将其进行BLAST同源性对比以验证其特异性，然后下载比对结果中的相似序列，利用MEGA7对其进行相似性分析，接着选择其中保守区间序列使用LAMP引物在线设计网站(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)中的PrimerExplorer5在线软件进行LAMP体系引物的设计。最后在将设计好的LAMP引物再进行一次BLAST对比，以确保引物的特异性。该多重LAMP引物组的具体核苷酸序列如下所示：
沙门氏菌的LAMP引物组：
一对外引物如下：
SM-F3：AGGAGAAAAACTTCGGGAGC
SM-B3：ACGCTGCAAAACTTCAGAGA
一对内引物如下：
SM-FIP：TGACGTTACGCGCGAGTGTCGTTACGTGCTGCGAAATGC
SM-BIP：ATATGCTGGATCAGCTGGAGGCGGCATGTCTGAGCACTTCT
一对环引物如下：
SM-LF：CCGCCAGACAATGATAAAGCT
SM-LB：GGCAATTCGGGTAACCGGTAC
阪崎肠杆菌的LAMP引物组：
一对外引物如下：
BQ-F3：GCTCCGGAAGTACAGACCA
BQ-B3：GCGTCAGAACCGATACGG
一对内引物如下：
BQ-FIP：CCTTCCGGTTTCAGGGTAGCTTAGCACTTCACCCTGAAGTCT
BQ-BIP：GCGCTGGATCAGCTGTACTCTCTGAAGCCCAGAACCACTACA
一对环引物如下：
BQ-LF：TGTTGAAGTTGAACAGAACGTC
BQ-LB：CTGAGCAACCTGGATCCGAAA
金黄色葡萄球菌的LAMP引物组：
一对外引物如下：
JH-F3：AACAGTATATAGTGCAACTTCAA
JH-B3：CTTTGTCAAACTCGACTTCAA
一对内引物如下：
JH-FIP：ATGTCATTGGTTGACCTTTGTACATAAATTACATAAAGAACCTGCGA
JH-BIP：GTTGATACACCTGAAACAAAGCATCATTTTTTTCGTAAATGCACTTGC
一对环引物如下：
JH-LF：CCGTATCACCATCAATCGCTTTAAT
JH-LB：AAAGGTGTAGAGAAATATGGTCCTG
(二)多重LAMP反应体系的建立及优化
1、菌株活化培养与细菌基因组DNA的提取
将沙门氏菌(Salmonella paratyphi)、阪崎肠杆菌(Cronobactersakazakii)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)在LB固体培养基上进行平板划线培养，于37℃培养12～18h，传代2次，然后挑取有明显特征的单一菌落于LB液体培养基中培养。然后使用艾德莱细菌基因组DNA快速提取试剂盒对沙门氏菌(Salmonella paratyphi)、阪崎肠杆菌(Cronobactersakazakii)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的基因组DNA进行提取，提取后的细菌基因组DNA于-20℃下保存。基因组DNA提取步骤如下：
1.1)取0.5-2mL过夜培养的含有沙门氏菌(Salmonella paratyphi)、阪崎肠杆菌(Cronobactersakazakii)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的菌液，10,000rpm，离心30s，尽可能的吸弃上清，收集菌体。
1.2)加入180μL缓冲液(20mMTris，pH8.0；2mMNa2-EDTA；1.2％TritonX-100；临用前加入终浓度为20mg/mL的溶菌酶)，37℃处理30min以上。
1.3)加入20μL蛋白酶K(20mg/mL)溶液，充分混匀，再加入200μL结合液CB(艾德莱细菌基因组DNA快速提取试剂盒)，立刻涡旋振荡充分混匀，在70℃放置10min。
