CN105803064A - 检测肠杆菌科食源性致病菌的lamp方法、核酸及引物对 - Google Patents

检测肠杆菌科食源性致病菌的lamp方法、核酸及引物对 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测肠杆菌科食源性致病菌的LAMP方法、核酸及引物对，属于食品安全检测技术领域，所述的LAMP方法包括如下步骤：利用生物信息学和比较基因组学，筛选到了肠杆菌科致病菌的共有基因序列，并以此序列设计特异性扩增引物对；并通过优化反应条件建立LAMP检测体系；本发明还涉及一种碱基序列如SEQ ID NO:1所示的核酸及一组(三对)引物，引物的碱基序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示。与现有技术相比，本发明采用的检测方法检测肠杆菌科，检测时间短，成本低，更加具有实用性，检测结果特异，结果判定简单。

Description

检测肠杆菌科食源性致病菌的LAMP方法、核酸及引物对
技术领域
本发明涉及食品安全检测技术领域，具体涉及一种检测肠杆菌科食源性致病菌的LAMP方法、核酸及引物对。
背景技术
《伯杰氏细菌系统鉴定手册》中将肠杆菌科(Enterobacteriaceae)定义为广泛存在于人和动物肠道及自然界中的一大群生物学性状相似的革兰阴性无芽胞杆菌。此类细菌在VRBGA琼脂上30℃±1℃或37℃±1℃下可以形成明显的菌落并可发酵葡萄糖，氧化酶阴性的细菌。《伯杰氏系统细菌学手册(2004版)》将肠杆菌科细菌分为44个属170多个种。肠杆菌科现已包括了大肠菌群中的细菌，也包括了除大肠菌群外但有致病性的沙门氏菌属、志贺氏菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属、肠杆菌属和耶尔森菌属等菌属，这几类菌有明显的致病性，常引起食源性感染疾病，多数是食品卫生的重要指示菌，所以检测肠杆菌科细菌比单纯检测大肠菌群更能真实地反映出食品加工中潜在的污染状况。
不少学者对肠杆菌科检验方法曾进行了研究。ISO21528-1：2004及SN0738-1997检测肠杆菌科的方法均是进行MPN计数，GB/T4789.31-2003中制定了肠杆菌科的噬菌体检验方法，但鉴于行标中需要对VRBGA平板上的菌落进行葡萄糖发酵及氧化酶确认试验，且需要配制培养基和准备消毒平皿，平板培养后需人工计数易造成漏检等误差。国标中需要准备噬菌体对一些实验室来说相对较困难。NMKL法仅以氧化酶阴性对肠杆菌科进行确认，此法可将不发酵葡萄糖，但可利用蛋白胨生长、氧化酶也为阴性的沃夫氏不动杆菌误判为肠杆菌科，造成假阳性结果，使计数结果偏高；ISO方法以氧化酶阴性和葡萄糖琼脂呈黄色为阳性对肠杆菌科进行确认，此法则易将葡萄糖琼脂表面变为蓝色的阴沟肠杆菌，产气肠杆菌和沙雷氏菌漏检，出现假阴性，使计数结果偏低，而且这些方法检测周期较长。因此，我国有必要研制新的更简便快捷、可操作性强的肠杆菌科检验方法。
为了解决上述技术问题，一种新颖的环介导等温扩增技术(Loop-MediatedIsothermalAmplification,LAMP)已逐步应用于致病菌等的检测；该技术利用4种不同的特异性引物识别靶DNA上6个特定区域，并利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(BstDNA)，在恒温条件下快速、高效、特异地扩增核酸。LAMP技术具有与PCR技术同等甚至超越的优势，它的优越性表现在：反应速度快，反应时间短；与其他核酸诊断方法相比，具有较低的成本；LAMP技术对反应条件的要求相对宽松，使得对操作人员的专业水平要求不高，这也为该核酸扩增方法的普及创造了条件。本发明便提供一种检测时间短、成本低、检测结果特异性好、结果判定简单的检测肠杆菌科食源性致病菌的LAMP方法、核酸及引物对。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种检测时间短、成本低、检测结果特异性好、结果判定简单的检测肠杆菌科食源性致病菌的LAMP方法、核酸及引物对。
本发明是通过以下技术方案实现的：
检测肠杆菌科食源性致病菌的LAMP方法，具体包括如下步骤：
步骤一、根据肠杆菌科的30SribosomalproteinS3的编码基因rpsC序列中如SEQIDNO:1所示的肠杆菌科保守序列设计特异性扩增引物对；
