CN102154451A - 阪崎肠杆菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种阪崎肠杆菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和检测试剂盒。本发明针对阪崎肠杆菌的ompA基因，设计和筛选了一套特异性检测引物组以及含有该检测引物组的检测试剂盒和利用该检测试剂盒通过LAMP的检测方法，对待检测样品进行检测，特别是奶粉，确认是否存在阪崎肠杆菌的特定基因片段，进而确定待检测样品是否存在阪崎肠杆菌的检测方法。本发明的检测试剂盒和检测方法具有灵敏度高、特异性强、检测时间短，不需要PCR仪和电泳仪，操作过程简单，特别适合基层检测机构和食品企业自检使用，对于奶粉快速检测和保障奶粉安全具有重要意义。

Description

阪崎肠杆菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和检测试剂盒

技术领域：

本发明涉及一种基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)技术的病原菌快速检测技术，特别涉及对阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)特定基因ompA基因的片段具有特异性的检测引物组，将所述检测引物组用环介导等温扩增法LAMP检测阪崎肠杆菌的检测方法和检测试剂盒。

背景技术：

阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)是肠杆菌科肠杆菌属的一种革兰阴性无芽孢杆菌，1980年前称为黄色阴沟肠杆菌，1980后更名为阪崎肠杆菌。1961年，Franklin等首次报道了2例由阪崎肠杆菌引起的婴儿脑膜炎病例，随后在全球范围内相继报道了一系列新生儿阪崎肠杆菌感染事件。阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，并且可引起神经系统后遗症和死亡，该菌感染引起的死亡率高达20％-50％。尽管现在还不能确定阪崎肠杆菌的宿主和传播模型，但在一些新生儿阪崎肠杆菌感染事件的调查中，发现婴幼儿配方粉是主要的感染渠道。2004年FAO/WTO在日内瓦召开的专家咨询会上将阪崎肠杆菌列为导致婴儿感染疾病和死亡的“A”类微生物范围。

在阪崎肠杆菌的检测技术方面，除传统生化方法外，新修订的国家标准GB4789.40-2010增加了显色培养基作为分离鉴定的一个方法，但仍需要进一步生化鉴定。随着分子生物学技术的发展，分子检测方法如PCR、荧光定量PCR技术等亦逐步应用于阪崎肠杆菌快速检测，然而这些技术也存有一定局限性，如需要昂贵仪器，操作复杂，不易推广使用等缺点。目前，仍然缺乏一套较为系统的快速检测方法。

LAMP技术是2000年Notomi等开发的一种新型核酸扩增技术，针对待测靶基因的6个区域设计4-6条特异性引物，在BstDNA聚合酶的作用下，在65℃左右等温条件1h内可以进行特异高效快速的核酸扩增，达到10⁹拷贝，扩增结果可直接观察焦磷酸镁沉淀或者加入显色剂进行判断。LAMP方法与PCR技术相比，检测时间短，具有更高的灵敏度，操作简单，仅仅需要普通水浴锅就可以完成检测。近年来已广泛用于疾病预防和病原检测等方面。

发明内容：

本发明的第一个目的在于提供一种应用环介导等温扩增检测阪崎肠杆菌的检测引物组，该检测引物组对阪崎肠杆菌的ompA基因具有特异性。

该检测阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)的检测引物组由下列引物组成：

上游外引物为F3(5’-3’)：CCGTGAACTTTTCCCAAGGA

下游外引物B3(5’-3’)：GTGGAACTGGGACCAACC

上游内引物FIP(5’-3’)：ACTGCAATCGCGATAGCTGTCTAGCGCATGGCCTTTTTGG

下游内引物BIP(5’-3’)：GCACTGGCTGGCTTCGCTACGTTTGCCACCTGCGTACC。

本发明的第二个目的是提供一种阪崎肠杆菌的检测方法，其特征在于，以阪崎肠杆菌的ompA基因为靶基因，通过LAMP方法用上述检测引物组对样品中的菌体的DNA选择性扩增所述的靶基因ompA的特定片段，确认是否存在有扩增产物。

