CN107012216A - 用于检测阴沟肠杆菌的lamp引物组、试剂盒及快速检测方法 - Google Patents

用于检测阴沟肠杆菌的lamp引物组、试剂盒及快速检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于检测阴沟肠杆菌的LAMP引物组、试剂盒及快速检测方法。本发明的LAMP引物是根据阴沟肠杆菌dnaJ基因设计的六条特异性引物，应用上述六条引物，可实现特异性扩增，能够有效鉴别阴沟肠杆菌，最低检测极限可达到1个DNA拷贝；60min内可以完成对DNA样品的检测；且可根据实际情况灵活选择检测方法，方便快捷，有非常广阔的应用前景。

Description

用于检测阴沟肠杆菌的LAMP引物组、试剂盒及快速检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及用于检测阴沟肠杆菌的引物组、试剂盒及快速检测方法。
背景技术
肠杆菌属现有15种，其中阴沟肠杆菌是最常见的一种，是肠道正常菌丛的一部分，认为不会引起腹泻，广泛存在于自然环境中，在人和动物的粪便水、泥土、植物中均可检出，但能引起多种肠道外的条件致病性感染，如泌尿道、呼吸道和伤口感染，亦可引起菌血症和脑膜炎。
传统的阴沟肠杆菌检测主要通过生化鉴定和普通PCR。其中，生化鉴定需要对细菌进行纯培养后配成相当浓度的菌液后加到商业化的生化鉴定板，前后需要时间在2天以上。普通PCR则需要变性-退火-延伸3个阶段，即反应过程需要专业PCR仪控温，扩增后需要电泳仪判读结果。这些耗时长、操作繁琐及需要昂贵的仪器设备的方法都限制了阴沟肠杆菌的现场检测的发展，因此，开发一种简便、快捷的阴沟肠杆菌的检测方法具有极大的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供用于检测阴沟肠杆菌的引物组；
本发明的另一个目的在于提供用于检测阴沟肠杆菌的试剂盒；
本发明的另一个目的在于提供阴沟肠杆菌的快速检测方法。
本发明所采取的技术方案是：
用于检测阴沟肠杆菌的LAMP引物组，所述LAMP引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
dnaJ-F3：5’-CATGTCCGCACTGTCATG-3’；
dnaJ-B3：5’-TTCACAGTAGAGGTTGTTGC-3’；
dnaJ-FIP：5’-TTCTCAACGCGACCGTGGGTGGGACGCTGATTAAAGA-3’；
dnaJ-BIP：5’-GGTGACCGCATCCGTCTGGAACGTACAGATCGCCTG-3’；
dnaJ-LF：5’-TGGCATTTGGTGCATGGA-3’；
dnaJ-LB：5’-CAGGTGAAGGCGAAGCAG-3’。
用于检测阴沟肠杆菌的试剂盒，包括上述LAMP引物组。
作为上述试剂盒的优选，LAMP引物组中，外引物、内引物、环引物的摩尔比为：(1～2)：(4～8)：(2～4)。
作为上述试剂盒的改进，还包括以下成分： DNA聚合酶、反应液、显色剂、荧光染料、封闭液、阳性对照和阴性对照。
作为上述试剂盒的优选，反应液为含有20mM pH值为8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、10mM氯化钾、10mM硫酸铵、8mM硫酸镁、0.1%曲拉通X-100、甜菜碱0.8mM、4种dNTPs均2.8mM。
作为上述试剂盒的优选，荧光染料为SYBR GREEN Ⅰ。
作为上述试剂盒的优选，显色剂为SYBR GREEN Ⅰ与钙黄绿素与锰离子配合物的混合体积比为1：10～15。
非疾病诊断目的的阴沟肠杆菌的快速检测方法，包括如下步骤：
（1）提取待检样品DNA；
（2）利用上述的LAMP引物组对待检样品DNA进行恒温荧光扩增或恒温扩增；
所述恒温荧光扩增反应在qPCR仪器中进行，实时读取荧光信号；若有“S”型扩增曲线，则判断为阳性，若无“S”型扩增曲线，则判断为阴性；
所述恒温扩增反应在恒温装置下进行，反应结束后加入1～2μL的显色剂，混匀后即可观察反应液的颜色：若呈现荧光黄绿色，则判断为阳性，若呈现橙色，则判断为阴性。
作为上述检测方法的优选，所述恒温荧光扩增反应的25μL反应体系含有：dnaJ-F30.02μM、dnaJ-B3 0.02μM、dnaJ-FIP 0.16μM、dnaJ-BIP 0.16μM、dnaJ-LF 0.08μM、dnaJ-LB0.08μM、反应液12.5μL、DNA聚合酶2μL、待检样品DNA 2μL、荧光染料0.5μL，用超纯水补齐到25µL；反应体系混匀后，加入20μL密封液；恒温荧光扩增反应的条件为60～65℃反应55～65min。
作为上述检测方法的优选，所述恒温扩增反应的25μL反应体系含有：dnaJ-F30.02μM、dnaJ-B3 0.02μM、dnaJ-FIP 0.16μM、dnaJ-BIP 0.16μM、dnaJ-LF 0.08μM、dnaJ-LB0.08μM、反应液12.5μL、DNA聚合酶2μL、待检样品DNA 2μL，用超纯水补齐到25µL；反应体系混匀后，加入20μL密封液；恒温荧光扩增反应的条件为60～65℃反应55～65min。