步骤二、提取样品DNA，利用步骤一所得特异性扩增引物对采用LAMP方法进行扩增；
步骤三、通过荧光曲线判断样品中是否含有肠杆菌科。
较佳地，在步骤一中，所述引物对具体为：F3引物的碱基序列SEQIDNO:2所示，B3引物的碱基序列如SEQIDNO:3所示；FIP引物的碱基序列SEQIDNO:4所示，BIP引物的碱基序列如SEQIDNO:5所示；LF引物的碱基序列SEQIDNO:6所示，LB引物的碱基序列如SEQIDNO:7所示。
较佳地，在步骤二中所述的LAMP方法中，LAMP检测体系具体为：LAMP反应体系，15μL：英国OPTIGENE公司的isothermalmastermixBuffer，9.0μL；外引物F3+B3，10μmol/L，0.15+0.15μL；内引物FIP+BIP，10μmol/L，1.2+1.2μL；环引物LF+LB，10μmol/L，0.6+0.6μL；DNA模板，2μL；灭菌ddH2O，0.1μL。
较佳地，在步骤二中所述的LAMP方法中，LAMP检测体系扩增参数具体为：先在60℃持续1h，待反应结束后，温度升至98℃，再逐步降落至80℃，降幅为0.05℃/s，以绘制溶解曲线。
本发明还涉及检测肠杆菌科食源性致病菌的LAMP方法的核酸，该核酸的碱基序列如SEQIDNO:1所示。
本发明还涉及检测肠杆菌科食源性致病菌的LAMP方法的引物对，该引物对具体为：正向引物的碱基序列如SEQIDNO:2所示，反向引物的碱基序列如SEQIDNO:3所示。
本发明采用上述技术方案所带来的技术效果在于：
本发明涉及一种检测肠杆菌科食源性致病菌的LAMP方法、核酸及引物对。本发明的检测方法检测肠杆菌科菌株，检测速度快，结果准确可靠，操作简单，检测成本低；本发明的检测方法可以用于食品样品的检测；本发明的检测靶点是自行通过比较基因组学、生物信息学筛选并经过生物学验证而得到的，具有单一特异性，检测结果可靠，结果判定简单。
附图说明
图1为7株肠杆菌科标准菌株的检测结果示意图；
图2为7株非肠杆菌科标准菌株的检测结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述：
实施例1：肠杆菌科PCR检测方法，具体包括以下步骤：
步骤一，根据肠杆菌科的基因组DNA序列中的保守序列设计引物；
通过比较基因组和生物信息学分析，在肠杆菌科基因组DNA序列中找到特异的DNA序列，将之作为肠杆菌科的检测靶点，该核酸的碱基序列为：
5’—GCCTTTGTGCATTTTACGGAATTTTGTACGCTTTGGTTGTAACATCAGCGACGCTCCTTATTTACGGCCTTTACGCTGCTGCTTTTTCGGTTGAGCAGCCGGTTTTTCCGGTTGTTCAACAGCAGCCATACCACCCAGGATCTCGCCTTTGAAGATCCACACTTTAACGCCGATTACACCATAAGTGGTGTGCGCTTCAGAGGTGTTGTAGTCGATGTCAGCACGCAGAGTGTGCAGAGGTACGCGACCTTCGCGGTACCATTCGGTACGTGCGATTTCCGCGCCGCCCAGACGGCCGCTAACTTCAACTTTGATACCTTTAGCGCCCAGACGCATGGCGTTCTGTACAGCACGCTTCATCGCACGACGGAACATCACGCGACGTTCCAGCTGAGAAGTGATGCTGTCAGCAACCAGTTTAGCGTCCAGTTCAGGTTTACGAACTTCGGCGATATTGATCTGTGCAGGAACGCCAGCGATATCCGCTACGACCTTACGCA—3’，(SEQIDNO：1)
将此DNA核酸序列输入到引物设计软件PrimerPremier5.0中设计引物，引物序列如下(引物由大连宝生物工程有限公司)：
F3：5’—CCGGTTTTTCCGGTTGTTCA—3’，(SEQIDNO:2)
B3：5’—GAAGTTAGCGGCCGTCTG—3’，(SEQIDNO:3)
FIP：5’—AGCGCACACCACTTATGGTGTA-AGCAGCCATACCACCCAG—3’，(SEQIDNO:4)
BIP：5’—TTGTAGTCGATGTCAGCACGCA-AATCGCACGTACCGAATGG—3’，(SEQIDNO:5)
LF：5’—AGTGTGGATCTTCAAAGGCGAGATC—3’，(SEQIDNO:6)