所述的样品优选为奶粉。

所述的检测方法具体优选为：

(1)样品的制备和模板的提取：将待检样品用阪崎肠杆菌的增菌液增菌培养，提取培养液中菌体的DNA作为模板；

(2)环介导等温扩增LAMP：将扩增反应体系于65℃孵育45～60min，80℃终止反应1～2min；

所述的扩增反应体系包括：1×Thermopol反应缓冲液、1.4-1.8mmol/L dNTP s、4-8mmol/L硫酸镁(MgSO₄)、0.15-0.25μmol/L上游外引物F3、0.15-0.25μmol/L下游外引物B3，1.2-2μmol/L上游内引物FIP、1.2-2μmol/L下游内引物BIP、0.8-1mol/L甜菜碱、0.24-0.32U/μL的Bst DNA聚合酶和适量步骤(1)得到的模板DNA，余量为水；

(3)LAMP反应产物的检测：

利用电泳检测、荧光检测或浊度检测LAMP反应产物是否具有扩增产物。

所述的荧光检测是在反应管中加入SYBR Green I显色剂，1～5min后观察结果，如颜色为橙色，则待检测样品阪崎肠杆菌阴性，如颜色为绿色，则待检测样品阪崎肠杆菌阳性，含有阪崎肠杆菌。

所述的电泳检测是将LAMP反应产物经琼脂糖电泳，如电泳图呈现LAMP特征性阶梯状条带，则待检测样品阪崎肠杆菌阳性，含有阪崎肠杆菌，如电泳图无任何条带则待检测样品为阴性。

所述的浊度检测是用肉眼观察或浊度仪在400nm光下检测浊度，与阴性对照管比较显示，检测管出现明显浑浊则为阳性，含有阪崎肠杆菌，如未见浑浊则为阴性。

10×Thermopol缓冲液为现有技术中的物质，可以从试剂公司购买到，其含有200mmol/LpH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、100mmol/L氯化钾(KCl)、100mmol/L硫酸铵(NH₄)2SO₄、20mmol/L硫酸镁(MgSO₄)和1％曲拉通X-100(TtitonX-100)。

所述的步骤(1)的样品的制备和模板的提取具体优选为：所述的样品为奶粉，将奶粉加入到缓冲蛋白胨水中培养，然后再转接到改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(mLST-Vm)培养基中培养，再提取培养液中菌体的DNA作为模板。利用该优选步骤可以从奶粉样品中选择性的增菌，有利于奶粉样品的检测。

所述的缓冲蛋白胨水(BPW)和改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(mLST-Vm)是现有技术中的物质，可以从试剂公司购买到。

本发明的第三个目的是提供一种阪崎肠杆菌的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒至少包括含有上述上游外引物F3、下游外引物B3、上游内引物FIP和下游内引物BIP的检测引物组的环介导等温扩增反应液以及Bst DNA聚合酶。

所述的阪崎肠杆菌的检测试剂盒优选还包括显色剂：SYBR Green I。

所述的阪崎肠杆菌的检测试剂盒优选还包括缓冲蛋白胨水(BPW)和改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(mLST-Vm)。

ompA基因是与阪崎肠杆菌毒力因子有关的特异性靶基因，该基因比16srRNA具有更高的特异性，适用于阪崎肠杆菌的检测，特别适用于奶粉中阪崎肠杆菌的检测。本发明针对阪崎肠杆菌的ompA基因，设计和筛选了一套特异性检测引物组以及含有该检测引物组的检测试剂盒和利用该检测试剂盒通过LAMP的检测方法，对待检测样品进行检测，特别是奶粉，确认是否存在阪崎肠杆菌的特定基因片段，进而确定待检测样品是否存在阪崎肠杆菌的检测方法。本发明的检测试剂盒和检测方法具有灵敏度高、特异性强、检测时间短，不需要PCR仪和电泳仪，操作过程简单，特别适合基层检测机构和食品企业自检使用，对于奶粉快速检测和保障奶粉安全具有重要意义。