本发明的有益效果是：
（1）高特异性：本发明的LAMP引物是根据阴沟肠杆菌dnaJ基因设计的六条特异性引物（2条内部引物FIP/BIP、2条外部引物F3/B3、2条环状引物LF/LB），应用上述六条引物，扩增靶序列的6个区域，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行；并且引物在反应体系用量仅10-2μM级，便可实现特异性扩增，能够有效鉴别阴沟肠杆菌。
（2）高灵敏度：最低检测极限可达到1个DNA拷贝，灵敏度远高于目前现有技术公开的检测水平；
（3）快速高效：60min内可以完成对DNA样品的检测；
（4）可灵活选择检测方法：可根据实际情况灵活选择检测方法，恒温荧光扩增需额外配备qPCR仪器采集荧光信号，通过扩增曲线是否为“S”型来判断结果；而恒温扩增则无需大型设备，利用肉眼观察的显色反应，即可判断结果，其显色原理是利用钙黄绿素与锰离子结合处于淬火状态；扩增反应的副产物焦磷酸离子与锰离子结合释放钙黄绿素，淬灭状态解除，发出黄绿色荧光。
附图说明
图1：实施例2的方法灵敏度评价结果，图中，A～G分别为106、105、104、103、102、10、1为对应样品的质粒标准品拷贝数，H为DEPC水；
图2：实施例3的方法灵敏度评价结果，图中，标注的106、105、104、103、102、10、1为对应样品的质粒标准品拷贝数，control为DEPC水；
图3：实施例2的方法特异性评价结果，图中，positive（阳性样本）为20株阴沟肠杆菌；negative（阴性样本）共30个，分别为产气肠杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯杆菌、恶臭假单胞菌、奇异变形杆菌、弗氏枸橼酸杆菌、沙门氏菌、志贺杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、.普通变形杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、粘质沙雷菌、摩氏摩根菌、粪肠球菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、草绿链球菌、溶血葡萄球菌、鸟肠球菌、棉子糖肠球菌、白色念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、人体白细胞；图中negative（阴性样本）扩增曲线重叠在一起；
图4：实施例3的方法特异性评价结果，图中，样品管上标注的1～20为20株阴沟肠杆菌；标注的Q1～Q30依次对应样品为产气肠杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯杆菌、恶臭假单胞菌、奇异变形杆菌、弗氏枸橼酸杆菌、沙门氏菌、志贺杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、普通变形杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、粘质沙雷菌、摩氏摩根菌、粪肠球菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、草绿链球菌、溶血葡萄球菌、鸟肠球菌、棉子糖肠球菌、白色念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、人体白细胞。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1、用于检测阴沟肠杆菌的试剂盒
用于检测阴沟肠杆菌的试剂盒，包括以下成分：（1）LAMP引物组；（2）DNA聚合酶；（3）反应液；（4）显色剂；（5）荧光染料；（6）封闭液；（7）阳性对照和阴性对照。
（1）LAMP检测引物组
根据阴沟肠杆菌多个种特异靶基因进行多套LAMP引物设计，经过多次敏感性和特异性实验，筛选出dnaJ（GenBank登录号为：AB272638.1）为最终靶基因，并最终优选的引物组扩增效率高，敏感性和特异性优，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
dnaJ-F3：5’-CATGTCCGCACTGTCATG-3’（SEQ ID NO:1）；
dnaJ-B3：5’-TTCACAGTAGAGGTTGTTGC-3’ (SEQ ID NO:2）；
dnaJ-FIP：5’-TTCTCAACGCGACCGTGGGTGGGACGCTGATTAAAGA-3’（SEQ ID NO:3）；
dnaJ-BIP：5’-GGTGACCGCATCCGTCTGGAACGTACAGATCGCCTG-3’（SEQ ID NO:4）；
dnaJ-LF：5’-TGGCATTTGGTGCATGGA-3’（SEQ ID NO:5）；
dnaJ-LB：5’-CAGGTGAAGGCGAAGCAG-3’（SEQ ID NO:6）。