1.4)冷却后加入100μL异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
1.5)将上一步混合物(包括可能有的沉淀)加入一个吸附柱中，(吸附柱放入收集管中)13,000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液。
1.6)加入500μL抑制物去除液IR(艾德莱细菌基因组DNA快速提取试剂盒)，12,000rpm离心30s，弃掉废液。
1.7)加入600μL漂洗液WB(艾德莱细菌基因组DNA快速提取试剂盒)，12,000rpm离心30s，弃掉废液。
1.8)加入600μL漂洗液WB(艾德莱细菌基因组DNA快速提取试剂盒)，12,000rpm离心30s，弃掉废液。
1.9)将吸附柱放回空收集管中，13,000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
1.10)取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μL洗脱缓冲液EB(艾德莱细菌基因组DNA快速提取试剂盒)，室温放置3-5min，12,000rpm离心1min。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12,000rpm离心1min，分别收集DNA溶液，分别得到沙门氏菌(Salmonella paratyphi)、阪崎肠杆菌(Cronobactersakazakii)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的DNA。
2、多重LAMP反应初始体系
多重LAMP反应初始体系如下，包括10×ThermoPol Buffer、SM-F3、SM-B3、SM-FIP、SM-BIP、SM-LF、SM-LB、BQ-F3、BQ-B3、BQ-FIP、BQ-BIP、BQ-LF、BQ-LB、JH-F3、JH-B3、JH-FIP、JH-BIP、JH-LF、JH-LB、MgSO4、dNTP Mix(10mmol/L)、甜菜碱、Bst DNA聚合酶、模板DNA和ddH2O。体系具体组成如表2所示。
表2多重LAMP反应初始体系
3、多重LAMP体系反应温度优化
保持如步骤2所述的多重LAMP初始体系中其余条件不变，设置多重LAMP体系的反应温度在Bst DNA聚合酶的最适反应温度区间内，分别为62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃，温浴60min，以沙门氏菌、阪崎肠杆菌和金黄色葡萄球菌的DNA为反应模板进行LAMP反应，在85℃下灭活5min终止反应。LAMP反应结束后进行2％的琼脂糖凝胶电泳分析，观察琼脂糖凝胶电泳条带结果选择最适反应温度，结果如图1所示。
由图1可见，当反应温度为65℃时，条带最亮，故确定多重LAMP体系的最优反应温度为65℃。
4、多重LAMP体系反应时间优化
保持如步骤2所述的多重LAMP初始体系中其余条件不变，设置多重LAMP体系的反应时间分别为15min、30min、45min、60min、75min、90min。以沙门氏菌、阪崎肠杆菌和金黄色葡萄球菌的DNA为反应模板进行LAMP反应，在65℃条件下进行温浴，在85℃下灭活5min，终止反应。LAMP反应结束后进行2％的琼脂糖凝胶电泳分析，观察琼脂糖凝胶电泳条带结果选择最适反应时间，结果如图2所示。
由图2可见，当反应时间为60min时，条带最亮，故确定多重LAMP体系的最优反应时间为60min。
5、多重LAMP体系中Mg2+浓度优化
保持如步骤2所述的多重LAMP初始体系中其余条件不变，设置多重LAMP体系中Mg2+分别为2mmol/L、4mmol/L、6mmol/L、8mmol/L、10mmol/L、12mmol/L、14mmol/L、16mmol/L、18mmol/L。以沙门氏菌、阪崎肠杆菌和金黄色葡萄球菌的DNA为反应模板进行LAMP反应，65℃条件下温浴60min，85℃条件下再次灭活5min终止反应。LAMP反应结束后进行2％的琼脂糖凝胶电泳分析，观察琼脂糖凝胶电泳条带结果选择最适的Mg2+浓度，结果如图3所示。