具体实施方式：

以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

一、

实施例1：

1、样品预处理

将某实验室能力验证比对样品(奶粉冻干粉)1g，加入1mL缓冲蛋白胨水溶解(购自广东环凯微生物科技有限公司)，然后加入9ml 44℃预热的缓冲蛋白胨水中，充分震荡溶解，36℃±1℃培养6h，吸取1mL转种于10mL改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(mLST-Vm)(购自广东环凯微生物科技有限公司)中，44℃±0.5℃培养20h，获得细菌培养物。

2、细菌DNA的提取

取1mL细菌培养物于12000r/min离心5min，弃上清，收集菌体，加入50μL TE溶液充分悬浮混匀，于100℃水浴10min，冰浴3min，12000r/min离心5min，取上清液备用，该上清液含有细菌的DNA，作为模板DNA。

3、LAMP扩增

在装有23μL环介导等温扩增(LAMP)反应液的反应管中加入1μL Bst DNA聚合酶(8U/μL)和1μL模板DNA，于恒温水浴锅上65℃孵育60min，80℃终止反应1min，取出反应管。

所述23μL环介导等温扩增(LAMP)反应液组成为：2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、4μL 10mmol/LdNTPs、0.5μL 10μmol/L上游外引物F3、0.5μL 10μmol/L下游外引物B3、1μL40μmol/L上游内引物FIP、1μL 40μmol/L下游内引物BIP、1.5μL 100mmol/L MgSO₄、9μL2.5mol/L甜菜碱、3μL灭菌双蒸水ddH₂O。

4、显色剂观察

在反应管中加入1μL显色剂(质量分数为10％的荧光染料SYBR GREEN I)，直接用肉眼观察颜色变化，反应管颜色变为绿色，阪崎肠杆菌阳性，说明样品中含有阪崎肠杆菌。

5、阪崎肠杆菌显色生化确证

将步骤1中的奶粉样品经缓冲蛋白胨水和改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤分步培养后的获得的细菌培养物，直接用接种环划线阪崎肠杆菌显色培养基(购自广东环凯微生物科技有限公司)，37℃培养18h～24h，肉眼观察菌落颜色，有的菌落颜色为蓝绿色，纯化蓝绿色菌落，进行API生化鉴定，结果是检出阪崎肠杆菌。说明待检测样品：实验室能力验证比对样品(奶粉冻干粉)检出阪崎肠杆菌。

由此可见，本发明的检测方法检测的结果与传统方法：阪崎肠杆菌显色生化鉴定检测结果一致，证明此方法数据可靠。

实施例2：

1、样品预处理

市场某奶粉样品(1)100g，加入900ml 44℃预热的缓冲蛋白胨水(购自广东环凯微生物科技有限公司)中，充分搅拌溶解，36℃±1℃培养6h，吸取1mL转种于10ml改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(mLST-Vm)(购自广东环凯微生物科技有限公司)，44℃±0.5℃培养18±2h，获得细菌培养物。

以下2、3、4步骤与实施例1相同

加入显色剂后，直接用肉眼观察颜色变化，反应管颜色变为橙色，阪崎肠杆菌阴性，说明样品中未检出阪崎肠杆菌。

5、阪崎肠杆菌显色培养基确证

将步骤1中的某奶粉样品(1)经缓冲蛋白胨水和改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤分步培养后的获得的细菌培养物，直接用接种环划线阪崎肠杆菌显色培养基(购自广东环凯微生物科技有限公司)，37℃培养18h～24h，肉眼观察菌落颜色，颜色为白色，说明待检测样品：某奶粉样品(1)阪崎肠杆菌阴性，未检出阪崎肠杆菌。