（2）DNA聚合酶：Bst DNA聚合酶，酶活为8U/μL。
（3）反应液：含有20mM pH值为8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、10mM氯化钾、10mM硫酸铵、8mM硫酸镁、0.1%曲拉通X-100、甜菜碱0.8mM、4种dNTPs均2.8mM。
（4）显示剂：SYBR GREEN Ⅰ与钙黄绿素与锰离子配合物的混合体积比为1：12。
（5）荧光染料：SYBR GREEN Ⅰ。
（6）封闭液：液体石蜡油。
（7）阳性对照：含有阴沟肠杆菌dnaJ基因片段的质粒样品，其制备方法为：以分离鉴定的阴沟肠杆菌为模板，利用的dnaJ外引物（SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2）进行扩增，回收该扩增片段，利用常规方法连接到PMD-18T载体中，即为阳性对照。
（8）阴性对照：DEPC水。
实施例2、阴沟肠杆菌的恒温荧光扩增检测方法
利用实施例1的试剂盒检测阴沟肠杆菌，具体步骤如下：
（1）提取待检样品DNA；
（2）利用LAMP引物组对待检样品DNA进行恒温荧光扩增：
在反应管内加入恒温扩增的25μL体系，其含有：dnaJ-F3 0.02μM、dnaJ-B3 0.02μM、dnaJ-FIP 0.16μM、dnaJ-BIP 0.16μM、dnaJ-LF 0.08μM、dnaJ-LB 0.08μM、反应液12.5μL、DNA聚合酶2μL、待检样品DNA 2μL、荧光染料0.5μL、用超纯水补齐到25µL，混匀后，加入20μL密封液，盖紧反应管盖；
设置qPCR仪器，选用FAM通道，反应程序为63℃ 30s，将63℃ 15s，63℃ 45s作为一个循环，于63℃ 45s处采集荧光信号，反应40个循环。
结果判断：若有“S”型扩增曲线，则判断为阳性，若无“S”型扩增曲线，则判断为阴性。
实施例3、阴沟肠杆菌的恒温扩增检测方法
利用实施例1的试剂盒检测阴沟肠杆菌，具体步骤如下：
（1）提取待检样品DNA；
（2）利用LAMP引物组对待检样品DNA进行恒温扩增：
在反应管内加入恒温扩增的25μL体系，其含有：dnaJ-F3 0.02μM、dnaJ-B3 0.02μM、dnaJ-FIP 0.16μM、dnaJ-BIP 0.16μM、dnaJ-LF 0.08μM、dnaJ-LB 0.08μM、反应液12.5μL、DNA聚合酶2μL、待检样品DNA 2μL、用超纯水补齐到25µL，混匀后，加入20μL密封液，最后在管盖加1μL显色液，盖紧反应管盖；于恒温装置中63℃反应60min。
反应结束后，通过瞬时离心，将反应管盖上的显色液甩至管内，用肉眼观察颜色变化；
结果判断：若呈现荧光黄绿色，则判断为阳性，若呈现橙色，则判断为阴性。
实施例4、灵敏度评价
含有阴沟肠杆菌dnaJ基因片段的质粒样品作为模板，，进行10倍梯度稀释，至拷贝数分别为106、105、104、103、102、10、1，用实施例2和实施例3的方法分别进行灵敏度鉴定，阴性对照为DEPC水。
图1所示为实施例2阴沟肠杆菌的恒温荧光扩增检测方法的灵敏度评价结果，可以看出：该方法的最低检测限为DNA拷贝数1。
图2所示为实施例3阴沟肠杆菌的恒温扩增检测方法的灵敏度评价结果，可以看出：该方法的最低检测限为DNA拷贝数1。
实施例5、特异性评价
分别用实施例2和3的方法对下述样品进行检测：包括20株阴沟肠杆菌，以及30株非阴沟肠杆菌样品，分别为产气肠杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯杆菌、恶臭假单胞菌、奇异变形杆菌、弗氏枸橼酸杆菌、沙门氏菌、志贺杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、普通变形杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、粘质沙雷菌、摩氏摩根菌、粪肠球菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、草绿链球菌、溶血葡萄球菌、鸟肠球菌、棉子糖肠球菌、白色念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、人体白细胞。
图3所示为实施例2阴沟肠杆菌的恒温荧光扩增检测方法的特异性评价结果，可以看出：选取的20株阴沟肠杆菌均为阳性，30株非阴沟肠杆菌均为阴性，图中30株阴性样品及阴性对照的扩增曲线重叠。
图4所示为实施例3阴沟肠杆菌的恒温扩增检测方法的特异性评价结果，可以看出：选取的20株均呈现荧光黄绿色，为阳性，30株非阴沟肠杆菌均为橙色，为阴性。
综上，以上实施例说明本发明所用的检测阴沟肠杆菌的引物和方法灵敏度高、特异性强，检测准确度可以达99%以上。
以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。
SEQUENCE LISTING
<110> 南方医科大学南方医院
<120> 用于检测阴沟肠杆菌的LAMP引物组、试剂盒及快速检测方法