LB：5’—TGTGCAGAGGTACGCGACCT—3’，(SEQIDNO:7)
步骤二，LAMP检测方法的体系及反应参数
LAMP检测方法如下：
LAMP反应体系(15μL)为：英国OPTIGENE公司的isothermalmastermixBuffer，9.0μL；外引物F3+B3，10μmol/L，0.15+0.15μL；内引物FIP+BIP，10μmol/L，1.2+1.2μL；环引物LF+LB，10μmol/L，0.6+0.6μL；DNA模板，2μL；灭菌ddH2O，0.1μL。然后将反应管离心后，放入LAMP仪中，按照以下参数进行：
LAMP扩增反应先在60℃持续1h，待反应结束后，温度升至98℃，再逐步降落至80℃，降幅为0.05℃/s，以绘制溶解曲线；
步骤三，检测
取14株肠杆菌科标准菌株、15株非肠杆菌科标准菌株(如表1所示)，按照DNA模板提取方法，分别提取基因组DNA。每株菌株的DNA溶液均取2μL作为LAMP反应株菌株添加到LAMP体系中进行扩增反应。提取过程如下：将以上29株标准菌株(如表1所示)分别接至50mL的LB液体培养基中，在37℃增菌8h后，取1mL菌液，放入1.5mL离心管中；之后在3,000r/min离心10min，取上清液，再在12,000r/min离心5min，收集菌体。用无菌双蒸水重新悬浮菌体，离心洗涤后加入100μL无菌超纯水，在沸水浴中煮15min，立即取出，在-20℃放置30min。在37℃解冻后，12,000r/min离心5min，取上清液放置-20℃备用；
如图1所示，7株肠杆菌科标准菌株的检测结果，全部为阳性(有扩增曲线)；图2为7株非肠杆菌科标准菌株的检测结果，全部为阴性(没有扩增曲线)；所用菌株的编号信息请参见附图说明。
表1检测所用标准菌株
BacilluscereusATCC63301，PseudomonasaeruginosaATCC27853，LactobacillusrhamnosusATCC7469，BifidobacteriabifidumATCC29521，VibrioparahaemolyticusATCC17802，StaphylococcusaureusATCC25923，PseudomonasaeruginosaATCC27853，ddH2O。
其中，图1中1-8号曲线的模板分别为：EnterobactercloacaeATCC13047，CitrobacterfreundiiATCC43864，EscherichiacoliATCC25922，SalmonellaEnteritidisATCC15611，EnterobactersakazakiiATCC51329，ShigellaflexneriATCC12022，ProteusmirabilisATCC49005，ddH2O。
如图2所示，图2中1-8号曲线的模板分别为：BacilluscereusATCC63301，PseudomonasaeruginosaATCC27853，LactobacillusrhamnosusATCC7469，BifidobacteriabifidumATCC29521，VibrioparahaemolyticusATCC17802，StaphylococcusaureusATCC25923，PseudomonasaeruginosaATCC27853，ddH2O。
实施例2：利用实施例1中的检测方法，对30株来自食品样品的分离菌株进行检测，样品处理以及菌株分离与鉴定参见国标GB/T4789.4-2010。结果显示，LAMP检测与国标方法鉴定一致(如表2所示)。
表2检测所用分离菌株
序列表
<110>浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120>检测肠杆菌科食源性致病菌的LAMP方法、核酸及引物对
<160>7
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>500
<212>DNA
<213>沙门氏菌
<400>1
1GCCTTTGTGCATTTTACGGAATTTTGTACGCTTTGGTTGTAACATCAGCGACGCTCCTTA
61TTTACGGCCTTTACGCTGCTGCTTTTTCGGTTGAGCAGCCGGTTTTTCCGGTTGTTCAAC
121AGCAGCCATACCACCCAGGATCTCGCCTTTGAAGATCCACACTTTAACGCCGATTACACC
181ATAAGTGGTGTGCGCTTCAGAGGTGTTGTAGTCGATGTCAGCACGCAGAGTGTGCAGAGG
241TACGCGACCTTCGCGGTACCATTCGGTACGTGCGATTTCCGCGCCGCCCAGACGGCCGCT
301AACTTCAACTTTGATACCTTTAGCGCCCAGACGCATGGCGTTCTGTACAGCACGCTTCAT
361CGCACGACGGAACATCACGCGACGTTCCAGCTGAGAAGTGATGCTGTCAGCAACCAGTTT
421AGCGTCCAGTTCAGGTTTACGAACTTCGGCGATATTGATCTGTGCAGGAACGCCAGCGAT
481ATCCGCTACGACCTTACGCA
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
CCGGTTTTTCCGGTTGTTCA20
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
GAAGTTAGCGGCCGTCTG18
<210>4
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
AGCGCACACCACTTATGGTGTAAGCAGCCATACCACCCAG40
<210>5
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
TTGTAGTCGATGTCAGCACGCAAATCGCACGTACCGAATGG41
<210>6
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
AGTGTGGATCTTCAAAGGCGAGATC25
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
TGTGCAGAGGTACGCGACCT20

Claims (6)

1.检测肠杆菌科食源性致病菌的LAMP方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一、根据肠杆菌科的30SribosomalproteinS3的编码基因rpsC序列中如SEQIDNO:1所示的肠杆菌科保守序列设计特异性扩增引物对；
步骤二、提取样品DNA，利用步骤一所得特异性扩增引物对采用LAMP方法进行扩增；
步骤三、通过荧光曲线判断样品中是否含有肠杆菌科。
2.根据权利要求1所述的检测肠杆菌科食源性致病菌的LAMP方法，其特征在于：在步骤一中，所述引物对具体为：F3引物的碱基序列SEQIDNO:2所示，B3引物的碱基序列如SEQIDNO:3所示；FIP引物的碱基序列SEQIDNO:4所示，BIP引物的碱基序列如SEQIDNO:5所示；LF引物的碱基序列SEQIDNO:6所示，LB引物的碱基序列如SEQIDNO:7所示。
3.根据权利要求1所述的检测肠杆菌科食源性致病菌的LAMP方法，其特征在于：在步骤二中所述的LAMP方法中，LAMP检测体系具体为：LAMP反应体系，15μL：英国OPTIGENE公司的isothermalmastermixBuffer，9.0μL；外引物F3+B3，10μmol/L，0.15+0.15μL；内引物FIP+BIP，10μmol/L，1.2+1.2μL；环引物LF+LB，10μmol/L，0.6+0.6μL；DNA模板，2μL；灭菌ddH2O，0.1μL。
4.根据权利要求1或3所述的检测肠杆菌科食源性致病菌的LAMP方法，其特征在于：在步骤二中所述的LAMP方法中，LAMP检测体系扩增参数具体为：先在60℃持续1h，待反应结束后，温度升至98℃，再逐步降落至80℃，降幅为0.05℃/s，以绘制溶解曲线。
5.检测肠杆菌科食源性致病菌的LAMP方法的核酸，其特征在于：该核酸的碱基序列如SEQIDNO:1所示。
6.检测肠杆菌科食源性致病菌的LAMP方法的引物对，其特征在于：该引物对具体为：正向引物的碱基序列如SEQIDNO:2所示，反向引物的碱基序列如SEQIDNO:3所示。
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