由此可见，本发明的检测方法检测的结果与传统方法：阪崎肠杆菌显色培养基检测，检测结果一致，证明此方法数据可靠。

实施例3：

1、样品预处理

市场某奶粉样品(2)100g，加入900ml 44℃预热的缓冲蛋白胨水(购自广东环凯微生物科技有限公司)中，充分搅拌溶解，36℃±1℃培养6h，吸取1mL转种于10ml改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(mLST-Vm)(购自广东环凯微生物科技有限公司)，44℃±0.5℃培养18±2h，获得细菌培养物。

以下2、3、4步骤与实施例1相同

加入显色剂后，直接用肉眼观察颜色变化，反应管颜色变为绿色，阪崎肠杆菌阳性，说明样品中检出阪崎肠杆菌。

5、阪崎肠杆菌显色生化确证

将步骤1中的某奶粉样品(2)经缓冲蛋白胨水和改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤分步培养后的获得的细菌培养物，直接用接种环划线阪崎肠杆菌显色培养基(购自广东环凯微生物科技有限公司)，37℃培养18h～24h，肉眼观察菌落颜色，颜色为蓝绿色，进行API生化鉴定，结果是检出阪崎肠杆菌。说明待检测样品：某奶粉样品(2)阪崎肠杆菌阳性，检出阪崎肠杆菌。

由此可见，本发明的检测方法检测的结果与传统方法：阪崎肠杆菌显色生化检测结果一致，证明此方法数据可靠。

实施例4：

本实施例与实施例3基本相同，奶粉样也为某奶粉样品(2)，只是步骤(3)中的LAMP扩增中，23μL环介导等温扩增(LAMP)反应液组成为：2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、3.5μL 10mmol/LdNTPs、0.375μL 10μmol/L上游外引物F3、0.375μL 10μmol/L下游外引物B3、0.75μL 40μmol/L上游内引物FIP、0.75μL 40μmol/L下游内引物BIP、1μL 100mmol/L MgSO₄、8μL 2.5mol/L甜菜碱、5.75μL灭菌双蒸水ddH₂O。

经检测反应管颜色变为绿色，阪崎肠杆菌阳性，说明样品中含有阪崎肠杆菌。与实施例3的检测结果吻合。

实施例5：

本实施例与实施例2基本相同，样品也为某奶粉样品(1)，只是步骤(3)中的LAMP扩增中，23μL环介导等温扩增(LAMP)反应液组成为：2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、4.5μL 10mmol/LdNTPs、0.625μL 10μmol/L上游外引物F3、0.625μL 10μmol/L下游外引物B3、1.25μL 40μmol/L上游内引物FIP、1.25μL 40μmol/L下游内引物BIP、2μL 100mmol/L MgSO₄、10μL 2.5mol/L甜菜碱、0.25μL灭菌双蒸水ddH₂O。

且在上述23μL环介导等温扩增(LAMP)反应液的反应管中加入0.75μL Bst DNA聚合酶(8U/μL)和1.25μL模板DNA，于恒温水浴锅上65℃孵育45min，80℃终止反应2min，取出反应管。其他步骤同实施例2。

经检测反应管颜色变为橙色，阪崎肠杆菌阴性，说明样品中未检出阪崎肠杆菌。与实施例2的检测结果吻合。

二、特异性和灵敏度检测

1、特异性

收集阪崎肠杆菌26株及非阪崎肠杆菌18株，将这些菌株分别在胰蛋白胨肉汤TSB(副溶血性弧菌在3.5％氯化钠营养肉汤)37℃培养24h后，取1mL菌液，按实施例1的方法提取细菌DNA，并分别进行LAMP扩增和加入显色剂观察。

其检测结果如表1所示。

表1  试验所用菌株及检测结果

注：+：阳性结果、-：阴性结果；ATCC：美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection)，CMCC：中国普通微生物菌种保藏管理中心(China Microbiological Culture Collection)，GIM：广东微生物研究所(Guangdong Institute ofMicrobiology)，NCTC：英国典型菌种保藏中心(National Collection of Type Cultures)