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
catgtccgca ctgtcatg 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttcacagtag aggttgttgc 20
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttctcaacgc gaccgtgggt gggacgctga ttaaaga 37
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggtgaccgca tccgtctgga acgtacagat cgcctg 36
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tggcatttgg tgcatgga 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
caggtgaagg cgaagcag 18

Claims (10)

1.用于检测阴沟肠杆菌的LAMP引物组，所述LAMP引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
dnaJ-F3：5’-CATGTCCGCACTGTCATG-3’；
dnaJ-B3：5’-TTCACAGTAGAGGTTGTTGC-3’；
dnaJ-FIP：5’-TTCTCAACGCGACCGTGGGTGGGACGCTGATTAAAGA-3’；
dnaJ-BIP：5’-GGTGACCGCATCCGTCTGGAACGTACAGATCGCCTG-3’；
dnaJ-LF：5’-TGGCATTTGGTGCATGGA-3’；
dnaJ-LB：5’-CAGGTGAAGGCGAAGCAG-3’。
2.用于检测阴沟肠杆菌的试剂盒，包括权利要求1所示的LAMP引物组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：LAMP引物组中，外引物、内引物、环引物的摩尔比为：(1～2)：(4～8)：(2～4)。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：还包括以下成分： DNA聚合酶、反应液、显色剂、荧光染料、封闭液、阳性对照和阴性对照。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：反应液为含有20mM pH值为8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、10mM氯化钾、10mM硫酸铵、8mM硫酸镁、0.1%曲拉通X-100、甜菜碱0.8mM、4种dNTPs均2.8mM。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：荧光染料为SYBR GREEN Ⅰ。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：显色剂为SYBR GREEN Ⅰ与钙黄绿素与锰离子配合物的混合体积比为1：10～15。
8.非疾病诊断目的的阴沟肠杆菌的快速检测方法，包括如下步骤：
（1）提取待检样品DNA；
（2）利用权利要求1的LAMP引物组对待检样品DNA进行恒温荧光扩增或恒温扩增；
所述恒温荧光扩增反应在qPCR仪器中进行，实时读取荧光信号；若有“S”型扩增曲线，则判断为阳性，若无“S”型扩增曲线，则判断为阴性；
所述恒温扩增反应在恒温装置下进行，反应结束后加入1～2μL的显色剂，混匀后即可观察反应液的颜色：若呈现荧光黄绿色，则判断为阳性，若呈现橙色，则判断为阴性。
9.根据权利要求8所述的非疾病诊断目的的阴沟肠杆菌的快速检测方法，其特征在于：所述恒温荧光扩增反应的25μL反应体系含有：dnaJ-F3 0.02μM、dnaJ-B3 0.02μM、dnaJ-FIP0.16μM、dnaJ-BIP 0.16μM、dnaJ-LF 0.08μM、dnaJ-LB 0.08μM、反应液12.5μL、DNA聚合酶2μL、待检样品DNA 2μL、荧光染料0.5μL，用超纯水补齐到25µL；反应体系混匀后，加入20μL密封液；恒温荧光扩增反应的条件为60～65℃反应55～65min。
10.根据权利要求8所述的非疾病诊断目的的阴沟肠杆菌的快速检测方法，其特征在于：所述恒温扩增反应的25μL反应体系含有：dnaJ-F3 0.02μM、dnaJ-B3 0.02μM、dnaJ-FIP0.16μM、dnaJ-BIP 0.16μM、dnaJ-LF 0.08μM、dnaJ-LB 0.08μM、反应液12.5μL、DNA聚合酶2μL、待检样品DNA 2μL，用超纯水补齐到25µL；反应体系混匀后，加入20μL密封液；恒温荧光扩增反应的条件为60～65℃反应55～65min。
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