由图3可见，当Mg2+浓度为8mmol/L时，条带最亮，故确定多重LAMP体系的最优Mg2+浓度为8mmol/L。
6、多重LAMP体系中dNTP Mix浓度优化
保持如步骤2所述的多重LAMP初始体系中其余条件不变，设置多重LAMP体系中dNTP Mix浓度分别为0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L、1.4mmol/L、1.6mmol/L、1.8mmol/L、2.0mmol/L。以沙门氏菌、阪崎肠杆菌和金黄色葡萄球菌的DNA为反应模板进行LAMP反应，65℃条件下温浴60min，85℃条件下再次灭活5min终止反应。LAMP反应结束后进行2％的琼脂糖凝胶电泳分析，观察琼脂糖凝胶电泳条带结果选择最适的dNTP Mix浓度，结果如图4所示。
由图4可见，当dNTP Mix浓度为1.4mmol/L时，条带最亮，故确定多重LAMP体系的最优dNTP Mix浓度为1.4mmol/L。
7、多重LAMP反应体系可视化染料HNB浓度优化
在各个条件都已优化完成后的多重LAMP体系中，设置多重LAMP体系中可视化染料HNB浓度分别为0μmol/L、60μmol/L、120μmol/L、180μmol/L、240μmol/L。以沙门氏菌、阪崎肠杆菌和金黄色葡萄球菌的DNA为反应模板进行LAMP反应，65℃条件下温浴60min，85℃条件下再次灭活5min，终止反应。LAMP反应结束后进行2％的琼脂糖凝胶电泳分析，观察琼脂糖凝胶电泳条带结果与离心管内肉眼可见的颜色效果选择最适的HNB浓度，结果如图5、图6所示。
由图5可见，HNB的添加对LAMP反应无影响，根据图6不同HNB浓度下空白对照组与阳性对照组的颜色对比，确定多重LAMP体系的最优HNB浓度为180μmol/L。
实施例2一种同时检测婴幼儿配方奶粉中的沙门氏菌、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌的可视化快速检测试剂盒
(一)试剂盒的组装
1、多重LAMP体系引物的制备
将由生工生物工程(上海)股份有限公司合成的设计好的沙门氏菌、阪崎肠杆菌和金黄色葡萄球菌引物先于离心机中4000rpm离心30～60s，再轻柔地打开管盖，按照引物合成报告上指示的添加量加入缓冲溶液，重新盖上管盖，放置于涡旋振荡器上充分混匀，得到浓度为100μmol/L的引物。分别将沙门氏菌的内引物稀释至1.6μmol/L，外引物稀释至0.2μmol/L，环引物稀释至0.8μmol/L，将三种引物等体积混合均匀，放置于一个洁净干燥的离心管中，标记为SM引物。阪崎肠杆菌和金黄色葡萄球菌的引物配制同上，分别标记为BQ引物和JH引物，于-20℃条件下保存。该多重LAMP体系引物的具体核苷酸序列如下所示：
沙门氏菌的LAMP引物组：
SM-F3：AGGAGAAAAACTTCGGGAGC
SM-B3：ACGCTGCAAAACTTCAGAGA
SM-FIP：TGACGTTACGCGCGAGTGTCGTTACGTGCTGCGAAATGC
SM-BIP：ATATGCTGGATCAGCTGGAGGCGGCATGTCTGAGCACTTCT
SM-LF：CCGCCAGACAATGATAAAGCT
SM-LB：GGCAATTCGGGTAACCGGTAC
阪崎肠杆菌的LAMP引物组：
BQ-F3：GCTCCGGAAGTACAGACCA
BQ-B3：GCGTCAGAACCGATACGG
BQ-FIP：CCTTCCGGTTTCAGGGTAGCTTAGCACTTCACCCTGAAGTCT
BQ-BIP：GCGCTGGATCAGCTGTACTCTCTGAAGCCCAGAACCACTACA
BQ-LF：TGTTGAAGTTGAACAGAACGTC
BQ-LB：CTGAGCAACCTGGATCCGAAA
金黄色葡萄球菌的LAMP引物组：
JH-F3：AACAGTATATAGTGCAACTTCAA
JH-B3：CTTTGTCAAACTCGACTTCAA
JH-FIP：ATGTCATTGGTTGACCTTTGTACATAAATTACATAAAGAACCTGCGA
JH-BIP：GTTGATACACCTGAAACAAAGCATCATTTTTTTCGTAAATGCACTTGC
JH-LF：CCGTATCACCATCAATCGCTTTAAT
JH-LB：AAAGGTGTAGAGAAATATGGTCCTG
2、阳性对照品的制备
取在LB液体培养基中于37℃，24h培养的乙型副伤寒沙门氏菌CMCC(B)50094、阪崎肠杆菌CMCC45401、金黄色葡萄球菌ATCC6538的菌液1mL，使用艾德莱细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，具体步骤如上述实施例1中(二)的步骤1。观察所提取的DNA状态，澄清透明为合格。运用所建立的LAMP方法或PCR方法对所提取的基因组分别进行检测，证明其为阳性后，将三种目的菌的DNA进行混合，于-20℃条件下保存。
3、空白对照品的制备
将无菌ddH2O作为空白对照样品进行分装，澄清透明为合格。运用所建立的LAMP方法或PCR方法对其进行检测，证明其为空白对照样品后，于-20℃条件下保存。
4、其他组分组成
除上述引物以及阳性对照品、空白对照品外，LAMP检测试剂盒中还包括诺唯赞生物公司生产的Bst DNA聚合酶、10×Thermopol Buffer、MgSO4(100mmol/L)以及dNTP Mix(10mmol/L)、甜菜碱(5mol/L)、HNB(3mmol/L)。
5、试剂盒的组装
完成上述多重体系各个条件优化后，计算各组分最优的浓度添加量，分装好后，进行试剂盒的组装。试剂盒的组成如表3所示。
表3试剂盒组成
(二)试剂盒的使用方法
1、反应容器内加入表1所示用量的各组分进行LAMP反应。
2、将反应容器内各组分混匀后，置于65℃条件下温浴60min，再于85℃条件下灭活5min终止反应。
3、反应结果通过观察反应容器内的颜色变化来判断，若为紫罗兰色则为阴性，若为蓝色则为阳性。反应结果也可通过2％琼脂糖凝胶电泳来判断，若出现明亮且清晰的梯形扩增条带，则为阳性，若无条带则为阴性。阳性结果表示待测样品中含有沙门氏菌和/或阪崎肠杆菌和/或金黄色葡萄球菌，阴性结果表示待测样品中未检出沙门氏菌、阪崎肠杆菌和金黄色葡萄球菌。
(三)多重LAMP试剂盒特异性检测
1、待测菌株DNA的提取
使用艾德莱细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取肠炎沙门氏菌(ATCC13076)、鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)、阪崎肠杆菌(CMCC45401)、阪崎肠杆菌(ATCC29544)、金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、金黄色葡萄球菌(ATCC29213)，阴性样品选择单核细胞增生李斯特菌(CMCC 54004)、副溶血性弧菌(ATCC17802)、铜绿假单胞菌(ATCC9027)、蜡样芽孢杆菌(ATCC14579)、大肠埃希氏菌(CMCC44102)、大肠杆菌(ATCC10536)、大肠杆菌(ATCC25922)、阴沟肠杆菌(CMCC43501)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(ATCC23715)、痢疾志贺氏菌(ATCC13313)、福氏志贺氏菌(CMCC51572)、空肠弯曲杆菌(ATCC33291)、枯草芽孢杆菌(ATCC6633)、肺炎克雷伯氏菌(ATCC10031)、产酸克雷伯氏菌(实验室保藏)的基因组，具体步骤如上述实施例1中(二)的步骤1。
2、对所组装的多重LAMP试剂盒的特异性进行测试
分别以上述步骤1提取的DNA为阳性样品，按照试剂盒使用方法进行检测。具体检测步骤如上述(二)，反应后的琼脂糖凝胶电泳结果如图7所示。
由图7可见，只有6株目的菌有扩增条带产生呈阳性，其余15株非目的菌均无扩增条带产生，呈阴性。
(四)多重LAMP试剂盒基因组灵敏度测试
1、待测菌株DNA的提取与样品制备
使用艾德莱细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取乙型副伤寒沙门氏菌(CMCC(B)50094)、阪崎肠杆菌(CMCC45401)、金黄色葡萄球菌(ATCC6538)的基因组，具体步骤如上述实施例1中(二)的步骤1。经测量乙型副伤寒沙门氏菌、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌的DNA浓度为分别为102.8ng/μL、124.3ng/μL、91.7ng/μL，然后将所提取的基因组浓度进行10倍梯度稀释。
2、对所组装的多重LAMP试剂盒的基因组灵敏度进行测试
分别以上述步骤1制备的DNA为阳性样品，按照试剂盒使用方法进行检测。具体检测步骤如上述(二)，反应后的琼脂糖凝胶电泳结果如图8、图9、图10所示。
由图8、图9、图10可见，使用多重LAMP试剂盒检测沙门氏菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌基因组的检测限分别为1.03×10-8ng/μL、1.24×10-7ng/μL、9.17×10-7ng/μL。
(五)多重LAMP试剂盒菌液灵敏度测试
1、待测样品DNA的提取
选取沙门氏菌、阪崎肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行培养，用无菌生理盐水对菌液进行10倍梯度稀释，选取适当稀释度的菌液涂布平板，进行平板菌落计数，每个稀释度涂布三个平板，确定菌液浓度。在对每个稀释度的菌液进行DNA的提取，具体步骤如上述实施例1中(二)的步骤1。
2、对所组装的多重LAMP试剂盒的菌液灵敏度进行测试
分别以上述步骤1提取的DNA为阳性样品，按照试剂盒使用方法进行检测。具体检测步骤如上述(二)，反应后的琼脂糖凝胶电泳结果如图11、图12、图13所示。
由图11、图12、图13可见，使用多重LAMP试剂盒检测沙门氏菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌菌液的检测限分别为2.6×100CFU/mL、4.1×101CFU/mL、5.5×101CFU/mL。
(六)多重LAMP试剂盒对人工污染样品的检测限与灵敏度测试
1、人工污染样品的制备
将沙门氏菌、阪崎肠杆菌和金黄色葡萄球菌在LB培养基中，于37℃条件下培养24h，将沙门氏菌、阪崎肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌液分别与溶解在灭菌后的婴幼儿配方奶粉蛋白胨水溶液样品混合，得到分别被沙门氏菌、阪崎肠杆菌和金黄色葡萄球菌污染的样品。
2、待测样品DNA的提取与制备
使用艾德莱细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取上述步骤1中样品的基因组，具体步骤如上述实施例1中(二)的步骤1。经测量，样品中沙门氏菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌的DNA浓度分别为109.4ng/μL、113.3ng/μL、99.7ng/μL，然后将所提取的基因组浓度进行10倍梯度稀释。
3、对所组装的多重LAMP试剂盒对人工污染样品的检测限与灵敏度测试
分别以上述步骤2提取的DNA为阳性样品，按照试剂盒使用方法进行检测。具体检测步骤如上述(二)，反应后的琼脂糖凝胶电泳结果如图14、图16、图18所示。使用市售单重商品化沙门氏菌、阪崎肠杆菌以及金黄色葡萄球菌LAMP检测试剂盒进行检测，结果如图15、图17、图19所示。
由图14、图15、图16、图17、图18、图19可见，使用多重LAMP试剂盒检测人工污染样品中的沙门氏菌、阪崎肠杆菌和金黄色葡萄球菌检测限分别为1.09×10-9ng/μL、1.13×10-8ng/μL、9.97×10-7ng/μL，使用市售单重商品化LAMP检测试剂盒检测人工污染样品中的沙门氏菌、阪崎肠杆菌和金黄色葡萄球菌检测限分别为1.09×10-3ng/μL、1.13×10-3ng/μL、9.97×10-2ng/μL。多重LAMP试剂盒的对沙门氏菌、阪崎肠杆菌和金黄色葡萄球菌的检测限较市售单重商品化分别高106，105，105倍。
(七)多重LAMP试剂盒稳定性检测
将所组装的多重LAMP试剂盒存放于-20℃条件下，在0天、15天、30天、45天、60天、75天、90天取出，按照试剂盒使用方法进行操作，具体检测步骤如上述(二)，结果通过2％琼脂糖凝胶电泳及离心管内颜色变化来判断，完成对多重LAMP试剂盒稳定性进行检测。
结果如表4所示，试剂盒在90天仍可出现阳性反应，说明所组装的试剂盒在-20℃条件下可存放90天仍能发挥作用，稳定性合格。
表4多重LAMP试剂盒稳定性结果
实施例3一种同时检测人工污染婴幼儿配方奶粉中多种致病菌的试剂盒
1、人工污染样品的制备
1.1)将沙门氏菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌在LB培养基中于37℃，培养24h；
1.2)取100μL沙门氏菌菌液加入900μL的溶解在蛋白胨水溶液中的无菌婴幼儿配方奶粉样品溶液中，共4份；取100μL阪崎肠杆菌菌液加入900μL的溶解在蛋白胨水溶液中的无菌婴幼儿配方奶粉样品溶液中，共4份；取100μL金黄色葡萄球菌菌液加入900μL的溶解在蛋白胨水溶液中的无菌婴幼儿配方奶粉样品溶液中，共4份；另取90μL沙门氏菌、阪崎肠杆菌和金黄色葡萄球菌的混合菌液(各30μL)加入810μL的溶解在蛋白胨水溶液中的无菌婴幼儿配方奶粉样品溶液中，共5份；
1.3)将上一部所制备的17份人工污染婴幼儿配方奶粉样品与23份普通婴幼儿配方奶粉样品共40份，做好标记后，打乱顺序混合。
2、待测样品DNA的提取
使用艾德莱细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取上述步骤1中样品的基因组，具体步骤如上述实施例1中(二)的步骤1。
3、使用所组装的多重LAMP试剂盒对40份样品进行检测
分别以上述步骤2提取的DNA为阳性样品，按照试剂盒使用方法进行检测。具体检测步骤如上述实施例2中的(二)。
4、结果：对40份含有人工污染样品的奶粉进行多重LAMP试剂盒检测的结果如下图20，表5所示。
表5人工污染样品多重LAMP试剂盒检测结果
40份样品中，其中检测结果含菌呈阳性(沙门氏菌或阪崎肠杆菌或金黄色葡萄球菌)的样品有20份，其余20份样品中未检测出以上三种致病菌。多重LAMP试剂盒的阳性结果数超过实际受污染样品数，可能是由于LAMP方法灵敏度过高导致的假阳性结果，但多重LAMP试剂盒仍有较高的特异性与准确性，误差也在可控范围内，可以加以应用。
Claims (8)
1.一种同时检测婴幼儿配方奶粉中多种致病菌的LAMP引物组，其特征在于，包括沙门氏菌的LAMP引物组、阪崎肠杆菌的LAMP引物组、金黄色葡萄球菌的LAMP引物组；
沙门氏菌的LAMP引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
一对外引物如下：
SM-F3：AGGAGAAAAACTTCGGGAGC
SM-B3：ACGCTGCAAAACTTCAGAGA
一对内引物如下：
SM-FIP：TGACGTTACGCGCGAGTGTCGTTACGTGCTGCGAAATGC
SM-BIP：ATATGCTGGATCAGCTGGAGGCGGCATGTCTGAGCACTTCT
一对环引物如下：
SM-LF：CCGCCAGACAATGATAAAGCT
SM-LB：GGCAATTCGGGTAACCGGTAC
阪崎肠杆菌的LAMP引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
一对外引物如下：
BQ-F3：GCTCCGGAAGTACAGACCA
BQ-B3：GCGTCAGAACCGATACGG
一对内引物如下：
BQ-FIP：CCTTCCGGTTTCAGGGTAGCTTAGCACTTCACCCTGAAGTCT
BQ-BIP：GCGCTGGATCAGCTGTACTCTCTGAAGCCCAGAACCACTACA
一对环引物如下：
BQ-LF：TGTTGAAGTTGAACAGAACGTC
BQ-LB：CTGAGCAACCTGGATCCGAAA
金黄色葡萄球菌的LAMP引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
一对外引物如下：
JH-F3：AACAGTATATAGTGCAACTTCAA
JH-B3：CTTTGTCAAACTCGACTTCAA
一对内引物如下：
JH-FIP：ATGTCATTGGTTGACCTTTGTACATAAATTACATAAAGAACCTGCGA
JH-BIP：GTTGATACACCTGAAACAAAGCATCATTTTTTTCGTAAATGCACTTGC
一对环引物如下：
JH-LF：CCGTATCACCATCAATCGCTTTAAT
JH-LB：AAAGGTGTAGAGAAATATGGTCCTG。
2.一种同时检测婴幼儿配方奶粉中多种致病菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括：沙门氏菌的LAMP引物组；阪崎肠杆菌的LAMP引物组；金黄色葡萄球菌的LAMP引物组；10×Thermopol Buffer；MgSO4；dNTP Mix；Bst DNA聚合酶；HNB；甜菜碱；阳性对照品；无菌ddH2O。
3.如权利要求2所述的一种同时检测婴幼儿配方奶粉中多种致病菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述的沙门氏菌的LAMP引物组中，SM-F3、SM-B3、SM-FIP、SM-BIP、SM-LF、SM-LB的摩尔浓度比为8：8：1：1：4：4；所述的阪崎肠杆菌的LAMP引物组中，BQ-F3、BQ-B3、BQ-FIP、BQ-BIP、BQ-LF、BQ-LB的摩尔浓度比为8：8：1：1：4：4；所述的金黄色葡萄球菌的LAMP引物组中，JH-F3、JH-B3、JH-FIP、JH-BIP、JH-LF、JH-LB的摩尔浓度比为8：8：1：1：4：4。
4.如权利要求2所述的一种同时检测婴幼儿配方奶粉中多种致病菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述的MgSO4浓度为100mmol/L。
5.如权利要求2所述的一种同时检测婴幼儿配方奶粉中多种致病菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述的dNTP Mix浓度为10mmol/L。
6.如权利要求2所述的一种同时检测婴幼儿配方奶粉中多种致病菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述的HNB为羟基萘酚蓝，浓度为3mmol/L。
7.如权利要求2所述的一种同时检测婴幼儿配方奶粉中多种致病菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照品为乙型副伤寒沙门氏菌CMCC(B)50094、阪崎肠杆菌CMCC45401、金黄色葡萄球菌ATCC6538的基因组DNA。
8.一种采用权利要求2所述的LAMP检测试剂盒同时检测沙门氏菌、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)反应容器内加入下表1所示用量的各组分进行LAMP反应，
表1多重LAMP反应体系中试剂盒内各组分添加量
(2)将反应容器内各组分混匀后，置于65℃条件下温浴60min，再于85℃条件下灭活5min终止反应，
(3)反应结果通过观察反应容器内的颜色变化来判断，若为紫罗兰色则为阴性，若为蓝色则为阳性。反应结果也可通过2％琼脂糖凝胶电泳来判断，若出现明亮且清晰的梯形扩增条带，则为阳性，若无条带则为阴性。
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