由表1可以看出，本发明的检测试剂盒和检测方法具有较好的特异性，只有阪崎肠杆菌菌株扩增阳性，其他非阪崎肠杆菌菌株为阴性。

2、灵敏度

以阪崎肠杆菌Enterobacter sakazakii ATCC29544为参考菌株，将其在TSB增菌液中37℃培养24h后，取1mL菌液，用灭菌生理盐水进行10倍梯度稀释，选取适宜的3个稀释度进行平板计数，每个稀释度2个平板，试验重复3次。取经平板计数分别为8×10⁰cfu/mL、8×10¹cfu/mL、8×10²cfu/mL、8×10³cfu/mL浓度菌液各1mL，按实施例1中的方法提取细菌DNA，进行LAMP扩增，加入显色剂显色观察，验证该方法的灵敏度。结果表明，LAMP方法的最低检测限可以达到8×10⁰cfu/mL，具有较高的灵敏度。

Claims (8)

1.一种应用环介导等温扩增检测阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)的检测引物组，其特征在于，由下列引物组成：

上游外引物为F3(5’-3’)：CCGTGAACTTTTCCCAAGGA

下游外引物B3(5’-3’)：GTGGAACTGGGACCAACC

上游内引物FIP(5’-3’)：ACTGCAATCGCGATAGCTGTCTAGCGCATGGCCTTTTTGG

下游内引物BIP(5’-3’)：GCACTGGCTGGCTTCGCTACGTTTGCCACCTGCGTACC。

2.一种阪崎肠杆菌的检测方法，其特征在于，以阪崎肠杆菌的ompA基因为靶基因，通过LAMP方法用权利要求1所述的检测引物组对样品中的菌体的DNA选择性扩增所述的靶基因ompA的特定片段，确认是否存在有扩增产物。

3.根据权利要求2所述的阪崎肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述的样品为奶粉。

4.根据权利要求2所述的阪崎肠杆菌的检测方法，其特征在于，该检测方法具体为：

(1)样品的制备和模板的提取：将待检样品用阪崎肠杆菌的增菌液增菌培养，提取培养液中菌体的DNA作为模板；

(2)环介导等温扩增LAMP：将扩增反应体系于65℃孵育45～60min，80℃终止反应1～2min；

所述的扩增反应体系包括：1×Thermopol反应缓冲液、1.4-1.8mmol/L dNTP s、4-8mmol/L硫酸镁(MgSO₄)、0.15-0.25μmol/L上游外引物F3、0.15-0.25μmol/L下游外引物B3，1.2-2μmol/L上游内引物FIP、1.2-2μmol/L下游内引物BIP、0.8-1mol/L甜菜碱、0.24-0.32U/μL的Bst DNA聚合酶和适量步骤(1)得到的模板DNA，余量为水；

(3)LAMP反应产物的检测：

利用电泳检测、荧光检测或浊度检测LAMP反应产物是否具有扩增产物。

5.根据权利要求4所述的阪崎肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述的步骤(1)的样品的制备和模板的提取具体为：所述的样品为奶粉，将奶粉加入到缓冲蛋白胨水中培养，然后再转接到改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤培养基中培养，再提取培养液中菌体的DNA作为模板。

6.一种阪崎肠杆菌的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒至少包括含有权利要求1所述的上游外引物F3、下游外引物B3、上游内引物FIP和下游内引物BIP的检测引物组的环介导等温扩增反应液以及Bst DNA聚合酶。

7.根据权利要求6所述的阪崎肠杆菌的检测试剂盒，其特征在于，所述的阪崎肠杆菌的检测试剂盒还包括显色剂：SYBR Green I。

8.根据权利要求6或7所述的阪崎肠杆菌的检测试剂盒，其特征在于，所述的阪崎肠杆菌的检测试剂盒还包括缓冲蛋白胨水和改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤。